CN109311995A - 抗体、药物组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了包含与阶段特异性胚胎抗原4(SSEA‑4)结合的抗体或其抗原结合片段的药物组合物及其使用方法。使用方法包括但不限于癌症治疗和诊断。本公开的抗体能够结合某些癌细胞表面。本文公开的抗体的示例性靶标可包括癌，例如乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌、胆管癌、肝癌、颊癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、肾癌、***癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、口腔癌、神经内分泌癌、肾上腺癌、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤和/或脑肿瘤。

Description

抗体、药物组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年3月29日提交的美国临时专利申请第62/314,841号的优先权。将前述申请通过引用整体并入本文。
发明领域
本公开涉及针对糖类抗原的抗体及其结合片段以及编码诸如抗体的核酸、互补核酸、多肽、载体、宿主细胞及其制备和使用方法，包括包含所述抗体和/或结合片段的药物组合物。此外，提供了向对象施用有效抑制癌细胞的量的抗体的方法。具体地，本文公开了结合阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)的抗体以及相关组合物和使用方法。使用方法包括但不限于癌症治疗和诊断。
发明背景
许多表面糖类在恶性肿瘤细胞中表达。例如，已显示Globo H在多种上皮癌中过表达，并且与乳腺癌和小细胞肺癌中的肿瘤侵袭和不良预后相关。以前的研究表明，在乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞上观察到Globo H和阶段特异性胚胎抗原3(SSEA-3，也称为Gb5)(WWChang等人."Expression of Globo H and SSEA3 in breast cancer stem cells andthe involvement of fucosyl transferases 1 and 2 in Globo H synthesis.”PNAS,105(33):11667-11672,2008))。这些发现支持了针对肿瘤相关糖类抗原的抗体开发的基本原理，因为对癌症的有效治疗和/或预防仍然存在医学上未满足的需求。鉴定与癌症相关和/或预测癌症的聚糖标志物并开发针对这些标记物的抗体用于诊断和治疗大范围的癌症非常有意义。
发明概述
本公开内容基于以下发现：阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)在广泛的癌症中大量表达，但在正常细胞上不表达。表达SSEA-4的癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌、胆管癌、肝癌、颊癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、肾癌、***癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、口腔癌、神经内分泌癌、肾上腺癌、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤或脑肿瘤。
在一个方面，本公开的特征在于SSEA-4特异性的抗体或其结合片段。抗SSEA-4抗体与Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1结合。
在某些方面，本公开提供了命名为1J1s(以美国模式培养物保藏中心(ATCC)保藏编号PTA-122679保藏)、1G1s(以ATCC保藏编号PTA-122678保藏)、2F20s(以ATCC编号PTA-122676保藏)的杂交瘤克隆和由其产生的抗体或抗原结合片段。
在一个方面，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少约80％同源性的氨基酸序列(表1)。在一些方面，包含与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)的氨基酸序列将包含或不包含天然存在的序列。在一些方面，包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列将包含或不包含天然存在的序列。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含选自表1所示的(i)-(iii)的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3以及包含选自(iv)-(vi)的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3：
所述(i)-(iii)分别为
(i)选自SEQ ID NO：13的H-CDR1；
(ii)选自SEQ ID NO：15的H-CDR2；
(iii)选自SEQ ID NO：17的H-CDR3；
以及所述(iv)-(vi)分别为：
(iv)选自SEQ ID NO：6的L-CDR1；
(v)选自SEQ ID NO：8的L-CDR2；以及
(vi)选自SEQ ID NO：10的L-CDR3。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链区，其中所述重链区包含与选自SEQ ID NO：13、15或17的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链区，其中所述轻链区包含与选自SEQ ID NO：6、8或10的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段不包含天然存在的序列。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含天然存在的序列。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含选自表1所示的(i)-(iv)的H-FW1、H-FW2、H-FW3和H-FW4以及包含选自(v)-(viii)的L-FW1、L-FW2、L-FW3和L-FW4：
所述(i)-(iv)分别为：
(i)选自SEQ ID NO：12的H-FW1；
(ii)选自SEQ ID NO：14的H-FW2；
(iii)选自SEQ ID NO：16的H-FW3；
(iv)选自SEQ ID NO：18的H-FW4；
以及所述(v)-(viii)分别为：
(v)选自SEQ ID NO：5的L-FW1；
(vi)选自SEQ ID NO：7的L-FW2；
(vii)选自SEQ ID NO：9的L-FW3；
(viii)选自SEQ ID NO：11的L-FW4。
在一个方面，本公开提供了由以ATCC保藏编号PTA-122679保藏的命名为1J1s的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本公开提供了以ATCC保藏编号PTA-122679保藏的命名为1J1s的杂交瘤。
在某些方面，本公开提供抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有至少约80％同源性的氨基酸序列(表2)。在一些方面，包含与SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)的氨基酸序列将包含或不包含天然存在的序列。在一些方面，包含与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列的轻链可变结构域(LH)的氨基酸序列将包含或不包含天然存在的序列。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含选自表2所示的(i)-(iii)的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3以及包含选自(iv)-(vi)的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3：
所述(i)-(iii)分别为：
(i)选自SEQ ID NO：31的H-CDR1；
(ii)选自SEQ ID NO：33的H-CDR2；
(iii)选自SEQ ID NO：35的H-CDR3；
以及所述(iv)-(vi)分别为：
(iv)选自SEQ ID NO：24的L-CDR1；
(v)选自SEQ ID NO：26的L-CDR2；和
(vi)选自SEQ ID NO：28的L-CDR3。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链区，其中所述重链区包含与选自SEQ ID NO：31、33或35的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链区，其中所述轻链区包含与选自SEQ ID NO：24、26或28的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含或不包含天然存在的序列。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含选自表2所示的(i)-(iv)的H-FW1、H-FW2、H-FW3和H-FW4以及包含选自(v)-(viii)的L-FW1、L-FW2、L-FW3和L-FW4：
所述(i)-(iv)分别为：
(i)选自SEQ ID NO：30的H-FW1；
(ii)选自SEQ ID NO：32的H-FW2；
(iii)选自SEQ ID NO：34的H-FW3；
(iv)选自SEQ ID NO：36的H-FW4；
以及所述(v)-(viii)分别为：
(v)选自SEQ ID NO：23的L-FW1；
(vi)选自SEQ ID NO：25的L-FW2；
(vii)选自SEQ ID NO：27的L-FW3；
(viii)选自SEQ ID NO：29的L-FW4。
在一个方面，本公开提供了由以ATCC保藏编号PTA-122678保藏的命名为1G1s的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本公开提供了以ATCC保藏编号PTA-122678保藏的命名为1G1s的杂交瘤。
在某些方面，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少约80％同源性的氨基酸序列(表3)。在一些方面，包含与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)的氨基酸序列将包含或不包含天然存在的序列。在一些方面，包含与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VH)的氨基酸序列将包含或不包含天然存在的序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还包含选自表3所示的(i)-(iii)的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3以及包含选自(iv)-(vi)的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3：
所述(i)-(iii)分别为：
(i)选自SEQ ID NO：49的H-CDR1；
(ii)选自SEQ ID NO：51的H-CDR2；
(iii)选自SEQ ID NO：53的H-CDR3；
以及所述(iv)-(vi)分别为：
(iv)选自SEQ ID NO：42的L-CDR1；
(v)选自SEQ ID NO：44的L-CDR2；和
(vi)选自SEQ ID NO：46的L-CDR3。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链区，其中所述重链区包含与选自SEQ ID NO：49、51或53的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链区，其中所述轻链区包含与选自SEQ ID NO：42、44或46的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含或不包含天然存在的序列。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含选自表3所示的(i)-(iv)的H-FW1、H-FW2、H-FW3和H-FW4以及包含选自(v)-(viii)的L-FW1、L-FW2、L-FW3和L-FW4：
所述(i)-(iv)分别为：
(i)选自SEQ ID NO：48的H-FW1；
(ii)选自SEQ ID NO：50的H-FW2；
(iii)选自SEQ ID NO：52的H-FW3；
(iv)选自SEQ ID NO：54的H-FW4；
以及所述(v)-(viii)分别为：
(v)选自SEQ ID NO：41的L-FW1；
(vi)选自SEQ ID NO：43的L-FW2；
(vii)选自SEQ ID NO：45的L-FW3；
(viii)选自SEQ ID NO：47的L-FW4。
在一个方面，本公开提供了由以ATCC保藏编号PTA-122676保藏的命名为2F20s的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本公开提供了以ATCC保藏编号PTA-122676保藏的命名为2F20s的杂交瘤。
在某些实施方案中，示例性抗体或其抗原结合片段包括能够结合一种或多种糖类抗原的可变结构域。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段靶向糖类抗原SSEA-4(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)(SSEA-4六糖)。
在某些方面，本公开提供了抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：39的VH和选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：40的VL。在一些方面，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域包含与SEQ SEQ ID NO：3、21或39所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：4、22或40所示的氨基酸序列具有至少约80％同源性的氨基酸序列。在一些方面，抗体或其抗原结合片段可包含或不包含天然序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自：(a)整个免疫球蛋白分子；
(b)scFv；
(c)Fab片段；
(d)F(ab’)2；或者
(e)二硫键连接的Fv。
在某些实施方案中，抗体是人源化抗体。
在某些实施方案中，抗体是IgG或IgM。
在一个方面，本公开提供了药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；和至少一种药学可接受的载体。
在某些实施方案中，药物组合物还包含至少一种其它治疗剂。
在一个方面，本公开提供了抑制癌细胞增殖的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的示例性药物组合物，其中癌细胞的增殖被抑制。
在某些实施方案中，本公开提供了治疗对象中的癌症的方法。所述方法包括向有需要的对象施用有效量的本文所述的示例性抗体。
在某些实施方案中，癌症选自乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌、胆管癌、肝癌、颊癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、肾癌、***癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、口腔癌、神经内分泌癌、肾上腺癌、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤或脑肿瘤。
在一个方面，本公开提供了对对象中的癌症分期的方法，其包括：
(a)将检测SSEA-4表达的一种或多种抗体应用于获自所述对象的细胞或组织样品；
(b)分析所述一种或多种抗体与所述细胞或组织样品的结合；
(c)将与正常对照的结合进行比较以确定对象中癌症的存在；以及
(d)基于与正常基线指数相比相应抗体结合的相对水平对疾病进展阶段进行分类。
在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据附图、一些实施方案的详细描述以及所附权利要求，本发明的其他特征和/或优点将显而易见。
附图简要描述
图1显示了在每周用10mL/kg×10媒介物腹腔内处理两次之后第36天，具有HPAC植入肿瘤的BALB/c雄性裸鼠的照片。
图2显示了在每周用0.4mg/kg×10Globo H-2C2腹膜内处理两次之后第36天，具有HPAC植入肿瘤的BALB/c雄性裸鼠的照片。
图3显示了在每周用0.4mg/kg×10商业SSEA-4抗体(MC-813-70)腹腔内处理两次之后第36天，具有HPAC植入肿瘤的BALB/c雄性裸鼠的照片。
图4显示了在每周用0.4mg/kg×10 1G1s腹腔内处理两次之后第36天，具有HPAC植入肿瘤的BALB/c雄性裸鼠的照片。
图5显示了在每周用0.4mg/kg×10 1J1s腹腔内处理两次之后第36天，具有HPAC植入肿瘤的BALB/c雄性裸鼠的照片。
图6显示了在每周用0.4mg/kg×10 2F20s腹腔内处理两次之后第36天，具有HPAC植入肿瘤的BALB/c雄性裸鼠的照片。
图7显示了在36天的抗体注射过程中肿瘤体积的测量图。测量SSEA-4抗体1G1s、2F20s和1J1s对HPAC肿瘤的作用。还测量了商业SSEA-4抗体(MC-813-70)和媒介物(PBS)。
图8显示了流式细胞术直方图。用测试的抗体(绿线)或同种型对照(黑线)将2×105个细胞/管染色，随后与FITC-缀合的第二抗体孵育。
图9显示了示例性SSEA-4抗体1J1s、1G1s、2F20s和商业克隆MC-813-70对多种癌细胞系和非癌细胞系的FACS结合分析结果。测试的癌细胞系是MCF-7(乳腺癌)、MDA-MB231(乳腺癌)、HPAC(胰腺癌)、LN-18(成胶质细胞瘤)和LL-2(Lewis肺癌)。测试的非致瘤细胞系是HK2(肾、皮质/近端小管)、NL-20(支气管上皮细胞)、THLE-3(肝脏、正常细胞)和HuMEC(人乳腺上皮细胞)。
图10显示了与脂质1缀合的SS系列糖和Gb系列糖的结构。
图11通过滴定ELISA显示了表位的特征。(A)商业SSEA-4抗体(MC-813-70)，(B)1G1s，(C)1J1s，(D)2F20s。
图12通过化学发光夹心ELISA分析显示了与生物素化的糖的交叉反应性测试。
图13显示了在37天的抗体组合注射过程中肿瘤体积的测量图。测量抗体2C2(抗Globo H)和1J1s(抗SSEA4)对HPAC肿瘤的作用。
发明详细描述
提供了针对用于诊断和治疗大范围癌症的标志物的抗体方法和组合物。本文开发并公开了抗SSEA-4抗体。使用方法包括但不限于癌症治疗和诊断。本文描述的抗体能够与大范围的表达SSEA-4的癌细胞结合，从而促进癌症诊断和治疗。能够被抗体靶向的细胞包括癌，例如皮肤癌、血液癌、***癌、脑癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、***、卵巢癌、***癌等中的那些。
定义
除非另有说明，否则本发明的实践采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中被充分说明。参见例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版,Sambrook,Fritsch和Maniatis编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)；DNA Cloning,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑,1985)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology,第154卷和第155卷(Wu等人编辑),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编辑,Academic Press,London,1987)；Harlow和Lane s的Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)；以及Handbook OfExperimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1986)。
本文使用的术语“聚糖”是指多糖或寡糖。本文还使用聚糖来指糖缀合物的糖部分，所述糖缀合物如糖蛋白、糖脂、糖肽、糖蛋白质组、肽聚糖、脂多糖或蛋白聚糖。聚糖通常仅由单糖之间的O-糖苷连键组成。例如，纤维素是由β-1,4-连接的D-葡萄糖组成的聚糖(或更具体地，葡聚糖)，以及几丁质是由β-1,4-连接的N-乙酰基-D-葡萄糖胺组成的聚糖。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物，并且可以是直链或支链的。发现聚糖可以与如糖蛋白和蛋白聚糖中的蛋白质相连。它们通常存在于细胞的外表面上。O-和N-连接的聚糖在真核生物中十分常见，但也可以存在于原核生物中，尽管不太常见。发现N-连接的聚糖与序列子中的天冬酰胺的R-基团氮(N)连接。序列子是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。
本文使用的术语“抗原”被定义为能够引发免疫应答的任何物质。
本文使用的术语“免疫原性”指免疫原、抗原或疫苗引发免疫应答的能力。
本文使用的术语“表位”被定义为抗原分子与抗体或T细胞受体的抗原结合位点接触的部分。
本文使用的术语“疫苗”指用于赋予针对生物体引起的疾病的免疫力的含有由整个致病生物体(被杀死或弱化的)或这些生物体的组分如蛋白质、肽或多糖组成的抗原的制剂，。疫苗制剂可包括或不包括天然的、合成的或重组衍生的制剂中的任何一种。例如，可以通过重组DNA技术获得重组衍生的制剂。
本文使用的术语“抗原特异的”指细胞群的使得特定抗原或抗原片段的提供导致特定细胞增殖的特性。
