CN116396874A - 一种丁酸梭菌的联合发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丁酸梭菌的联合发酵方法，包括如下步骤：将酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌依次错时接种至液态培养基中，不额外提供无氧环境，进行丁酸梭菌的联合发酵。本发明的联合发酵方法提供了一种绿色节能培养新模式，在联合液态发酵过程中通过错时接种方法，满足了丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的生长需求，联合发酵产物中丁酸梭菌的活菌数和芽孢数可达2.73×109cfu/mL和2.65×109cfu/mL，有效解决现有技术中丁酸梭菌混合发酵中丁酸梭菌浓度较低的问题。而且本发明中联合发酵离心废液的回收利用减少了废水处理造成的资源浪费，降低了相关企业对发酵废水处理的成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种丁酸梭菌的联合发酵方法，属于微生态制剂生产方法技术领域。
背景技术
近年来，微生态制剂在医药保健、食品、饲料、畜禽养殖等领域发挥着重要的作用，随着“限抗令”的逐步推行，微生态制剂越来越多地应用到畜禽养殖领域。研究证明微生态制剂可以维持动物肠道内的菌群平衡，防止肠道感染，提高动物机体免疫力。另外，由于益生菌能分泌多种消化酶，微生态制剂对提高饲料利用率、改善动物生产性能、提高畜禽产品质量起到了锦上添花的作用。
丁酸梭菌具有极强的整肠作用，由于其在调节动物肠道功能、改善动物生长性能、增强免疫力方面的巨大优势，被越来越多地应用到饲料添加剂中。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属，临床上多用来调节肠道的菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖。酿酒酵母能促进饲料中营养物质的吸收、提高动物机体免疫力，其本身也是营养丰富的单细胞蛋白，具有缩短饲养期、改善肉质和提高瘦肉率的作用。
丁酸梭菌是严格的厌氧菌，在其发酵过程中，需要在石蜡油或氮气、二氧化碳等惰性气体维持的厌氧环境中进行，这增加了丁酸梭菌发酵过程中设备的复杂性和方法难度，增加了生产成本。
为解决上述问题，公开号为CN111500508A中国发明专利申请公开了一种丁酸梭状芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌液体混合发酵方法，制备凝结芽孢杆菌和丁酸梭菌的种子液后，同时接种至液态培养基中发酵培养。该混合发酵方法，丁酸梭菌活菌数和芽孢数可以达到5.8×108cfu/mL和5.3×108cfu/mL。
公开号为CN110241053A中国发明专利申请公开了一种混合发酵培养丁酸梭菌的方法，首先分别对丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌进行单独培养获得单菌培养液后，按一定比例混合后进行混和培养。该混合发酵培养方法，丁酸梭菌的浓度可以达到1×109cfu/mL。
但是，上述混合发酵的方法均是同时接种，其中凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌生长快，消耗营养物质过多，在一定程度上影响最终发酵产物中丁酸梭菌的浓度。因此，开发出一种方法简单、成本较低，且丁酸梭菌的浓度更高的发酵方法是亟待解决的问题。
发明内容
为实现解决上述问题，本发明的目的是提供一种丁酸梭菌的联合发酵方法，避免了丁酸梭菌厌氧发酵过程中需要氮气或厌氧剂提供无氧条件，增加发酵成本和设备投资的问题，又解决现有技术中丁酸梭菌混合发酵中丁酸梭菌浓度较低的问题。
为了实现上述目的，本发明中丁酸梭菌的联合发酵方法的技术方案是：
一种丁酸梭菌的联合发酵方法，包括如下步骤：将酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌依次错时接种至液态培养基中，不额外提供无氧环境，进行丁酸梭菌的联合发酵。
上述技术方案的有益效果在于：本发明将酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌错时接种至液态培养基中联合发酵培养。在联合发酵中，酿酒酵母和嗜酸乳杆菌足以消耗培养基中的氧气，为丁酸梭菌的培养提供厌氧的环境，且完成增殖过程的同时消耗的营养物质少，将更多营养分配给丁酸梭菌，发酵完成后获得的混合发酵液中，丁酸梭菌的活菌数和芽孢数可以达到2.73×109cfu/mL和2.65×109cfu/mL。
作为进一步地改进，所述错时接种为先将酿酒酵母接种至液态培养基中，5～8h后接种嗜酸乳杆菌，12～16h后接种丁酸梭菌。优选地，液态培养基的初始pH为6.8～7，装罐系数为40～50％，将酿酒酵母以4～5％的接种量接种至液态培养基中，于35～37℃的条件下培养5～8h后，再以2～3％的接种量接种嗜酸乳杆菌继续培养，12～16h后，最后以4～5％的接种量接种丁酸梭菌。
