CN102559560A - 一种发酵后高产乳酸的地衣芽孢杆菌及其制剂和应用 - Google Patents
一种发酵后高产乳酸的地衣芽孢杆菌及其制剂和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物应用领域，具体地，涉及一种发酵后高产乳酸的地衣芽孢杆菌及其制剂和应用。本发明提供了一种发酵后高产乳酸的地衣芽孢杆菌CRVAB001(Bacillus licheniformis)，其保藏编号为：CGMCC No.4850。本发明还提供了一种微生态液体制剂，包含上述的地衣芽孢杆菌。本发明还提供了一种上述微生态液体制剂的制备方法。本发明还提供了一种微生态粉剂，包含上述的地衣芽孢杆菌。本发明还提供了一种上述微生态粉剂的制备方法。本发明的地衣芽孢杆菌可高效快速发酵产乳酸，具有较强的工业应用前景。本发明液体制剂中的活菌含量可达1×1010CFU/mL以上，粉剂中的活菌含量可达1×1011CFU/g以上，充分地保证了地衣芽孢杆菌制剂的有效性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，具体地，涉及一种发酵后高产乳酸的地衣芽孢杆菌及其制剂和应用。
背景技术
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是我国农业部2008年1126号公告批准使用的饲料级菌株之一。地衣芽孢杆菌属于能够产生芽孢的兼性厌氧微生物。菌体繁殖速度快、抗逆性强，并且能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸。与乳酸菌和双歧杆菌等相比，芽孢杆菌的优点在于它对外界不良环境有很强的抵抗力，与同为芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌相比，地衣芽孢杆菌生长温度高5～7℃；其次，其生长速率适中，容易使刚跨膜的未合适折叠的蛋白充分折叠；此外，地衣芽孢杆菌分泌蛋白至培养基中的能力大约是枯草芽孢杆菌的2倍，异源蛋白表达水平已报道达到20～25mg/mL，为所见报道的所有芽孢杆菌中表达水平最高者。地衣芽孢杆菌治疗下痢和腹泻效果很好，是制造微生态制剂的理想菌株。在我国，沈阳第一制药于1992年上市销售的“整肠生”，其主要成分就为地衣芽孢杆菌，抗腹泻效果显著，而且无副作用。
目前芽孢杆菌的生产工艺主要有两种：固体发酵法和液体发酵法。固体发酵法产量低，劳动强度大，易污染，但投资较少。目前国内许多小规模的芽孢杆菌生产厂家多采用这种生长方式，生产水平参差不齐，产品活菌数从每克几十亿到几百亿不等。液体发酵工艺具有产量大、机械化程度高、易于监控、深层发酵转化率高的优点，但是设备投资高，动力消耗较大。这种生产方式产品质量稳定，通过离心浓缩得到的芽孢杆菌产品，其活菌数最高可以达到每克一万亿以上。
CN101986865A公开了一种地衣芽孢杆菌的制备方法，采用三级液体深层发酵，连续补料分批发酵，芽孢率可以达到90％以上。液体发酵易于控制，减少污染，但是该专利并未披露利用该技术发酵的地衣芽孢杆菌的活菌数。专利CN1202522A公开了一株地衣芽孢杆菌及其微生态制剂，该法利用固体发酵法或者液体发酵法发酵地衣芽孢杆菌，操作简单，易于实现，但是该法属于实验室研发阶段，不利于大生产的推广。专利CN102021131A公开了一种地衣芽孢杆菌液体制剂的制备方法，液体深层发酵，活菌数2×109CFU/mL时，获得所需要的发酵液，该法制备属于典型的液体发酵，发酵液可用来防治西瓜枯萎病；液体发酵法不易染菌，但是该工艺制备的活菌数较低。专利CN102120972A公开了一种地衣芽孢杆菌的制备方法，该法采用三个温度梯度对地衣芽孢杆菌冻干菌粉进行复苏，复苏后的地衣芽孢杆菌经斜面、三角瓶、发酵罐后制备发酵液，发酵液经60±2℃热风循环烘干，经过三级复苏后制备的地衣芽孢杆菌菌粉，活菌数高，而且该发酵法后处理操作简单，但是热烘干耗时太长，活菌数损失较大。王新磊等(2010)研究了地衣芽孢杆菌转化淀粉生产乳酸的发酵条件，优化后产乳酸量高，产酸速率快，但没有披露活菌数及芽孢形成率。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种发酵后高产乳酸的地衣芽孢杆菌CRVAB001。
本发明的另一目的是提供一种微生态液体制剂。
本发明的另一目的是提供上述微生态液体制剂的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种微生态粉剂。
本发明的另一目的是提供上述微生态粉剂的制备方法。
本发明分离筛选出一种产乳酸的地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌CRVAB001(Bacillus licheniformis)。该菌株于2011年5月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.4850。
本发明提供了一种微生态液体制剂，包含上述的地衣芽孢杆菌CRVAB001。
本发明还提供了上述微生态液体制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)菌体一级斜面培养：将地衣芽孢杆菌CRVAB001接种于斜面培养基培养，于30～45℃下培养18～36小时获得菌体一级斜面；