本文使用的术语“特异性结合”指结合对(例如抗体和抗原)之间的相互作用。在多种情况下，特异性结合可以通过约10-6摩尔/升，约10-7摩尔/升或约10-8摩尔/升或更低的亲和常数来体现。
本文使用的短语“基本相似”、“基本相同”、“等同”或“基本等同”表示两个数值(例如一个与分子相关，并且另一个与参照/比较分子相关)之间的足够高的相似度，使得本领域技术人员会认为这两个值之间的差异在由所述值(例如Kd值、抗病毒效应等)测量的生物学特征的背景下具有很小或没有生物学和/或统计学显著性。所述两个值之间的差异作为参照/比较分子的值的函数例如，小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％和/或小于约10％。
本文使用的短语“基本上减少”或“基本上不同”表示两个数值(通常一个与分子相关，并且另一个与参照/比较分子相关)之间的足够高的差异程度，使得本领域技术人员会认为在由所述值(例如Kd值)测量的生物学特征的背景下，两个值之间的差异具有统计学显著性。所述两个值之间的差异作为参照/比较分子的值的函数例如，大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％和/或大于约50％。
本文使用的“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的总非共价相互作用之和的强度。除非另有说明，否则本文使用的“结合亲和力”指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间的1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的常规方法测量亲和力，所述方法包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且倾向于容易地解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持更长时间的结合。多种测量结合亲和力的方法在本领域是已知的，其中任何方法均可用于本发明的目的。以下描述了具体的说明性实施方案
在某些实施方案中，通过用以下分析所述的目标抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记的抗原结合分析(RIA)来测量根据本发明的“Kd”或“Kd值”。通过在滴定系列的未标记抗原的存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen，等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881)。为了建立分析条件，将微量滴定板(Dynex)用含5μg/mL的捕获抗Fab抗体(CappelLabs)的50mM碳酸钠(pH9.6)包被过夜，然后用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS室温(约23℃)封闭2至5小时。在非吸附板(Nunc，Cat#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目标Fab的系列稀释液混合(例如与Presta等人，(1997)Cancer Res.57：4593-4599中的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后将目标Fab孵育过夜；但是，孵育可以持续更长的时间(例如，65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移到捕获板中，在室温下孵育(例如1小时)。然后移除溶液，并用含0.1％吐温-20的PBS将板洗涤8次。当将板干燥后，添加150μL/孔的闪烁剂(MicroScint-20；Packard)，并将板在Topcountγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合分析。根据另一实施方案，用约10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片，通过在25℃下使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，使用表面等离子体共振分析测量Kd或Kd值。简言之，根据供应商的说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。在以5μL/分钟的流速注射之前，用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/mL(约0.2μM)，以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。在每个实验中，斑点被激活并且被乙醇胺阻断但没有固定蛋白质，用于参考减法。对于动力学测量，在25℃下，以约25μL/min的流速将两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)注射到含有0.05％吐温20的PBS(PBST)中。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件3.2版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon的比率。参见例如Chen，Y.等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881。如果通过上述表面等离子体共振分析，结合速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光猝灭技术测定结合速率，该技术测量在如光谱仪中测量的增加浓度的抗原的存在下，在25℃下含20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的PBS(pH7.2)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，所述光谱仪如带有配备有截流的分光光度计(AvivInstruments)或带有搅拌槽的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)。
根据供应商的说明书，根据本发明的“结合速率(on-rate)”或“结合速率(rate ofassociation)”或“结合速率(association rate)”或“kon”也可以在25℃下使用固定化抗原CM5芯片，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，利用与上述相同的表面等离子体共振技术来测定，或者根据本发明的“结合速率”或“kon”的也可以用相同的表面等离子体N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来测定。在以5μL/分钟的流速注射之前，将抗原用10mM乙酸钠(pH4.8)稀释至5μg/mL(约0.2μM)，以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下，以约25μL/min的流速将两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)注射到含有0.05％吐温20的PBS(PBST)中。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件3.2版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon的比率。参见例如Chen，Y.等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881。然而，如果通过上述表面等离子体共振分析，结合速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光猝灭技术测定结合速率，该技术测量在如光谱仪中测量的增加浓度的抗原的存在下，在25℃下含20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的PBS(pH7.2)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，所述光谱仪如带有配备有截流的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌槽的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)。
本文使用的术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，其内可以连接另外的DNA区段。另一类型的载体是噬菌体载体。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常，在重组DNA技术中可用的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物或者可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。可以在合成后进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记物缀合。其他类型的修饰包括，例如“加帽”，用类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰例如含有不带电荷的连键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯、氨基甲酸酯等)和带电荷的连键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有侧链部分的那些例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)，含有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些，含有烷化剂的那些，含有修饰的连键的那些(例如α异构核酸等)以及未修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸基团取代，被标准保护基团保护或者被活化以制备与另外核苷酸的另外连键，或者可以缀合至固体或半固体支持物。5’和3’末端OH可被磷酸化或者被胺或1-20个碳原子的有机封端基团部分取代。其他羟基也可以衍生为标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮基-核糖，被胺或1-20个碳原子的有机封端基团部分取代的碳环糖类似物。其他羟基也可以衍生为标准保护基团。多核苷酸也可含有侧链。一个或多个磷酸二酯键可以被替代性的连接基团取代。这些替代性的连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代物”)、P(S)S(“二硫代物”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)取代的实施方案，其中每个R或R’独立地为H或者任选含有醚(1-20个碳原子)的取代或未取代的烷基(1-20C)。其他羟基也可以衍生化为标准保护需要相同的核苷酸。前面的描述适用于本文提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
本文使用的“寡核苷酸”通常是指短的，单链的合成多核苷酸，其长度通常但不是必须小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。以上对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
本文使用的“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体表现出对特定抗原的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和通常缺乏抗原特异性的其他抗体样分子这两者。后一种多肽例如通过淋巴***以低水平产生以及通过骨髓瘤以增加的水平产生。
本文使用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可互换使用，并且如本文更详细描述的，其包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)，多克隆抗体，单价、多价抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物活性)，并且还可以包括某些抗体片段。抗体可以是嵌合的，人的，人源化的和/或亲和力成熟的。
本文使用的抗体的“可变区”或“可变结构域”指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。这些结构域通常是抗体中变异最大的部分并含有抗原结合位点。
本文使用的术语“可变的”是指以下事实：抗体之间可变结构域的某些部分在序列上广泛不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。但是，变异性不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域的较为高度保守部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个CDR连接的主要采用β-折叠构型的四个FR区，，所述CDR形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近保持在一起，并且与来自其他链的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段和残留的“Fc”片段，每个Fab片段具有单个抗原结合位点，Fc的名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，该区域由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链Fv种类中的“二聚体”结构结合。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面限定抗原结合位点。总共六个CDR赋予抗体抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于全部结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中Fab’的指定，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab’片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被归属于称为κ(κ)和λ(λ)的两种明显不同的类型之一。
根据抗体(免疫球蛋白)的重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将该抗体(免疫球蛋白)归属于不同的类别。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白(称为bulin)的重链恒定结构域可以归属于不同的类别。不同类别的免疫球蛋白有五种三维构型是熟知的，并且通常描述于例如Abbas等人.Cellular and Mol.Immunology,第4版(2000)。抗体可以是通过所述抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”可在本文互换使用，其指处于其基本完整的形式的抗体，而非以下限定的抗体片段。该术语具体指含有包含Fc区的重链的抗体。
本文使用的“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留在存在于完整体中时通常与该部分相关的功能的至少一种以及最多种或全部。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，因此保留结合抗原的能力。在另一实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留在存在于完整抗体中时通常与Fc区相关的至少一种生物学功能，如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有与完整抗体基本类似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可以包含与能够赋予片段体内稳定性的Fc序列连接的抗原结合臂。
本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群体获得的抗体，即除了可以以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。此类单克隆抗体通常包括含有结合靶标的多肽序列的抗体，其中所述靶标结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的方法获得。在某些实施方案中，单克隆抗体可以不包含天然序列。在一些方面，选择过程可以是从多个克隆如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库中选择独特的克隆。应当理解，可以进一步改变所选靶标结合序列，例如以提高对靶标的亲和力，使靶标结合序列人源化，改善其在细胞培养物中的产生，降低其在体内的免疫原性，产生多特异性抗体等，以及包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包含针对不同决定簇(例如表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体制剂的优点还在于它们通常不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本同质的抗体群体获得的，并且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler等人,Nature,256:495(1975)；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring HarborLaboratory Press,第2版.1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cellhybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))以及用于在含有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或类人抗体的技术(参见例如WO98/24893；WO96/34096；WO96/33735；WO91/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号；Marks等人,Bio.Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列以及此类抗体的片段相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性(美国专利第4,816,567号；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
本发明的抗体还包括由本发明的抗体产生的嵌合的或人源化的单克隆抗体。
抗体可以是全长的或可以包含具有抗原结合部分的抗体片段，其包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fab’、F(ab)’、Fv、单链Fv(scFv)、二价scFv(bi-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段(例如，Ward等人,Nature,341：544-546(1989))、CDR、双链抗体、三链抗体、四链抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。通过使用重组方法或合成接头连接抗体片段所产生的单链抗体也涵盖在本发明中。Bird等人.Science,1988,242:423-426.Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988,85:5879-5883。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。
所有抗体同种型均涵盖在本发明中，包括IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，IgM，IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE(本发明涵盖所有类别和亚类)。抗体或其抗原结合部分可以是哺乳动物(例如小鼠、人)抗体或其抗原结合部分。抗体的轻链可以是κ或λ型。
因此，本发明的抗癌抗体包括与非鼠源优选人源的重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分的组合，其可以并入本发明的抗体中。
具有重链可变区和轻链可变区的抗体与参照抗体产生的抗体的重链可变区和轻链可变区至少约70％、、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同源，并且还能够结合糖类抗原(例如SSEA-4)。同源性可以存在于氨基酸或核苷酸序列水平。在一些方面，具有与氨基酸或核苷酸序列的所述同源性的抗体序列将不包含天然存在的抗体序列。在一些方面，具有与氨基酸或核苷酸序列的所述同源性的抗体序列将包含天然存在的抗体序列。
在某些实施方案中，对应于表1-3中的CDR的CDR具有序列变异。例如，结合糖类抗原的抗体(或其抗原结合部分)中可以存在这样的CDR，其中CDR中的1、2、3、4、5、6、7或8个残基或者少于CDR总残基的20％、30％或约40％被取代或缺失。
抗体或抗原结合部分可以是肽。此类肽可包括表现出生物活性的肽的变体、类似物、直系同源物、同源物和衍生物，所述生物活性例如糖类抗原的结合。肽可含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然存在的氨基酸，仅在不相关的生物***中天然存在的氨基酸、来自哺乳动物***的修饰的氨基酸等)，具有取代的连键以及本领域已知的其他修饰的肽。