上述技术方案的有益效果在于：嗜酸乳杆菌为兼性厌氧菌，能在酵母菌的基础上进一步消耗完体系中的氧气，为丁酸梭菌的发酵营造严格厌氧的环境。
作为进一步地改进，所述联合发酵的最终发酵液中，丁酸梭菌的活菌数和芽孢数不少于2×109cfu/mL。
上述技术方案的有益效果在于：本发明利用错时接种酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌，能显著提高丁酸梭菌的量，最终的联合发酵液中，丁酸梭菌的活菌数和芽孢数可以达到2.73×109cfu/mL和2.65×109cfu/mL。
作为进一步地改进，所述联合发酵的最终发酵液中，嗜酸乳杆菌的活菌数不少于1×1010cfu/mL，酿酒酵母的活菌数不少于3×109cfu/mL。
上述技术方案的有益效果在于：本发明利用错时接种酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌，能最大限度地实现资源合理利用，最终的联合发酵液中，酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的活菌数可以达到3.71×109cfu/mL和1.69×1010cfu/mL。
作为进一步地改进，所述液态培养基的成分包括：葡萄糖5～25g/L、麸皮6～10g/L、酵母膏5～15g/L、蛋白胨5～20g/L、硫酸镁0.1～5g/L、磷酸氢二钾0.1～5g/L、碳酸钙5～10g/L。
上述技术方案的有益效果在于：本发明从酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌各自的发酵特点和生产成本出发，对联合液态培养基的成分进行优化。优化得到的该配方能保证混合发酵过程的顺利进行，获得的活菌数较高，且成本较低。
作为进一步地改进，所述联合液态发酵的过程中pH控制范围为6.0～7.0。
上述技术方案的有益效果在于：在联合液态发酵的过程中pH控制在6.0～7.0之间能有效提高丁酸梭菌芽孢率，还可以提高丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的活菌数。
作为进一步地改进，所述联合液态发酵时发酵罐装液系数为30％～70％。
上述技术方案的有益效果在于：在保证成功发酵的同时，节省生产成本、降低投入。
作为进一步地改进，所述丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的接种量为2％～6％。
上述技术方案的有益效果在于：此接种量能保证发酵过程正常进行，最终产物中丁酸梭菌和芽孢数可达到一个较高的水平。
作为进一步地改进，在接种丁酸梭菌后5～7h开始补料，补料至对数期结束。
上述技术方案的有益效果在于：补料时机和持续时间影响发酵的最终结果，按上述补料方案可以有效提高混合培养中丁酸梭菌的芽孢率。
作为进一步地改进，所述补料包括第一次补料和第二次补料，第一次补料结束后直接开始第二次补料；所述第一次补料的补料液成分为葡萄糖4～10g/L，持续6～8h；所述第二次补料的补料液成分为葡萄糖4～10g/L，蛋白胨2～6g/L，磷酸氢二钾1～3g/L，持续至对数期结束。具体地，补料液的溶剂为水。
上述技术方案的有益效果在于：按上述补料的补料液成分进行分次补料，能有效地保证能源利用的最大化。
作为进一步地改进，所述联合发酵方法包括将联合发酵的发酵离心液接种至固态发酵培养基中，经固态发酵获得饲料添加剂。
上述技术方案的有益效果在于：联合发酵的发酵离心废液含有丰富的蛋白、多糖和无机盐等营养物质，还含有未被彻底离心的菌体，将其回收利用后减少了废水处理造成的资源浪费，且减轻了环保的压力，最大限度地利用了资源，同时降低了相关企业对发酵废水处理的成本。
作为进一步地改进，所述固态发酵培养基的成分包括10～20％的麸皮，40％～80％的豆粕，1％～10％的小麦秸秆，1％～10％的玉米秸秆，1％～10％的花生秸秆，0.05％～0.15％的硫酸镁，0.5％～1.5％的碳酸钙，0.5％～1.5％的磷酸氢二钾。
上述技术方案的有益效果在于：固态发酵的培养基中含有大量的秸秆，将农作副产物秸秆回收利用、节约资源的同时，为相关企业降低生产成本。
作为进一步地改进，所述固态发酵的条件为30～37℃培养3～7d。
作为进一步地改进，所述发酵离心液的接种量为2％～6％(v/m)。
附图说明
图1是本发明实施例1中丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的生长曲线；
图2是本发明实施例2中碳源对菌株生长的影响；
图3是本发明实施例2中氮源对菌株生长的影响；
图4是本发明实施例2中无机盐对菌株生长的影响；
图5是本发明实施例3中温度对菌株生长的影响；
图6是本发明实施例3中pH对菌株生长的影响；
图7是本发明实施例3中装液系数对菌株生长的影响；
图8是本发明实施例3中摇瓶培养条件优化后各菌株的生长曲线；
图9是本发明实施例4中10L罐发酵过程中补料液碳氮比对菌株生长的影响；
图1-9中：左侧纵坐标适用于丁酸梭菌和酿酒酵母的菌浓，右侧纵坐标适用于嗜酸乳杆菌的菌浓。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例中所用的各类试剂、仪器等均为市售商品。
