CN108441452A - 一种生长肥育猪用复合微生物发酵剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生长肥育猪用复合微生物发酵剂及其应用，所述发酵剂包括复合菌体和载体；其中，所述复合菌体和载体的质量比为(1‑3):(5‑10)；所述复合菌体包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红酵母。本发明通过研究生长肥育猪的自身特点和生长需求，科学筛选活性菌种，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到一种生长肥育猪用复合微生物发酵剂，将其适量添加到饲料原料中，调整发酵工艺流程，最终制备得到质量安全稳定且营养均衡的新型生物发酵饲料，饲喂生长肥育猪后能有效提高其生产性能，提高生长肥育猪的小肠消化吸收、抗氧化能力和免疫机能，提高生长肥育猪的血清总蛋白含量和健康水平，降低饲养成本，提高经济效益。

Description

一种生长肥育猪用复合微生物发酵剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，主要涉及一种生长肥育猪用复合微生物发酵剂及其应用。
背景技术
养猪是传统行业，饲养技术和饲料技术也在养猪过程中不断得到发展和创新。现代大规模养猪业和集约化饲料工业的快速发展，使得养殖猪的生产速度越来越快，但猪肉的品质和风味却在下降，常常导致生猪体能下降，肠胃功能退化，影响了生猪的正常生长。大量药物在养殖的应用也容易造成动物抗药性、药物残留等食品安全问题。而随着生活水平的提高，人们却越来越追求消费高品质的猪肉。解决养猪业和饲料行业当前存在的这一问题，开发改善猪肉品质的生物发酵饲料是促进这两大民生行业发展的大势所趋。近年来，生物发酵被证明是提高原料营养价值、降低霉菌毒素和抗营养因子，从而促进非常规原料开发、减少抗生素使用和改善动物健康的有效途径。
CN107279462A涉及菊花粕发酵生产水产畜禽用活性肽粉的方法，以菊花粕、豆粕、精氨酸浓菌浆干粉、玉米浆干粉为原料，以枯草芽孢杆菌、精氨酸产生菌、海洋红酵母、植物乳杆菌为出发菌株，分别采用液体种子培养和发酵培养。固体与液体按比例均匀混合，放置到发酵床上，经通入无菌空气进行有氧固体发酵培养，再经烘干、粉碎、过筛得到菊花粕发酵生产的水产畜禽用活性肽粉。该发明具有发酵原材料来源特定，菊花粕、精氨酸浓菌浆干粉和玉米浆干粉价格低廉、发酵后产生的产物多。CN107319129A公开了一种富含虾青素的发酵豆粕的制备与应用方法，以海洋红酵母为主要发酵剂，以豆粕为主要原料，通过发酵液的活化、低水分发酵及后熟、混合、制粒等步骤，制备得到富含虾青素的发酵豆粕及其饲料产品，该发明满足了断奶仔猪、哺乳母猪的营养需求，提高动物的免疫力，减少仔猪腹泻的发生，提高了母猪的***质量，进而提高了哺乳仔猪的生产性能。但上述现有技术未充分考虑不同动物的消化生理特点和养分需要，且菌种制备过程复杂、培养基成本高，程序繁多，不利于推广，使用多种营养及非营养添加剂，不能充分利用发酵产物和优质原料的营养价值，提高了养殖成本，缺乏普遍适用性。
因此，通过改变进食饲料的成分，提供一种高效的生长肥育猪用复合微生物发酵剂并用于制备生物发酵饲料是提高生长肥育猪的猪肉品质和生产性能的重要途径，具有重要的市场价值和应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足和市场需求，本发明提供了一种生长肥育猪用复合微生物发酵剂及其应用，通过研究生长肥育猪的自身特点和生长需求，科学筛选发酵菌种，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到一种生长肥育猪用复合微生物发酵剂，将其适量添加到饲料原料中，调整发酵工艺流程，最终制备得到质量安全稳定且营养均衡的生长肥育猪用生物发酵饲料，饲喂生长肥育猪过程中，可显著提高生长肥育猪的生产性能，提高生长肥育猪的小肠消化吸收、抗氧化能力和免疫机能，降低饲养成本，提高经济效益。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种生长肥育猪用复合微生物发酵剂，所述发酵剂包括复合菌体和载体；
其中，所述复合菌体和载体的质量比为(1-3):(5-10)，例如可以是1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、2:5、2:7、1:4、2:9、3:5、1:2、3:7、3:8、1:3或3:10；
所述复合菌体包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红酵母的组合。
发明人在长期生产实践过程中，充分研究生长肥育猪的饲料组成与生产性能的关系，对多种发酵菌种进行科学筛选，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到第一方面所述的生长肥育猪用复合微生物发酵剂，该发酵剂发酵得到的饲料营养均衡，能够提高生长肥育猪的血清总蛋白含量和健康水平，降低血清品中胆固醇含量和改善肉品质。
优选地，所述载体包括稻壳粉和/或石粉。
优选地，所述枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BFC1601，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.13131，保藏日期为2016年10月21日。
