CN109423466A

CN109423466A - 一种复合发酵菌剂及其应用

Info

Publication number: CN109423466A
Application number: CN201710786611.7A
Authority: CN
Inventors: 吴培均; 李富伟; 骆骅; 李兆勇
Original assignee: Beijing Crvab Bio Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Crvab Bio Tech Co ltd
Priority date: 2017-09-04
Filing date: 2017-09-04
Publication date: 2019-03-05
Anticipated expiration: 2037-09-04
Also published as: CN109423466B

Abstract

本发明公开了一种复合发酵菌剂及其应用，以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和屎肠球菌为活性成分，将三者按照菌数比1～5：1～5：0.5～5的比例配合而成，总菌数为20‑200亿CFU/g。本发明进行发酵饲料的生产，实现抗菌、酸化、预消化和降低霉菌毒素等多个功能，应用前景广阔。

Description

一种复合发酵菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高效固体复合发酵菌剂及其应用。

背景技术

发酵饲料，是通过将多种有益微生物经过科学复配，以一定比例接种到饲料原料中，并且在合适的条件下进行发酵，最后生成的一种生物活性功能的有机生物饲料。发酵饲料不仅可以降低饲料原料(如棉粕、豆粕等)中的抗营养因子，提高其利用价值；也可以利用非常规饲料资源(如马铃薯渣、酒糟、苹果渣等)提高营养成分及适口性。因此，发酵饲料不仅可以缓解饲料资源短缺的问题也能节约资源甚至废弃物的排放。

我国在2012年12月将生物技术作为国家新兴发展战略产业，必将推动生物技术领域的全面发展。目前，我国畜牧业正处于加快发展方式转变的关键时期，示范推广绿色、环保、安全、高效的益生菌制剂，对保障畜产品有效供给、促进农民增收、保护生态环境，推进畜牧业又好又快发展具有重要意义。农业部在新修订的《饲料添加剂品种目录(2013)》中规范了我国允许使用的微生态种类和应用，扩大了允许在饲料中使用的益生素的种类和使用对象，鼓励绿色安全微生态饲料的研发和应用，从政策上推动了微生态制剂在畜牧业中的推广使用。因此，依据国家政策支持和发展方向，研究低成本高效微生态饲料具有时代特征，符合国家产业发展方向，符合当前畜牧业发展需求，具有未来发展和应用前途和潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固体复合发酵菌剂，该菌剂生产出的发酵饲料可以减少抗生素用量，降低黄曲霉毒素含量以及在发酵过程中对饲料具有预消化作用。

为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种复合发酵菌剂，以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和屎肠球菌为活性成分，将三者按照菌数比1～5：1～5：0.5～5的比例配合而成，总菌数为20～200亿CFU/g。

所述屎肠球菌Enterococcus Faecium高产乳酸，保存编号CGMCC No.9666；所述地衣芽孢杆菌Baclicuslincheniformis高产中性蛋白酶和淀粉酶，保存编号为CGMCCNo.14441；所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在固体发酵时能降低饲料中黄曲霉毒素含量，保存编号为CGMCC No.14442。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)已于2017年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号分别为CGMCC NO.14442、CGMCC NO.14441。屎肠球菌(Enterococcus Faecium)已于2014年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9666。

本发明主要涉及一株高产乳酸的屎肠球菌，一株高产中性蛋白酶和淀粉酶的地衣芽孢杆菌；一株在固体发酵时能降低饲料中黄曲霉毒素含量的枯草芽孢杆菌。

本发明所述枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的生产方法包括如下步骤：

一级斜面培养：将芽孢杆菌接种于一级斜面培养基上，于24～37℃下培养24～36小时，得到一级芽孢杆菌菌落；培养基组成：牛肉浸膏2.5～5.0g，大豆蛋白胨5.0～15.0g，酵母膏1.0～5.0g，氯化钠1.0～5.0g，葡萄糖5.0～10.0g，琼脂5.0～20g，蒸馏水1000ml，pH为6.5～7.5；

二级液体培养：将培养的一级芽孢杆菌菌落接种于二级培养液中，装液量为150ml/500ml，在30～37℃、110～220转/分的条件下培养15～20小时，得到二级芽孢杆菌种子液；二级培养液配制比例：蛋白胨5.0～15g，牛肉膏1.0～5.0g，氯化钠1.0～5.0g，蒸馏水1000mL，pH为6.5～7.5；