下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：
培养基：
丁酸梭菌活化培养基与种子培养基组分相同，包括：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉3g/L、葡萄糖5g/L、可溶性淀粉1g/L、氯化钠5g/L、醋酸钠3g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，琼脂0.5g/L，pH 6.8；
丁酸梭菌计数培养基：在RCM液体培养基成分中再加入2.0％的琼脂粉；
嗜酸乳杆菌活化培养基与种子培养基组分相同，均为MRS液体培养基，包括：酪白蛋白胨10g/L、牛肉浸取物10g/L、酵母提取液5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸二胺2g/L、吐温80 1g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸锰0.05g/L、碳酸钙20g/L，pH 6.8；
嗜酸乳杆菌计数培养基：在MRS液体培养基成分中再加入2.0％的琼脂粉；
酿酒酵母活化培养基与种子培养基组分相同，均为YPD培养基，包括：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，pH 5.6；
酿酒酵母计数培养基：在YPD液体培养基成分中再加入2.0％的琼脂粉。
一、一种丁酸梭菌的联合发酵方法的具体实施例
实施例1菌种生长曲线的测定
丁酸梭菌的培养方式：液体深层静置培养，锥形瓶装液系数60％，接种量4％，用8层纱布和2层牛皮纸封口，37℃静置培养48h。
嗜酸乳杆菌的培养方式：液体深层静置培养，锥形瓶装液系数40％，接种量4％，用8层纱布封口，37℃静置培养48h。
酿酒酵母的培养方式：液体摇瓶培养，锥形瓶装液系数40％，接种量5％，于30℃180r/min培养48h。
按照上面的方法进行菌种活化与培养，在培养期间间每隔4h取样测定活菌数分别绘制其生长曲线，如图1所示。
根据图1可知，三菌种生长曲线，对数后期菌浓高，菌体生命力旺盛，故丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母种子培养时间分别选择16h、18h和36h。
实施例2混合发酵中联合液态培养基成分的优化
混合培养初始发酵方式：根据丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的生长曲线，以RCM培养基为初始联合培养基，先将酿酒酵母以4％的接种量接种至联合液态培养基中，6h后将嗜酸乳杆菌以4％的接种量接种至联合液态培养基中，14h后将丁酸梭菌以4％的接种量接种至联合培养基中，锥形瓶装液系数为50％，37℃静置培养，锥形瓶用8层纱布和2层牛皮纸封口。
错时接种的时间间隔选择原理为：根据图1丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的生长曲线可知，三种菌种进入对数生长期的时间，如果酿酒酵母进入对数生长期后会快速生长并消耗氧气，此时是接种需氧量较少的嗜酸乳杆菌的最佳接种时机，如接种晚会消耗更多的营养成分，为目标丁酸梭菌剩下的营养减少。
在初始培养基的基础上对碳源葡萄糖进行优化，选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、麸皮、黄豆粕共8种碳源探索不同碳源对联合培养菌种生长的影响。
利用选定的优化碳源，从蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、玉米浆干粉、豆粕粉、鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉中选取优选氮源。
根据碳源和氮源种类优化结果设计正交实验，对碳源和氮源的浓度进行优化，碳源浓度设置15g/L、20g/L、25g/L三个浓度，氮源浓度设置为10g/L、20g/L、30g/L三个浓度。
初试时选无机盐有硫酸镁、硫酸锰、磷酸氢二钾、三水合乙酸钠、碳酸钙、氯化钠、氯化钾。在无机盐种类优化基础上，设计正交实验，对无机盐浓度进行优化。在优化过程中选取丁酸梭菌活菌数及其芽孢数、嗜酸乳杆菌活菌数、酿酒酵母活菌数为考察指标，以丁酸梭菌作为主要考察对象，每组试验重复3次。
2.1、碳源的优化
由图2可以看出，葡萄糖为碳源时，丁酸梭菌活菌数远高于其他碳源；碳源为麦芽糖时嗜酸乳杆菌和酿酒酵母活菌数最多；麸皮为碳源时丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的活菌数均较理想。为进一步优化碳源，将葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖分别与麸皮复合，来探索复合碳源对菌种生长的影响，结果如表1。
表1复合碳源的优化结果
注：组合一为葡萄糖12g/L+麸皮8g/L；组合二为麦芽糖10g/L+麸皮10g/L；组合三为蔗糖12g/L+麸皮8g/L；组合四为乳糖10g/L+麸皮10g/L；对照为葡萄糖20g/L。
