CN102517238B - 一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产酸蜡样芽孢杆菌，该菌株命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，已于2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011352。本发明的菌株可以用于制备微生态制剂，应用时，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉可以单独作为有效成分与玉米淀粉混合制成微生态制剂，或：产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与其它至少一种有效成分或菌粉以及玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。本发明还提供了一种复合微生态制剂M3，其是以三大耐高温菌种：枯草芽孢杆菌N9-1-35、丁酸梭菌Cb-2以及本发明的产酸芽孢菌GF1及玉米淀粉混合制成，三种菌粉及玉米淀粉的质量比为1∶2∶2∶5，各菌粉的活菌数分别大于或者等于1.0×10⁹cfu/g、5.0×10⁸cfu/g、5.0×10⁸cfu/g。

Description

一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用。

背景技术

乳酸菌在发酵过程中产生有机酸、各种消化酶及乳酸菌素，畜禽饲料中添加乳酸菌类益生素能有效降低胃肠道内的pH，抑制病原菌的生长，提高饲料报酬，增强畜禽免疫力。近年来乳酸菌类益生素的研究越来越深入。但是，一般乳酸菌的营养要求较高，对不良环境的抵抗力差，特别是抗干燥、抗高温、抗胃酸和胆汁的能力较弱，因此，能活着进入肠道的乳酸菌种类和数量为数不多。普通的乳酸菌对环境耐受性差影响了乳酸菌的应用，它不耐高温，在高温制粒的过程中存活率极低，因此在饲喂颗粒料的生产应用中受到了很大的限制。

产酸芽孢杆菌是优选出能产乳酸的芽孢菌，兼具乳酸菌和芽孢菌的优势，可作为一种新型的微生物添加剂开发和应用。国内最早报道的产酸芽孢菌是1996年王艳萍等筛选的一株名为TQ33的菌株，后来鉴定TQ33为凝结芽孢杆菌，随后对产酸芽孢菌的研究慢慢展开。苏勇等(2006)研究表明产酸芽孢菌S1能提高断奶后仔猪空肠和结肠食糜中乳酸菌与大肠杆菌的数量比值，而乳酸菌所占比例的提高能够预防仔猪腹泻；研究发现产酸芽孢菌对哺乳仔猪黄白痢有良好的预防效果，连续灌服3d产酸芽孢菌制剂对乳猪黄白痢的预防率可达到99.5％；在仔猪出生时即投喂产酸芽孢菌TPY-211口服液，对防治7日龄内仔猪腹泻有明显效果(P＜0.01)。另外，产酸芽孢菌在肉鸡上的试验也取得了良好的效果，产酸芽孢菌制剂能提高AA肉鸡生产性能，显著提高21～42日龄黄羽肉鸡平均日采食量、平均日增重和饲料转化率，同时可增强试验组肉鸡的免疫性能。不仅如此，产酸芽孢菌在水产养殖中的应用越来越受欢迎，鱼虾颗粒料对制粒条件的要求更加严格，普通的乳酸菌制剂根本不可能成活，因此开发可以产乳酸的芽孢菌不仅能承受高温高压的制粒过程，发挥芽孢菌的优势，并且被鱼虾采食后，可以发挥乳酸菌的优势，起到调节胃肠pH，提高饲料报酬，增强免疫力的作用。

由上可见，筛选具有产酸能力的芽孢菌不仅具有乳酸菌的优势，而且在发酵后期可以产生芽孢，可以很好地耐受高温、高压的制粒过程，提高存活率。目前所报道的产酸芽孢菌多为凝结芽孢杆菌，尚未见到有产酸蜡样芽孢杆菌的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明经筛选得到了一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用，为开发肉禽及水产专用益生素提供了平台。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株产酸蜡样芽孢杆菌，该菌株命名为蜡样芽孢杆菌GF-1Bacillus cereus GF-1，已于2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011352。

所述菌株的菌学特征为：菌落为圆形或近似圆形，呈无色素的白色，菌体细胞杆状，成短或长链，培养48h，菌落不透明，直径可达10mm，表面粗糙，边缘不整齐，平铺似毛玻璃状。产芽孢，中生，革兰氏阳性，无荚膜。

所述菌株的最适培养条件为：培养基：酵母膏0.5％，蛋白胨0.6％，葡萄糖1.0％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.08％(按质量百分数)，调pH至7.5。最适温度：35℃，好氧。

本发明还对产酸蜡样芽孢杆菌的液体工业大规模生产的工艺及培养基做了摸索研究，经研究，其最佳培养基配方如下：

种子培养基：酵母膏0.5％，蛋白胨0.6％，葡萄糖1.0％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.08％(按质量百分数)。

液体发酵培养基：玉米粉：3.0％，豆粉：3.2％，麸皮：2.5％，硫酸铵：0.8％，硫酸镁：0.01％，磷酸氢二钠：1％，磷酸二氢钠：0.075％，柠檬三钠：0.1％(按质量百分数)。

其最佳生产工艺流程如下：

(1)一级种子：斜面接种，500mL三角瓶装量100mL，35℃，220rpm摇床培养10～16h；接入二级种子液扩大培养。

(2)二级种子：5L三角瓶装量1L，接种量6％(v/v)，35℃，220rpm摇床培养12～18h；接入三级种子液扩大培养。

(3)三级种子：100L发酵罐装量60L，4％(v/v)接种，35℃，220rpm培养10～16h；接入发酵罐进行工业化生产。

(4)发酵罐培养条件：2％接种(v/v)，35℃，220rpm培养26～32h，镜检形成芽孢90％左右，放罐，喷干，获得芽孢菌粉。

所述产酸蜡样芽孢杆菌菌粉可以用于制备微生态制剂，应用时，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉可以单独作为有效成分与玉米淀粉混合制成微生态制剂，或：产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与其它至少一种有效成分或菌粉以及玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。优选的，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与枯草芽孢杆菌N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉和玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。