2)菌体二级液体培养：将步骤1)所得菌体一级斜面接种于液体培养基培养，在30～45℃、150～250r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌液，菌数≥1.0×1010CFU/mL时停止培养，获得菌液；
3)菌体三级种子液培养：将步骤2)所得菌液以1％～5％接种量(重量/重量)接种于液体培养基，于30～45℃、150～250r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌种子液，活菌数≥1.0×1010CFU/mL时停止培养，获得种子液；
4)液体发酵：先用蒸汽对罐体空消20～40min，然后将发酵培养基加入发酵罐中，通高压蒸汽升温至110～130℃，并保温20～40min，之后通冷却水冷却至30～45℃，无菌条件下将步骤3)所得种子液接种于发酵培养基中，接种量为2％～5％(重量/重量)，罐压0.03～0.10MPa，发酵温度30～45℃，转速150～250r/min，采用需氧—厌氧转换发酵，发酵开始的前6小时通气比为1∶0.8，7～14小时通气比为1∶1，进行需氧发酵(合理的通气比保证溶氧值不低于20％，有助于菌体发酵和芽孢的形成)，需氧发酵阶段，0～8小时，溶氧20％，9～14小时，溶氧35％；14小时后停止供氧，间歇搅拌，进行厌氧发酵，活菌数≥1×1010CFU/mL，芽孢形成率达到90％以上，乳酸含量≥30g/L，停止发酵，收集发酵液，获得微生态液体制剂。
其中，所述斜面培养基配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，水1000mL，pH 7.0～7.5，无菌。
根据本发明的微生态液体制剂的制备方法，其中，所述液体培养基配方为：按重量百分比计算，玉米粉0.5％～4.0％、豆粕0.5％～2.0％、鱼粉0.1％～0.5％、葡萄糖0.1％～1.0％、硫酸镁0.01％～0.1％、硫酸锰0.01％～0.05％，水余量，pH 7.0～7.5，无菌。
根据本发明的微生态液体制剂的制备方法，其中，所述液体培养基配方为：按重量百分比计算，葡萄糖5％～10％、玉米浆0.03％～0.07％、硫酸铵0.05％～0.20％、MgSO4 0.01％～0.03％、FeSO4 0.001～0.003％、NaCl 0.1％～0.5％、CaCO3 1％～5％、KH2PO4 0.06％～0.16％、水余量，无菌。
本发明还提供了一种微生态粉剂，包含上述的地衣芽孢杆菌CRVAB001。
本发明还提供了一种微生态粉剂的制备方法，包括以下步骤：
1)菌体一级斜面培养：将地衣芽孢杆菌CRVAB001接种于斜面培养基培养，于30～45℃下培养18～36小时获得菌体一级斜面；
2)菌体二级液体培养：将步骤1)所得菌体一级斜面接种于液体培养基培养，在30～45℃、150～250r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌液，菌数≥1.0×1010CFU/mL时停止培养，获得菌液；
3)菌体三级种子液培养：将步骤2)所得菌液以1％～5％接种量(重量/重量)接种于液体培养基，于30～45℃、150～250r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌种子液，活菌数≥1.0×1010CFU/mL时停止培养，获得种子液；
4)液体发酵：先用蒸汽对罐体空消20～40min，然后将发酵培养基加入发酵罐中，通高压蒸汽升温至110～130℃，并保温20～40min，之后通冷却水冷却至30～45℃，无菌条件下将步骤3)所得种子液接种于发酵培养基中，接种量为2％～5％(重量/重量)，罐压0.03～0.10MPa，发酵温度30～45℃，转速150～250r/min，采用需氧—厌氧转换发酵，发酵开始的前6小时通气比为1∶0.8，7～14小时通气比为1∶1，进行需氧发酵，需氧发酵阶段，0～8小时，溶氧20％，9～14小时，溶氧35％；14小时后停止供氧，间歇搅拌，进行厌氧发酵，活菌数≥1×1010CFU/mL，芽孢形成率达到90％以上，乳酸含量≥30g/L，停止发酵，收集发酵液。
5)盐析：向步骤4)所得发酵液中加入1％～5％(g/mL)磷酸氢二钠、1％～5％(g/mL)氯化钙、1％～5％(g/mL)氢氧化钠的水溶液，搅拌30～60min；
6)过滤：向步骤1)的溶液中加入助滤剂，搅拌10～20min，静置10～90min，进入板框过滤机过滤，过滤温度为30～50℃，过滤压力为3～5kg/cm2，板框过滤的物料水分保持在30％～50％(重量比)，获得滤饼，
其中，所述助滤剂为，按重量百分比计算，1％～6％轻质碳酸钙、1％～5％珍珠岩和1％～5％硅藻土中的一种或几种；
将所得滤饼直接进行干燥，优选进入闪蒸干燥机干燥，进风温度为120～180℃，进料速度为80～200r/min，物料出口温度为60～90℃，最终物料水分为0.5％～10％(重量比)，获得微生态粉剂。
本发明还提供了上述微生态液体制剂作为饲料添加剂及在改善养殖水体环境方面的应用。
本发明还提供了上述微生态粉剂作为饲料添加剂及在改善养殖水体环境方面的应用。