由表1可知，复合碳源的效果比使用单一碳源理想，可见，复合碳源更利于三菌联合培养。复合碳源为葡萄糖和麸皮时，丁酸梭菌的活菌数和芽孢数达到了最大值，复合碳源为麦芽糖和麸皮时，嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的活菌数达到了最大值，丁酸梭菌的活菌数和芽孢数略低于组合一。综合考虑，选取葡萄糖和麸皮作为联合培养的碳源。
2.2、氮源的优化
由图3可见，当氮源为酵母膏时，丁酸梭菌的活菌数和芽孢数均最高，分别达到了2.36×107cfu/mL和2.12×107cfu/mL，并且嗜酸乳杆菌的活菌数也远远高于其他氮源。氮源为蛋白胨时，酿酒酵母的活菌数达到最大值。查阅相关文献发现，复合氮源能达到更优的效果，故本实验结果将酵母膏和其他氮源进行复合，结果如表2。
表2复合氮源的优化结果
注：酵母膏和其他氮源比例1:1，氮源含量为20g/L，对照为20g/L酵母膏。
由表2可知，在复合氮源为酵母膏和蛋白胨的组合中，丁酸梭菌的活菌数及芽孢数、嗜酸乳杆菌的活菌数均达到了最大值；复合氮源为酵母膏和鱼粉时，酿酒酵母的活菌数达到了最大值。而以酵母膏和其他氮源为复合氮源的组合中，三菌的活菌数较酵母膏单独使用时均有不同程度的提高。综合考虑，选取酵母膏和蛋白胨的复合氮源。
2.3、碳源及氮源浓度配比的优化
通过单因素实验确定了最佳碳源和氮源的种类，其浓度与配比对菌体生长也有很大影响，因此设计正交实验来进一步确定复合碳、氮源的最优添加比例，用SPSS 20.0软件设计L9(34)正交表如表3。
表3碳源及氮源浓度配比的正交试验因素水平表
对结果进行极差和K值分析，结果见表4。
表4碳源及氮源浓度配比的正交试验结果
注：A1、B1、C1分别对应表中的各物质的第一水平，如A1代表葡萄糖的添加量为15g/L。
由表4可知：丁酸梭菌活菌数影响大小为D＞B＞C＞A，说明蛋白胨对丁酸梭菌活菌数影响较大；丁酸梭菌芽孢数影响大小为B＞D＞A＞C，说明麸皮对丁酸梭菌转孢影响较大；嗜酸乳杆菌活菌数影响大小为B＞C＞A＞D，说明麸皮对嗜酸乳杆菌活菌数影响较大；酿酒酵母活菌数影响大小为C＞B＞D＞A，说明酵母膏对酿酒酵母活菌数影响较大。通过比较K值可得优化实验条件为：A3B2C3D3，但此方法条件不在实施的实验中，验证试验结果为丁酸梭菌活菌数4.67×108cfu/mL，丁酸梭菌芽孢数3.63×108cfu/mL，嗜酸乳杆菌活菌数9.35×109cfu/mL，酿酒酵母的活菌数为2.27×108cfu/mL。
2.4、无机盐的优化
无机盐对发酵菌体的影响效果虽不及碳源和氮源，但适量的添加可促进菌体健康快速的生长繁殖，提高其代谢产物量。几种常见的无机盐对菌体生长影响结果如图4，氯化钠和氯化钾添加量分别为5g/L，磷酸氢二钾和碳酸钙添加量分别为1g/L和5g/L，硫酸锰和硫酸镁的添加量分别为0.3g/L，三水合乙酸钠的添加量为3g/L，对照为不添加无机盐。
由图4可知，磷酸氢二钾可促进丁酸梭菌生长和转孢，无机盐为碳酸钙时嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的活菌数均达到了最大值。为进一步确定无机盐的成分，选取磷酸氢二钾和三水合乙酸钠、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙这四种结果较好的无机盐进行复合无机盐的优化，结果如表5。
表5复合无机盐的优化结果
注：组合一磷酸氢二钾和三水合乙酸钠；组合二为磷酸氢二钾和硫酸锰；组合三为磷酸氢二钾和硫酸镁；组合四磷酸氢二钾和碳酸钙；对照为单独添加磷酸氢二钾。
由表5可知，组合三和组合四中丁酸梭菌的活菌数相当，且磷酸氢二钾与碳酸钙的组合丁酸梭菌芽孢数结果更优，此时丁酸梭菌活菌数达到了4.05×108cfu/mL，芽孢数达到3.75×108。由此结果可知，可选用磷酸氢二钾、硫酸镁和碳酸钙作为联合培养基中最佳无机盐成分。
上述实验结果表明磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙为最佳无机盐，用SPSS 20.0软件设计L9(33)正交表探究三者的浓度和配比，并对其结果进行分析，正交试验因素和水平如表6。
表6复合无机盐配比正交试验因素水平表
对结果进行极差和K值分析，结果见表7。
表7复合无机盐配比正交试验结果
注：A1、B1、C1分别对应表中的各物质的第一水平，如A1代表磷酸氢二钾的添加量为2g/L。
通过对实验进行极差分析可知：丁酸梭菌活菌影响力大小为C＞B＞A；芽孢数影响力大小为C＞B＞A；嗜酸乳杆菌活菌数影响力大小为C＞A＞B；酿酒酵母活菌数量的影响力大小为A＞B＞C。通过比较K值大小可得最佳实验条件为A2B3C3，即磷酸氢二钾的添加量为3.0g/L，硫酸镁的添加量为0.8g/L，碳酸钙的添加量为8g/L，所得丁酸梭菌活菌数为5.24×108cfu/mL，芽孢数为4.32×108cfu/mL，嗜酸乳杆菌活菌数为1.05×1010cfu/mL，酿酒酵母活菌数为2.74×108cfu/mL。
综上混合发酵中联合液态培养基成分优化的结果可知，本发明的最优联合液态培养基包括葡萄糖25g/L，麸皮6g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁0.8g/L、碳酸钙8g/L。