本发明还提供了一种复合微生态制剂M3，其是以三大耐高温菌种：枯草芽孢杆菌N9-1-35(已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2011301)、丁酸梭菌Cb-2(已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011384)以及本发明的产酸芽孢菌GF1(10×10⁸cfu/g)及玉米淀粉混合制成，三种菌粉及玉米淀粉的质量比为1∶2∶2∶5，各菌粉的活菌数分别大于或者等于1.0×10⁹cfu/g、5.0×10⁸cfu/g、5.0×10⁸cfu/g。其功能及效果如下：

1、可以提高饲料报酬，降低料肉比，从而降低养殖成本。

2、可以增强机体的总抗氧化水平，降低各种氧化应激所产生的副作用。

3、可以提高脾脏、法氏囊器官指数。

4、可以增加免疫器官指数，提高机体内IgG水平，增强机体产生抗体的能力，从而增强抵抗力。

具体应用时，可以按照0.5‰～2.0‰(质量比)的比例添加于饲料中。

本发明的产酸蜡样芽孢杆菌，不仅具有良好的生长性能，而且在发酵终点能够有效地形成芽孢。不仅具备乳酸菌的特点：可以代谢产生有机酸，主要为乙酸和乳酸及少量丙酸和丁酸，而且可以形成芽孢，增强了其抗应激性，能够耐热、耐酸、耐胆盐，可以耐受高温制粒、低pH和高胆盐环境，顺利通过胃和十二指肠，进入肠道内发挥其益生菌的作用，因此，可以用于制备复合微生态制剂M3。实际应用时，可以与部分抗生素同时使用，但为了保证本发明的菌能够充分发挥益生素的作用，应尽量避免与抗生素同时使用或使用时先做抑菌试验。另外，通过小鼠的急性毒性试验表明，本发明的产酸蜡样芽孢杆菌安全无毒副作用，可以放心地作为益生素在饲料中添加使用。

附图说明

本发明提供的菌株命名为蜡样芽孢杆菌GF-1Bacillus cereus GF-1，已于2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011352，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

菌株枯草芽孢杆菌N9-1-35Bacillus subtilis N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011301，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

菌株丁酸梭菌Cb-2Clostridium butyricum Cb-2，已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011384，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

图1为GF1菌落融钙图，图中菌落周围透明的部分即为融钙圈，表示产酸。

图2为16srDNA的PCR扩增产物电泳图，其中，M代表marker，1和2为16S rDNA序列的两个重复。

图3为GF1与GU056812.1，GU250444.1，FJ665379.1序列对比结果示意图。

图4为LYN3发酵液pH变化曲线图。

图5为GF1抗生素药敏图，图中，数字代表：1、盐酸林可霉素；2、硫酸粘杆菌素；3、盐酸土霉素；4、酒石酸泰乐菌素；5、多西环素。

图6为GF1生长曲线。

图7为各试验组料重比对照图。

图8为血清总抗氧化能力T-AOC测定结果示意图。

图9为各试验组IgG水平比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一  产酸芽孢杆菌的筛选及其它研究

一、产酸芽孢杆菌的筛选

1 试验材料

1.1 分离源：鸡肠道、鸡粪便、猪粪便、牛粪便

1.2 培养基：

1.2.1 菌种分离用培养基

基础培养基：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.08％，碳酸钙1.5％，琼脂1.5％。

1.2.2 菌种培养用培养基

种子培养基：酵母膏0.1％，蛋白胨0.1％，葡萄糖0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.02％，pH 7.0～7.5。

发酵培养基(基础)：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.08％。

2 菌种筛选

2.1 产酸芽孢菌分离纯化方法：采用菌种分离培养基，涂布分离，40℃培养48h，挑选生长速度快、周围产生融钙圈的单个菌落作为分离菌株，取一环分离菌使其分散于生理盐水中，90℃水浴15min，再按上述方法进行分离，选取单一菌落划线培养。

2.2 鉴定方法：菌种鉴定采用16S rDNA保守序列的PCR鉴定法和常规生理生化检测试验，16S rDNA保守序列的PCR鉴定法具体方法如下：细菌16S rDNA扩增的引物序列为：上游：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，序列由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为：dNTP Mixture 4μL，5×PrimeSTARBuffer 10μL，上下游引物各0.6μL，基因组模板0.8μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.6μL，用无菌去离子水补充至50μL。PCR循环参数为：95℃5min；94℃1min，58℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min。将PCR反应产物送上海桑尼生物科技有限公司测序，测序结果应用DNAStar软件下的MegAlign子软件进行分析。

3 产酸蜡样芽孢菌的性能检测

3.1 菌株芽孢形成率测定

发酵液中芽孢百分数的测定：将筛选得到的菌株GF1在发酵培养基中37℃，220rpm培养48h。处理一：取1mL菌液梯度稀释法计发酵液中活菌总数；处理二：取部分菌液在沸水中加热10min，然后取1mL菌液梯度稀释法计热处理后活菌数。计算芽孢形成率。芽孢形成率＝热处理后活菌数/发酵液中活菌总数×100％。

3.2 菌株代谢产物(有机酸)分析

菌株经摇瓶液体发酵培养，每隔2h取发酵液5mL，直至发酵培养48h，绘制pH变化曲线，根据检测结果选取发酵初期pH迅速下降的6～12h，发酵液5000rpm离心10min，所得上清进行液相色谱分析有机酸的含量及组成成分。

3.3 菌株应用稳定性的研究

菌株的耐酸、耐胆盐和耐热性能检测：分别将GF1菌株液体发酵培养48h，镜检至大部分菌体形成芽孢，未形成芽孢的菌体80℃水浴15min灭活，平板培养计数，作为待测菌株耐受性试验的起始浓度，经热处理(80℃水浴15min)的发酵液作为待测液，备用。