本发明的含地衣芽孢杆菌的微生态液体制剂或粉剂的使用方法为：
1)将地衣芽孢杆菌液体制剂或粉剂与饲料混合或拌料；在猪的全价料中的添加比例为0.1‰～2‰(重量/重量)；在肉鸡和肉鸭全价料中的添加比例为0.1‰～2‰(重量/重量)；在蛋鸡和蛋鸭料中的添加比例为0.1‰～2‰(重量/重量)；在牛和羊等反刍动物精料中的添加比例为0.2‰～3‰(重量/重量)；在水产动物饲料中的添加比例为500～1000g/(亩·米)；
2)也可直接口服或加入水中饮用。
本发明提供的两种地衣芽孢杆菌微生态制剂，它们分别达到了以下的质量标准：
液体制剂为棕黄色液体，较浓的酸香味；活菌数≥1×1010CFU/mL，芽孢形成率≥90％，乳酸含量≥30g/L；铅(以Pb计)≤40mg/kg，无机砷(以As计)≤10mg/kg，氟(以F计)≤1000mg/kg，沙门氏菌未见检出，符合国家饲料卫生标准。
粉剂为淡黄白色粉末；活菌数≥1×1011CFU/g；干燥粉剂水分含量为0.5％～10％；铅(以Pb计)≤40mg/kg，无机砷(以As计)≤10mg/kg，氟(以F计)≤1000mg/kg，沙门氏菌未见检出，符合国家饲料卫生标准。
本发明的含地衣芽孢杆菌的微生态液体制剂或粉剂及其制备方法与现有技术相比具有以下显著的优点：
1)本发明的地衣芽孢杆菌CRVAB001，可分解多种糖产酸，产生蛋白酶和淀粉酶，耐高温，耐酸，在高盐浓度下可以生长；
2)本发明采用液体深层发酵法，使得制备工艺的效率得到大大提高，通过进一步优化各步骤采用的培养基的组成以及发酵工艺条件，使得最终产品中的地衣芽孢杆菌的活菌含量被大幅度提高，其中液体制剂中的活菌含量可达1×1010CFU/mL以上，粉剂中的活菌含量可达1×1011CFU/g以上，充分地保证了地衣芽孢杆菌制剂的有效性；
3)本发明所用地衣芽孢杆菌可高效快速利用葡萄糖等糖源发酵产乳酸，具有较强的工业应用前景；
4)本发明所用的液体深层发酵法，采用需氧—厌氧转换发酵方式，利于地衣芽孢杆菌产乳酸的积累；
5)本发明制备的地衣芽孢杆菌制剂耐酸、耐胆盐，在肠道环境中保持高效稳定，为地衣芽孢杆菌制剂的广泛推广使用奠定了基础；
6)本发明的地衣芽孢杆菌制剂中地衣芽孢杆菌的芽孢形成率高，成孢率≥90％，更耐高温，便于加工和保存；
7)本发明的地衣芽孢杆菌制剂无毒副作用、无耐药性、无残留，成本低、效果显著；
8)本发明的地衣芽孢杆菌制剂，用作饲料添加剂中可以提高动物生产性能；用在养殖水体中，可改善养殖环境。
附图说明
地衣芽孢杆菌CRVAB001(Bacillus licheniformis)，于2011年5月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.4850。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1地衣芽孢杆菌CRVAB001(Bacillus licheniformis)的菌株分离、纯化
分别从肉仔鸡、蛋鸡、仔猪、母猪的胃肠道采集样品，在实验室进行微生物分离、纯化，从中分离到114株芽孢杆菌，经过耐酸、耐胆盐、耐蛋白酶及耐温等抗逆性试验筛选出12株芽孢杆菌，再通过产乳酸试验筛选出1株高产乳酸菌株，经气相色谱测定其乳酸含量可达20μg/mL。该菌株编号为CRVAB001，经16S rRNA基因序列鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。该菌株于2011年5月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.4850。
实施例2地衣芽孢杆菌CRVAB001(Bacillus licheniformis)的生物学特征
细菌形态及理化特征鉴定依据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行。该地衣芽孢杆菌CRVAB001显微形态和理化特征试验结果如下表1所示。
表1地衣芽孢杆菌细菌形态和理化试验结果
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 碳水化合物产酸 | |
| 细菌形状 | 杆状 | 葡萄糖 | + |
| 细胞直径＞1μm | - | ***糖 | + |
| 形成芽孢 | + | 木糖 | + |
| 芽孢膨大 | - | 甘露醇 | + |
| 芽孢圆形 | - | 乳糖 | - |
| 接触酶 | + | 发酵葡萄糖产气 | - |
| 氧化酶 | + | 淀粉水解 | + |
| 厌氧生长 | + | 酪素水解 | + |
| VP试验 | + | 利用柠檬酸盐 | + |
| VP菌液pH＞7 | - | 50℃生长 | + |
| VP菌液pH＜6 | + | 7％NaCl生长 | + |
| MR试验 | + | pH 5.7生长 | + |
| 硝酸盐还原试验 | + |
实施例3制备新型地衣芽孢杆菌液剂-Y1
1)地衣芽孢杆菌一级斜面培养：采用常规方法将地衣芽孢杆菌CRVAB001接种于斜面培养基，于30℃下培养36小时得到地衣芽孢杆菌一级斜面；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L)：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，水1000mL，pH 7.0～7.5；