三级扩大培养：将二级芽孢杆菌种子液以0.1％～0.5％重量比接种于发酵罐中，采用常规方法在培养基上于30～37℃、110～220转/分的条件下培养24～36小时，得到三级芽孢杆菌种子液；培养基组成：玉米粉0.1～0.5％，葡萄糖0.1～1.0％，豆饼粉0.1～5.0％，鱼粉0.1～0.5％，碳酸钙1.0～5.0％，硫酸铵0.01～0.05％，磷酸氢二钾0.01～0.05％，硫酸镁0.01～0.05％和硫酸锰0.01～0.05％；

液体发酵：发酵罐通蒸汽于100～150℃保温灭菌40～60分钟后，将发酵底物粉碎到80目放入发酵罐中，再加入水，所加入水的重量与发酵底物重量之比为80～120：1～10，然后通高压蒸汽升温至100～150℃，并保温40～60分钟后自然冷却40～60分钟，通冷却水冷却至20～40℃，无菌条件下接入三级枯草芽孢杆菌种子液，以重量比计，接种量为0.1～1.0％，罐压为0.05MPa，搅拌转速为120～220转/分，以体积比计，通风比为0.5～1：0.5～1，发酵时间为24～48小时；检测发酵液活菌数为l.35×10¹⁰CFU/ml；以重量比计，所述的发酵底物包含：酵母粉1％～5％、3％的豆粕水解液1％～5％、葡萄糖0.1～1.5％、玉米淀粉0.1～1.5％、碳酸钙0.1～1.0％，pH为7.0-7.5；该发酵液通过过滤即为含量达到10¹⁰CFU/ml的液体芽孢杆菌。

本发明提供了一种屎肠球菌发酵方法，步骤如下：

用MRS培养基为种子培养基，在35～45℃有氧或兼性条件下培养屎肠球菌18～24小时，成为一级种子；

将一级种子液接种在种子罐中进行扩大培养，采用MRS培养基为种子培养基，在35～45℃有氧或兼性条件下培养18～24小时，成为二级种子；

将获得的二级种子液接种在发酵罐中进行发酵培养，采用改良的MRS培养基为发酵培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下，采用定时或连续补料分批发酵方式培养18～36小时；

优选的，发酵屎肠球菌的MRS培养基是在每升MRS培养基中加有大豆蛋白胨5～30g，葡萄糖1～10g，酵母粉1～10g，乙酸钠1～10g，拧檬酸二胺0.1～8g，Tween800.1～5g，磷酸氢二钾0.1～5g，硫酸镁0.05～lg，硫酸锰0.001～0.2g，碳酸钙1～30g，纯净水1升，调节pH值5.5～7.5。

本发明还提供了上述的复合发酵菌剂在发酵固体培养基中的应用。

优选地，将所述复合发酵菌剂按质量比5-15％的接种量加入固体发酵料中用于固体发酵。

进一步地，用于固体发酵的具体的生产方法包括如下步骤：

(1)取发酵菌种和碳源加入30-40℃水中，充分搅拌，放置5-12小时；

(2)步骤(1)得到溶液加入固体发酵料中，并补加水使固体发酵料的含水量在35％-40％之间，发酵12小时到36小时即可。

根据本发明的一个优选技术方案，采用本发明提供的发酵菌种进行固体发酵，步骤如下：

准备可盛水100-300公斤塑料桶，取发酵菌种，以及1000克红糖放入塑料桶中，然后把桶加满水，水温范围在30-40℃最佳，充分搅拌，放置5-12小时。尽量采用无杂物和污染的干净水源，放置过程中也减少外界接触。

首先计算出需要添加的水重量，加过水后物料的含水量在35％-40％之间，以一吨饲料为例，正常饲料中含水14％，则每吨饲料需要额外加水重量从400公斤～430公斤之间，温度高时减少加水量，温度低时提高加水量。需要额外添加的水重量＝已经活化的水重量+还需要添加的水重量，将还需要添加的水与活化水混合后，再与饲料混合均匀。使用的水温尽量接近30℃，这样有利于微生物快速发酵。

将饲料堆放在干净不渗水的水泥地面上，防止水分下渗地面，尽量堆积成1米左右厚度，饲料上面再铺上一层塑料纸。饲料堆放处尽量干净、温暖、无风、防雨条件下，冬天尽量保温，夏天避阳光直射。发酵时间一般在12小时到36小时，和具体环境温度关系密切，夏天时间缩短，冬天时间延长。随发酵程度加深，饲料内部温度会上升。发酵12小时(冬天24小时)后，可隔10小时翻动一次饲料促进均匀发酵。