实施例3联合发酵培养条件的优化
在实施例2获得的最优发酵培养基的基础上，对联合发酵培养条件进行优化。在250mL锥形瓶中装入50％体积培养基，初始pH为6.5；灭菌，冷却后接入4％丁酸梭菌、4％嗜酸乳杆菌、4％酿酒酵母种子，37℃静置培养42h后检测菌体浓度。
3.1、发酵温度的优化
发酵温度选择30℃、33℃、37℃、40℃、42℃、45℃考察发酵温度对发酵的影响，结果如图5所示。由图5可以看出，温度对联合发酵过程中菌株的生长影响较显著，当温度在30～37℃范围内时，丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母的菌体浓度随温度的升高而逐渐增加，在33℃时，酿酒酵母的活菌数达到最大值，为2.45×108cfu/mL。在37℃时丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌的活菌数均达到最大值，分别为4.96×108cfu/mL和9.14×109cfu/mL。温度超过42℃后丁酸梭菌的活菌数明显下降。结合相关文献及本实验研究结果，联合发酵时要综合考虑三菌的生长特性，故将三菌联合发酵的温度定为37℃。
3.2、pH的优化
调整联合发酵培养中的pH分别为5.5、5.7、6.0、6.5、6.8、7.2、7.5，考察pH对联合发酵过程中菌株生长的影响，由图6的结果可以看出：在初始pH为5.5时，丁酸梭菌几乎不怎么生长，而在初始pH为5.5～6.8范围内，丁酸梭菌的活菌数随着初始pH的升高而逐渐增加，当初始pH为6.8时，丁酸梭菌的活菌数达到最高。嗜酸乳杆菌在初始pH为5.5时可以生长，当初始pH为5.7时活菌数达到最大值。酿酒酵母随pH的变化生长曲线较平缓，当初始pH为6.5时，酿酒酵母活菌数达到最大值。查阅相关文献并结合本实验的研究结果，将三菌联合发酵的最适初始pH定为6.8。
3.3、装液系数的优化
选取30％、40％、50％、60％、70％五个梯度考察装液系数对联合发酵的影响。由图7可以看出，装液系数为50％时，丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌的活菌数达到最高，装液系数为40％时，酿酒酵母的活菌数达到最高，但丁酸梭菌的活菌数略有下降，考虑到过高的装液系数不利于丁酸梭菌的生长，故将此三菌联合发酵的最适装液系数定为50％。
3.4、接种量的优化
以丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的接种量为三个因素，每个因素设置3个水平，按L9(33)正交表如表8进行试验。
表8接种量正交试验因素水平表
用SPSS 20.0软件对正交试验结果进行分析，所得最佳接种比例优化结果如表9所示。
表9接种量正交试验结果
注：A1、B1、C1分别对应表中的各物质的第一水平，如A1代表丁酸梭菌的接种量为2％。
由极差分析可知，对丁酸梭菌活菌数的影响力大小为C＞A＞B；对丁酸梭菌芽孢数的影响力大小为A＞C＞B；对嗜酸乳杆菌的活菌数影响力大小为A＞B＞C；对酿酒酵母活菌数的影响力大小为A＞C＞B。通过比较K值大小可得最佳实验条件为A3B1C2，即丁酸梭菌的接种量为5％，嗜酸乳杆菌的接种量为2％，酿酒酵母的接种量为4％。以此接种进行试验的结果为丁酸梭菌的活菌数为5.12×108cfu/mL，芽孢数为4.23×108cfu/mL，嗜酸乳杆菌的活菌数为1.01×1010cfu/mL，酿酒酵母的活菌数为2.41×108cfu/mL。
3.5、发酵时间的优化
按照上述发酵方法，先将酿酒酵母以4％的接种量接种至联合液态培养基培养6h后，将嗜酸乳杆菌以2％的接种量接种至联合液态培养基中，14h后，将丁酸梭菌以5％的接种量接种至联合培养基中。在0～48h内每4小时取样检测菌体浓度，以确定培养时间，结果如图8所示。由图8可以看出，在4～20h，酿酒酵母利用培养基中的营养成分迅速繁殖，8～20h时，嗜酸乳杆菌迅速生长，两菌在大量繁殖的同时消耗培养基中残留的氧气为丁酸梭菌的生长提供无氧环境。18h时丁酸梭菌开始繁殖，并迅速进入对数期，在20～30h，丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌、酿酒酵母共同生长，嗜酸乳杆菌、酿酒酵母为丁酸梭菌的生长提供营养环境，丁酸梭菌则为其他两菌提供维生素等生长因子。丁酸梭菌在34h开始生成孢子，42h活菌数达到最大值，但此时芽孢率的绝对值略低于40h。综合考虑，将42h作为混合发酵的终点。
实施例4补料方法的优化