2)地衣芽孢杆菌二级液体培养：将步骤1)获得的地衣芽孢杆菌一级斜面接种于液体培养基，在30℃、250r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌液，活菌数≥1×1010CFU/mL时停止培养；其中，按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：玉米粉4.0％、豆粕2.0％、鱼粉0.5％、葡萄糖1.0％、硫酸镁0.1％、硫酸锰0.05％，pH 7.0～7.5；
3)地衣芽孢杆菌三级种子液培养：将步骤2)得到的地衣芽孢杆菌液以1％接种量(重量/重量)接种于种子培养基，于30℃、250r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌种子液，活菌数≥1×1010CFU/mL；按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：玉米粉4.0％、豆粕2.0％、鱼粉0.5％、葡萄糖1.0％、硫酸镁0.1％、硫酸锰0.05％，pH 7.0～7.5；
4)地衣芽孢杆菌液体发酵：先用蒸汽对罐体空消40min，将发酵培养基放入发酵罐中，然后通高压蒸汽升温至110℃，并保温40min，之后通冷却水冷却至30℃，无菌条件下接种入步骤3)所述的地衣芽孢杆菌种子液，接种量为2％(重量/重量)，罐压0.03MPa，发酵温度30℃，转速250r/min，采用需氧—厌氧转换发酵：发酵开始的前6小时通气比为1∶0.8，7～14小时通气比为1∶1，进行需氧发酵，需氧发酵阶段，0～8小时，溶氧20％，9～14小时，溶氧35％；14小时后停止供氧，间歇搅拌，进行厌氧发酵，活菌数≥1×1010CFU/mL，芽孢形成率达到90％以上，乳酸含量≥30g/L，停止发酵；其中，按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：葡萄糖10％、玉米浆0.07％、硫酸铵0.20％、MgSO4 0.03％、FeSO4 0.003％、NaCl 0.5％、CaCO3 5％、KH2PO4 0.16％。该地衣芽孢杆菌发酵液可以直接作为地衣芽孢杆菌液体制剂。
实施例4制备地衣芽孢杆菌液体制剂-Y2
1)地衣芽孢杆菌一级斜面培养：采用常规方法将地衣芽孢杆菌CRVAB001接种于斜面培养基，于45℃下培养18小时得到地衣芽孢杆菌一级斜面；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L)：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，水1000mL，pH 7.0～7.5；
2)地衣芽孢杆菌二级液体培养：将步骤1)获得的地衣芽孢杆菌一级斜面接种于液体培养基，在45℃、150r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌液，活菌数≥1×1010CFU/mL时停止培养；其中，按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：玉米粉0.5％、豆粕0.5％、鱼粉0.1％、葡萄糖0.1％、硫酸镁0.01％、硫酸锰0.01％，pH 7.0～7.5；
3)地衣芽孢杆菌三级种子液培养：将步骤2)得到的地衣芽孢杆菌液以5％接种量(重量/重量)接种于种子培养基，于45℃、150r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌种子液，活菌数≥1×1010CFU/mL；按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：玉米粉0.5％、豆粕0.5％、鱼粉0.1％、葡萄糖0.1％、硫酸镁0.01％、硫酸锰0.01％，pH 7.0～7.5；
4)地衣芽孢杆菌液体发酵：先用蒸汽对罐体空消20min，将发酵培养基放入发酵罐中，然后通高压蒸汽升温至130℃，并保温20min，之后通冷却水冷却至45℃，无菌条件下接种入步骤3)所述的地衣芽孢杆菌种子液，接种量为5％(重量/重量)，罐压0.10MPa，发酵温度45℃，转速150r/min，采用需氧—厌氧转换发酵：发酵开始的前6小时通气比为1∶0.8，7～14小时通气比为1∶1，进行需氧发酵，需氧发酵阶段，0～8小时，溶氧20％，9～14小时，溶氧35％；14小时后停止供氧，间歇搅拌，进行厌氧发酵，活菌数≥1×1010CFU/mL，芽孢形成率达到90％以上，乳酸含量≥30g/L，停止发酵；其中，按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：葡萄糖5％、玉米浆0.03％、硫酸铵0.05％、MgSO4 0.01％、FeSO4 0.001％、NaCl 0.1％、CaCO3 1％、KH2PO4 0.06％。该地衣芽孢杆菌发酵液可以直接作为地衣芽孢杆菌液体制剂。
实施例5制备地衣芽孢杆菌液体制剂-Y3