所述植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC1602，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.13132，保藏日期为2016年10月21日。
所述红酵母，命名为红酵母(Rhodotorula sp)BFC1703，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.15125，保藏日期为2017年12月26日。
优选地，所述复合菌体中植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红酵母为(2-4):(1-3):(3-7)，以菌落形成单位计，例如可以是2:1:3、2:3:7、4:1:3、4:1:7、2:3:3或4:3:7。
优选地，所述发酵剂中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红酵母的活菌数≥5.0×1010CFU/g。
本发明中，发酵剂的制备方法包括如下步骤：将植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红酵母分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或pH6.8的磷酸缓冲液重悬菌体，将植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红酵母按比例混合，得到复合菌体，将复合菌体混合物与石粉按按比例混合低温干燥制得发酵剂，其中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红酵母的活菌数≥5.0×1010CFU/g；
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述发酵剂用于制备生长肥育猪用饲料和/或饲料辅料。
第三方面，本发明提供一种采用第一方面所述的发酵剂发酵得到的生长肥育猪用饲料。
优选地，所述饲料按重量百分比主要由如下原料制备得到：
玉米15-18％、棉籽粕5-7％、花生粕3-5％、玉米蛋白粉2-7％、喷浆玉米皮3-8％、玉米胚芽粕23-26％、木薯渣3-5％、小麦麸6-12％、糖蜜1-5％、石粉1-5％，余量为水；
优选地，所述玉米的重量百分比为15-18％，例如可以是15％、16％、17％或18％。
优选地，所述棉籽粕的重量百分比为5-7％，例如可以是5％、6％或7％。
优选地，所述芝麻粕的重量百分比为3-8％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％。
优选地，所述玉米蛋白粉的重量百分比为2-7％，例如可以是2％、3％、4％、5％、6％或7％。
优选地，所述喷浆玉米皮的重量百分比为3-8％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％。
优选地，所述玉米胚芽粕的重量百分比为23-26％，例如可以是23％、24％、25％或26％。
优选地，所述木薯渣的重量百分比为3-5％，例如可以是3％、4％或5％。
优选地，所述小麦麸的重量百分比为6-12％，例如可以是6％、7％、8％、9％、10％、11％或12％。
优选地，所述糖蜜的重量百分比为1-5％，例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。
优选地，所述石粉的重量百分比为7-12％，例如可以是7％、8％、9％、10％、11％或12％。
优选地，所述复合微生物发酵剂的添加量为原料总量的0.1-0.3％，例如可以是0.1％、0.2％或0.3％，优选为0.1％。
第四方面，本发明提供一种制备如第三方面所述饲料的方法，包括如下步骤：
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，活化后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合得到原料粉末；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5的比例混合，搅拌后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌成菌料混合物，进行发酵。
优选地，步骤(1)所述活化的温度为34-36℃，例如可以是33℃、34℃或35℃，优选为35℃。
优选地，步骤(1)所述活化的时间为0.5-1h，例如可以是0.5h、0.8h或1h。
优选地，步骤(2)所述过筛的孔径为1.5-2.5mm，例如可以是1.5mm、2.0mm或2.5mm，优选为2mm。
优选地，步骤(2)所述混合的时间为1-3min，例如可以是1min、2min、或3min。
优选地，步骤(3)所述搅拌的时间为0.5-3min，例如可以是0.5min、1min、2min或3min。
优选地，步骤(3)所述纯净水、糖蜜、种子液的比例为25:2:5，例如可以是18:1:1、18:1:10、18:7:1、18:7:10、30:1:1、30:7:10或30:7:1。
优选地，步骤(4)所述搅拌的时间为3-5min，例如可以是3min、4min或5min。