在10L发酵罐中装入50％体积优化后的联合液态培养基，初始pH调至6.8，121℃灭菌30min，冷却后溶氧设置为100％，接种4％的酿酒酵母种子，于33℃，160rpm培养6h后溶氧降低至60％时，接种2％的嗜酸乳杆菌并于37℃静置培养，8h后溶氧降低至为10％，接种5％的丁酸梭菌于37℃静置培养。静置培养期间每20min间歇以50rpm搅拌2min以防止培养沉淀。20h开始补入10g/L葡萄糖，持续流加8h，第一次补料后马上进行二次补料，补料液为葡萄糖8g/L，蛋白胨2g/L，磷酸氢二钾1g/L组成的复合补料液，补料至对数期结束，对复合补料液碳源和氮源含量和比例进行探究。在发酵过程中定时取样至48h，检测菌体浓度和发酵液残糖含量，结果如图9所示。由图9可以看出，补料液中碳源对酿酒酵母的影响较大，氮源对嗜酸乳杆菌的影响较大。当补料液中只有葡萄糖时，丁酸梭菌活菌数有所增加，加入不同比例的氮源后，丁酸梭菌活菌数和芽孢率有所提高，当碳氮比为2:1时，丁酸梭菌活菌数达到最高，丁酸梭菌芽孢率也较高，此时发酵液中的活菌数也最高。综合考虑，将丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母联合发酵中补料液的碳氮比定为2:1。
在发酵过程中，控制pH为6.8或不调整pH，发酵过程补料或不补料，考察发酵过程中pH和补料对发酵的影响，具体结果见表10。
表10流加补料并调节pH发酵结果
注：对照1为调控pH为6.8，不补料，对照2为自然发酵，不进行补料和调节pH。
由表10可知，补料和pH控制对发酵结果有着重要影响，通过补料和pH控制可有效提高丁酸梭菌芽孢率，还可以提高丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的活菌数。
实施例5联合发酵离心废液的回收利用
将联合发酵液于4000rpm离心10min，菌泥用于通过喷雾干燥法制备菌粉，上清液中含丁酸梭菌1.25×107cfu/mL，嗜酸乳杆菌2.76×108cfu/mL，酿酒酵母2.54×106cfu/mL，可用作进行固态饲料发酵的种子液。
制备固态培养基：先将花生、玉米和小麦秸秆粉碎至50目。然后将本实施例中设计的含量将花生秸秆、玉米秸秆、小麦秸秆、的麸皮、豆粕、硫酸镁、碳酸钙和的磷酸氢二钾混合均匀，于121℃灭菌20min。
取灭菌固态发酵培养基5.0Kg，装入带单向放气阀的发酵袋中，每袋500g，将上清液按照不同比例加入袋中，搅拌均匀后封口，置于培养箱中37℃培养7天，期间每天通过抖动使物料混合均匀。
固态发酵培养基中的麸皮豆粕比、料水比和菌种接种量是固态饲料发酵工艺中比较重要的影响因素，根据文献和本课题积累的经验，进行下述工艺优化研究。
5.1、麸皮豆粕比、料水比和上清液接种量优化
为达到最好的固态发酵结果，以粉碎后的花生秸秆、玉米秸秆、小麦秸秆比例为1:1:1(三者各占6.5％)，麸皮豆粕总量80％,硫酸镁的添加量为0.1％，磷酸氢二钾的添加量为0.1％，碳酸钙的添加量为0.5％为初始条件，选择麸皮豆粕比、料水比和上清液接种量三个因素，按L9(33)正交表如表11进行正交试验。
表11麸皮豆粕比、料水比和上清液接种量正交试验因素水平表
用SPSS 20.0软件对正交试验结果进行分析，所得最佳优化结果如表12所示。
表12麸皮豆粕比、料水比和上清液接种量正交试验结果
注：A1、B1、C1分别对应表中的各物质的第一水平，如A1代表麸皮豆粕比为1:2。
分析极差可知，各因素对丁酸梭菌活菌数影响力大小为A＞C＞B，对嗜酸乳杆菌活菌数的影响力大小为C＞A＞B，对酿酒酵母活菌数的影响力大小为C＞B＞A。通过比较K值可得最佳实验条件为A2B1C2，即麸皮豆粕比为1:3，料水比为1:0.5，上清液的接种量为15％，以此条件进行验证试验，结果为：丁酸梭菌的活菌数为3.93×107cfu/g，嗜酸乳杆菌的活菌数为7.51×108cfu/g，酿酒酵母的活菌数为7.94×106cfu/g。
5.2、小麦、玉米和花生秸秆添加比例优化
得到上述发酵条件后，在此条件的基础上，选择小麦秸秆添加比例、玉米秸秆添加比例和花生秸秆添加比例三个因素，按L9(33)正交表如表13进行正交试验。
表13小麦、玉米和花生秸秆添加比例正交试验因素水平表
用SPSS 20.0软件对正交试验结果进行分析，所得最佳优化结果如表14所示。
表14小麦、玉米和花生秸秆添加比例正交试验结果
注：A1、B1、C1分别对应表中的各物质的第一水平，如A1代表小麦秸秆的添加比例为15％。
分析极差可知，各因素对丁酸梭菌活菌数影响力大小为B＞C＞A，对嗜酸乳杆菌活菌数影响力大小为C＞B＞A，对酿酒酵母活菌数影响力大小为A＞B＞C。通过比较K值可得小麦秸秆、玉米秸秆、花生秸秆的最佳添加比例为A1B2C3，即小麦秸秆的添加比例为5％，玉米秸秆和花生秸秆的添加比例均为7％，以此条件进行验证试验，结果为：丁酸梭菌活菌数为2.63×108cfu/g，嗜酸乳杆菌的活菌数为4.62×109cfu/g，酿酒酵母的活菌数为2.56×108cfu/g。
5.3、无机盐添加量的优化
为进一步优化无机盐的添加量，在以上优化条件的基础上，选择硫酸镁、磷酸氢二钾和碳酸钙添加量三个因素，按L9(33)正交表如表15进行正交试验。
表15无机盐添加量正交试验因素水平表
用SPSS 20.0软件对正交试验结果进行分析，所得最佳优化结果如表16所示。
表16无机盐添加量正交试验结果
注：A1、B1、C1分别对应表中的各物质的第一水平，如A1代表硫酸镁的添加量为0.1g/L。
分析极差可知，各因素对丁酸梭菌活菌数影响力大小为A＞B＞C，对嗜酸乳杆菌活菌数的影响力大小为C＞B＞A，对酿酒酵母活菌数的影响力大小为B＞A＞C，通过比较K值可得硫酸镁、磷酸氢二钾、碳酸钙的最佳添加比例为A1B2C3，即硫酸镁的添加量为0.1g/L，磷酸氢二钾的添加量为0.3g/L，碳酸钙的添加量为10g/L，以此条件进行验证试验，结果为：丁酸梭菌活菌数为4.86×108cfu/g，嗜酸乳杆菌的活菌数为6.65×109cfu/g，酿酒酵母的活菌数为4.57×108cfu/g。