3.3.1 酸耐受试验

将液体发酵培养基的起始pH分别调节为2.0、3.0、4.0、5.0，接种1h、2h、3h后取样，平板培养计数。

3.3.2 胆盐耐受试验

液体发酵培养基高压灭菌后，加入胆盐母液(10％)，使其胆盐浓度分别为0.2％、0.3％、0.4％，接种0.5h、1.5h、2h后取样，平板培养计数。

3.3.3 热稳定性试验

菌株液体发酵培养48h，残留菌体80℃水浴15min灭活处理后，设定温度梯度为85℃、90℃、95℃，水浴15min后取样，平板培养计数。

3.3.4 产酶性能检测

分别取不同生长阶段：对数生长前期6h、中期16h、后期24h和28h以及发酵终点48h的发酵液，进行酶活检测。采用Folin福林酚法测定中性蛋白酶和酸性蛋白酶，采用CMC糖化力法测定发酵液纤维素酶活力。

3.4 对抗生素的敏感性试验

选取盐酸林可霉素、硫酸粘杆菌素、盐酸土霉素、酒石酸泰乐菌素、多西环素五种抗生素，按推荐用量配成不同梯度溶液，管碟法测定抑菌圈直径，其中指示菌为所分离菌株，浓度为1.8×10⁸cfu/mL。

4 产酸芽孢菌液体发酵条件优化

研究产酸芽孢菌液体发酵中的发酵温度、初始pH值、通风量、发酵时间和接种量等各项因素对菌体产量和芽孢形成的影响。

4.1 发酵温度的确定：

温度通过影响微生物膜液晶结构、酶和蛋白质的合成和活性，以及RNA的结构及转录等影响微生物的生理活动，对微生物的生长直接产生影响。分别在28℃、30℃、33℃、35℃、37℃、40℃不同温度下，对所筛选的菌进行发酵培养48h，于不同时段测定活菌数。

4.2 发酵最佳初始pH测定：

微生物需要在一定的酸碱度的环境中才能正常的生长繁殖，pH过高或过低都会抑制微生物的生长。本试验分别在pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下培养至发酵终点48h，于不同时段测定活菌数。

4.3 通风量的确定

供氧量的多少会直接影响菌株的生长或代谢作用。因此发酵过程中通风量的大小直接影响菌体的生成，试验以装样量和摇床转速为通风量大小的代表，研究了芽孢菌在不同装样量(500mL三角瓶装样50mL、100mL、150mL、200mL)和摇床转速(160rpm、180rpm、200rpm、220rpm)下菌体生成量的变化。分别在35℃培养36h后测定菌体含量。

4.4 培养基碳源和氮源组成配比优化

将发酵培养基中碳源和氮源的含量上下适当调整，将作为主要碳源的葡萄糖含量为别设为：0.75％、1.0％、1.25％，氮源蛋白胨的含量分别设为0.4％、0.6％、0.8％，进行两因素三水平的正交试验，在发酵20h取发酵液测定发酵48h平板计数法记录活菌数，同时95℃煮15min灭活菌体，计芽孢数，确定碳源和氮源的最佳配比。

5 生长曲线的绘制

按照发酵优化结果，将GF1经500mL摇瓶液体发酵培养，每隔2h取发酵液1mL，平板梯度稀释法，35℃培养24h计菌落总数，绘制生长曲线。

6 动物安全性试验

6.1 试验动物

昆明种小鼠，动物级别二级，雌雄各半共50只，体重18～22g。

6.2 试验动物分组与饲喂

基础日粮预饲1周后随机分为5组，其中1组为对照组，其余4组为试验组。

根据人每天大约需要5×10⁸个活菌，设定试验组小鼠每天服用活菌数为人每天需要量的1/5倍、1倍、5倍和10倍。将喷干菌粉稀释后拌料、重新制粒，连续饲喂30天。

试验区封闭、清洁级，试验期间观察小鼠体态，试验结束时解剖小鼠心脏、肝脏、肾脏和脾脏，观察有无病变。

二、结果与分析

2.1 菌株的分离与鉴定

2.1.1 产酸芽孢菌的分离

从鸡肠道内容物以及鸡、猪和牛新鲜粪便中分离得到25株目标菌株，使得平板内菌落周围的培养基颜色由白色不透明变为透明淡黄色，说明所选菌株产酸并将培养基中的碳酸钙融解，其中菌株GF1较其它菌株发酵液生物量高，融钙圈大(如图1所示)，因此选择GF1为试验备选菌株。

2.1.2 产酸芽孢菌的分子生物学和生理生化鉴定

产酸芽孢菌的分子生物学检测：取GF1发酵液1mL，提取总DNA，PCR扩增16S rDNA序列，PCR产物电泳结果显示，在分子量大小为1400bp左右得到一条特异性好的条带，与预期结果一致(如图2所示)。

将GF1菌株的16S rDNA目的片段切胶回收(TAKARA胶回收试剂盒)，送TAKARA测序，将序列测定结果(如序列表1所示)输入GeneBank中与已知序列进行比较，测定结果表明GF1与编号为GU056812.1，GU250444.1，FJ665379.1菌株同源性为99.4％(如图3所示)。

GF1生理生化检测结果(如表1所示)：在选择性培养基上，35℃，培养24h，可形成圆形或近似圆形、无色素的白色菌落，菌体细胞杆状，成短或长链，培养48h，菌落不透明，直径可达10mm，表面粗糙，边缘不整齐，平铺似毛玻璃状。产芽孢，中生，革兰氏阳性，无荚膜。

表1  分离菌株的生理生化特征

根据形态观察、生理生化测定结果以及16S rDNA序列测定结果，参照蜡样芽孢杆菌检测国标(GB/T 26427-2010)和《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，2001年)，可判定GF1为蜡样芽孢杆菌，发明人对其进行了保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年10月16日，保藏编号为：CCTCC M 2011352。