本发明使用的枯草芽孢杆菌是一株在固体发酵时能降低饲料中黄曲霉毒素含量的芽孢杆菌，保存编号为CGMCC No.14442。本发明提供了一种以此屎肠球菌结合枯草芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌进行生产高效固体发酵的方法。该菌种生产出的发酵饲料可以减少抗生素用量，降低黄曲霉毒素含量以及在发酵过程中对饲料具有预消化作用。本发明中使用到的同时高产中性蛋白酶和淀粉酶的芽孢杆菌，该芽孢杆菌能促进乳酸菌增殖。本发明筛选到的屎肠球菌能迅速增殖，产生有机酸，快速降低发酵过程中的pH值，抑制杂菌生长。本发明中使用到的地衣芽孢杆菌在固体发酵时能降低饲料中黄曲霉毒素含量。优选地，本发明提供的高效固体发酵专用菌种将两株芽孢杆菌与屎肠球菌按照菌数比2:2:1配合使用，进行发酵饲料的生产，实现抗菌、酸化、预消化和降低霉菌毒素等多个功能，应用前景广阔。

附图说明

图1为产蛋白酶菌株的筛选结果；

图2为α-淀粉酶产生菌株的筛选结果；

图3为本发明屎肠球菌菌落形态。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一蛋白酶和淀粉酶高产菌株的筛选

1 试验方法

1.1 产蛋白酶菌株的筛选

初筛：采用酪蛋白平板水解透明圈法，将分离纯化后的菌株点种于酪蛋白培养基平板，于恒温箱内培养48h，挑取产生水解透明圈的菌落(如图1所示)，测定L值(L值＝透明圈直径/菌落直径)后，4℃保存备用。

复筛：经初筛得到产生透明圈的菌株，吸取1mL菌悬液(10⁸CFU/mL)接种于发酵培养基中，搅拌均匀，自然pH值，于37℃的培养箱中培养24h后测定蛋白酶活力。酶活力测定：取待测酶液。40℃恒温水浴2min，加入酪素2mL(摇匀)，40℃恒温水浴10min，然后加入三氯乙酸4mL(摇匀)，离心取上清液，测OD275nm值。同时作空白对照。

1.2 α-淀粉酶产生菌株的筛选

初筛：把菌株接种到已灭菌的淀粉琼脂培养基上，37℃静置培养24h后，转接入装有25mL该培养基的液体三角瓶中，以37℃、220r/min摇床培养24h。取1mL培养液用无菌水梯度稀释，各取0.15mL菌悬液分别涂布于平板分离培养基，37℃培养24h，在平板上喷洒碘液，将有透明圈的单菌落挑出(如图2所示)，进一步划线分离后，挑至斜面保藏培养基上，37℃培养24h，于4℃下保存。

复筛：取1环初筛菌种接入种子培养基，于37℃、220r/min摇床培养24h。取1mL接入固态产酶培养基，于30℃恒温培养72h后测定α-淀粉酶酶活，并于4℃下保存活性最佳的菌种。

酶活的测定方法：取底物5mL在40℃水浴预热10min，加入0.5mL酶液，准确保温5min，取0.5mL混合液加入5mL 0.1mol/L的H₂SO₄终止反应，从中取0.5mL加入5mL稀碘液显色，在660nm处测定吸光值。以0.5mL缓冲液代替0.5mL的酶液为对照，以蒸馏水作为比色的空白。

2 实验结果

2.1 初筛从30株细菌中初筛得到产生酪蛋白水解圈菌株共15株，占全部测试菌株的50％。初步测定其L值(见表1)，数据显示，其中菌株Y27的L值最大，为3.01。

2.2 复筛及酶活测定将挑选出L值较大的5株菌，发酵培养后测定其蛋白酶活性(见表2)，5株菌中，L值和酶活都较大的菌株是Y27，其L值为3.01，蛋白酶活是324.72U/mL。

2.3 α-淀粉酶产生菌株的筛选经产淀粉酶实验发现，共有9株菌产α-淀粉酶，占测试菌株的30％。进一步复筛发现，Y8、Y20和Y27产α-淀粉酶活力较好，其中Y27菌株产酶较高，酶活达到225.76U/g，其中酶活较低的是Y30菌株，酶活为67.9U/g，结果见表3。综合比较供试菌株的产酶能力，则蛋白酶和α-淀粉酶活性最高的是菌株Y27。