综上，由上述正交试验已得出利用离心上清液和农作物副产物进行固态发酵的最佳实验条件，即麸皮豆粕比为1:3(麸皮20％，豆粕60％)，小麦秸秆的添加比例为5％，玉米秸秆和花生秸秆的添加比例均为7％，硫酸镁的添加量为0.1％，磷酸氢二钾的添加量为0.3％，碳酸钙的添加量为1％。料水比为1:0.5，上清液的接种量为15％。在固态发酵后，固态发酵产物中丁酸梭菌活菌数达到了4.86×108cfu/g，嗜酸乳杆菌的活菌数达到了6.65×109cfu/g，酿酒酵母的活菌数达到了4.57×108cfu/g。
二、实验例
实验例1液态发酵效果对比
除了探索一种丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的联合液态发酵工艺之外，在本申请前期也探索了一种丁酸梭菌和酿酒酵母的联合液态发酵方法，并对其进行工艺优化，所得结果如表17。
表17联合液态发酵中不同发酵菌种发酵结果对比
由表17可知，添加嗜酸乳杆菌可以进一步消耗发酵过程中的氧气，为丁酸梭菌的发酵提供良好环境，增加发酵终产物中的丁酸梭菌活菌数和芽孢数。
实验例2固态发酵效果对比
将按照实施例2～4中优化得到的培养基配方和发酵工艺进行液态发酵，所得发酵液离心所得上清液用于固态饲料发酵的种子。
将上清液按照15％的比例分别接种于实施例5优化的固态发酵培养基中，同时按照15％比例接种于传统固态培养基(包括24.7％麸皮、74.1％豆粕、硫酸镁的添加量为0.1％，磷酸氢二钾的添加量为0.3％，碳酸钙的添加量为1％)中，用封口膜密封，37℃置于培养箱中培养42h。结果见表18。
表18固态发酵效果对比
从表18中可以看出，与传统固态培养基相比，以花生秸秆、玉米秸秆和小麦秸秆作为一部分培养基成分进行固态发酵所得到的丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的活菌数与传统固态发酵结果相当。由此可知，利用秸秆代替一部分培养基成分也可达到较为理想的发酵结果，但成本更低。
实验例3固态发酵产物的动物喂养实验
本实验例用于说明固态发酵产物对于犊牛生长状态及免疫力的影响。
选取50日龄(80kg)左右健康犊牛30头，随机分成3组，每组10只，对照组饲喂基础日粮，实验组一在饲喂基础饲料的基础上据犊牛体重每日添加0.5g/Kg实施例五中的固态发酵产物，实验组二在饲喂基础饲料的基础上据犊牛体重每日添加1g/Kg专利CN108048355A《一种丁酸梭菌发酵产物以及丁酸梭菌固态发酵方法》中的复合菌剂(根据专利中记载的制备方法进行制备，该复合菌剂的主要成分包括豆粕、麦麸、玉米粉、碱性蛋白酶和α-淀粉酶等)，采用漏斗式饲槽自由采食，供水充足，日常管理按照常规，共进行为期35天的饲喂实验。
基础饲料成分组成：玉米44.5％，豆粕20％，棉籽粕10％，麸皮20％，石粉1％，碳酸氢钙1.5％，食盐0.8％，小苏打1.2％，预混料1％。
在实验开始(0天)，7天，21天与试验结束时(35天)分别称量饲料重量并在实验结束时(35天)称量犊牛重量。每日上午9点统计腹泻犊牛数量，计算平均日增重(averagedaily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed:gain，F/G)。
平均日增重(ADG)＝(试验末重－试验初重)/试验天数；
料重比＝平均日采食量/平均日增重；
腹泻率＝腹泻牛头数/(试验牛头数×总天数)×100％，
其中，实验期腹泻犊牛头次＝第1天腹泻犊牛数+第2天腹泻犊牛数+……第35天腹泻犊牛数。
采用SAS(Statistical Analysis)7.2版本进行统计分析和方差分析，结果以P＜0.05为显著。显著性差异用字母标记法表示：首先将全部平均数从大到小依次排列，然后在最大的平均数上标字母a；并将该平均数与以下各平均数相比，凡相差不显著的，都标上字母a，直至某一个与之相差显著的平均数，标记字母b；再以该标有b的平均数为标准，与上方各个比它大的平均数比较，凡不显著的也一律标以字母b；再以标有b的最大平均数为标准，与以下各未标记的平均数比，凡不显著的继续标以字母b，直至遇到某一个与其差异显著的平均数标记c。结果见表19，每组数据取平均值。
表19动物喂养实验效果比对
| 组别 | 始重/kg | 末重/kg | 日增重/g | 料重比 | 腹泻率 |
| 对照组 | 80.1a | 91.4a | 0.32a | 6.5a | 14.2a |
| 实验组一 | 79.8a | 94.1b | 0.41c | 4.5b | 9.8c |
| 实验组二 | 79.9a | 93.8b | 0.38c | 5.2b | 11.1b |
注：同列数字肩标上的字母a、b、c表示差异极显著(P＜0.01)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。