1)地衣芽孢杆菌一级斜面培养：采用常规方法将地衣芽孢杆菌CRVAB001接种于斜面培养基，于35℃下培养20小时得到地衣芽孢杆菌一级斜面；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L)：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，水1000mL，pH 7.0～7.5；
2)地衣芽孢杆菌二级液体培养：将步骤1)获得的地衣芽孢杆菌一级斜面接种于液体培养基，在35℃、200r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌液，活菌数≥1×1010CFU/mL时停止培养；其中，按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：玉米粉3.0％、豆粕1.0％、鱼粉0.3％、葡萄糖0.5％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.03％，pH 7.0～7.5；
3)地衣芽孢杆菌三级种子液培养：将步骤2)得到的地衣芽孢杆菌液以3％接种量(重量/重量)接种于种子培养基，于35℃、200r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌种子液，活菌数≥1×1010CFU/mL；按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：玉米粉3.0％、豆粕1.0％、鱼粉0.3％、葡萄糖0.5％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.03％，pH 7.0～7.5；
4)地衣芽孢杆菌液体发酵：先用蒸汽对罐体空消30min，将发酵培养基放入发酵罐中，然后通高压蒸汽升温至126℃，并保温30min，之后通冷却水冷却至35℃，无菌条件下接种入步骤3)所述的地衣芽孢杆菌种子液，接种量为3％(重量/重量)，罐压0.06MPa，发酵温度35℃，转速200r/min，采用需氧—厌氧转换发酵：发酵开始的前6小时通气比为1∶0.8，7～14小时通气比为1∶1，进行需氧发酵，需氧发酵阶段，0～8小时，溶氧20％，9～14小时，溶氧35％；14小时后停止供氧，间歇搅拌，进行厌氧发酵，活菌数≥1×1010CFU/mL，芽孢形成率达到90％以上，乳酸含量≥30g/L，停止发酵；其中，按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：葡萄糖7％、玉米浆0.05％、硫酸铵0.15％、MgSO4 0.02％、FeSO4 0.002％、NaCl 0.3％、CaCO3 3％、KH2PO4 0.11％。该地衣芽孢杆菌发酵液可以直接作为地衣芽孢杆菌液体制剂。
实施例6制备地衣芽孢杆菌液体制剂-Y4
1)地衣芽孢杆菌一级斜面培养：采用常规方法将地衣芽孢杆菌CRVAB001接种于斜面培养基，于37℃下培养24小时得到地衣芽孢杆菌一级斜面；所述的培养基为按下述比例配制的混合物(g/L)：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，水1000mL，pH 7.0～7.5；
2)地衣芽孢杆菌二级液体培养：将步骤1)获得的地衣芽孢杆菌一级斜面接种于液体培养基，在37℃、210r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌液，活菌数≥1×1010CFU/mL时停止培养；其中，按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：玉米粉3.2％、豆粕1.5％、鱼粉0.3％、葡萄糖0.5％、硫酸镁0.015％、硫酸锰0.03％，pH 7.0～7.5；
3)地衣芽孢杆菌三级种子液培养：将步骤2)得到的地衣芽孢杆菌液以2％接种量(重量/重量)接种于种子培养基，于37℃、210r/min的条件下培养得到地衣芽孢杆菌种子液，活菌数≥1×1010CFU/mL；按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：玉米粉3.0％、豆粕1.5％、鱼粉0.3％、葡萄糖0.5％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.03％，pH 7.0～7.5；
4)地衣芽孢杆菌液体发酵：先用蒸汽对罐体空消30min，将发酵培养基放入发酵罐中，然后通高压蒸汽升温至121℃，并保温30min，之后通冷却水冷却至37℃，无菌条件下接种入步骤3)所述的地衣芽孢杆菌种子液，接种量为2％(重量/重量)，罐压0.05MPa，发酵温度37℃，转速210r/min，采用需氧—厌氧转换发酵：发酵开始的前6小时通气比为1∶0.8，7～14小时通气比为1∶1，进行需氧发酵，需氧发酵阶段，0～8小时，溶氧20％，9～14小时，溶氧35％；14小时后停止供氧，间歇搅拌，进行厌氧发酵，活菌数≥1×1010CFU/mL，芽孢形成率达到90％以上，乳酸含量≥30g/L，停止发酵；其中，按重量百分比计算，所述的发酵培养基为按下述比例配制的混合液(％)：葡萄糖8％、玉米浆0.05％、硫酸铵0.10％、MgSO4 0.02％、FeSO4 0.001％、NaCl 0.2％、CaCO3 3％、KH2PO4 0.132％。该地衣芽孢杆菌发酵液可以直接作为地衣芽孢杆菌液体制剂。