2.2 产酸蜡样芽孢菌的性能检测

2.2.1 菌株GF1发酵活菌数和最终芽孢率检测

通过对GF1液体培养预试验，确定GF1发酵点为48h：即在GF1液体培养后期(液体发酵培养38h之后)，每隔2h涂片检查其生长状态及芽孢形成情况，将GF1镜检芽孢率在85％以上的时间点确定为发酵终点，经反复试验发酵终点定为48h(如表2所示)。

表2  菌株GF1发酵液最终芽孢率

由表2可以看出，通过对GF1深层发酵培养48h，最终发酵液活菌总数可达3～4×10⁹cfu/mL，90℃热处理10分钟将未形成芽孢的菌体杀死，3个组的平均活菌总数由原来的3.8×10⁹cfu/mL变为3.5×10⁹cfu/mL，存活率为92％，说明菌株GF1在发酵终点形成92％的芽孢，表明菌株GF1具有良好的生长性能和芽孢形成能力。

2.2.2 菌株代谢产物(有机酸)分析

具有优异的产酸能力的检测是该株芽孢菌必备的性能，而定量分析GF1代谢过程中有机酸的生成量及有机酸的种类是最有力的依据。

在整个发酵过程中每隔2h取发酵液，通过pH计检测发酵过程中pH的变化，从图4中GF1发酵液的pH变化看出，由于GF1在生长的过程中不断产酸，使得pH不断下降，发酵6h之后，发酵液的pH急剧下降，由大于7.0的碱性环境变为酸性，14h后发酵液的pH降至5.0以下，由16h到24h，发酵液的pH维持在5.0之下，且随着菌株生长进入平台期，pH相对稳定，24h之后，随着发酵培养时间的延长，发酵液pH逐渐回升，为发酵后期形成芽孢创造条件，至发酵终点48h，发酵液pH又变为碱性。

试验选取发酵初期pH迅速下降的6～12h，采用液相色谱法检测发酵液有机酸的含量及成分组成，从表3可以看出，菌株代谢产生的有机酸主要为乙酸和乳酸，同时产生少量的丙酸和丁酸，大量的乳酸和乙酸对于提高饲料消化率、维持肠道有益微生物的生长繁殖同时抑制肠道致病菌、改善肠道环境具有重要的作用，正是由于这些有机酸的产生，使得菌株发酵初期发酵液的pH迅速下降。

表3  菌株代谢产物(有机酸)含量(mg/mL)

2.3 菌株耐受性分析

只有具备活性的益生菌进入肠道之后才能迅速增殖，不断产酶产酸，较好的发挥益生菌的作用。而一般的乳酸菌由于对不良环境的抵抗力差，特别是对高温高热、胃酸和胆汁的抵抗能力较弱，因此，在进入小肠之前已经失去活性，因此能活着进入肠道的乳酸菌种类和数量不多。本研究依据温度、pH值、抗生素对活菌剂活性的影响，从体外模拟高温高热，并调整培养液的pH和胆盐浓度，根据胃排空和食物进入小肠所需要的时间确定取样点，检测GF1的耐受性。

2.3.1 酸耐受试验分析

胃液pH的大小根据饮食结构不同而波动很大，通常pH在3.0左右，空腹食用酸性食品可达2.0，食用碱性食品可达4.0～5.0，鱼肠道pH在5.0～7.0。根据肠道pH的特性和食物过胃的时间一般为1～2h，设计体外pH耐受试验，将培养液用0.1mol/L的盐酸分别调整pH为2.0、3.0、4.0、5.0，在试验开始后0h、1h、2h、3h分别取样。

从表4看出，菌株在pH为2.0～5.0范围内存活率基本不受影响，调整初始活菌数为1.8×10⁸cfu/mL，在pH为2.0的条件下3h仍然能够达到1.5×10⁸cfu/mL，存活率为83.3％，表明GF1由于其芽孢的保护作用可以耐受胃肠道的酸性环境，顺利通过胃酸进入肠道，进而发挥益生菌的作用。

表4  起始pH值对菌株活菌数的影响    活菌数：(×10⁸cfu/mL)

2.3.2 胆盐耐受试验分析

菌种对胆盐的耐受性是衡量益生菌的一项重要指标。十二指肠中胆汁盐的含量范围在0.03-0.3％之间，只有具备较强耐胆汁盐能力的菌株才能顺利通过十二指肠。据此，用猪胆盐将培养基的胆盐浓度调整为0.2％、0.3％和0.4％，体外培养，每隔30min取样一次，检测GF1对胆盐的耐受性。

表5  胆盐对菌株存活率的影响活菌数：(×10⁸cfu/mL)

细菌在肠道的存活和增殖，必须能够耐受0.3％的胆盐环境。上述试验结果表明(表5所示)，调整初始活菌数为1.8×10⁸cfu/mL，在胆盐浓度0.4％的条件下2h菌株的活菌数为1.2×10⁸cfu/mL，存活率可达75％，这使得该菌株在肠道的存活和增殖成为可能。

2.3.3 热稳定性分析

根据颗粒饲料生产过程中温度一般在80℃～95℃，将GF1在85℃、90℃、95℃分别处理15min，检测GF1的热稳定性。

表6  湿热处理对菌株存活率的影响    活菌数：(×10⁸cfu/mL)

试验结果表明(如表6所示)，95℃、15min湿热处理GF1，其活菌数只下降了一个数量级，表明该菌株在生长后期形成芽孢，可以有效地保护菌体不受制粒过程高温高压的影响，耐受工业生产中85℃的高温制粒过程。GF1良好的耐热性能使其在饲料加工过程中能够耐受高温制粒的影响，便于添加和混合。

2.3.4 菌株产酶能力分析

表7菌株酶活力测定(U/mL)