表1 产蛋白酶菌株初筛

表2 菌株的复筛

表3 α-淀粉酶活性测定结果

2.4 菌株的鉴定

通过gyrB基因序列鉴定，Y27菌株的基因序列(SEQ ID NO.1)与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的相似性为99％，确定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。菌株于2017年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.14441。

实施例2 高产酸乳酸菌的筛选

1 试验方法

1.1 产酸菌株筛选

结合富集培养法与溶钙圈试验从健康鸡肠道中分离到5株产酸菌株，将纯化菌株接种至5mL灭菌MRS肉汤培养基中，37℃厌氧发酵24h后检测发酵液离心上清(4℃，5000g，10min)的pH及乳酸含量。

测定乳酸含量时，先于560nm紫外光下测定乳酸标准液(10、20、30、40和50mg/L)的吸光度值，接着以乳酸标准液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制曲线。样品液处理时，首先在40mL离心上清液中加入4g活性炭，于65℃水浴搅拌脱色40min后滤纸过滤，接着反复处理滤液数次，直到滤液变澄清为止，此澄清溶液即为有机酸粗提液最后参照梁等开发的乳酸测定法预处理MRS肉汤发酵上清，再以蒸馏水做空白对照，于560nm测定样品发酵液的吸光度值。

表4 乳酸菌发酵液的pH及其发酵液中乳酸含量(mg/L)

1.2 高产乳酸菌株的分子生物学鉴定

16SDNA序列分析：上述YB-5细菌总DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化(北京)科技有限公司，Tiangen DP302-02)提取。16S rDNA扩增引物采用细菌通用引物，其引物序列为：正向引物为27F(对应于Escherichia coil 8-27位碱基)：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3'；反向引物为1495R(对应于Escherichia coil 1495-1515位碱基)：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。反应体系(50μL)如表2所示：

表5 PCR扩增体系

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min；58℃退火1min；72℃延伸2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度约1500bp的阳性产物经纯化后送睿博兴科生物技术(北京)有限公司进行序列测定，YB-5细菌的16S rRNA的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列。

得到的基因序列(SEQ ID NO.2)在GenBank数据库中进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比对。鉴定结果发现YB-5与屎肠球菌(Enterococcus faecium)的同源性为99％，确定为Enterococcus faecium。菌株于2014年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.9666，其分类命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，其菌落形态如图3所示。

实施例3 高效固体发酵菌种的组合配伍研究

(一)枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌固体发酵料中的组合配比实验

以玉米豆粕为培养基，接种枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的不同比例组合，通过测定固体发酵后菌数的变化确定两菌种之间的最适添加比例。按照1吨发酵底物加100g总菌数200亿的菌粉进行配比，分组设计见下表6。准确称取100g玉米豆粕(7:3)7份，用报纸包好，120℃，灭菌30min。将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌按相应比例加入灭菌的玉米豆粕中，充分搅拌均匀，并加入水使最终玉米豆粕培养基的含水量为40％。放入37℃培养箱中，培养36h。利用混合平板计数法计算各试验组的总菌数。

表6 分组设计

由表6和7可看出，七个组合中第四组发酵后总菌数最高，此结果说明第四组中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的比例最适合，可以相互配伍提高固体发酵的菌种增殖能力。

表7 发酵后活菌数

(二)屎肠球菌与芽孢杆菌在固体发酵料中的组合配比实验

本次以筛选到高产乳酸的屎肠球菌结合高产中性蛋白酶和淀粉酶的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在实验室将三种菌以不同比例组合，对饲料进行发酵，通过发酵后的pH、总菌数和饲料分解率等指标，评定不同菌种比例对饲料的发酵分解效果，确定发酵饲料型复合微生态制剂的最适组合配伍。按照1吨发酵底物加100g菌数为200亿CFU/g的菌粉进行配比，分组设计见下表8。

表8 分组设计

空白对照组：饲料样中加入与试验组等量的无菌水，将水和料充分搅拌均匀。

试验组：将灭菌的饲料样和按比例充分溶解的菌液倒入烧杯中，再用50ml水冲洗三角瓶，将菌液冲洗干净，全部转移至烧杯中，将水和料充分搅拌均匀。放入37℃培养箱中，培养36h。