在本发明范围内的还有抗体或其抗原结合部分，其中特定氨基酸已被取代、缺失或添加。在一个示例性实施方案中，这些改变对肽的生物学特性如结合亲和力没有实质性影响。在另一示例性实施方案中，抗体可以在框架区中具有氨基酸取代，如以提高抗体与抗原的结合亲和力。在另一示例性实施方案中，选定的少量受体框架残基可以被相应的供体氨基酸取代。供体框架可以是成熟或种系人抗体框架序列或共有序列。Bowie等人,Science,247:1306-1310(1990).Cunningham等人,Science,244:1081-1085(1989).Ausubel(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994).T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989).Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994).Gonnet等人,Science 256:1443-45(1992)中提供了关于如何进行表型沉默氨基酸取代的指导。
抗体或其抗原结合部分可以被衍生化或与另一功能分子连接。例如，抗体可以与一种或多种其他分子实体功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价相互作用等)，所述分子实体如另一种抗体、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂、能够介导与另一种分子结合的蛋白或肽(如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)、氨基酸接头、信号序列、免疫原性载体或可用于蛋白质纯化的配体(如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A)。通过交联两种或更多种蛋白(相同类型或不同类型)产生一种类型的衍生化蛋白。合适的交联剂包括具有由适当的间隔基隔开的两个不同的反应基团的异双功能的那些交联剂(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的那些交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。这种接头可从Pierce Chemical Company，Rockford，111获得。可用于衍生(或标记)蛋白的可检测试剂包括荧光化合物、多种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性材料。非限制性示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。蛋白或抗体也可以用可检测的酶衍生化，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等。蛋白也可以用辅基(例如链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)衍生化。
编码本发明的抗体或其抗原结合部分的功能活性变体的核酸也涵盖在本发明中。这些核酸分子可以在中等严格条件、高度严格条件或非常高的严格条件下与编码任何本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸杂交。进行杂交反应的指导可见于Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.6.3.1-6.3.6,1989，将其通过引用并入本文。本文提及的特异性杂交条件如下：1)中等严格的杂交条件：在约45℃下，在6×SSC中杂交，然后在60℃下，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次；2)高度严格的杂交条件：在约45℃下，在6×SSC中杂交，然后在65℃下，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及3)非常高的严格杂交条件：在65℃下，在0.5M磷酸钠，7％SDS中杂交，然后在65℃下，以0.2×SSC，1％SDS洗涤一次或多次。
可以将编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸引入可以在合适的表达***中表达的表达载体中，然后分离或纯化表达的抗体或其抗原结合部分。任选地，编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸可以在无细胞翻译***中进行翻译。美国专利第4,816,567号.Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA，86:10029-10033(1989)。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以通过用编码期望抗体的轻链和重链(或其部分)的DNA转化的宿主细胞来产生。可以使用标准技术从这些培养物上清液和/或细胞中分离和纯化抗体。例如，可以用编码抗体的轻链、重链或两者的DNA转化宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除编码不是结合所必需的轻链和重链(例如恒定区)中的任一种或两种的一些或全部DNA。
本发明的核酸可以在多种合适的细胞中表达，包括原核细胞和真核细胞，例如细菌细胞(例如大肠杆菌)、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。许多哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且包括可从美国模式培养物保藏中心(ATCC)获得的永生细胞系。细胞的非限制性实例包括哺乳动物来源的或具有哺乳动物样特征的所有细胞系，包括但不限于下述细胞的亲本细胞、衍生产物和/或工程化变体：猴肾细胞(COS，例如COS-1、COS-7)、HEK293、幼仓鼠肾细胞(BHK，例如BHK21)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NSO、PerC6、BSC-1、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、SP2/0、HeLa、Madin-Darby牛肾细胞(MDBK)、骨髓瘤和淋巴瘤细胞。工程化变体包括例如聚糖特征修饰的和/或位点特异性的整合位点衍生产物。
本发明还提供了包含本文所述的核酸的细胞。细胞可以是杂交瘤或转染子。
可选地，本发明的抗体或其抗原结合部分可通过本领域熟知的固相方法合成。IRL在Oxford University Press(1989)出版的Solid Phase Peptide Synthesis:APractical Approach by E.Atherton and R.C.Sheppard.Methods in MolecularBiology,第35卷:Peptide Synthesis Protocols(M.W.Pennington和B.M.Dunn编辑),第7章.Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984).G.Barany and R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,E.Gross和J.Meienhofer编辑,第1卷和第2卷,Academic Press,New York,(1980),pp.3-254.M.Bodansky,Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin(1984)。
“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有期望的特异性、亲和力和/或能力的高变区的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见下述综述文章和其中引用的参考文献：Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”指抗体可变结构域的区域，其在序列中是高变的和/或形成结构上确定的环。通常，抗体包含六个高变区；VH中有三个(H1、H2、H3)以及VL中有三个(L1、L2、L3)。许多高变区描述正在使用中并且其涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia反而指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
本文使用的“框架”或“FW”残基是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
术语“Kabat中的可变结构域残基编号”或“Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型指在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中用于编译抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号***。使用该编号***，实际的线性氨基酸序列可含有较少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或***。例如，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单个氨基酸***物(例如根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82之后***的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区域比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
本文使用的“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun,The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
本文使用的术语“双链抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在同一多肽链(VH-VL)中包含连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双链抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO93/1161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中。
本文使用的“人抗体”是具有对应于人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或使用本文公开的制备人抗体的任何技术制备的人抗体。人抗体的这种定义明确地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文使用的“亲和力成熟的抗体”是在其一个或多个HVR中具有一种或多种改变的抗体，其与不具有那些改变的亲本抗体相比导致抗体对抗原的亲和力的改善。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶标抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks等人.Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述于：Barbas等人.Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人.Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人.J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；以及Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
本文使用的“阻断抗体”或“拮抗剂抗体”是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。某些阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
本文使用的“激动剂抗体”是模拟目标多肽的至少一种功能活性的抗体。
本文使用的“病症”是将受益于用本发明的抗体进行的治疗的任何病况。这包括慢性病症或疾病和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患讨论中的病症的那些病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性实例包括癌症。
本文使用的术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是癌症。
本文使用的“肿瘤”指所有赘生性细胞的生长和增殖(无论是恶性的还是良性的)以及所有癌前细胞和组织以及癌细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”不是如本文所提及的相互排斥。
本文使用的术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病以及其他淋巴组织增生性病症以及多种类型的头颈癌。
本文使用的“治疗”指试图改变所治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预，并且可以在用于预防时或在临床病理学过程中进行。理想的治疗效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防或减少炎症和/或组织/器官损害、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。在某些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发展。
本文使用的“抗体-药物缀合物(ADC)”指与细胞毒性剂缀合的抗体，所述细胞毒性剂如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
本文使用的“T细胞表面抗原”指可包括本领域已知的代表性T细胞表面标志物的抗原，包括T细胞抗原受体(TcR)，其是所有T细胞的主要界定标志物，它们被T细胞用于特异性识别MHC相关肽抗原。与TcR相关的范例是被称为CD3的蛋白复合物，其在TcR与其同源MHC/抗原复合物结合后参与细胞内信号的转导。T细胞表面抗原的其他实例可包括(或不包括)CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L和/或CD44。
本文使用的“个体”或“对象”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物(如奶牛)、参加体育运动的动物、宠物(如猫、狗和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，脊椎动物是人。
本文使用的用于治疗目的的“哺乳动物”指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人，家畜和农场动物以及动物园动物、参加体育运动的动物或宠物动物，如狗、马、猫、奶牛等。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
本文使用的“有效量”指在该剂量下和必要的时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本发明的物质/分子的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及物质/分子引发个体中期望的应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过该物质/分子的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指在该剂量下和必要的时间段内有效实现期望的预防结果的量。通常但不是必须的，因为在疾病之前或疾病的早期阶段在对象中使用预防剂量，预防有效量将小于治疗有效量。
本文使用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱、长春新碱、长春碱、依托泊苷、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)、酶(如核溶酶)及其片段、抗生素和毒素如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括它们的片段和/或变体以及下文公开的多种抗肿瘤剂或抗癌剂。以下描述了其他细胞毒性剂。杀肿瘤剂引起肿瘤细胞的破坏。
本文使用的“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯(盐)，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌，美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢***酚(屈***酚，)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康CPT-11(伊立替康，)、乙酰喜树碱、东莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来辛、卡折来辛和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；多卡米星(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、氯代磷酰胺(chlomaphazine)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙铵、氧化氮芥氢氯化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼莫司汀；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如卡里奇霉素，特别是卡里奇霉素γ1I和卡里奇霉素ΩI1(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素d、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净思他丁、佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充物，如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；甲基苄肼；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；氨基甲酸乙酯；长春地辛 达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；***糖苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)、ABRAXANETM不含聚氧乙烯蓖麻油、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒配制剂(AmericanPharmaceutical Partners,Schaumberg,IL)和多西紫杉醇(Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春花碱铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱奥沙利铂；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨米托蒽醌；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A，如视黄酸；卡培他滨任何以上的药学可接受的盐、酸或衍生物；以及以上两种或更多种的组合，如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙组合治疗的缩写)和FOLFOX(用与5-FU和亚叶酸组合的奥沙利铂(ELOXATINTM)进行的治疗方案的缩写)。
靶向SSEA-4的抗体
本公开的一个方面的特征在于靶向SSEA-4相关抗原的新抗体。
mAb 1J1s(ATCC保藏编号PTA-122679)是由杂交瘤细胞系(ATCC保藏编号PTA-122679)产生的单克隆抗体。本文描述的抗体可含有与抗体1J1s相同的VH链和VL链。与1J1s结合相同表位的抗体也在本公开的范围内。
以下提供了范例及其氨基酸和核酸结构/序列：
表1.抗体1J1s的氨基酸和核苷酸序列
mAb 1G1s(ATCC保藏编号PTA-122678)是由杂交瘤细胞系(ATCC保藏编号PTA-122678)产生的小鼠单克隆抗体。本文描述的抗体可含有与抗体1G1s相同的VH链和VL链。与1G1s结合相同表位的抗体也在本发明的范围内。
以下提供了范例及其氨基酸和核酸结构/序列：
表2.抗体1G1s的氨基酸和核苷酸序列
mAb 2F20s(ATCC保藏编号PTA-122676)是由杂交瘤细胞系(ATCC保藏编号PTA-122676)产生的单克隆抗体。本文描述的抗体可含有与抗体2F20s相同的VH链和VL链。与2F20s结合相同表位的抗体也在本发明的范围内。
以下提供了范例及其氨基酸和核酸结构/序列：
表3.抗体2F20s的氨基酸和核苷酸序列
“1J1s抗体”或“mAb 1J1s”或“来自克隆1J1s的抗体”指由克隆1J1s表达的抗体或以其他方式合成的但具有与克隆1J1s表达的抗体相同的CDR以及任选地相同的框架区的抗体。
本公开的一个方面的特征在于对SSEA-4具有特异性的新抗体。抗SSEA-4抗体与Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六糖)结合。
本文描述的任何抗体可以是全长抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，抗原结合片段是Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段。在一些实例中，抗原结合片段是Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段。在一些实例中，抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体。