实施例7制备地衣芽孢杆菌粉剂-F1
向实施例1制备的地衣芽孢杆菌发酵液中加1％(g/mL)磷酸氢二钠、1％(g/mL)氯化钙、1％(g/mL)氢氧化钠的水溶液后，搅拌30min，再加入1％轻质碳酸钙、1％珍珠岩，搅拌10min，静置10min，然后进入板框过滤机进行过滤，过滤温度为30℃，过滤压力为3kg/cm2，板框过滤的物料水分保持在50％(重量比)；板框过滤后的滤饼直接进入闪蒸干燥机进行干燥，进风温度为180℃，进料速度为200r/min，物料出口温度为90℃，最终物料水分为10％(重量比)，得到的地衣芽孢杆菌的活菌数≥1×1011CFU/g。
实施例8制备地衣芽孢杆菌粉剂-F2
向实施例2制备的地衣芽孢杆菌发酵液中加5％(g/mL)磷酸氢二钠、5％(g/mL)氯化钙、5％(g/mL)氢氧化钠的水溶液后，搅拌60min，再加入6％轻质碳酸钙、1％硅藻土，搅拌20min，静置90min，然后进入板框过滤机进行过滤，过滤温度为50℃，过滤压力为5kg/cm2，板框过滤的物料水分保持在30％(重量比)；板框过滤后的滤饼直接进入闪蒸干燥机进行干燥，进风温度为120℃，进料速度为80r/min，物料出口温度为60℃，最终物料水分为0.5％(重量比)，得到的地衣芽孢杆菌的活菌数≥1×1011CFU/g。
实施例9制备地衣芽孢杆菌粉剂-F3
向实施例3制备的地衣芽孢杆菌发酵液中加3％(g/mL)磷酸氢二钠、3％(g/mL)氯化钙、3％(g/mL)氢氧化钠的水溶液后，搅拌30min，再加入1％珍珠岩、5％硅藻土，搅拌20min，静置40min，然后进入板框过滤机进行过滤，过滤温度为40℃，过滤压力为4kg/cm2，板框过滤的物料水分保持在38％重量比)；板框过滤后的滤饼直接进入闪蒸干燥机进行干燥，进风温度为160℃，进料速度为150r/min，物料出口温度为80℃，最终物料水分为2％(重量比)，得到的地衣芽孢杆菌的活菌数≥1×1011CFU/g。
实施例10制备地衣芽孢杆菌粉剂-F4
向实施例4制备的地衣芽孢杆菌发酵液中加5％(g/mL)磷酸氢二钠、5％(g/mL)氯化钙、5％(g/mL)氢氧化钠的水溶液后，搅拌30min，再加入2％轻质碳酸钙、5％珍珠岩，搅拌20min，静置20min，然后进入板框过滤机进行过滤，过滤温度为42℃，过滤压力为4kg/cm2，板框过滤的物料水分保持在35％(重量比)；板框过滤后的滤饼直接进入闪蒸干燥机进行干燥，进风温度为160℃，进料速度为200r/min，物料出口温度为85℃，最终物料水分为1％(重量比)，得到的地衣芽孢杆菌的活菌数≥1×1011CFU/g。
实施例11地衣芽孢杆菌粉剂的安全性研究
将地衣芽孢杆菌CRVAB001活化后接种于液体培养基，37℃培养24h，取100μL菌液滴加到血平板中，37℃培养48h后观察有否透明圈。选21日龄北京当地柴鸡雏鸡180只，随机分为2组(试验组和对照组)，每组3个重复，每个重复30只鸡，试验组鸡每只肌肉注射1mL地衣芽孢杆菌CRVAB001(1.5×109CFU/mL)，另外每只每天口服1.5×109CFU/mL地衣芽孢杆菌CRVAB001菌液1mL；对照组每只鸡注射1mL蒸馏水并每天口服1mL地衣芽孢杆菌CRVAB001的培养基，14天后解剖。结果发现，血平板培养未见溶血现象；试验组鸡只健康及精神状态良好，采食、饮水、粪便均正常，动物无死亡，14天内未见中毒症状；试验组鸡只解剖时亦未发现鸡只膀胱、肝总管结石；试验组鸡只血常规各项指标均在正常值范围内(见表2)，与对照组之间均无显著性差异；镜下观察试验组肝、脾、肾、法氏囊、十二指肠等均未见病理改变。说明地衣芽孢杆菌CRVAB001对动物安全，无毒副作用，可以在饲料添加剂中放心使用。
表2地衣芽孢杆菌安全性试验结果
实施例12地衣芽孢杆菌液体制剂的产酸性研究
将实施例4制备的地衣芽胞杆菌液体制剂经除蛋白处理，离心过滤后进行离子色谱检测，测定乳酸的含量为32.8g/L。该结果显示，地衣芽孢杆菌CRVAB001具有优良的产乳酸能力。
实施例13地衣芽孢杆菌粉剂的耐酸性研究
动物胃中pH较低，呈现酸性，成年猪胃pH一般为1～2，断奶仔猪胃的pH变异较大，一般为2.60～5.83，食物通过胃的排空时间为2～6h，因此，地衣芽孢杆菌必须能耐受较低的pH，才能在动物消化***发挥作用。将实施例5制备的地衣芽孢杆菌粉剂在人工模拟胃液(pH为2.0、3.0、4.0)中37℃下处理2小时，菌株存活率分别达到90.8％、92.1％和96.3％；在人工模拟胃液(pH为2.0、3.0、4.0)中37℃下处理6小时，菌株的存活率分别达到89.5％、90.5％和95.8％(见表3)；说明该地衣芽孢杆菌制剂可以在经过胃液后并保持相当高的活性而到达肠道。
表3地衣芽孢杆菌粉剂在人工模拟胃液中37℃下处理2或6小时后的存活结果(×1011CFU/g)
实施例14地衣芽孢杆菌粉剂的耐胆盐研究
消化道中分泌的胆汁是地衣芽孢杆菌发挥作用的另一障碍，菌体只有具有较高的胆盐耐受性，才能保持足够的活菌数，从而发挥益生作用，动物小肠中胆汁盐含量波动范围为0.03％～0.3％。将实施例8制备的地衣芽孢杆菌粉剂于0.03％、0.1％、0.2％和0.3％不同浓度的猪胆盐溶液中处理6h后活菌存活率分别为99.8％、98.4％、96.8％和91.5％(见表4)。说明该地衣芽孢杆菌制剂对胆盐有很强的耐受性。