优选地，步骤(4)所述发酵的水分含量为25-35％，例如可以是25％、28％、30％、32％或35％。
优选地，步骤(4)所述发酵的温度为25-30℃，例如可以是25℃、28℃或30℃。
优选地，步骤(4)所述发酵的时间为3-7天，例如可以是3天、4天、5天、6天或7天。
作为优选技术方法，一种制备如第三方面所述饲料的方法，具体包括如下步骤：
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，34-36℃活化0.5-1h后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合1-3min得到原料粉末，过筛的孔径为1.5-2.5mm；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5的比例混合，搅拌0.5-3min后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌3-5min成菌料混合物，水分含量控制为25-35％，25-30℃发酵3-7天。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供的生长肥育猪用复合微生物发酵剂通过科学筛选发酵菌种，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到新型微生物发酵剂，该发酵剂发酵得到的饲料营养均衡，在饲喂生长肥育猪的过程中，可显著提高生长肥育猪生产性能，提高生长肥育猪小肠消化吸收、抗氧化能力和免疫机能，提高生长肥育猪的血清总蛋白含量和健康水平，降低血清品中胆固醇含量和改善肉品质，降低饲养成本，提高经济效益；
(2)本发明提供的发酵饲料原料廉价易得，生产设备投入成本低，生产工艺简单，便于产业化，饲料质量安全稳定营养均衡。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
制备发酵剂
将植物乳杆菌CGMCC No.13132、枯草芽孢杆菌CGMCC No.13131和红酵母CGMCCNo.15125分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或pH 6.8的磷酸缓冲液重悬菌体，按植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红酵母为2:1:3的比例混合，得到复合菌体，将复合菌体混合物与稻壳粉按1:5比例混合低温干燥制得发酵剂，其中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红酵母的活菌数≥5.0×1010CFU/g。
制备生物发酵饲料
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，35℃活化0.5h后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合1min得到原料粉末，过筛的孔径为2mm；
按重量百分比主要由如下原料制备得到：
玉米17％、棉籽粕6％、花生粕4％、玉米蛋白粉5％、喷浆玉米皮6％、玉米胚芽粕25％、木薯渣4％、小麦麸10％、糖蜜4％、石粉3％，余量为水，复合微生物发酵剂的添加量为原料总量的0.1％；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5比例混合，搅拌0.5min后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌3min成菌料混合物，水分含量控制为25％，25℃发酵3天，得到生物发酵饲料，成品营养成分见表1；
表1生物发酵饲料营养成分
实施例2
制备发酵剂
将植物乳杆菌CGMCC No.13132、枯草芽孢杆菌CGMCC No.13131和红酵母CGMCCNo.15125分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或pH 6.8的磷酸缓冲液重悬菌体，按植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红酵母为4:3:7的比例混合，得到复合菌体，将复合菌体混合物与稻壳粉按3:10比例混合低温干燥制得发酵剂，其中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红酵母的活菌数≥5.0×1010CFU/g；
制备生物发酵饲料
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，36℃活化1h后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合3min得到原料粉末，过筛的孔径为2.5mm；
玉米15％、棉籽粕5％、花生粕3％、玉米蛋白粉2％、喷浆玉米皮3％、玉米胚芽粕23％、木薯渣3％、小麦麸6％、糖蜜1％、石粉1％，余量为水，复合微生物发酵剂的添加量为原料总量的0.3％，
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5比例混合，搅拌3min后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌5min成菌料混合物，水分含量控制为35％，30℃发酵7天，得到生物发酵饲料，营养成分与实施例1相似。