本文描述的任何抗体具有以下一种或多种特征：(a)是重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体片段、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、IgG1抗体、IgG2抗体或抗体衍生物；(b)是人、鼠、人源化或嵌合抗体，抗原结合片段或抗体衍生物；(c)是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD同种型和/或其亚类的单链抗体片段、多体、Fab片段和/或免疫球蛋白；(d)具有以下一种或多种特征：(i)介导癌细胞的ADCC和/或CDC；(ii)诱导和/或促进癌细胞的凋亡；(iii)抑制癌细胞靶标细胞的增殖；(iv)诱导和/或促进癌细胞的吞噬作用；和/或(v)诱导和/或促进细胞毒性剂的释放；(e)特异性结合肿瘤相关的糖类抗原，其是肿瘤特异性糖类抗原；(f)不结合在非癌细胞、非肿瘤细胞、良性癌细胞和/或良性肿瘤细胞上表达的抗原；和/或(g)特异性结合在癌症干细胞和正常癌细胞上表达的肿瘤相关糖类抗原。
优选地，抗体与其各自抗原的结合是特异性的。术语“特异性”通常用于指这样的情况：其中结合对的一个成员不会对除其特异性结合伴侣之外的分子显示出任何显著的结合，例如与除本文所述的那些之外的任何其他分子具有小于约30％，优选20％、10％或1％的交叉反应性。
抗体适合以高亲和力(低KD值)与靶标表位结合，并且优选KD在纳摩尔范围或更低。亲和力可以通过本领域已知的方法(例如表面等离子体共振)测量。
示例性抗体制备
能够结合本文所述的Globo H表位和SSEA-4表位的示例性抗体可以通过本领域已知的任何方法来制备。参见例如Harlow和Lane，(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。
宿主动物的免疫和杂交瘤技术
在一个实施方案中，本发明提供了制备表达特异性结合糖类抗原(例如Globo H)的抗体的杂交瘤的方法。该方法包括以下步骤：用包含糖类抗原(例如Globo H)的组合物免疫动物；从动物体内分离脾细胞；由脾细胞产生杂交瘤；以及选择产生特异性结合Globo H的抗体的杂交瘤。Kohler和Milstein,Nature,256:495,1975.Harlow,E.和Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1988。
在一个实施方案中，糖类抗原用于皮下免疫小鼠。可能会或可能不会给出一个或多个加强。可以通过例如ELISA(酶联免疫吸附分析)或流式细胞术监测血浆中抗体的滴度。将具有足够抗糖类抗原的抗体滴度的小鼠用于融合。在处死和移除脾脏之前3天，可以用或不用抗原加强小鼠。分离小鼠脾细胞并用PEG融合至小鼠骨髓瘤细胞系。然后筛选得到的杂交瘤的抗原特异性抗体的产生。将细胞接种，然后在选择培养基中培养。然后通过ELISA筛选来自各孔的上清液的人抗糖类抗原单克隆抗体。重复分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，并且如果针对抗糖类抗原抗体仍然呈阳性，则可以通过有限稀释进行亚克隆。
可将佐剂用于增加一种或多种糖类抗原的免疫原性。佐剂的非限制性实例包括磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v聚山梨醇酯80(吐温80)、0.5％w/v脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85))、含CpG的核酸、QS21(皂苷佐剂)、α-半乳糖基-神经酰胺或其合成类似物(例如C34，参见US 8,268,969)、MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-脱酰基MPL)、来自Aquilla的提取物ISCOMS(参见例如Sjolander等人.(1998)J.Leukocyte Biol.64:713；WO90/03184；W096/11711；WO 00/48630；W098/36772；WO00/41720；WO06/134423和WO07/026190)、LT/CT突变体、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、白细胞介素、弗氏佐剂、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-nor-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，被称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(-2’-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，被称为MTP-PE)和RIBI，其含有在2％>角鲨烯/吐温80的乳液中提取自细菌的三种组分：单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
抗-SSEA-4抗体的示例性多克隆抗体可以通过以下制备：从检测血清中所需抗体增加的免疫的哺乳动物中收集血液，以及通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，以及含有多克隆抗体的部分可以从血清中分离。
通常通过多次皮下(sc)或腹腔内(ip)注射相关抗原和佐剂在宿主动物(例如，兔、小鼠、马或山羊)中激发多克隆抗体。使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2等将相关抗原缀合至在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质，例如钥孔戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，可能是有用的，。
可以用抗原免疫任何哺乳动物以产生所需抗体。通常，可以使用啮齿目动物、兔形目动物或灵长类动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如兔子。灵长类动物包括，例如，狭鼻小目(Catarrhini)中的猴子(旧世界猴)，例如食蟹猴、恒河猴、狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹腔内注射或皮下注射抗原是哺乳动物免疫的标准方法。更具体地，可以将抗原稀释并悬浮在适当量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中。如果需要，可以将抗原悬浮液与适量的标准佐剂(例如弗氏完全佐剂)混合，制成乳液，然后给予哺乳动物。通过将1mg或1μg肽或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏不完全佐剂组合，针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。
每4至21天，通过几次施用与适当量的弗氏不完全佐剂混合的抗原，可以将动物加强直至滴度平稳。通过在多个部位皮下注射，用弗氏完全佐剂中的原始量的肽或缀合物的1/5至1/10加强动物。7至14天后，将动物放血并分析血清的抗体滴度。适当的载体也可用于免疫。在如上免疫后，通过标准方法检查血清中所需抗体的量的增加。优选地，用相同抗原但与不同的蛋白质和/或通过不同的交联剂缀合的缀合物加强动物。缀合物也可以作为蛋白质融合物在重组细胞培养物中制备。此外，诸如明矾的聚集剂适合用于增强免疫应答。
在过去的二三十年中，已经开发了许多方法来制备用于人体内治疗应用的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。最常用且经过验证的方法是使用杂交瘤方法制备小鼠mAb，然后通过将mAb的VH结构域和VL结构域的框架区和恒定区转化为期望的人γ免疫球蛋白同种型和亚类的人VH结构域和VL结构域最同源的人框架区和恒定区来人源化mAb。临床上使用的许多mAb，例如Xolair，是人γ1，κ同种型和亚类的人源化mAb，并使用该方法制备。
在某些实施方案中，抗体可以通过常规杂交瘤技术制备。Kohler等人，Nature，256：495(1975)。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物，如仓鼠或兔，以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。可选地，可以在体外免疫淋巴细胞。
为了制备单克隆抗体，从用抗原免疫的哺乳动物中收集免疫细胞，如上所述检查血清中所需抗体的增加水平，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选从脾脏中获得。与上述免疫细胞融合的其他优选的亲本细胞包括，例如，哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选具有通过药物选择融合细胞的获得性特性的骨髓瘤细胞。
优选的骨髓瘤细胞是那些细胞，其有效融合，通过选定的产生抗体的细胞支持稳定的高水平抗体产生，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如来自美国加利福尼亚州圣地亚哥Salk研究所细胞分布中心的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，以及来自美国马里兰州罗克维尔的美国模式培养物保藏中心的SP-2细胞。人类骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
可以根据已知方法融合上述免疫细胞和骨髓瘤细胞，所述方法例如，Milstein等人的方法。(Galfre等人，Methods Enzymol.73：3-46,1981)。使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。通过细胞融合获得的所得杂交瘤可以通过在标准选择培养基(例如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基))中培养来选择。细胞培养通常在HAT培养基中延续数天至数周，该时间足以使除所需杂交瘤之外的所有其他细胞(未融合的细胞)死亡。然后，进行标准有限稀释以筛选和克隆产生所需抗体的杂交瘤细胞。
将如此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中生长，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质可防止HGPRT缺陷细胞的生长。
分析杂交瘤细胞在其中生长的培养基的产生针对抗原的单克隆抗体。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合分析来确定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。酶联免疫吸附分析(ELISA)、酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)和/或免疫荧光中吸光度的测量可用于测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定在平板上，将本发明的蛋白质应用于平板，然后应用含有所需抗体的样品，例如产生抗体的细胞的培养上清液或纯化的抗体。然后，应用识别第一抗体并用酶(例如碱性磷酸酶)标记的第二抗体，并孵育平板。接下来，在洗涤后，将诸如对硝基苯基磷酸酯(盐)的酶底物添加到板中，并测量吸光度以评价样品的抗原结合活性。在该方法中可以使用蛋白质的片段，例如C末端或N末端片段。BIAcore(Pharmacia)可用于评价根据本发明的抗体的活性。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
应用任何常规方法，包括上述那些，可以鉴定和选择产生与本文所述表位结合的抗体的杂交瘤细胞用于进一步表征。
在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序亚克隆克隆并通过标准方法使其生长(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如琼脂糖蛋白A(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体适当地与培养基、腹水或血清分离。
此外，杂交瘤细胞可以在体内作为动物的腹水肿瘤生长。例如，随后可以将获得的杂交瘤移植到小鼠的腹腔中并收获腹水。
获得的单克隆抗体可以通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或本发明蛋白偶联的亲和柱来纯化。本发明的抗体不仅可以用于纯化和检测本发明的蛋白质，还可以用作本发明蛋白质的激动剂和拮抗剂的候选物。另外，该抗体可以应用于针对与本发明蛋白质相关的疾病的抗体治疗。
重组技术
如此获得的单克隆抗体也可以使用基因工程技术重组制备(参见，例如，Borrebaeck C.A.K.和Larrick J.W.Therapeutic Monoclonal Antibodies，由MacMillanPublishers LTD在英国出版，1990)。编码抗体的DNA可以从免疫细胞克隆，例如产生抗体的杂交瘤或免疫的淋巴细胞，***合适的载体中，并引入宿主细胞中以制备重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。
当将获得的抗体施用于人体(抗体治疗)时，优选人抗体或人源化抗体用于降低免疫原性。例如，具有人抗体基因库的转基因动物可以用选自蛋白质、表达蛋白质的细胞或其裂解物的抗原免疫。然后从动物收集产生抗体的细胞并与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤，从中可以制备针对蛋白质的人抗体。可选地，产生抗体的免疫细胞(例如免疫的淋巴细胞)可以通过致癌基因永生化并用于制备单克隆抗体。
编码单克隆抗体的DNA可以使用常规方法容易地分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。分离后，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其他方式产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Pluckthun,Immunol.Rev.,130:151-188(1992)。
编码由上述杂交瘤细胞产生的抗体的DNA可以通过常规技术进行遗传修饰，以产生遗传工程化抗体。遗传工程化抗体，例如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体，可以通过例如常规重组技术产生。然后可以修饰DNA，例如，通过用编码序列取代人重链和轻链恒定结构域代替同源鼠序列，Morrison等人,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851，或通过共价连接免疫球蛋白全部的编码序列或非免疫球蛋白多肽的部分编码序列。以这种方式，可以制备具有靶标抗原结合特异性的基因工程抗体，例如“嵌合”或“杂合”抗体。
开发用于产生“嵌合抗体”的技术是本领域熟知的。参见，例如，Morrison等人.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger等人.(1984)Nature 312,604；和Takeda等人.(1984)Nature 314:452。通常，这种非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体，其包含一种对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一种对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
嵌合或杂合抗体也可以使用合成蛋白质化学中的已知方法在体外制备，包括涉及交联剂的那些。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇酯(盐)和甲基-4-巯基丁酰亚胺。
用于人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“进口”残基，其通常取自“进口”可变结构域。人源化可以基本上按照Winter和同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列进行。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近啮齿动物序列的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一种方法使用源自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。同一框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA,89:4285(1992)；Prestaetal.,J.Immnol.,151:2623(1993))。
更重要的是，抗体被人源化，其中保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现该目标，根据优选的方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。可获得说明和展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从接受者和进口序列中选择和组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，如对靶标抗原的增加的亲和力。通常，CDR残基直接且最基本地参与影响抗原结合。
可选地，现在有可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整的人抗体库。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合子缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等人,Year in Immuno.,7:33(1993)。人抗体也可以来源于噬菌体展示文库(Hoogenboom等人,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))。
编码本文所述的抗SSEA-4抗体(包括重链、轻链或两者)的任何核酸，载体如包含一种或多种核酸的表达载体以及包含一种或多种载体的宿主细胞也在本公开的范围内。在一些实例中，载体包含核酸，所述核酸包含编码如本文所述的抗Globo H抗体的重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列。在一些实例中，载体包含核酸，所述核酸包含编码如本文所述的抗SSEA-4抗体的重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列。在其他实例中，载体包含编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，其表达可以由单个启动子或两个单独的启动子控制。此处还提供了用于产生如本文所述的任何抗Globo H和抗SSEA-4抗体的方法，例如，通过本文所述的重组技术。
其他制备抗体的技术
在某些实施方案中，可以通过使用已经工程化以表达特异性人免疫球蛋白的市售小鼠来获得完全人抗体。设计用于产生更理想的(例如，完全人抗体)或更强的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化抗体或人抗体。这种技术的实例是来自Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)的XenomouseRTM和来自Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-MouseRTM和TC MouseTM。可选地，可以通过噬菌体展示技术重组制备抗体。参见，例如，美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号和第6,265,150号；和Winter等人,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。可选地，噬菌体展示技术(McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-553)可用于从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中体外产生人抗体和抗体片段。
完整抗体(即全长抗体)的抗原结合片段可通过常规方法制备。例如，F(ab')2片段可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生，Fab片段可以通过还原F(ab')2片段的二硫键产生。
可选地，本文所述的抗Globo H和抗SSEA-4抗体可以从使用McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)；Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库(例如，单链抗体噬菌体文库)中分离。后来的出版物描述了通过链改组(Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))产生高亲和力(nM范围)人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
如本文所述获得的抗体可以纯化至同质。例如，可以根据用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析分开和分离抗体，例如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等(抗体(Antibodies):实验室手册(A Laboratory Manual).Ed Harlow和David Lane,ColdSpring Harbor Laboratory,1988)，但不限于此。如上获得的抗体浓度可以通过吸光度的测量、酶联免疫吸附分析(ELISA)等来确定。除亲和力之外的示例性色谱法包括例如离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤法、反相色谱法、吸附色谱法等(蛋白质纯化和表征策略(Strategies for Protein Purification and Characterization)：实验室课程手册(ALaboratory Course Manual).Daniel R.Marshak等人编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press，1996)。色谱方法可以通过诸如HPLC或FPLC的液相色谱法进行。