表9 各组发酵后菌数及pH值变化

表10 饲料分解率

饲料本身可溶物/％＝(饲料本身物质重—空白干物质重)/饲料本身干物质重×100％；微生物对饲料的分解率/％＝(空白干物质重—样品干物质重)/饲料本身干物质重×100％；

从表3-10复合微生态制剂的组合配伍研究结果表明乳酸菌与芽孢杆菌的比例为2:8时能最大程度的发挥协同作用。

实施例4 利用高效固体发酵菌种发酵的饲料在仔猪上的应用

本试验选用胎次、体重相近，健康状况良好的28日龄断奶的杜×长×大三元杂交猪100头，随机分为2个组，每组分为5个重复，每个重复10头。对照组：饲喂基础日粮，试验组：饲喂利用高效发酵菌种发酵得到的固体发酵料。

试验自断奶仔猪28日龄始，试验期21天。试验前充分冲洗和严格消毒猪圈。试验期间每天喂料5次，采用干拌料，以食槽略剩料为原则。试验猪自由采食、自由饮水。圈舍自然通风，定期打扫，常规接种免疫。

固体发酵料对仔猪生长性能和腹泻率的影响结果见表11。

表11 固体发酵料对仔猪生长性能和腹泻率的影响

注：同行数据后标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(p＞0.05)。结果以平均数±标准差表示，下同。

如表11所示，利用发酵菌种发酵的固体发酵料可显著提高仔猪的平均日增重和平均日采食量，同时降低腹泻率。

固体发酵料对仔猪干物质消化率的影响结果见表12

表12 猪干物质消化率试验结果比较

由表12可见，饲喂固体发酵料的试验组的干物质消化率较对照组提高。

饲喂利用高效固体发酵菌种发酵的饲料能够显著提高仔猪的采食量和平均日增重，料肉比有降低的趋势，降低仔猪腹泻率，提高干物质消化，促进营养物质的吸收与利用，提高机体免疫力进而提升猪场养殖效益，减少环境污染。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 北京科为博生物科技有限公司

<120> 一种复合发酵菌剂及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1113

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

cacggttgac atcttcaccg cttccggtgc caagggcggt gatcatagaa cgaacctcat 60

tgttggacaa tattttgtcc aggcgggctt tttcgacgtt caaaattttc cctctcaaag 120

gcaaaattgc ttggaaatga cggtcgcggc cctgttttgc cgatccgccc gcagagtcac 180

cctcaacgat gtaaagttcg gaaatcgtcg ggtctttaga agaacagtca gcaagtttcc 240

ccggcagatt ggacacttca agggcgcttt ttctgcgcgt caattcgcgt gctttctttg 300

cagccatccg tgctctggcg gccataaccc ctttttcaac gatttttttc gctgaatccg 360

ggttttctag cagaaacttt tcaagcgctt ctgaaaatag cgcatctgtt atcgtacgcg 420

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ctttgaatac gccgtttctt ctcgcgtaat cattgatgac cctcgtcaaa ccggtcttaa 600

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cttcaatata gaccggctct tcatgaataa cttcccgcga acggttcaag tgttcaacat 780

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<210> 2

<211> 1463

<212> DNA

<213> 屎肠球菌(Enterococcus Faecium)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgtac 60

gcttcttttt ccaccggagc ttgctccacc ggaaaaagag gagtggcgaa cgggtgagta 120

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ttcatccctt gacggtatct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgt 540

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tctagagata gggcttcccc ttcgggggca aagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgttagttgc 1080

catcattcag ttgggcactc tagcaagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggaagtac 1200

aacgagttgc gaagtcgcga ggctaagcta atctcttaaa gcttctctca gttcggattg 1260

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Claims

1.一种复合发酵菌剂，其特征在于，以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和屎肠球菌为活性成分，将三者按照菌数比1～5：1～5：0.5～5的比例配合而成，总菌数为20-200亿CFU/g。

2.根据权利要求1所述的复合发酵菌剂，其特征在于，所述屎肠球菌EnterococcusFaecium高产乳酸，保存编号CGMCC No.9666；所述地衣芽孢杆菌高产中性蛋白酶和淀粉酶，保存编号为CGMCC No.14441；所述枯草芽孢杆菌在固体发酵时能降低饲料中黄曲霉毒素含量，保存编号为CGMCC No.14442。

3.根据权利要求1所述的复合发酵菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的生产方法包括如下步骤：