实施例3
制备发酵剂
将植物乳杆菌CGMCC No.13132、枯草芽孢杆菌CGMCC No.13131和红酵母CGMCCNo.15125分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或pH 6.8的磷酸缓冲液重悬菌体，按植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红酵母为2:3:3的比例混合，复合菌体混合物与石粉按2:7比例混合低温干燥制得发酵剂，其中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红酵母的活菌数≥5.0×1010CFU/g；
制备生物发酵饲料
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，34℃活化0.8h后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合2min得到原料粉末，过筛的孔径为1.5mm；
玉米18％、棉籽粕7％、花生粕5％、玉米蛋白粉7％、喷浆玉米皮8％、玉米胚芽粕26％、木薯渣5％、小麦麸12％、糖蜜5％、石粉5％，余量为水，复合微生物发酵剂的添加量为原料总量的0.2％；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5比例混合，搅拌2min后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌4min成菌料混合物，水分含量控制为28％，28℃发酵5天，得到生物发酵饲料，营养成分与实施例1相似。
实施例4
与实施例1相比，除了采用植物乳杆菌CGMCC No.5297(已公开在CN104877986A中)、枯草芽孢杆菌CGMCC No.6088(已公开在CN104195061A中)和红酵母CGMCC No.5081(已公开在《红酵母降解中国黄酒中氨基甲酸乙酯的研究》，赵雅敏江南大学)进行发酵外，其他条件与实施例1相同。
对比例1
与实施例1相比，除发酵剂中不含有植物乳杆菌外，其他条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，除发酵剂中不含有枯草芽孢杆菌外，其他条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，除发酵剂中不含有红酵母外，其他条件与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，除发酵剂中三种菌种的比例改为1:1:1外，其他条件与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，除复合菌体添加量为原料总量的0.05％外，其他条件与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比，除复合菌体添加量为原料总量的0.5％外，其他条件与实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比，除了采用膨润土载体外，其他条件与实施例1相同。
生物发酵饲料在生长肥育猪上的应用
试验方案设计：选取400头初始体重相近(35kg)的健康杜×长×大杂交生长肥育猪，公母各半，共分为1个对照组和9个实验组，其中实验组包括实施例1-3和对比例1-6共9个小组，每组4个重复，每个重复10头猪，试验期为35天。试验时间分为两个阶段，预试期和正试期。预饲养为期5天，正试饲养为期30天。其中对照组正常饲喂基础日粮，试验组饲喂添加实施例和对比例制备得到的发酵饲料的试验组日粮(配方见表2)，试验在生物饲料开发国家工程研究中心生猪养殖示范基地进行。
表2基础日粮和试验组日粮配方
饲养管理：饲养管理按照示范基地现行方案执行，试验猪在同一栋猪舍，不同圈舍中饲养，智能电脑空调控温，保持最适温度(控制温度为22℃)，猪舍内的相对湿度保持在65％，饲喂采用定时饲养，每天统计饲喂量和健康状况。试验猪自由饮水，采用常规免疫程序进行免疫接种，每天打扫，通风，定时消毒。在试验开始前和试验结束后早上都逐栏进行称重。
样品采集：试验结束时，从每个组每个重复中各取5头体况正常的生长肥育猪，进行前腔静脉采血10mL，静置，3000r/min离心10min，将离出的血清转移至新离心管中，并标上序号，于-20℃冷冻保存，从10个重复中随机抽号，每个重复取一头猪进行屠宰，采样，打开腹腔，取十二指肠(近胃)、空肠(近十二指肠)和回肠(回盲口)，置于4％多聚甲醛磷酸缓冲液(pH 7.4)固定48h。
数据处理：采用SAS统计软件ANOVA过程对结果进行统计分析和Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示，以P<0.05为判断显著性的标准。
测定指标：
(1)平均日増重：试验猪初始体重和结束时终末体重，分别于试验开始和结束，早上空腹称重，计算平均日增重公式：平均日増重(g)＝(试验猪结束体重－试验猪初始体重)/试验天数，结果见表3所示；
表3生物发酵饲料对生长肥育猪平均日增重的影响
组别 平均日增重(g/d) 组别 平均日增重(g/d)
对照组 600.9±8.1 对比例2 604.1±8.2
实施例1 613.7±10.2 对比例3 606.3±8.1
实施例2 611.5±11.1 对比例4 607.5±6.3