表4地衣芽孢杆菌粉剂在不同猪胆盐处理后的存活结果(×1011CFU/g)
实施例15地衣芽孢杆菌制剂的耐高温研究
将实施例7制备的地衣芽孢杆菌粉剂以0.1‰的比例添加入全价料中进行制粒处理，并检测菌株的存活率。在80、90和100℃下制粒处理10分钟，地衣芽孢杆菌存活率分别在97.2％、92.1％和82.4％(见表5)。说明该地衣芽孢杆菌可以耐受高温制粒处理而保持良好的活性。
表5地衣芽孢杆菌制剂在不同制粒温度下处理10分钟后的存活率(×1011CFU/g)
实施例16地衣芽孢杆菌制剂的储存稳定性研究
以4％的重量比将实施例7制备的地衣芽孢杆菌粉剂在预混料中贮存3个月、6个月和12个月，其菌株存活率分别为97.8％、90.1％和79.8％(见表6)，说明该地衣芽孢杆菌制剂的储存性良好，可以在一定的时期内保持较高的活菌数量，保证制剂的活性。
表6地衣芽孢杆菌粉剂在预混料中贮藏3、6和12个月后的菌株存活率(×1011CFU/g)
实施例17地衣芽孢杆菌制剂在动物生产中的应用
将160只AA肉仔鸡随机分为对照组和地衣芽孢杆菌组，每组4个重复，每重复20只鸡，对照组饲喂普通玉米—豆粕型日粮作为基础日粮，试验组在基础日粮中添加实施例8制备的地衣芽孢杆菌粉剂，按0.3％添加量添加，试验期为21天。结果表明(见表7)，与对照组相比，在7、14、21日龄地衣芽孢杆菌制剂组的日增重提高，日采食量和料肉比，其中，地衣芽孢杆菌制剂极显著降低7日龄肉仔鸡的平均采食量(P＜0.01)。
表7地衣芽孢杆菌对1～21日龄肉仔鸡生产性能的影响
同行数据后标有不同小写字母标示差异显著(P＜0.05)；标有不同大写子母表不差异极显著(P＜0.01)。
实施例18地衣芽孢杆菌制剂在养殖水体中的应用
养殖环境中的氨氮、亚硝酸盐和硫化氢等有毒有害物质使养殖水体恶化，对水环境生态良性循环起到严重破坏，而研究报道，使用微生态制剂对养殖水体具有很好的改善作用。在养殖池塘进水消毒后3天，对照组不使用地衣芽孢杆菌，试验组按1.5mg/L的用量施加实施例8制备的地衣芽孢杆菌制剂(活菌含量1.24×1011CFU/g)，试验持续5个月，放苗后每10天使用1次地衣芽孢杆菌，用量为0.75mg/L。放苗后每20天测定1次养殖池塘水体的氨氮和亚硝酸氮含量。结果显示，对照组的氨氮和亚硝酸氮浓度随养殖时间推移不断升高；与对照组相比，试验组呈明显的下降趋势，自养殖35天后其氨氮和亚硝酸氮浓度始终保持在较低水平，其平均值分别为0.12和0.015mg/L，显著低于对照组(P＜0.05)。说明地衣芽孢杆菌对于养殖水体的改善具有良好的效果。
Claims (9)
1.一种发酵后高产乳酸的地衣芽孢杆菌CRVAB001(Bacillus licheniformis)，其特征在于，保藏编号为：CGMCC No.4850。
2.一种微生态液体制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌CRVAB001。
3.一种微生态液体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌体一级斜面培养：将保藏编号为CGMCC No.4850的地衣芽孢杆菌CRVAB001接种于斜面培养基培养，获得菌体一级斜面；
2)菌体二级液体培养：将步骤1)所得菌体一级斜面接种于液体培养基培养，活菌数≥1.0×1010CFU/mL时停止培养，获得菌液；
3)菌体三级种子液培养：将步骤2)所得菌液接种于液体培养基培养，活菌数≥1.0×1010CFU/mL时停止培养，获得种子液；
4)液体发酵：将步骤3)所得种子液接种于发酵培养基中，采用需氧—厌氧转换发酵，发酵开始的前6小时通气比为1∶0.8，7～14小时通气比为1∶1，活菌数≥1×1010CFU/mL，芽孢形成率达到90％以上，乳酸含量≥30g/L，停止发酵，收集发酵液，获得微生态液体制剂。
4.根据权利要求3所述微生态液体制剂的制备方法，其特征在于，所述液体培养基配方为：按重量百分比计算，玉米粉0.5％～4.0％、豆粕0.5％～2.0％、鱼粉0.1％～0.5％、葡萄糖0.1％～1.0％、硫酸镁0.01％～0.1％、硫酸锰0.01％～0.05％，水余量，pH 7.0～7.5。
5.根据权利要求3所述微生态液体制剂的制备方法，其特征在于，所述液体培养基配方为：按重量百分比计算，葡萄糖5％～10％、玉米浆0.03％～0.07％、硫酸铵0.05％～0.20％、MgSO4 0.01％～0.03％、FeSO4 0.001～0.003％、NaCl 0.1％～0.5％、CaCO3 1％～5％、KH2PO4 0.06％～0.16％、水余量。
6.一种微生态粉剂，其特征在于，包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌CRVAB001。
7.一种微生态粉剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌体一级斜面培养：将保藏编号为CGMCC No.4850的地衣芽孢杆菌CRVAB001接种于斜面培养基培养，获得菌体一级斜面；