1)将枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌接种于一级斜面培养基上，于24～37℃下培养24～36小时，得到一级芽孢杆菌菌落；培养基组成：牛肉浸膏2.5～5.0g，大豆蛋白胨5.0～15.0g，酵母膏1.0～5.0g，氯化钠1.0～5.0g，葡萄糖5.0～10.0g，琼脂5.0～20g，蒸馏水1000ml，pH为6.5～7.5；

2)将培养的一级芽孢杆菌菌落接种于二级培养液中，装液量为150ml/500ml，在30～37℃、110～220转/分的条件下培养15～20小时，得到二级芽孢杆菌种子液；二级培养液配制比例：蛋白胨5.0～15g，牛肉膏1.0～5.0g，氯化钠1.0～5.0g，蒸馏水1000mL，pH为6.5～7.5；

3)将二级芽孢杆菌种子液以0.1％～0.5％重量比接种于发酵罐中，采用常规方法在培养基上于30～37℃、110～220转/分的条件下培养24～36小时，得到三级芽孢杆菌种子液；培养基组成：玉米粉0.1～0.5％，葡萄糖0.1～1.0％，豆饼粉0.1～5.0％，鱼粉0.1～0.5％，碳酸钙1.0～5.0％，硫酸铵0.01～0.05％，磷酸氢二钾0.01～0.05％，硫酸镁0.01～0.05％和硫酸锰0.01～0.05％；

4)发酵罐通蒸汽于100～150℃保温灭菌40～60分钟后，将发酵底物粉碎到80目放入发酵罐中，再加入水，所加入水的重量与发酵底物重量之比为80～120：1～10，然后通高压蒸汽升温至100～150℃，并保温40～60分钟后自然冷却40～60分钟，通冷却水冷却至20～40℃，无菌条件下接入三级枯草芽孢杆菌种子液，以重量比计，接种量为0.1～1.0％，罐压为0.05MPa，搅拌转速为120～220转/分，以体积比计，通风比为0.5～1：0.5～1，发酵时间为24～48小时；检测发酵液活菌数为l.35×10¹⁰CFU/ml；以重量比计，所述的发酵底物包含：酵母粉1％～5％、3％的豆粕水解液1％～5％、葡萄糖0.1～1.5％、玉米淀粉0.1～1.5％、碳酸钙0.1～1.0％，pH为7.0-7.5；该发酵液通过过滤即为含量达到10¹⁰CFU/ml的液体芽孢杆菌。

4.根据权利要求1所述的复合发酵菌剂，其特征在于，所述屎肠球菌的生产方法包括如下步骤：

1)用MRS培养基为种子培养基，在35～45℃有氧或兼性条件下培养屎肠球菌18～24小时，成为一级种子；

2)将步骤1)所获得的一级种子液接种在种子罐中进行扩大培养，采用MRS培养基为种子培养基，在35～45℃有氧或兼性条件下培养18～24小时，成为二级种子；

3)将步骤2)所获得的二级种子液接种在发酵罐中进行发酵培养，采用改良的MRS培养基为发酵培养基，在30～45℃有氧或兼性条件下，采用定时或连续补料分批发酵方式培养18～36小时。

5.根据权利要求4所述的复合发酵菌剂，其特征在于，所述步骤3)中的改良MRS培养基是在每升MRS培养基中加有大豆蛋白胨5～30g，葡萄糖1～10g，酵母粉1～10g，乙酸钠1～10g，拧檬酸二胺0.1～8g，Tween80 0.1～5g，磷酸氢二钾0.1～5g，硫酸镁0.05～lg，硫酸锰0.001～0.2g，碳酸钙1～30g，纯净水1升，调节pH值5.5～7.5。

6.权利要求1-5任一项所述的复合发酵菌剂在发酵固体培养基中的应用。

7.根据权利要求6所述的复合发酵菌剂在发酵固体培养基中的应用，其特征在于，将所述复合发酵菌剂按质量比5-15％的接种量加入固体发酵料中用于固体发酵。

8.根据权利要求7所述的复合发酵菌剂在发酵固体培养基中的应用，其特征在于，用于固体发酵的具体的生产方法包括如下步骤：

1)取发酵菌种和碳源加入30～40℃水中，充分搅拌，放置5-12小时；

2)步骤1)得到溶液加入固体发酵料中，并补加水使固体发酵料的含水量在35％～40％之间，发酵12小时到36小时即可。