实施例3 612.4±13.3 对比例5 607.8±4.5
实施例4 610.8±14.4 对比例6 607.7±5.7
对比例1 605.9±8.2 对比例7 608.6±2.0
(2)平均日采食量：每天记录各栏猪饲料投放量和回收剩余量，计算每栏每天采食量，并记录猪的死淘数和发病等情况。计算日采食量公式：平均日采食(kg)＝(试验投料量－试验剩余料量)/(试验天数×头数)，结果见表4所示；
表4生物发酵饲料对生长肥育猪平均日采食量的影响
(3)料肉比：各栏总的饲料消耗量与总的增重为基础，计算料肉比公式：料肉比＝每栏总采食量/每栏总增重×每栏猪数量×试验天数，结果见表5所示；
表5生物发酵饲料对生长肥育猪料重比的影响
组别 料重比 组别 料重比
对照组 2.55±0.24 对比例2 2.38±0.25
实施例1 2.48±0.25 对比例3 2.38±0.13
实施例2 2.46±0.24 对比例4 2.39±0.54
实施例3 2.47±0.15 对比例5 2.39±0.25
实施例4 2.45±0.33 对比例6 2.39±0.57
对比例1 2.38±0.34 对比例7 2.40±0.75
由表3-表5分析结果表明，实施例1-4的平均日增重、日采食量高于对照组，但差异不显著，料肉比与对照组相比降低，其中实施例1的效果最好，平均日增重达到613.7±10.2g/d，对比例1-3中发酵菌株缺少任一种，对比例4-7不采用本发明提供的菌种配比、复合菌种添加量和载体种类，制备得到的发酵饲料的效果均不理想。
(4)总蛋白、白蛋白和球蛋白，总胆固醇和葡萄糖采用生化分析仪测定，结果见表6-表9。
表6生物发酵饲料对生长肥育猪总蛋白的影响
注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，下同。
表7生物发酵饲料对生长肥育猪白蛋白的影响
组别 白蛋白(g/L) 组别 白蛋白(g/L)
对照组 22.61±1.01 对比例2 22.90±3.02
实施例1 23.88±1.02 对比例3 22.83±3.03
实施例2 23.67±2.05 对比例4 22.95±2.02
实施例3 23.25±3.15 对比例5 22.98±3.04
实施例4 23.06±4.06 对比例6 22.89±1.02
对比例1 22.81±2.01 对比例7 22.99±1.04
表8生物发酵饲料对生长肥育猪球蛋白的影响
组别 球蛋白(g/L) 组别 球蛋白(g/L)
对照组 46.70±1.44 对比例2 48.50±2.40
实施例1 51.92±1.71 对比例3 48.60±5.40
实施例2 51.73±1.70 对比例4 47.24±1.34
实施例3 51.82±3.51 对比例5 48.73±3.04
实施例4 51.65±2.43 对比例6 48.40±1.42
对比例1 47.60±1.34 对比例7 49.60±1.54
表9生物发酵饲料对生长肥育猪总胆固醇的影响
表10生物发酵饲料对生长肥育猪葡萄糖的影响
由表6-表10的分析结果表明，与对照组相比，实施例1-4的发酵饲料组血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白含量均有升高。发酵饲料组血清的总胆固醇含量与对照组相比有降低，葡萄糖含量有提高；其中实施例1的效果最好，总蛋白达到76.9±1.34a g/L，对比例1-3中发酵菌株缺少任一种，对比例4-7不采用本发明提供的菌种配比、复合菌种添加量和载体种类，制备得到的发酵饲料的效果均不理想。
(5)制备组织切片，将染好的切片，在光学显微镜下进行观察小肠黏膜形态结构的变化情况，并应用显微镜拍照，每段肠道选5张HE染色切片，每张切片选5个视野具体测量每头试验猪的绒毛长度和隐窝深度，每个肠道组织选取5根最长肠绒毛长度(肠腺绒毛连接处到绒毛顶端为准)和最深隐窝深度(肠腺绒毛连接处到肠腺基部为准)，PAS染色切片观察，每头猪选取5张切片，每张切片选出5个放大200倍的视野观察肠绒毛上的杯状细胞，选取基本一致5根肠绒毛统计其杯状细胞数量，应用显微镜进行拍照，结果如表11-表28。
表11生物发酵饲料对生长肥育猪绒毛长度的影响
组别 十二指肠(75日) 组别 十二指肠(75日)
对照组 382.41±31.25 对比例2 383.03±25.12
实施例1 386.13±35.22 对比例3 383.03±45.02
实施例2 385.51±40.34 对比例4 383.12±15.21
实施例3 385.30±31.32 对比例5 383.11±33.32
实施例4 384.21±23.21 对比例6 383.10±32.02
对比例1 383.03±33.12 对比例7 382.53±34.24
表12生物发酵饲料对生长肥育猪绒毛长度的影响
表13生物发酵饲料对生长肥育猪绒毛长度的影响
组别 空肠(75日) 组别 空肠(75日)
对照组 372.81±35.01 对比例2 373.48±37.22
实施例1 375.99±27.92 对比例3 373.65±26.31
实施例2 374.61±22.62 对比例4 373.39±45.93
实施例3 374.45±24.42 对比例5 373.22±13.22
实施例4 374.51±15.21 对比例6 373.31±21.15
对比例1 373.29±27.92 对比例7 374.00±34.92
表14生物发酵饲料对生长肥育猪绒毛长度的影响
组别 空肠(110日) 组别 空肠(110日)