由表7可以看出：在对数生长前期，没有检测出酶活，可能是因为前期是菌种复苏阶段不以发挥功能为主，主要为进入对数生长阶段做准备。随着发酵的进行，16h检测到中性蛋白酶，在对数生长后期即24h和28h，中性蛋白酶、酸性蛋白酶和纤维素酶均呈现出一定的活性，而在发酵终点48h，中性蛋白酶和纤维素酶活性最高，未检测到酸性蛋白酶活，这与发酵液在整个发酵过程中的pH变化有关，在发酵后期，发酵液pH呈现弱碱性，不利于酸性蛋白酶的活性发挥，而后期随着发酵进入平台期，产酶性能也得到充分的发挥，分泌大量的酶类，发挥益生菌的作用。

2.4 对抗生素的敏感性分析

饲用抗生素的添加在一定程度上限制了益生素作用的有效发挥，为了检测GF1对饲用抗生素的耐受性能，选取5种常用的饲用抗生素，并将其浓度调整至实际添加量的最大值，即：盐酸林可霉素(50ppm)，硫酸粘杆菌素(400ppm)，盐酸土霉素(500ppm)，酒石酸泰乐菌素(600ppm)，多西环素(300ppm)，j结果见图5和表8。

表8  抗生素耐受性试验直径(mm)

注：表中的A，B，C，D，E分别代表盐酸林可霉素，硫酸粘杆菌素，盐酸土霉素，酒石酸泰乐菌素和多西环素。

试验结果表明盐酸林可霉素和硫酸粘杆菌素对产酸芽孢菌GF1无抑菌圈，表明该菌株可以耐受盐酸林可霉素这一对革兰阳性球菌有较好作用的窄谱抗生素，同时可以耐受硫酸粘杆菌素这一主要对革兰氏阴性菌有强大抗菌作用并有明显促生长作用的窄谱抗生素。盐酸土霉素抑菌圈直径大于20mm，菌株对其高度敏感，这表明该菌株不能与盐酸土霉素这一广谱抗生素同时使用。酒石酸泰乐菌素(大环内酯类动物专用抗生素)和多西环素的抑菌圈直径在10～20mm范围内，表明GF1对其中度敏感，可以调整使用时间与抗生素间隔添加使用。

研究结果表明，受试抗生素中大部分对分离菌株有很强的抑菌作用，若同时使用，会大大削弱甚至完全抑制益生素的作用，只有盐酸林可霉素和硫酸粘杆菌素对益生素没有影响。实际应用中应尽量避免同时使用抗生素和益生素，若遇急性肠胃疾病，可在抗生素短期使用后，再饲喂益生素维持肠道正常。

2.5 产酸芽孢杆菌发酵条件优化结果

2.5.1 温度对GF1生物量和芽孢率的影响

温度通过影响微生物膜液晶结构、酶和蛋白质的合成和活性，以及RNA的结构及转录等影响微生物的生理活动，对微生物的生长直接产生影响。分别在28℃、30℃、33℃、35℃、37℃、40℃的温度下，对所筛选的菌进行发酵培养48h，测定活菌数和芽孢形成率。

表9  温度对GF1生物量和芽孢率的影响

试验结果表明(如表9所示)，GF1对生长温度的要求不严格，于28℃～40℃的温度范围内都能生长，其中32℃和35℃最有利于菌种的生长和芽孢的形成，40℃时，GF1的生物量明显下降，生长受到抑制。因此发酵GF1以32℃～35℃为宜。

2.5.2 pH对GF1生物量和芽孢率的影响

微生物需要在一定的酸碱度的环境中才能正常的生长繁殖，经过大量试验表明，在酸性条件下不利于GF1在培养后期形成芽孢。GF1在生长后期形成偏碱性的环境，对于芽孢的形成非常必要。将培养基初始pH值调整为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，检测pH对GF1的活菌数和芽孢形成率的影响。

表10  培养基初始pH对GF1生物量和芽孢率的影响

试验结果表明(如表10所示)，初始pH为7.5时，活菌数可达5.4×10⁹cfu/g，芽孢率为94％，发酵液中大部分菌体都能在48h时形成芽孢。当初始pH为8.0时，虽然活菌数与pH为7.5时差异不大，但最终芽孢形成率却仅为50％，显著低于94％，整体来看，发酵液初始pH为7.5时效果最好，这可能与GF1最终芽孢形成时所需要的pH有关，由图4中GF1发酵液的pH变化曲线表明，GF1形成芽孢时的pH在7.5左右，而其它pH的发酵液由于加入了一定的缓冲液使得发酵液最终pH很难维持在7.5左右，导致芽孢形成率低。

2.5.3 转速和装液量对GF1生物量和芽孢率的影响

培养过程中转速和装液量的大小关系到发酵液的通气量，进而影响发酵培养基的溶氧水平，而在芽孢菌的生长后期由于生物量的加大从而需要更多的氧气，因此优化转速和装液量对芽孢菌培养后期芽孢的形成非常重要。

表11  转速对GF1生物量和芽孢率的影响

表11结果表明，转速对GF1的影响不大，低转速140rpm和高转速220rpm的活菌数都在2.0×10⁹cfu/g左右，而芽孢率以200rpm和220rpm最高，分别为95％和96％，但与低转速的芽孢形成率差异不明显。

表12  装液量对GF1生物量和芽孢率的影响

当250mL三角瓶中装液量为40mL和60mL时，GF1发酵液的活菌数和芽孢形成率分别为4.5×10⁹cfu/g和4.3×10⁹cfu/g、85％和84％(如表12所示)，没有显著的差异，这说明40mL和60mL的装液量三角瓶内溶氧充足。但当装液量大于80mL时，GF1的生物量明显降低，当装液量为100mL时，活菌数为2.1×10⁹cfu/g，较装液量为60mL时下降一半，但芽孢率为80％，这可能是溶氧不足导致生长条件差而引起芽孢形成。而装液量为120mL时，活菌数为1.2×10⁹cfu/g，镜检菌体瘦小，此时芽孢率仅为24％。从发酵液的活菌数和芽孢率来看，装液量即溶氧效果对菌株的影响比较大，装液量越多溶氧越少，菌株的生长受的限制就越大，最终确定装液量为250mL三角瓶中装60mL培养基。