2)菌体二级液体培养：将步骤1)所得菌体一级斜面接种于液体培养基培养，活菌数≥1.0×1010CFU/mL时停止培养，获得菌液；
3)菌体三级种子液培养：将步骤2)所得菌液接种于液体培养基培养，活菌数≥1.0×1010CFU/mL时停止培养，获得种子液；
4)液体发酵：将步骤3)所得种子液接种于发酵培养基中，采用需氧—厌氧转换发酵，发酵开始的前6小时通气比为1∶0.8，7～14小时通气比为1∶1，活菌数≥1×1010CFU/mL，芽孢形成率达到90％以上，乳酸含量≥30g/L，停止发酵，收集发酵液；
5)盐析：向步骤4)所得发酵液中加入1％～5％(g/mL)磷酸氢二钠、1％～5％(g/mL)氯化钙、1％～5％(g/mL)氢氧化钠的水溶液，搅拌；
6)向步骤1)的溶液中加入助滤剂，搅拌，静置，过滤，获得滤饼，经干燥获得微生态粉剂，
其中，所述助滤剂为，按重量百分比计算，1％～6％轻质碳酸钙、1％～5％珍珠岩和1％～5％硅藻土中的一种或几种。
8.权利要求2所述微生态液体制剂作为饲料添加剂及在改善养殖水体环境方面的应用。
9.权利要求7所述微生态粉剂作为饲料添加剂及在改善养殖水体环境方面的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Denomination of invention: Bacillus licheniformis for producing lactic acid at high yield after fermentation, and preparation and application of Bacillus licheniformis Effective date of registration: 20151215 Granted publication date: 20130828 Pledgee: Beijing technology intellectual property financing Company limited by guarantee Pledgor: BEIJING CRVAB BIO-TECH CO.,LTD. Registration number: 2015990001110 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20161220 Granted publication date: 20130828 Pledgee: Beijing technology intellectual property financing Company limited by guarantee Pledgor: BEIJING CRVAB BIO-TECH CO.,LTD. Registration number: 2015990001110 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Bacillus licheniformis for producing lactic acid at high yield after fermentation, and preparation and application of Bacillus licheniformis Effective date of registration: 20161223 Granted publication date: 20130828 Pledgee: Beijing technology intellectual property financing Company limited by guarantee Pledgor: BEIJING CRVAB BIO-TECH CO.,LTD. Registration number: 2016990001167 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20180129 Granted publication date: 20130828 Pledgee: Beijing technology intellectual property financing Company limited by guarantee Pledgor: BEIJING CRVAB BIO-TECH CO.,LTD. Registration number: 2016990001167 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Lactic Acid Producing Lichen Bacillus and Its Preparation and Application after Fermentation Granted publication date: 20130828 Pledgee: Haidian Beijing science and technology enterprise financing Company limited by guarantee Pledgor: BEIJING CRVAB BIO-TECH CO.,LTD. Registration number: Y2024110000063 |