对照组 368.13±35.96 对比例2 371.11±34.49
实施例1 380.11±34.46 对比例3 371.13±37.46
实施例2 379.20±13.53 对比例4 372.31±24.27
实施例3 379.13±25.26 对比例5 373.12±33.86
实施例4 378.32±34.99 对比例6 374.41±14.42
对比例1 370.11±24.46 对比例7 375.15±35.16
表15生物发酵饲料对生长肥育猪绒毛长度的影响
表16生物发酵饲料对生长肥育猪绒毛长度的影响
组别 回肠(110日) 组别 回肠(110日)
对照组 353.00±20.11b 对比例2 354.47±22.02a
实施例1 362.37±21.07a 对比例3 355.37±11.13a
实施例2 361.10±40.01b 对比例4 356.52±22.07a
实施例3 361.02±21.21b 对比例5 359.30±31.01a
实施例4 360.30±50.13b 对比例6 356.17±23.47a
对比例1 354.37±31.17a 对比例7 358.33±51.57a
表17生物发酵饲料对生长肥育猪隐窝深度的影响
组别 十二指肠(75日) 组别 十二指肠(75日)
对照组 289.90±21.99 对比例2 288.20±21.91
实施例1 285.88±30.35 对比例3 288.93±11.49
实施例2 286.21±23.04 对比例4 287.50±21.96
实施例3 286.30±12.15 对比例5 287.92±31.59
实施例4 286.43±30.23 对比例6 287.20±51.92
对比例1 288.91±01.39 对比例7 287.14±21.29
表18生物发酵饲料对生长肥育猪隐窝深度的影响
表19生物发酵饲料对生长肥育猪隐窝深度的影响
组别 空肠(75日) 组别 空肠(75日)
对照组 284.45±21.77 对比例2 284.44±81.24
实施例1 284.42±16.81 对比例3 284.44±82.72
实施例2 284.43±23.72 对比例4 284.44±91.66
实施例3 284.43±10.83 对比例5 284.44±73.77
实施例4 284.43±26.61 对比例6 284.44±61.53
对比例1 284.44±91.77 对比例7 284.44±45.71
表20生物发酵饲料对生长肥育猪隐窝深度的影响
组别 空肠(110日) 组别 空肠(110日)
对照组 286.58±10.03 对比例2 287.57±11.02
实施例1 295.85±18.33 对比例3 288.68±20.33
实施例2 294.85±24.47 对比例4 288.46±32.25
实施例3 294.85±32.56 对比例5 289.25±10.04
实施例4 293.85±25.32 对比例6 289.15±53.41
对比例1 287.48±10.24 对比例7 289.33±40.10
表21生物发酵饲料对生长肥育猪隐窝深度的影响
组别 回肠(75日) 组别 回肠(75日)
对照组 252.77±38.78 对比例2 253.67±32.72
实施例1 256.29±36.22 对比例3 253.73±75.56
实施例2 255.19±25.57 对比例4 253.57±55.35
实施例3 255.22±13.62 对比例5 253.74±94.47
实施例4 254.34±32.11 对比例6 253.17±66.14
对比例1 253.72±18.68 对比例7 253.99±44.21
表22生物发酵饲料对生长肥育猪隐窝深度的影响
组别 回肠(110日) 组别 回肠(110日)
对照组 272.98±39.60 对比例2 273.25±12.11
实施例1 276.15±31.31 对比例3 273.34±33.33
实施例2 275.24±33.20 对比例4 273.54±55.22
实施例3 275.32±21.52 对比例5 273.36±73.45
实施例4 274.51±32.45 对比例6 273.45±54.57
对比例1 273.23±31.20 对比例7 273.98±45.42
表23生物发酵饲料对生长肥育猪小肠杯状细胞数目的影响
表24生物发酵饲料对生长肥育猪小肠杯状细胞数目的影响
组别 十二指肠(110日) 组别 十二指肠(110日)
对照组 12.95±6.12b 对比例2 13.45±5.31b
实施例1 21.55±5.31a 对比例3 14.63±6.13b
实施例2 20.62±4.11a 对比例4 14.24±2.42b
实施例3 20.43±5.32a 对比例5 15.85±3.67b
实施例4 20.05±3.46a 对比例6 15.73±6.55b
对比例1 13.34±6.22b 对比例7 16.66±5.37b
表25生物发酵饲料对生长肥育猪小肠杯状细胞数目的影响
组别 空肠(75日) 组别 空肠(75日)
对照组 18.44±6.16 对比例2 18.53±5.32
实施例1 19.22±5.85 对比例3 18.65±4.12
实施例2 19.13±6.42 对比例4 18.64±2.55
实施例3 19.14±4.53 对比例5 18.72±4.44
实施例4 19.02±3.61 对比例6 18.74±3.31