2.5.4 接种量对GF1生物量和芽孢率的影响

接种量的大小在一定程度上影响菌种能否快速地进入对数生长阶段，分别按照4％、6％、8％、10％、12％的接种量接种，35℃，220rpm，培养48h，检测生物量和芽孢形成水平。

表13  接种量对GF1生物量和芽孢率的影响

试验表明(如表13所示)，不同接种量对GF1的影响差异表现在最终芽孢率的大小上，接种量越大，芽孢形成率越高，当接种量≥8％时，芽孢率在80％以上，当接种量为12％时，芽孢率可达90％。原因可能是接种量越大，营养消耗的越快，达到生长平台期越快，越有利于芽孢的形成。

2.6 产酸芽孢菌GF1培养基优化结果

培养基中碳源和氮源的合理搭配对菌种的生长非常关键，因此对GF1发酵培养基主要碳源、氮源的葡萄糖和蛋白胨的浓度进行了两因素三水平的正交实验，实验因素和水平设计如表14所示。

表14  正交实验因素和水平设计

表15  两因素三水平正交试验结果

从菌株发酵48h时活菌数来看(表15所示)，最佳的因素水平组合为A2B2；从菌株发酵48h时芽孢形成率来看，较好的因素水平组合为A2B1、A2B2和A3B2。综合来看，最佳的因素水平组合即为A2B2。即培养基配方为：酵母膏0.5％，蛋白胨0.6％，葡萄糖1.0％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.08％。

2.7 GF1生长曲线的绘制

为大批量生产GF1种子发酵液，给生产提供理论指导，将GF1经500mL摇瓶液体发酵培养，每隔2h取发酵液，平板梯度稀释法，35℃培养，220rpm培养48h计菌落总数，绘制生长曲线。

从图6可以看出，GF1在8h之后进入快速生长期，22h达到平台期，在实际生产的过程中应按照GF1的生长特点进行控制，如果要发酵种子液，可以选择在快速生长后期18h的发酵产物做种子，而大规模发酵生产则可以在22h进行二次投料，以期获得更大的生物量。

2.8 产酸芽孢菌GF1在小鼠上的免疫功能试验

2.8.1 菌株对小鼠脾脏指数的影响

表16  小鼠脾脏指数的变化

注：同行中肩标为不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)；同行中肩标为相同大写字母表示差异不是极显著(p＜0.01)；同行中肩标为不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)；同行中肩标为相同小写字母表示差异不显著(p＜0.05)。

对脾脏指数的影响，如表16所示，10d、30d时2组和3组都高于对照组，20d时三个试验组都高于对照组，说明该菌株能提高小鼠的脾脏指数，增强小鼠的免疫能力，而且30d时2组、3组与1组相比差异极显著(p＜0.01)，但随着试验周期的延长，脾脏指数逐渐下降，这可能是由于小鼠体重增长过快引起的。

2.8.2 菌株对小鼠溶菌酶活力的影响

表17  小鼠溶菌酶活力的变化

注：同行中肩标为不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)；同行中肩标为相同大写字母表示差异不是极显著(p＜0.01)；同行中肩标为不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)；同行中肩标为相同小写字母表示差异不显著(p＜0.05)。

对溶菌酶活力的影响，如表17所示，20d时试验组的酶活都高于对照组，说明该菌株能提高小鼠的溶菌酶活力，但随着试验周期的延长，溶菌酶活力逐渐下降，这可能是由于每次测定酶活时因标准管不同带来的操作误差引起的。

2.8.3 菌株对小鼠红细胞数量的影响

表18  小鼠红细胞数量的变化

注：同行中肩标为不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)；同行中肩标为相同大写字母表示差异不是极显著(p＜0.01)；同行中肩标为不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)；同行中肩标为相同小写字母表示差异不显著(p＜0.05)。

对红细胞数量的影响，如表18所示，20d时试验组均高于对照组，且2组与对照组相比差异显著(p＜0.05)，整个试验周期内，1组的红细胞数量逐渐上升，且20d和30d时均高于对照组，是比较合适的添加剂量。

2.8.4 菌株对小鼠白细胞数量的影响

表19  小鼠白细胞数量的变化

注：同行中肩标为不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)；同行中肩标为相同大写字母表示差异不是极显著(p＜0.01)；同行中肩标为不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)；同行中肩标为相同小写字母表示差异不显著(p＜0.05)。

对白细胞数量的影响，如表19所示，20d时试验组均高于对照组，而且2组与对照相比差异极显著(p＜0.01)，3组与对照相比差异显著(p＜0.05)，整个试验周期内，1组的白细胞数量逐渐上升，且20d和30d时均高于对照组，是比较合适的添加剂量。

2.8.5 菌株对小鼠血小板数量的影响

表20  小鼠血小板数量的变化

注：同行中肩标为不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)；同行中肩标为相同大写字母表示差异不是极显著(p＜0.01)；同行中肩标为不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)；同行中肩标为相同小写字母表示差异不显著(p＜0.05)。

对血小板数量的影响，如表20所示，10d和20d时试验组均高于对照组，且20d时试验组与对照组相比差异都极显著(p＜0.01)，1组和3组相比差异显著(p＜0.05)，这说明添加该菌株能提高血小板数量。

2.8.6 菌株对小鼠血红蛋白含量的影响

表21  小鼠血红蛋白含量的变化

注：同行中肩标为不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)；同行中肩标为相同大写字母表示差异不是极显著(p＜0.01)；同行中肩标为不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)；同行中肩标为相同小写字母表示差异不显著(p＜0.05)。