由表19的统计分析结果可知，实验组在平均日增重、料重比、腹泻率方面，与对照组差异性显著(P＜0.05)。实验组一在降低犊牛腹泻率方面，与实验组二差异性显著，且添加量只有实验组的一半。另外，本专利固态发酵中使用了秸秆为原料，固态发酵产品成本更低。因此，从饲喂成本和生长性能综合评估，利用丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母联合发酵的上清液对秸秆进行固态发酵的产物可以满足一部分犊牛养殖所需，达到改善犊牛生长性能和降低腹泻率的效果。
在实验结束当天犊牛禁食12h，每组选择5头犊牛颈静脉采血5mL，3500r/min离心10min，取上层血清，－20℃保存，用于测定犊牛血清中免疫球蛋白G(Ig G)含量。
实验组一犊牛血清中IgG含量的平均值为9.96g/L，实验组二犊牛血清中IgG含量的平均值为9.63g/L，实验组一和实验组二之间差异性显著(P＜0.05)，对照组犊牛血清中IgG含量的平均值为7.84g/L，实验组与对照组之间差异性显著(P＜0.05)。
综合上述结果可以看出，利用混合发酵的离心液进行固态发酵的产物可提高犊牛的生长性能，使血清免疫水平有所提高，降低腹泻率。
最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于包括如下步骤：将酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌依次错时接种至液态培养基中，不额外提供无氧环境，进行丁酸梭菌的联合发酵。
2.根据权利要求1所述的丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于：所述错时接种为先将酿酒酵母接种至液态培养基中，5～8h后接种嗜酸乳杆菌，12～16h后接种丁酸梭菌。
3.根据权利要求1所述的丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于：所述联合发酵的最终发酵液中，丁酸梭菌的活菌数和芽孢数不少于2×109cfu/mL。
4.根据权利要求3所述的丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于：所述联合发酵的最终发酵液中，嗜酸乳杆菌的活菌数不少于1×1010cfu/mL，酿酒酵母的活菌数不少于3×109cfu/mL。
5.根据权利要求1所述的丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于：所述液态培养基的成分包括：葡萄糖5～25g/L、麸皮6～10g/L、酵母膏5～15g/L、蛋白胨5～20g/L、硫酸镁0.1～5g/L、磷酸氢二钾0.1～5g/L、碳酸钙5～10g/L。
6.根据权利要求1所述的丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于：在接种丁酸梭菌后5～7h开始补料，补料至对数期结束。
7.根据权利要求6所述的丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于：所述补料包括第一次补料和第二次补料，第一次补料结束后直接开始第二次补料；所述第一次补料的补料液成分为葡萄糖4～10g/L，持续6～8h；所述第二次补料的补料液成分为葡萄糖4～10g/L，蛋白胨2～6g/L，磷酸氢二钾1～3g/L，持续至对数期结束。
8.根据权利要求1所述的丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于：所述联合发酵方法包括将联合发酵的发酵离心液接种至固态发酵培养基中，经固态发酵获得饲料添加剂。
9.根据权利要求8所述的丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于：所述固态发酵培养基的成分包括10％～20％的麸皮，40％～80％的豆粕，1％～10％的小麦秸秆，1％～10％的玉米秸秆，1％～10％的花生秸秆，0.05％～0.15％的硫酸镁，0.5％～1.5％的碳酸钙，0.5％～1.5％的磷酸氢二钾。
10.根据权利要求8所述的丁酸梭菌的联合发酵方法，其特征在于：所述固态发酵的条件为30～37℃培养3～7d。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487722A (zh) * | 2023-12-15 | 2024-02-02 | 河北平朴生物科技合伙企业(有限合伙) | 一种用于可溶性蛋白高密度发酵的补料培养基及其应用 |
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2023
- 2023-03-27 CN CN202310306684.7A patent/CN116396874A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487722A (zh) * | 2023-12-15 | 2024-02-02 | 河北平朴生物科技合伙企业(有限合伙) | 一种用于可溶性蛋白高密度发酵的补料培养基及其应用 |
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