对比例1 18.52±6.26 对比例7 18.81±1.13
表26生物发酵饲料对生长肥育猪小肠杯状细胞数目的影响
表27生物发酵饲料对生长肥育猪小肠杯状细胞数目的影响
组别 回肠(75日) 组别 回肠(75日)
对照组 24.58±5.74 对比例2 23.53±3.55
实施例1 21.63±6.27 对比例3 23.62±5.47
实施例2 22.10±5.40 对比例4 23.33±4.43
实施例3 22.23±3.26 对比例5 23.21±6.31
实施例4 22.62±4.35 对比例6 23.56±1.22
对比例1 23.41±2.63 对比例7 23.04±3.56
表28生物发酵饲料对生长肥育猪小肠杯状细胞数目的影响
组别 回肠(110日) 组别 回肠(110日)
对照组 23.65±4.55 对比例2 23.77±2.22
实施例1 24.98±5.76 对比例3 23.86±1.13
实施例2 24.85±4.73 对比例4 23.85±5.56
实施例3 24.78±2.56 对比例5 23.91±4.43
实施例4 24.53±3.71 对比例6 23.81±5.57
对比例1 23.75±3.33 对比例7 23.99±4.63
小肠绒毛是小肠的基本功能单位，由表11-表28的结果分析可知，110日龄时，实施例1-4的十二指肠和空肠绒毛长度整体高于对照组。在回肠中，在110日龄时，实施例1的绒毛长度比对照组高，且差异显著(P<0.05)。肠绒毛之间具有隐窝，隐窝深度决定肠绒毛通过有丝***产生上皮细胞的速度，反映了细胞生成率。隐窝变浅，表明细胞的成熟率上升，分泌功能强；在110日龄实施例1-4的隐窝深度低于对照组，表明发酵饲料可以降低隐窝深度；杯状细胞分泌的黏液虽然对肠黏膜有保护作用，但过多的杯状细胞分泌，造成消化酶分泌减少，肠绒毛的有效吸收面积减少，大量的黏液覆盖在肠道上皮细胞表面，吸收细胞与肠道内容物之间形成一道屏障，减少肠上皮细胞与营养物质的接触，因此会降低肠道的消化吸收功能；发酵饲料对猪十二指肠杯状细胞数量的影响：在110日龄时，对照组杯状细胞数量极显著高于实施例1-4(P<0.01)；空肠：对照组高于实施例1-4；回肠：对照组与实施例1-4相比差异不显著。实施例1-4中杯状细胞数目小于对照组，可能是减少粗纤维对肠道的刺激，从而提高机体对营养物质的消化吸收。
综上，结合小肠绒毛长度、隐窝深度和杯状细胞数目的数据进行分析，最终得出实施例1对提高生长肥育猪的生产性能和消化吸收的效果最好，而对比例1-3中发酵菌株缺少任一种，对比例4-7不采用本发明提供的菌种配比、复合菌种添加量和载体种类，制备得到的发酵饲料的效果均不理想。
(6)抗氧化能力指标(总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶)；免疫功能指标(血清免疫球蛋白IgM、IgG、IgA)，结果见表29-表35。
表29生物发酵饲料对生长肥育猪总抗氧化能力的影响
表30生物发酵饲料对生长肥育猪谷胱甘肽过氧化物酶的影响
表31生物发酵饲料对生长肥育猪丙二醛的影响
表32生物发酵饲料对生长肥育猪超氧化物歧化酶的影响
表33生物发酵饲料对生长肥育猪IgM的影响
组别 IgM(mg/mL) 组别 IgM(mg/mL)
对照组 0.406±0.04 对比例2 0.412±0.12
实施例1 0.422±0.02 对比例3 0.411±0.32
实施例2 0.421±0.21 对比例4 0.415±0.04
实施例3 0.421±0.12 对比例5 0.414±0.05
实施例4 0.420±0.11 对比例6 0.412±0.10
对比例1 0.410±0.03 对比例7 0.417±0.14
表34生物发酵饲料对生长肥育猪IgG的影响
表35生物发酵饲料对生长肥育猪IgA的影响
组别 IgA(mg/mL) 组别 IgA(mg/mL)
对照组 0.370±0.06 对比例2 0.372±0.06
实施例1 0.389±0.04 对比例3 0.373±0.04
实施例2 0.388±0.01 对比例4 0.375±0.03
实施例3 0.387±0.05 对比例5 0.376±0.01
实施例4 0.385±0.06 对比例6 0.375±0.02
对比例1 0.373±0.02 对比例7 0.379±0.02
由表29-表35分析可知，实施例1-4的样品血清中总抗氧化能力显著高于(P<0.05)对照组，但谷胱甘肽过氧化物酶与对照组差异不显著，提示饲喂发酵饲料都能够提高生长肥育猪抗氧化能力。而实施例1-4的样品血清中丙二醛含量与对照组相比有降低，超氧化物歧化酶高于对照组，并且实施例1对提高肥育猪抗氧化能力的效果最好，而对比例1-3中发酵菌株缺少任一种，对比例4-7不采用本发明提供的菌种配比、复合菌种添加量和载体种类，制备得到的发酵饲料的效果均不理想。
本发明证实了复合微生物发酵剂制备得到的生物发酵饲料对生长肥育猪抗氧化机能的提高作用。其抗氧化作用机理主要有下几个方面：清除体内的自由基(羟自由基、超氧阴离子自由基等)；产生抗氧化酶类如超氧化物歧化酶(SOD)等；产生还原性物质如还原型谷胱甘肽(GSH)，具有还原性。与对照组相比，实施例1-4的样品血清中IgM、IgG、IgA含量均有提高，而衡量免疫机能的主要指标是免疫球蛋白，育肥猪生长期，IgG的提高在一定程度上增加了血清中的抗体水平，可减少猪腹泻。IgM是初次免疫应答出现最早的，主要由B细胞抗原受体合成，存在于血液中。IgA含量仅次于IgG，主要由胃肠淋巴组织合成，具有对呼吸道、消化道等杀菌和机体粘膜防御起着重要作用。