可以使用本领域熟知的方法表征抗体。例如，一种方法是鉴定抗原结合的表位或“表位定位”。本领域已知用于绘制和表征蛋白质上表位的位置的许多方法，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争分析、基因片段表达分析和基于合成肽的分析，例如，在Harlow和Lane，Using Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.,1999的第11章中所述。另外，表位定位可用于确定抗体结合的序列。表位可以是线性表位(例如，包含在氨基酸的单个区段中)，或由氨基酸的三维相互作用形成的构象表位，其可以不必包含在单个区段中(一级结构线性序列)。可以分离或合成(例如，重组)不同长度的肽(例如，至少4-6个氨基酸长)并用于与抗体的结合分析。在另一个实例中，抗体结合的表位可以通过使用源自靶标抗原序列的重叠肽并通过抗体确定结合来在***筛选中确定。根据基因片段表达分析，编码靶标抗原的开放阅读框随机或通过特定的遗传构建片段化，并确定抗原的表达片段与待测抗体的反应性。例如，基因片段可以通过PCR产生，然后在放射性氨基酸存在下在体外转录并翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。还可以通过使用展示在噬菌体颗粒表面上的大型随机肽序列文库(噬菌体文库)来鉴定某些表位。可选地，可以在简单结合分析中测试限定的重叠肽片段文库与测试抗体的结合。
在另外的实例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变，以鉴定表位结合所需的、足够的和/或必需的残基。例如，可以使用靶标抗原的突变体进行结构域交换实验，其中候选抗体的结合表位中的多种残基已经被来自密切相关但抗原性不同的蛋白质(例如神经营养蛋白家族的另一成员)的序列替换(交换)。。通过评估抗体与突变靶蛋白的结合，可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
可选地，可以使用已知结合相同抗原的其他抗体进行竞争分析，以确定抗体是否与其他抗体结合相同的表位(例如，本文所述的MC45抗体)。竞争分析法是本领域技术人员熟知的。
示例性合适的通用抗体生产方法的其他方面
在动物(例如小鼠、兔、山羊、绵羊或马)中制备单克隆抗体和多克隆抗体及其片段的方法是本领域熟知的。参见，例如，Harlow和Lane，(1988)Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子及其片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv(单链抗体)和dAb(结构域抗体；Ward等人.(1989)Nature,341,544)。
本文公开的组合物可以与本领域技术人员在阅读本公开后可识别的其他活性剂、载体、媒介物、赋形剂或辅助剂一起包含在药物组合物中。
药物组合物优选包含至少一种药学可接受的载体。在此类药物组合物中，本文公开的组合物形成“活性化合物”，也称为“活性剂”。本文使用的术语“药学可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。配制药物组合物以与其预期的给药途径相容。给药途径的实例包括肠胃外给药，例如静脉内给药、皮内给药、皮下给药、口服(例如吸入)给药、透皮(例如局部)给药、透粘膜给药和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和调节张度的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
提供了包含至少一种抗SSEA-4抗体或至少一种包含编码抗SSEA-4抗体的序列的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，组合物可以是药物组合物。本文使用的组合物包含一种或多种结合一种或多种SSEA-4的抗体和/或一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码一种或多种结合一种或多种SSEA-4的抗体的序列。这些组合物可进一步包含合适的载体，例如包含缓冲剂的药学可接受的赋形剂，其是本领域熟知的。
在一个实施方案中，抗SSEA-4抗体是单克隆抗体。在另一实施方案中，提供了抗SSEA-4抗体的片段(例如，Fab、Fab'-SH和F(ab')2片段)。这些抗体片段可以通过传统方法产生，例如酶消化，或者可以通过重组技术产生。此类抗体片段可以是嵌合的、人源化的或人的。这些片段可用于下文示出的诊断和治疗目的。
本领域已知用于产生噬菌体展示文库的多种方法，从所述噬菌体展示文库中可以获得目标抗体。一种产生目标抗体的方法是通过使用Lee等人,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93中所述的噬菌体抗体文库。可以通过使用组合文库筛选具有所需活性的合成抗体克隆来制备本发明的抗SSEA-4抗体。原则上，通过筛选含有噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段。通过针对所需抗原的亲和层析淘选这些噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附到抗原上，从而与文库中的未结合克隆分离。然后从抗原洗脱结合克隆，并且可以通过另外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗SSEA-4抗体可通过以下获得：设计合适的抗原筛选程序以选择目标噬菌体克隆，然后使用来自目标噬菌体克隆的Fv序列和描述于Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda Md.(1991),第1-3卷的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗SSEA-4抗体克隆
抗体的抗原结合结构域由约110个氨基酸的两个可变(V)区形成，每个区域来自轻(VL)链和重(VH)链，两者均呈现三个高变环或互补决定区(CDR)。可变结构域可以以单链Fv(scFv)片段或Fab片段在噬菌体上功能性地展示，在单链Fv(scFv)片段中VH和VL通过短的柔性肽共价连接，在Fab片段中它们各自与恒定结构域融合，并且非共价地相互作用，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。本文使用的编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
可以通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述，搜索抗原结合克隆。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。可选地，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述，可以克隆天然库以提供针对宽范围的非自身和自身抗原的单一人抗体来源而无需任何免疫。最后，通过克隆来自干细胞的未重排的V基因区段，并使用含有编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的随机序列的PCR引物，也可以合成地制备天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。
丝状噬菌体用于通过与次要外壳蛋白pIII融合来展示抗体片段。抗体片段可以以单链Fv片段或Fab片段展示，在单链Fv片段中VH和VL结构域通过柔性多肽间隔区连接在同一多肽链上，例如，如Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，在Fab片段中一条链与pIII融合，而另一条链分泌到Fab外壳蛋白结构组装处的细菌宿主细胞周质中，所述Fab外壳蛋白结构通过置换一些野生型外壳蛋白显示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等人,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)所述。
通常，编码抗体基因片段的核酸获自从人或动物收获的免疫细胞。如果需要偏向于抗SSEA-4克隆的文库，则用SSEA-4免疫对象以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其他外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个实施方案中，通过在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(并且缺乏功能性内源抗体产生***)的转基因小鼠中产生抗人SSEA-4抗体应答，使得SSEA-4免疫产生针对SSEA-4的产生人抗体的B细胞来获得偏向于抗人SSEA-4克隆的人抗体基因片段文库。产生人抗体的转基因小鼠的产生如下所述。
通过使用合适的筛选程序分离表达SSEA-4特异性抗体的B细胞，例如通过用SSEA-4亲和层析进行细胞分离或细胞吸附荧光染料标记的/SSEA-4/随后进行流式激活的细胞分选(FACS)，可以获得抗SSEA-4反应性细胞群的另外富集。
可选地，使用来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其他PBL提供了可能抗体库的更好代表，并且还允许使用在其中SSEA-4不具有抗原性的任何动物(人或非人)物种中构建抗体文库。对于掺入体外抗体基因构建的文库，从对象收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。目标免疫细胞可以从多种动物物种中获得，例如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马和禽类物种等。
从目标细胞中回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并进行扩增。如Orlandi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)所述，在重排VH和VL基因文库的情况下，可以通过从淋巴细胞中分离基因组DNA或mRNA，然后使用与重排的VH和VL基因的5’和3’末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)来获得期望的DNA，从而制备用于表达的多种V基因库。如Orlandi等人.(1989)和Ward等人,Nature,341:544-546(1989)中所述，V基因可以扩增自cDNA和基因组DNA，其中在外显子5’末端的反向引物编码成熟V-结构域，以及正向引物基于J-区段。但是，对于从cDNA的扩增，如Jones等人,Biotechnol.,9:88-89(1991)中所述，反向引物也可以基于前导外显子，并且如Sastry等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)所述，正向引物基于恒定区。为了使互补性最大化，可以如Orlandi等人.(1989)或Sastry等人(1989)所述将简并性掺入引物中。在某些实施方案中，通过使用靶向每个V基因家族的PCR引物以扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可得的VH和VL排列来使文库多样性最大化，例如如Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的方法中所述或者如Orum等人,Nucleic Acids Res.,21:4491-4498(1993)的方法中所述。为了将扩增的DNA克隆到表达载体中，可以如Orlandi等人(1989)所述在PCR引物中将罕见的限制性位点作为标签引入一端，或者如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)所述用标记的引物进行进一步PCR扩增。
可以从V基因区段体外衍生合成重排的V基因库。大部分人VH基因区段已经被克隆并测序(在Tomlinson等人，J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)中报道)，并定位(在Matsuda等人,Nature Genet.,3:88-94(1993)中报道)；如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所述，使用编码不同序列和长度的H3环的PCR引物，这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构象)可用于产生不同的VH基因库。如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)中所述，也可以用集中在单一长度的长H3环的所有序列多样性制备VH库。已经克隆并测序了人Vκ和Vλ区段(在Williams和Winter，Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993)中报道)，并且其可用于制备合成轻链库。基于一系列VH和VL折叠以及L3和H3长度的合成V基因库将编码具有相当大的结构多样性的抗体。在扩增编码V基因的DNA后，可以根据Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法在体外重排种系V基因区段。
可以通过以几种方式将VH和VL基因库组合在一起来构建抗体片段库。每个库可以在不同载体中产生，并且载体在体外重组(例如如Hogrefe等人,Gene,128:119-126(1993)中所述)或通过组合感染在体内重组(例如Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中所述的loxP***)。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服由大肠杆菌转化效率施加的文库大小的限制。分别克隆初始VH库和VL库，一个进入噬菌粒，另一个进入噬菌体载体。然后通过噬菌体感染含有噬菌粒的细菌将两个文库组合，以使每个细胞含有不同的组合，并且文库大小仅受存在的细胞数量(约1012个克隆)的限制。两种载体均含有体内重组信号，以使VH和VL基因重组到单个复制子上并共同包装到噬菌体病毒粒子中。这些巨大的文库提供了大量具有良好亲和力的不同抗体。
可选地，可以将库顺序克隆到同一载体中(例如如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)中所述)或通过PCR组装在一起，然后克隆(例如如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)中所述)。PCR组装也可用于将VH和VLDNA与编码柔性肽间隔区的DNA连接以形成单链Fv(scFv)库。在另一种技术中，如Embleton等人,Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)中所述，“细胞内PCR组装”用于通过PCR将淋巴细胞内的VH和VL基因组合，然后克隆连接的基因的库。
可以通过任何本领域已知的技术实现文库的筛选。例如，SSEA-4靶标可用于包被吸附板的孔，在附着于吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选或与生物素缀合以用链霉亲和素包被的珠捕获或用于淘选噬菌体展示文库的任何其他本领域已知方法中。
在适于使至少一部分噬菌体颗粒与吸附剂结合的条件下，使噬菌体文库样品与固定化的SSEA-4接触。通常，选择包括pH、离子强度、温度等在内的条件以模拟生理条件。洗涤与固相结合的噬菌体，然后用酸洗脱(例如如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)中所述)或用碱洗脱(例如如Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所述)或通过SSEA-43/抗原竞争洗脱(例如在与Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争方法类似的程序中)。在一轮选择中，噬菌体可以被富集20-1000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中生长并进行进一轮的选择。
选择效率取决于许多因素，包括洗涤期间解离的动力学以及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能够同时与抗原结合。可以通过使用短时间洗涤、多价噬菌体展示和固相中高的抗原包被密度保留具有快速解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体。高密度不仅通过多价相互作用稳定噬菌体，而且还有利于重新结合已解离的噬菌体。可以通过使用长时间洗涤和单价噬菌体展示(如Bass等人,Proteins,8:309-314(1990)和WO92/09690中所述)以及低的抗原包被密度(如Marks等人,Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述)促进具有缓慢解离动力学(和良好结合亲和力)的抗体的选择。
对于SSEA-4，可以在具有不同亲和力，甚至具有略微不同的亲和力的噬菌体抗体之间进行选择。但是，所选抗体的随机突变(例如如在上述一些亲和力成熟技术中进行的)可能产生许多突变体，大多数突变体与抗原结合并且一些突变体具有较高亲和力。通过限制SSEA-4，罕见高亲和力的噬菌体可以竞争出局。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量生物素化的SSEA-4一起孵育，但生物素化的SSEA-4的摩尔浓度低于SSEA-4的靶标摩尔亲和常数。然后可以通过链霉亲和素包被的顺磁珠捕获高亲和力结合的噬菌体。这种“平衡捕获”允许根据它们的结合亲和力选择抗体，其灵敏度允许从具有较低亲和力的大量过量噬菌体中分离亲和力高至少两倍的突变体克隆。还可以操作用于洗涤与固相结合的噬菌体的条件，以基于解离动力学进行区分。
可以选择抗SSEA-4克隆。在一个实施方案中，本发明提供了抗SSEA-4抗体，其阻断SSEA-4配体和SSEA-4之间的结合，但不阻断SSEA-4配体和第二蛋白之间的结合。对应于这种抗SSEA-4抗体的Fv克隆可以通过以下进行选择：(1)如上文B(I)(2)部分所述所述，从噬菌体文库中分离抗SSEA-4克隆，并任选地通过在合适的细菌宿主中培养群体来扩增分离的噬菌体克隆群；(2)选择SSEA-4及分别需要阻断和非阻断活性的第二蛋白；(3)将抗SSEA-4噬菌体克隆吸附到固定化的SSEA-4上；(4)使用过量的第二蛋白洗脱识别SSEA-4结合决定簇的任何非期望克隆，所述SSEA-4结合决定簇与第二蛋白的结合决定簇重叠或共用；以及(5)洗脱步骤(4)后保持吸附的克隆。任选地，可以通过重复本文所述的选择程序一次或多次进一步富集具有期望的阻断/非阻断特性的克隆。
编码本发明的Fv克隆的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如通过使用设计用于特异性扩增来自杂交瘤或噬菌体DNA模板的目标重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到不以其他方式产生免疫球蛋白的宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得期望的单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.,5:256(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。
编码本发明的Fv克隆的DNA可以与编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如，可以从以上Kabat等人获得适当的DNA序列)组合以形成编码全长或部分长度的重链和/或轻链的克隆。将会理解，任何同种型的恒定区可用于此目的，所述恒定区包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这种恒定区可以从任何人或动物物种获得。源自一种动物(如人)物种的可变结构域DNA然后与另一种动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合”、全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包含在本文使用的“嵌合”和“杂合”抗体的定义内。在一个实施方案中，将源自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合，以形成所有人、全长或部分长度重链和/或轻链的编码序列。
由初始文库(天然的或合成的)产生的抗体可具有中等亲和力，但也可通过构建二级文库并从所述二级文库中再选择在体外模拟亲和力成熟，如以上Winter等人.(1994)中所述。在一些方面，抗体可以不包括天然存在的抗体序列。在一些方面，可以通过在Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法中或在Gram等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(1992)的方法中使用易错聚合酶(在Leung等人,Technique,1:11-15(1989)中报道)在体外随机引入突变。此外，亲和力成熟可以通过在所选单个Fv克隆中例如使用携带跨越目标CDR的随机序列的引物的PCR随机突变一个或多个CDR并筛选具有较高亲和力的克隆来进行)。WO 9607754(1996年3月14日公开)描述了在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以产生轻链基因文库的方法。另一种有效的方法是将通过噬菌体展示选择的VH或VL结构域与从未免疫的供体获得的天然存在的V结构域变体库重组，并在数轮如Marks等人,Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述的链改组中对较高亲和力进行筛选。该技术允许产生具有10-9M范围亲和力的抗体和抗体片段。