对血红蛋白含量的影响，如表21所示，20d时试验组均高于对照组，且2组与对照组相比差异显著(p＜0.05)。

2.8.7 菌株对小鼠淋巴细胞数量的影响

表22  小鼠淋巴细胞数量的变化

注：同行中肩标为不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)；同行中肩标为相同大写字母表示差异不是极显著(p＜0.01)；同行中肩标为不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)；同行中肩标为相同小写字母表示差异不显著(p＜0.05)。

对淋巴细胞数量的影响，如表22所示，20d和30d时试验组均高于对照组，且20d时2组和3组与对照相比差异显著(p＜0.05)，整个试验期间，1组和2组的淋巴细胞数量一直上升，说明1组和2组是较合适的添加剂量。

三、结论

本研究从新鲜牛粪中分离得到1株目标菌株，命名为GF1，根据形态观察、生理生化测定结果以及16S rDNA序列测定结果鉴定GF1为蜡样芽孢杆菌，GF1不仅具有良好的生长性能而且在发酵终点能够有效地形成芽孢。产酸芽孢杆菌GF1不仅具备乳酸菌的特点可以代谢产生有机酸，主要为乙酸和乳酸及少量丙酸和丁酸，而且可以形成芽孢，增强了其抗应激性，能够耐热、耐酸、耐胆盐，可以耐受高温制粒、低pH和高胆盐环境，顺利通过胃和十二指肠，进入肠道内发挥其益生菌的作用。饲用抗生素的抑菌试验表明GF1可以与部分抗生素同时使用，但为了保证GF1能够充分发挥益生素的作用，应尽量避免与抗生素同时使用或使用时先做抑菌试验。小鼠的急性毒性试验表明GF1安全无毒副作用，可以放心地作为益生素在饲料中添加使用。

通过对发酵条件的筛选，确定GF1最终发酵条件为：发酵液初始pH7.5，摇床转速220rpm，培养温度35℃，培养时间48h，生物量为3.5×10⁹cfu/g，芽孢率可达90％以上，接种量和通风量的结果则表明如果条件许可，可适当的提高接种量和通风量。

通过对培养基中碳源和氮源的优化，最终培养基配方调整为：酵母膏0.5％，蛋白胨0.6％，葡萄糖1.0％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.08％。

GF1能在一定程度上增强小鼠的免疫能力，提高机体免疫力

实施例二  产酸芽孢菌的工业大生产工艺

产酸芽孢菌液体工业大生产的发酵培养配方如下：

种子培养基：酵母膏0.5％，蛋白胨0.6％，葡萄糖1.0％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.08％。

液体发酵培养基：玉米粉：3.0％，豆粉：3.2％，麸皮：2.5％，硫酸铵：0.8％，硫酸镁：0.01％，磷酸氢二钠：1％，磷酸二氢钠：0.075％，柠檬三钠：0.1％。

产酸芽孢菌生产工艺流程如下：

(1)一级种子：斜面接种，500mL三角瓶装量100mL，35℃，220rpm摇床培养14h；接入二级种子液扩大培养。

(2)二级种子：5L三角瓶装量1L，接种量6％，35℃，220rpm摇床培养16h；接入三级种子液扩大培养。

(3)三级种子：100L发酵罐装量60L，4％接种，35℃，220rpm培养14h；接入发酵罐进行工业化生产。

(4)发酵罐培养条件：2％接种，35℃，220rpm培养28h，镜检形成芽孢90％左右，放罐，喷干，获得芽孢菌粉。

实施例三  复合微生态制剂M3应用试验

复合微生态制剂M3往往是几株益生菌联合配伍，以期更好的发挥益生菌的作用，为了将产酸芽孢菌GF1应用于生产以及为在颗粒料中的使用做理论依据，设计了复合微生态制剂M3。

1.复合微生态制剂M3配方

本品由三大耐高温菌种枯草芽孢杆菌N9-1-35(5×10⁸cfu/g)(已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2011301)、丁酸梭菌Cb-2(5×10⁸cfu/g)(已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2011384)、产酸芽孢菌GF1(1.0×10⁹cfu/g)及玉米淀粉(商品名称：玉米淀粉；商品号：6920420601219；生产厂家：山东金城股份有限公司)混合制成，三种菌粉及玉米淀粉的质量比为1∶2∶2∶5。在100g复合微生态制剂M3中，需要枯草芽孢杆菌N9-1-35菌粉10g、丁酸梭菌Cb-2菌粉20g、产酸芽孢菌GF1菌粉20g及玉米淀粉50g，复配方式为常规搅拌混合复配。

2.复合微生态制剂M3效果试验

2.1 生产性能的测定

肉鸡分别7、14、21、28、35日龄清晨空腹称重，计算各阶段的平均日增重、平均日采食量、饲料报酬、产蛋量；记录发病数与死亡数。

2.2 免疫性能测定

2.2.1 血浆总抗氧化能力的测定

分别在14、21、28、35和42日龄称重后静脉采血，肝素抗凝，3000rpm离心10min分离血浆，采用T-AOC检测试剂盒(南京建成)测定血浆总抗氧化能力。

2.2.2 免疫器官指数的测定

分别在14、21、28、35和42日龄称重后心脏打入空气法处死鸡只，解剖，取出胸腺、脾脏和法氏囊，分别称湿重，然后计算胸腺、脾脏和法氏囊指数。

2.2.3 血清(血浆)IgG水平的测定

分别在试验开始后14、21、28、35和42鸡翅静脉采血0.5mL，制备血清(血浆)，使用鸡免疫球蛋白G(IgG)Elisa试剂盒测定(上海江莱生物科技有限公司)。