综上所述，本发明提供的微生物发酵剂通过研究生长肥育猪的自身特点和生长需求，科学筛选发酵菌种，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到复合微生物发酵剂，该发酵剂发酵得到的饲料营养均衡，在饲喂生长肥育猪的过程中，可显著提高猪生产性能，提高猪小肠消化吸收、抗氧化能力和免疫机能，提高生长肥育猪的血清总蛋白含量和健康水平，降低血清品中胆固醇含量和改善肉品质，防止疾病感染和减少应激的发生，降低饲养成本，提高经济效益，具有广阔的应用前景和市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种生长肥育猪用复合微生物发酵剂，其特征在于，所述发酵剂包括复合菌体和载体；
其中，所述复合菌体和载体的质量比为(1-3):(5-10)；
所述复合菌体包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红酵母的组合。
2.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述载体包括稻壳粉和/或石粉；
优选地，所述枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BFC1601，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.13131，保藏日期为2016年10月21日；
所述植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC1602，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.13132，保藏日期为2016年10月21日；
所述红酵母，命名为红酵母(Rhodotorula sp)BFC1703，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15125，保藏日期为2017年12月26日。
3.根据权利要求1或2所述的发酵剂，其特征在于，所述复合菌体中植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红酵母为(2-4):(1-3):(3-7)，以菌落形成单位计。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红酵母的活菌数≥5.0×1010CFU/g。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述发酵剂用于制备生长肥育猪用饲料和/或饲料辅料。
6.一种生长肥育猪用饲料，其特征在于，采用如权利要求1-4中任一项所述的发酵剂发酵得到。
7.根据权利要求6所述的饲料，其特征在于，所述饲料按重量百分比主要由如下原料制备得到：
玉米15-18％、棉籽粕5-7％、花生粕3-5％、玉米蛋白粉2-7％、喷浆玉米皮3-8％、玉米胚芽粕23-26％、木薯渣3-5％、小麦麸6-12％、糖蜜1-5％、石粉1-5％，余量为水；
优选地，所述复合微生物发酵剂的添加量为原料总量的0.1-0.3％，优选为0.1％。
8.一种制备如权利要求6或7所述饲料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，活化后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合得到原料粉末；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5的比例混合，搅拌后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌成菌料混合物，进行发酵。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述活化的的温度为34-36℃，优选为35℃；
优选地，步骤(1)所述活化的时间为0.5-1h；
优选地，步骤(2)所述过筛的孔径为1.5-2.5mm，优选为2mm；
优选地，步骤(2)所述混合的时间为1-3min；
优选地，步骤(3)所述搅拌的时间为0.5-3min；
优选地，步骤(4)所述搅拌的时间为3-5min；
优选地，步骤(4)所述发酵的水分含量为25-35％；
优选地，步骤(4)所述发酵的温度为25-30℃；
优选地，步骤(4)所述发酵的时间为3-7天。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，34-36℃活化0.5-1h后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合1-3min得到原料粉末，过筛的孔径为1.5-2.5mm；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5的比例混合，搅拌0.5-3min后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌3-5min成菌料混合物，水分含量控制为25-35％，25-30℃发酵3-7天。
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