产生抗SSEA-4抗体的其他方法
产生和评估抗体亲和力的其他方法是本领域熟知的，并且描述于例如Kohler等人,Nature 256:495(1975)；美国专利第4,816,567号；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986；Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987；Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)；Engels等人,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-734(1989)；Abrahmsen等人,EMBO J.,4:3901(1985)；Methods in Enzymology,第44卷.(1976)；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。
通用方法
通常，本发明提供亲和力成熟的SSEA-4抗体。这些抗体对SSEA-4具有增加的亲和力和特异性。这种亲和力和灵敏度的增加允许本发明的分子用于受益于(a)本发明分子的灵敏度增加和/或(b)SSEA-4与本发明的分子的紧密结合的应用和方法。
在一个实施方案中，SSEA-4抗体可用于治疗需要部分或完全阻断一种或多种SSEA-4活性的SSEA-4介导的病症。在一个实施方案中，本发明的抗SSEA-4抗体用于治疗癌症。
本发明的抗SSEA-4抗体允许在诸如免疫沉淀、ELISA或免疫显微术的简单和常规生物分子分析中灵敏且特异性地检测表位，而无需进行质谱分析或遗传操作。这继而在观察和阐明这些途径的正常功能以及检测途径何时异常发挥功能方面提供了明显优势。
本发明的SSEA-4抗体也可用于确定在疾病的发展和发病机理中的作用。例如，如上所述，本发明的SSEA-4抗体可用于确定TACA是否暂时正常表达，这可与一种或多种疾病状态相关。
本发明的SSEA-4抗体可进一步用于治疗疾病，在所述疾病中，一种或多种SSEA-4被异常调节或异常发挥功能而不干扰本发明的抗SSEA-4的抗体非特异性的SSEA-4的正常活性。
在另一方面，发现了本发明的抗SSEA-4抗体作为检测多种细胞类型和组织中的癌症状态的试剂的效用。
在另一方面，本发明的抗SSEA-4抗体可用于开发具有与本发明的主题抗体类似的阻断活性模式的SSEA-4拮抗剂。例如，本发明的抗SSEA-4抗体可用于确定和鉴定具有相同SSEA-4结合特征和/或阻断SSEA-4途径的能力的其他抗体。
作为又一实例，本发明的抗SSEA-4抗体可用于鉴定其他抗SSEA-4抗体，其与本文示例的抗体基本上结合SSEA-4的相同抗原决定簇(包括线性和构象表位)。
本发明的抗SSEA-4抗体可用于基于SSEA-4参与的生理途径的分析中，以筛选SSEA-4的小分子拮抗剂，其在阻断一种或多种结合伴侣与SSEA-4的结合中表现出与抗体类似的药理学作用。
可以使用本领域的常规技术实现抗体的产生，所述常规技术包括本文所述的那些技术，如杂交瘤技术和结合物分子的噬菌体展示文库的筛选。这些方法在本领域已经建立。
简言之，本发明的抗SSEA-4抗体可以通过使用组合文库筛选具有期望活性的合成抗体克隆来制备。原则上，通过筛选含有展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的多个片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成的抗体克隆。通过针对期望抗原的亲和层析淘选这些噬菌体文库。表达能够结合期望抗原的Fv片段的克隆被吸附到抗原上，从而与文库中的未结合克隆分离。然后将结合克隆从抗原上洗脱，并且可以通过另外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗SSEA-4抗体均可通过下述获得：设计合适的抗原筛选程序以选择目标噬菌体克隆，随后使用来自目标噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda Md.(1991),第1-3卷中所述的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗SSEA-4抗体克隆。
在一个实施方案中，本发明的抗SSEA-4抗体是单克隆。本文提供的抗SSEA-4抗体的抗体片段，如Fab、Fab’、Fab’-SH和F(ab’)2片段及其变体也涵盖在本发明的范围内。这些抗体片段可以通过传统方法(如酶消化)产生或者可以通过重组技术产生。此类抗体片段可以是嵌合的、人的或人源化的。这些片段可用于本文所述的实验目的、诊断目的和治疗目的。
单克隆抗体可以从基本同质的抗体群体获得，即除了可以以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。
本发明的抗SSEA-4单克隆抗体可以使用本领域已知的多种方法制备，包括Kohler等人,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法，或者可选地它们可以通过重组DNA方法制备(例如美国专利第4,816,567号)。
载体、宿主细胞和重组方法
为了重组产生本发明的抗体，将编码其的核酸分离并***可复制载体中以进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。编码抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可获得许多载体。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。宿主细胞包括但不限于原核或真核(通常是哺乳动物)来源的细胞。将会理解，任何同种型的恒定区均可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这种恒定区可以获自任何人或动物物种。
使用原核宿主细胞产生抗体
载体构建
可以使用标准重组技术获得编码本发明抗体的多肽组分的多核苷酸序列。可以从产生抗体的细胞如杂交瘤细胞中分离期望的多核苷酸序列并对其进行测序。可选地，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，则将编码多肽的序列***能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可获得和已知的许多载体可用于本发明的目的。合适的载体的选择将主要取决于待***载体的核酸的大小和待用载体转化的特定宿主细胞。每种载体含有多种组件，这取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或这两者)以及其与其所在的具体宿主细胞的相容性。载体组件通常包括但不限于：复制起点、选择标志物基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸***物和转录终止序列。
通常，含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主一起使用。载体通常携带复制位点以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，通常使用源自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，因此提供了鉴定转化细胞的简便方法。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也可含有或经修饰以含有可被微生物用于表达内源蛋白的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例详细描述于Carter等人,美国专利第5,648,237号中。
此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可用作与这些宿主相关的转化载体。例如，噬菌体如λGEMTM-11可用于制备重组载体，该载体可用于转化易感宿主细胞如大肠杆菌LE392。
本发明的表达载体可包含两个或更多个编码各多肽组件的启动子-顺反子对。启动子是位于顺反子上游(5’)的调节其表达的非翻译调控序列。原核启动子通常分为两类：诱导型和组成型。诱导型启动子是在针对培养条件变化(例如是否存在营养物或者温度的变化)的应答中引发受其控制的增加顺反子转录水平的启动子。
由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是熟知的。可以通过经限制酶消化从来源DNA中移出启动子并将分离的启动子序列***本发明的载体中而将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作地连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在某些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶标多肽启动子相比，它们通常允许表达的靶基因的更高的转录和更高的收率。
适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子，与天然靶标多肽启动子相比，表达的靶基因的产率更高。经细菌中的限制酶移出来自来源DNA的启动子(如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经被公布，从而使得技术人员能够使用提供任何所需的限制性位点的接头或适配子，将它们可操作地连接到编码靶标轻链和重链的顺反子上(Siebenlist等人.(1980)Cell 20:269)。
在本发明的一个方面中，重组载体内的每个顺反子包含分泌信号序列组件，其指导表达的多肽的跨膜移动。通常，信号序列可以是载体的组件或者它可以是***载体中的靶标多肽DNA的一部分。为本发明的目的选择的信号序列应该是宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的原核信号序列取代。在本发明的一个实施方案中，在表达***的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
根据本发明的免疫球蛋白的产生可以发生在宿主细胞的细胞质中，因此不需要在每个顺反子内均存在分泌信号序列。在这方面，免疫球蛋白轻链和重链被表达、折叠和组装以在细胞质内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许表达的蛋白质亚基的正确折叠和组装。Proba和Pluckthun Gene,159:203(1995)。
还可以通过使用可以调节表达的多肽组分的定量比例以使本发明的分泌的和正确组装的抗体的收率最大化的表达***产生本发明的抗体。这种调节至少部分地通过同时调节多肽组分的翻译强度来完成。
在Simmons等人的美国专利第5,840,523号中公开了一种调节翻译强度的技术。它利用顺反子内的翻译起始区(TIR)的变体。对于给定的TIR，可以产生具有一系列翻译强度的一系列氨基酸或核酸序列变体，从而提供将该因子调整为特定链的期望的表达水平的方便手段。TIR变体可以通过导致可以改变氨基酸序列的密码子改变的常规诱变技术产生。在某些实施方案中，核苷酸序列的变化是沉默的。TIR的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间隔的改变以及信号序列的改变。一种产生突变信号序列的方法是在编码序列的开始产生不改变信号序列的氨基酸序列的“密码子库”(即改变是沉默的)。这可以通过改变每个密码子的第三个核苷酸的位置来完成；此外，一些氨基酸(如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸)具有多个可以增加所制备库的复杂性的第一位置和第二位置。在Yansura等人(1992)METHODS:A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158中详细描述了这种诱变方法。
在一个实施方案中，产生其内各顺反子具有一系列TIR强度的一组载体。该有限组提供了在多种TIR强度组合下各链的表达水平以及期望抗体产物的收率的比较。如Simmons等人，美国专利第5,840,523号中详细描述的，TIR强度可以通过定量报道基因的表达水平来确定。基于翻译强度比较，选择期望的各个TIR以组合进本发明的表达载体构建体中。
适用于表达本发明的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体。可用细菌的实例包括埃希氏菌(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠道菌、假单胞菌(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌、变形杆菌、志贺氏菌、根瘤菌、透明颤菌或副球菌。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，将大肠杆菌细胞用作本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987),pp.1190-1219；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110的菌株33D3(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987),pp.1190-1219；ATCC保藏号大肠杆菌294(ATCC 31,446))，大肠杆菌B、大肠杆菌E、大肠杆菌CC 31,446、大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些实例是说明性的而非限制性的。构建具有确定基因型的任何上述细菌的衍生物的方法是本领域已知的，并描述于例如Bass等人,Proteins,8:309-314(1990)中。考虑到复制子在细菌细胞中的可复制性，通常需要选择合适的细菌。例如，当熟知的质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410用于提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌可适合用作宿主。通常宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶，并且可以理想地将另外的蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。
抗体产生
用上述表达载体转化宿主细胞，并将其在视情况改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子，选择转化子或扩增编码期望序列的基因。
转化意为将DNA引入原核宿主中以使DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体进行复制。根据所用的宿主细胞，使用适合此类细胞的标准技术进行转化。使用氯化钙的钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法使用聚乙二醇/DMSO。使用的另一种技术是电穿孔。
用于产生本发明的多肽的原核细胞在本领域已知的培养基中生长，并且其适于培养所选宿主细胞。合适的培养基的实例包括luria肉汤(LB)加必需的营养补充物。在某些实施方案中，培养基还含有基于表达载体的构建选择的选择剂，以选择性允许含有表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素添加到培养基中以使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
除了碳源、氮源和无机磷源之外，还可以包括单独引入的适当浓度的任何必需的补充物或作为与另一种补充物或介质的混合物(例如复合氮源)包括任何必需的补充物。任选地，培养基可含有选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫胶质、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇的一种或多种还原剂。
将原核宿主细胞在合适的温度下培养。例如，对于大肠杆菌的生长，生长发生在包括但不限于约20℃至约39℃、约25℃至约37℃和约30℃的温度范围内。培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH，这主要取决于宿主生物体。对于大肠杆菌，pH可以为约6.8至约7.4或约7.0。
如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则在适于激活启动子的条件下诱导蛋白表达。在本发明的一个方面，将PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，将转化的宿主细胞在磷酸盐限制性培养基中培养以进行诱导。在一个实施方案中，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等人,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。根据所用的载体构建体，可以使用本领域已知的多种其他诱导物。
在一个实施方案中，将表达的本发明的多肽分泌到宿主细胞的周质中并从宿主细胞的周质中回收。蛋白回收通常涉及通常通过诸如渗透压休克、超声或裂解的手段破坏微生物。一旦细胞被破坏，则可通过离心或过滤移除细胞碎片或全细胞。蛋白可以例如通过亲和树脂层析进一步纯化。可选地，可将蛋白转运到培养基中并在其中进行分离。可以从培养物中移除细胞，并过滤培养上清液以及浓缩用于进一步纯化。可以使用通常已知的方法(如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹分析)进一步分离和鉴定表达的多肽。
在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模分批补料发酵程序可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，例如约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮以分配氧气和营养物，尤其是葡萄糖(常见的碳源/能源)。小规模发酵通常指发酵罐中的发酵，其体积容量不超过约100升，并且范围可以为约1升至约100升。
在发酵过程中，蛋白质表达的诱导通常在细胞已经在合适条件下生长至期望密度之后开始，在该阶段细胞处于早期稳定期(例如，OD550为约180-220)。如本领域已知的和如上所述，根据所用的载体构建体，可以使用的多种诱导物。在诱导之前，细胞可以生长较短时间。细胞通常诱导约12-50小时，但可以使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本发明的多肽的产生收率和质量，可以改变多种发酵条件。例如，为了改善分泌的抗体多肽的正确组装和折叠，可以使用过表达伴侣蛋白(如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰顺式,反式异构酶)的另外的载体共转化原核宿主细胞。已经证明伴侣蛋白促进细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的正确折叠和溶解。Chen等人.(1999)J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等人,美国专利第6,083,715号；Georgiou等人,美国专利第6,027,888号；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie等人.(2001)Mol.Microbiol.39:199-210。
为了使表达的异源蛋白(特别是蛋白水解敏感的那些)的蛋白水解最小化，可将某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株用于本发明。例如，可以修饰宿主细胞株以在编码已知细菌蛋白酶的基因中实现基因突变，所述细菌蛋白酶如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株是可获得的并描述于例如Joly等人.(1998),同上；Georgiou等人,美国专利第5,264,365号；Georgiou等人，美国专利第5,508,192号；Hara等人,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)。
在一个实施方案中，将缺乏蛋白水解酶并用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株用作本发明的表达***中的宿主细胞。
抗体纯化
在一个实施方案中，进一步纯化本文产生的抗体蛋白以获得基本同质的制剂用于进一步的分析和使用。可以使用本领域已知的标准蛋白纯化方法。以下程序是合适的纯化程序的示例：免疫亲和柱或离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅层析或阳离子交换树脂如DEAE层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的41kD的细胞壁蛋白，其以高亲和力结合抗体的Fc区。Lindmark等人(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。固定蛋白A的固相可以是包含玻璃或二氧化硅表面的柱或受控的孔玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱子包被试剂如甘油，以可能地防止污染物的非特异性粘附。
作为纯化的第一步，可以将源自如上所述的细胞培养物的制剂应用于蛋白A固定化固相上，以允许目标抗体与蛋白A的特异性结合。然后将固相洗涤，以移除非特异性结合到固相的污染物。最后，通过洗脱从固相中回收目标抗体。
使用真核宿主细胞产生抗体
载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(i)信号序列组件
用于真核宿主细胞的载体还可含有信号序列或在目标成熟蛋白或多肽的N-末端具有特异性切割位点的其他多肽。选择的异源信号序列通常是被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯性疱疹gD信号。
将这种前体区的DNA与编码抗体的DNA在阅读框内连接。
(ii)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件。例如，通常可以仅使用SV40起点，因为它含有早期启动子。