3 产品肉鸡效果试验结果

3.1 各试验组料重比测定结果

由图7可以看出，M3的添加没有影响正常日采食量，试验初始阶段即2周龄时各组料重比差异不大，其中试验3组和对照组料重比最高为1.364，试验2组料重比最低为1.305；随着试验的进行，3周龄时对照组明显高于各试验组，其中试验3组最低，其次是试验1组；试验进行至4周龄和5周龄时，各试验组均低于对照组，其中以试验1组效果最好。结果表明，其中以试验1组效果最稳定，料重比最低表明添加M3之后，在不影响采食量的同时能够明显提高日增重，降低料重比。

3.2 各试验组总抗氧化能力比较

由图8可以看出，试验初始阶段，试验3组血浆T-AOC含量低于其它各组，3周龄时试验1组、2组和对照组血浆T-AOC均明显下降，这可能是因为肉仔鸡由箱养转变为笼养所造成的应激所致，由对照组下降最显著，随着M3的连续添加，4周龄和5周龄时试验1组、2组血浆T-AOC含量呈现上升趋势且显著高于空白对照组，而试验3组的检测结果却没有呈现规律性。试验结果表明M3的添加可以有效增强机体抗氧化水平，短时间内添加高浓度M3可以有效促进机体的抗氧化应激能力。

3.3 免疫器官指数比较

表23  各试验组脾脏指数比较表

从表23可以看出，试验初始阶段，试验3组脾脏指数最高，显著高于试验1组和对照组，试验3组与试验2组没有显著差异，随着试验的不断进行，试验1组、2组、3组的脾脏指数在不断增大，而对照组的脾脏指数在4周龄时最高之后又下降，至6周龄时，试验1组、2组和3组法氏囊指数差异不太，显著高于其它两组，对照组的脾脏指数最低。

表24  各试验组法氏囊指数比较

法氏囊指数的检测结果表明(表24所示)，2周龄时试验2组法氏囊指数最高，试验1组、2组、3组之间没有明显差异，均显著高于对照组，4周龄时试验2组和3组的法氏囊指数均有所增加，其中试验2组最高，显著高于其它3组，至6周龄时，各组法氏囊指数较4周龄时均明显下架，试验1组、2组和3组法氏囊指数明显高于对照组。

试验结果表明添加1‰和0.5％的M3对法氏囊指数的影响效果比较好，可能由于随着肉鸡日龄的增加，法氏囊已不再是最重要的免疫器官因而退化，而脾脏指数的不断升高逐渐替代法氏囊的免疫功能，致使低剂量的M3对法氏囊免疫效果没有明显的推动作用。

试验结果表明，长期使用M3可以提高脾脏、法氏囊器官指数。

3.4 各试验组血浆IgG水平比较

由图9可以看出，试验初始阶段，各组血浆IgG水平差异不大，随着试验的进行至5周龄，各组血浆IgG水平均呈现上升趋势，其中试验1组明显高于其它各组，空白对照组一直处于最低水平。由5周龄到6周龄，虽然由于试验后期饲养条件越来越差，导致鸡群免疫力下降，使得血浆IgG水平整体降低，但试验1组和试验2组血浆IgG水平依然高于对照组。结果表明，M3的添加可以通过提高血浆IgG水平，增强机体免疫力。

4、结论

1、使用M3，可以提高饲料报酬，降低料肉比，从而降低养殖成本.

2、M3的持续添加，可以增强机体的总抗氧化水平，降低各种氧化应激所产生的副作用。

3、长期使用M3可以提高脾脏、法氏囊器官指数。

4、饲料中添加M3，可以增加免疫器官指数，提高机体内IgG水平，增强机体产生抗体的能力，从而增强抵抗力。

Claims (9)

1.一株产酸蜡样芽孢杆菌，其特征在于：该菌株命名为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）GF-1，已于2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCM2011352。

2.权利要求1所述的产酸蜡样芽孢杆菌在制备微生态制剂中的应用。

3.一株产酸蜡样芽孢杆菌菌粉，其特征在于：是通过培养权利要求1所述的产酸蜡样芽孢杆菌制备得到的。

4.权利要求3所述的产酸蜡样芽孢杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）一级种子：斜面接种，500mL三角瓶装量100mL，35℃，220rpm摇床培养10～16h；接入二级种子液扩大培养；

（2）二级种子：5L三角瓶装量1L，接种量6%，35℃，220rpm摇床培养12～18h；接入三级种子液扩大培养；

（3）三级种子：100L发酵罐装量60L，4%接种，35℃，220rpm培养10～16h；接入发酵罐进行工业化生产；

（4）发酵罐培养条件：2%接种，35℃，220rpm培养26～32h，镜检形成芽孢90%，放罐，喷干，获得芽孢杆菌菌粉。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中种子培养基的配方为：酵母膏0.5%，蛋白胨0.6%，葡萄糖1.0%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.08%；所述步骤（2）（3）（4）中液体发酵培养基的配方为：玉米粉：3.0%，豆粉：3.2%，麸皮：2.5%，硫酸铵：0.8%，硫酸镁：0.01%，磷酸氢二钠：1%，磷酸二氢钠：0.075%，柠檬酸三钠：0.1%。

6.权利要求3所述的产酸蜡样芽孢杆菌菌粉在制备微生态制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：应用时，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉单独作为有效成分与玉米淀粉混合制成微生态制剂，或：产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与其它至少一种有效成分以及玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：应用时，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与枯草芽孢杆菌N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉和玉米淀粉混合制成复合微生态制剂；

所述枯草芽孢杆菌N9-1-35命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2011301；

所述丁酸梭菌Cb-2命名为：丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Cb-2，已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2011384。

9.一种复合微生态制剂，其特征在于：由产酸蜡样芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉及玉米淀粉混合制成，其中，三种菌粉及玉米淀粉的质量比为1∶2∶2∶5，各菌粉的活菌数分别大于或者等于1.0×10⁹cfu/g、5.0×10⁸cfu/g、5.0×10⁸cfu/g。

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