(iii)选择基因组件
表达和克隆载体可含有选择基因，也称为选择标志物。典型的选择基因编码这样的蛋白：(a)赋予针对抗生素或其他毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补充营养缺陷型缺陷(在相关的情况下)；或(c)提供复杂培养基无法获得的关键营养物。
选择方案的一个实例利用药物来阻止宿主细胞的生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生赋予抗药性的蛋白，从而在选择方案中存活。这种显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适的选择标志物的另一实例是能够鉴定能够摄取抗体核酸的细胞的那些选择标志物，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II(例如灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，可首先通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化子来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞包括例如DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
可选地，可以通过在含有用于选择标志物的选择剂(如氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中的细胞生长选择用编码抗体、野生型DHFR蛋白和另一种选择标志物(如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利第4,965,199号。
(iv)启动子组件
表达和克隆载体通常含有被宿主生物体识别并与编码目标多肽(例如抗体)的核酸可操作地连接的启动子。对于真核生物而言，启动子序列是已知的。事实上，所有真核基因均具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基的富含AT的区域。在许多基因的转录起始上游70至80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’末端是AATAAA序列，其可以是将poly A尾巴添加到编码序列3’末端的信号。所有这些序列都适合***真核表达载体中。
可以控制哺乳动物宿主细胞中来自载体的抗体多肽转录，例如通过从病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)基因组获得的启动子、来自异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或者来自热休克的启动子，只要这些启动子与宿主细胞***相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为SV40限制性片段获得，该片段还含有SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子可方便地作为HindIII E限制性片段获得。使用牛***瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的***公开于美国专利第4,419,446号中。该***的改进描述于美国专利第4,601,978号中。还参见Reyes等人,Nature297:598-601(1982)关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA。可选地，可将劳斯氏肉瘤病毒长末端重复用作启动子。
(v)增强子元件组件
通常可以通过将增强子序列***载体中来增加高等真核生物对编码本发明的抗体多肽的DNA的转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。但是，通常人们将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。还参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)关于增强用于激活真核启动子的增强元件。增强子可以在编码抗体多肽的序列的5’或3’位置剪接到载体中，但通常位于启动子的5’位点。
(vi)转录终止组件
用于真核宿主细胞的表达载体通常还将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻译区和偶尔地3’非翻译区获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录为多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种可用的转录终止组件是牛生长激素多腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化
用于在本文的载体中克隆或表达DNA的合适的宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的增殖已成为常规程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(被亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,J.GenVirol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(HepG2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞用于产生抗体，并将其在视情况改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子，选择转化子或扩增编码期望序列的基因。
(viii)培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于产生本发明的抗体的宿主细胞。可商购的培养基如Ham’s F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，可将Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任何培养基用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基均可根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠，钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或等同能源。还可以包含本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必需补充物。培养条件(如温度、pH等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员将是显而易见的。
(ix)抗体的纯化
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内产生或直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生抗体，作为第一步，通常例如通过离心或超滤移除宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。当抗体分泌到培养基中时，通常首先使用市售蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)浓缩来自此类表达***的上清液。在任何前述步骤中可以包括蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析是通常可接受的纯化技术。亲和试剂如蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人γ3，推荐蛋白G(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所连接的基质最常见为琼脂糖，但也可以使用其他基质。物理上稳定的基质如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可允许实现比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体，也可用其他蛋白纯化技术，如离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅层析、肝素SEPHAROSETM层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可以根据需要对包含目标抗体和污染物的混合物进行进一步的纯化步骤，例如通过使用pH值在约2.5-4.5的洗脱缓冲剂的低pH疏水相互作用层析，其通常在低盐浓度下(例如约0-0.25M盐)进行。
应当注意，通常用于制备用于研究、测试和临床使用的抗体的技术和方法在本领域中是公认的，与上文一致和/或本领域技术人员认为适合特定的目标抗体。
活性分析
可通过本领域已知的多种分析来表征本发明的抗体的物理/化学特性和生物学功能。
本公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可以就其对抗原的结合亲和力进行描述或说明。可以使用任何合适的方法通过实验确定抗体对糖类抗原的亲和力(参见例如Berzofsky等人,"Antibody-Antigen Interactions,"In Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press:New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，则测量的特定抗体-糖类抗原相互作用的亲和力可以改变。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如KD、Ka、Ka)的测量优选用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲剂进行。
本发明的抗体或其抗原结合部分具有体外和体内治疗、预防和/或诊断效用。例如，可以将这些抗体施用于培养中的细胞(例如体外或离体)或施用于对象(例如体内)，以治疗、抑制、预防复发和/或诊断癌症。
纯化的抗体可以通过一系列分析进一步表征，所述分析包括但不限于N-末端测序、氨基酸分析、非变性尺寸排阻高压液相色谱(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。
必要时，分析抗体的生物活性。在某些实施方案中，测试本发明的抗体的抗原结合活性。本领域已知的并且可以在本文中使用的抗原结合分析包括但不限于使用诸如以下技术的任何直接或竞争结合分析：蛋白质印迹、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、“夹心”免疫分析、免疫沉淀分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析、纳米颗粒免疫分析、适配子免疫分析和蛋白A免疫分析。
抗体片段
本发明涵盖抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而非完整抗体是有利的。较小大小的片段允许快速清除，并且可以导致接近实体瘤的改善。
已经开发了多种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化得到的(参见例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；和Brennan等人,Science,229:81(1985))。但是，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。Fab、Fv和ScFv抗体片段均可在大肠杆菌中表达和由其分泌，从而允许容易地产生大量这些片段。可以从以上论述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。可选地，可直接从大肠杆菌中回收Fab’-SH片段并化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。包含补救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段描述于美国专利第5,869,046号中。用于产生抗体片段的其他技术对于技术人员来说是显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利第5,571,894号和第5,587,458号。Fv和sFv是唯一具有完整结合位点的物质，没有恒定区；因此，它们适合于在体内使用期间降低的非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以在sFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合。参见以上Antibody Engineering,Borrebaeck编辑。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如如美国专利第5,641,870号中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
人源化抗体
本发明涵盖人源化抗体。用于人源化非人抗体的多种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可以具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“进口”残基，其通常取自“进口”可变结构域。人源化可以基本上按照Winter和同事的方法(Jones等人.(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等人.(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等人.(1988)Science 239:1534-1536)通过用高变区序列取代人抗体的相应序列进行。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
在制备人源化抗体中使用的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性可能是重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近啮齿动物序列的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等人.(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等人.(1987)J.Mol.Biol.196:901。另一种方法使用源自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。同一框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；Prest等人.(1993)J.Immunol.,151:2623。
通常进一步期望抗体被人源化，其中保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现该目标，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。可获得说明和展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从接受者和进口序列中选择和组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，如对靶标抗原的增加的亲和力。通常，高变区残基直接且最基本地参与影响抗原结合。
人抗体
如上所述，可以通过将选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列与已知的人恒定结构域序列组合来构建本发明的人抗SSEA-4抗体。可选地，可以通过杂交瘤方法制备本发明的人单克隆抗SSEA-4抗体。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已描述于例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)中。
现在可以产生这样的转基因动物(例如小鼠)，其在免疫时能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体完整库。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合子缺失导致内源抗体产生的完全抑制。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原激发时产生人抗体。参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255(1993)；Bruggermann等人,Year in Immunol.,7:33(1993)。
基因改组也可以用于从非人类(例如啮齿动物)抗体中获得人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体类似的亲和力和特异性。根据这种也被称为“表位印记”的方法，通过如上所述的噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链或轻链可变区被人V结构域基因库取代，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合体的群体。用抗原选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链恢复在移除初级噬菌体展示克隆中相应的非人链时被破坏的抗原结合位点，即表位控制(印记)人链伴侣的选择。当重复该过程以取代剩余的非人链时，获得人抗体(参见1993年4月1日公布的PCT WO 93/06213)。与通过CDR移植的非人抗体的传统人源化不同，该技术提供完全人抗体，其不具有非人源的FR或CDR残基。
双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人或人源化抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一是针对包含特定赖氨酸连接的SSEA-4，另一个针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合具有两种不同的赖氨酸连接的两种不同的SSEA-4。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature,305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，并且产物收率低。在1993年5月13日公布的WO 93/08829中和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655(1991)中公开了类似的程序。
根据不同的实施方案，将具有期望结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。例如融合物含有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区。在某些实施方案中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一种融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA***单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在当在构建体中使用的不等比例的三种多肽链提供最佳收率的实施方案中，这在调节三种多肽片段的相互比例方面提供了很大的灵活性。但是，当以相等比例表达至少两条多肽链导致高收率或当比率没有特别重要时，可以将两条或所有三条多肽链的编码序列***一个表达载体中。
在一个实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构促进期望的双特异性化合物与非期望的免疫球蛋白链组合的分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方式。该方法在WO94/04690中公开。对于产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh等人,Methods inEnzymology,121:210(1986)。
根据另一种方法，可以将一对抗体分子之间的界面工程化以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。界面包含抗体恒定结构域CH3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或大小类似的补偿“空腔”。这提供了增加异二聚体相对于其他非期望的终产物如同源二聚体的产率的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与亲和素偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提出此类抗体使免疫***细胞靶向非期望的细胞(美国专利第4,676,980号)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/00373和EP03089)。可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂以及多种交联技术是本领域熟知的，并公开于美国专利第4,676,980号中。
用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可以使用化学连接制备双特异性抗体。Rennan等人,Science,229:81(1985)描述了通过蛋白水解切割完整抗体以产生F(ab’)2片段的方法。在二硫醇络合剂***的存在下还原这些片段，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种Fab’-TNB衍生物再转化为Fab’-硫醇，并将其与等摩尔量的其他Fab’-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶选择性固定化试剂。
最近的进展促进了从大肠杆菌中直接回收Fab’-SH片段，其可以化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每个Fab’片段分别从大肠杆菌中分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，并引发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。
还描述了直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab’部分连接。将抗体同源二聚体在铰链区还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异二聚体。该方法也可用于生产抗体同源二聚体。Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的“双链抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间进行配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994)。
考虑具有多于两个化合价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人.J.Immunol.147:60(1991)。
多价抗体
通过表达与抗体结合的抗原的细胞，多价抗体可以比二价抗体更快地内化(和/或分解代谢)。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)(不同于IgM类)，其可以通过重组表达编码抗体多肽链的核酸而容易地产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。二聚化结构域包含(或由其组成)例如Fc区或铰链区。在这种情况下，抗体将包含Fc区和Fc区氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。在一个实施方案中，多价抗体包含(或由其组成)，例如三至约八个或四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(例如两条多肽链)，其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体还可以包含至少两个(例如四个)轻链可变结构域多肽。本文的多价抗体可以例如包含约2至约8个轻链可变结构域多肽。本文考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地，还包含CL结构域。
抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性是可取的。通过将合适的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有期望特征。可以在制备序列时在主题抗体氨基酸序列中引入氨基酸改变。
如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定作为诱变优选位置的抗体的某些残基或区域的可用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”。在此，鉴定残基或靶残基组(例如带电残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影响氨基酸与抗原之间的相互作用。然后通过在取代位点引入更多的或其他变体来改进那些证明对取代具有功能敏感性的氨基酸位置。因此，尽管预先确定了引入氨基酸序列变异的位点，但不需要预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点的突变性能，在靶标密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并筛选表达的免疫球蛋白的期望活性。
氨基酸序列***包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N-或C-末端与增加抗体血清半衰期的酶(例如ADEPT)或多肽的融合。
另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个氨基酸残基被不同残基取代。对于取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑框架改变。
通过选择以下取代来完成对抗体的生物学特性的实质性修饰：所述取代对维持(a)取代区域中多肽骨架的结构(例如片状或螺旋构象)；(b)分子在靶标位点的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积的影响显著不同。可根据氨基酸侧链特性的相似性对其进行分组(A.L.Lehninger,in Biochemistry,第2版,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975))：
(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电的极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(O)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
可选地，可以基于共同的侧链特性将天然存在的残基分成以下组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。这些取代的残基也可以引入保守性取代位点或引入剩余(非保守的)位点中。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体具有改良的(例如改善的)生物学特性。用于产生此类取代变体的便利方式包括使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，突变几个高变区位点(例如6-7个位点)以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体由丝状噬菌体颗粒展示为与每个颗粒内包装的噬菌体外壳蛋白(例如M13的基因III产物)的至少一部分的融合物。然后如本文所公开的，筛选噬菌体展示变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行扫描诱变(例如丙氨酸扫描)以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可选地或此外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。根据本领域已知的技术(包括本文详述的那些)，这些接触残基和相邻残基是用于取代的候选物。一旦产生了这样的变体，则使用本领域已知的技术(包括本文所述的那些)对变体组进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关分析中具有优异特性的抗体用于进一步开发。
通过本领域已知的多种方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源中分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或者通过早期制备的抗体变体或抗体非变体形式的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变制备。在一些方面，核酸分子将不包含天然存在的序列。
在本发明的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体是可取的。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)，包括铰链半胱氨酸修饰。
免疫缀合物
在另一方面，本发明提供了免疫缀合物或抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与细胞毒性剂缀合的抗体，所述细胞毒性剂如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
抗体-药物缀合物在局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂(即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物(Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26:151-172，美国专利第4,975,278号))中的使用允许将药物部分靶向递送至肿瘤，并在其中的细胞内积累，其中这些未缀合的药剂的全身施用可以导致针对正常细胞以及寻求消除的肿瘤细胞的不可接受的毒性水平(Baldwin等人,(1986)Lancet pp.(Mar.15,1986):603-05；Thorpe,(1985)“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,”in MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(编辑),pp.475-506)。由此寻求具有最小毒性的最大效力。多克隆抗体和单克隆抗体均被报道可用于这些策略(Rowland等人,(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21:183-87)。在这些方法中使用的药物包括柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等人，(1986),同上)。用于抗体-毒素缀合物的毒素包括细菌毒素(如白喉毒素)、植物毒素(如蓖麻毒素)、小分子毒素(如格尔德霉素)(Mandler等人(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)、美登素(EP 1391213；Liu等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623)以及卡里奇霉素(Lode等人(1998)CancerRes.58:2928；Hinman等人(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制来产生其细胞毒性和细胞抑制作用。当与大的抗体或蛋白受体配体缀合时，一些细胞毒性药物倾向于无活性或活性较低。
抗体衍生物
可以进一步修饰本发明的抗体以包含本领域已知的且容易获得的另外的非蛋白部分。在一个实施方案中，适于衍生抗体的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在生产中具有优势。聚合物可以是任何分子量，并且可以是支链或非支链。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，并且如果连接多于一种聚合物，则聚合物可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于考虑因素来确定，所述考虑因素包括但不限于待改善的抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于确定条件下的治疗中等。
在另一实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.102:11600-11605(2005))。辐射可以是任意波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但是将非蛋白部分加热到抗体-非蛋白部分附近的细胞被杀死的温度的波长。
药物配制剂
在一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本文所述的抗体或其抗原结合部分以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，药物组合物包含编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸以及药学可接受的载体。药学可接受的载体包括生理上相容的任何以及所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个实施方案中，该组合物有效抑制对象中的癌细胞。
本发明的药物组合物的施用途径包括但不限于静脉内施用、肌肉内施用、鼻内施用、皮下施用、口服施用、局部施用、皮下施用、皮内施用、透皮施用、真皮下施用、肠胃外施用、直肠施用、脊柱施用或表皮施用。
本发明的药物组合物可以制备成注射剂，如作为液体溶液或悬浮液或者作为适合在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。药物组合物还可以以固体形式制备、可以是乳化的或封装在用于持续递送的脂质体媒介物或其他颗粒载体中的活性成分。例如，药物组合物可以是允许药物组合物的持续释放的下述形式：油乳液、油包水乳液、水包油包水乳液、位点特异性乳液、长效乳液、粘乳液、微乳液、纳米乳液、脂质体、微粒、微球、纳米球、纳米粒子以及多种天然或合成聚合物，如不可吸收的不渗透聚合物(如乙烯-乙酸乙烯共聚物和共聚物)、可膨胀聚合物(如水凝胶)或可再吸收的聚合物(如胶原蛋白和某些多元酸)或聚酯(如用于制备可再吸收缝线的那些)。
将本发明的抗体或其抗原结合部分配制成药物组合物，用于递送至哺乳动物对象。将药物组合物单独施用和/或与药学可接受的媒介物、赋形剂或载体混合施用。合适的媒介物是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。此外，媒介物可含有少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂。药学可接受的载体可含有生理学可接受的化合物，其用于例如稳定或增加或降低本发明的药物组合物的吸收或清除速率。生理学可接受的化合物可包括例如碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)，抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)，螯合剂，低分子量蛋白，洗涤剂，脂质体载体或赋形剂或者其他稳定剂和/或缓冲剂。其他生理学可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂。参见例如第21版Remington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton,Pa.("Remington's")。本发明的药物组合物还可包含辅助物质，如药理学试剂、细胞因子或其他生物应答调节剂。
此外，药物组合物可以配制成中性或盐形式的药物组合物。药学可接受的盐包括酸加成盐(与活性多肽的游离氨基形成)，并且其由无机酸(如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。由游离羧基形成的盐也可以由无机碱(如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)产生。
制备此类剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或者是显而易见的。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,第21版。
药物组合物可以按照时间表并且在适合对象的年龄、体重和状况，使用的具体组合物和给药途径、药物组合物是否用于预防或治疗目的等的时间段内以单剂量治疗或多剂量治疗施用。例如，在一个实施方案中，以每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天一次(qd)、一天两次(qid)或一天三次(tid)施用根据本发明的药物组合物。
根据本发明的抗体的施用持续时间，即施用药物组合物的时间段，可以根据多种因素中的任何一种而变化，例如对象反应等。例如该药物组合物可以在约一秒或多秒至一小时或多个小时、一天至约一周、约两周至约四周、约一个月至约两个月、约两个月至约四个月、约四个月至约六个月、约六个月至约八个月、约八个月至约一年、约一年至约两年或约两年至约四年或更长时间的一段时间内施用。
为了便于施用和剂量的均匀性，可以使用剂量单位形式的口服或肠胃外药物组合物。本文使用的剂量单位形式指适合以单位剂量用于待治疗对象的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以与所需的药物载体联合产生期望治疗效果的预定量的活性化合物。
从细胞培养物分析和动物研究获得的数据可用于配制用于人的一系列剂量。在一个实施方案中，此类化合物的剂量在包括ED50同时具有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可在此范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的施用途径。在另一实施方案中，最初可以从细胞培养物分析估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中测定的IC50(即实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。Sonderstrup,Springer,Sem.Immunopathol.25:35-45,2003.Nikula等人,Inhal.Toxicol.4(12):123-53,2000。
本发明的抗体或抗原结合部分的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围为约0.001至约60mg/kg体重、约0.01至约30mg/kg体重、约0.01至约25mg/kg体重、约0.5至约25mg/kg体重、约0.1至约20mg/kg体重、约10至约20mg/kg体重、约0.75至约10mg/kg体重、约1至约10mg/kg体重、约2至约9mg/kg体重、约1至约2mg/kg体重、约3至约8mg/kg体重、约4至约7mg/kg体重、约5至约6mg/kg体重、约8至约13mg/kg体重、约8.3至约12.5mg/kg体重、约4至约6mg/kg体重、约4.2至约6.3mg/kg体重、约1.6至约2.5mg/kg体重、约2至约3mg/kg体重或约10mg/kg体重。
将药物组合物配制为含有有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分，其中所述量取决于待治疗的动物和待治疗的病况。在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分的施用剂量范围为约0.01mg至约10g、约0.1mg至约9g、约1mg至约8g、约2mg至约7g、约3mg至约6g、约10mg至约5g、约20mg至约1g、约50mg至约800mg、约100mg至约500mg、约0.01μg至约10g、约0.05μg至约1.5mg、约10μg至约1mg蛋白质、约30μg至约500μg、约40μg至约300μg、约0.1μg至约约200μg、约0.1μg至约5μg、约5μg至约10μg、约10μg至约25μg、约25μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约500μg、约500μg至约1mg、约1mg至约2mg。任何特定对象的具体剂量水平取决于多种因素，包括具体肽的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径和***率、药物组合以及接受治疗的具体疾病的严重程度，并且其可以由本领域普通技术人员确定而无需过多的实验。
通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本发明的抗体的治疗配制剂，用于以水溶液、冻干或其他干燥配制剂的形式储存(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版,Osol,A.Ed.(1980))。在所用的剂量和浓度下，可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者无毒，并且其包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属配合物(例如、锌-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文的配制剂还可含有所治疗的具体适应症所必需的多种活性化合物，其包括但不限于具有彼此不会不利影响的互补活性那些活性化合物。这些分子以对预期目的有效的量适当地组合存在。
也可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合将活性成分包埋在制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，包埋在胶体药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版,Osol,A.Ed.(1980)中。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的免疫球蛋白的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球))以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使分子释放能够超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的免疫球蛋白长时间保留在体内时，它们可能由于暴露于37℃的水分而变性或聚集，导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。可以根据所涉及的机制设计合理的策略以实现稳定。例如，如果发现聚集机制是通过硫基-二硫化物互换形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂以及开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
用途
本发明的抗体可用于例如体外、离体和体内治疗方法。本发明的抗体可用作拮抗剂，以在体外、离体和/或体内部分或完全阻断特异性抗原活性。此外，本发明的至少一些抗体可以中和来自其他物种的抗原活性。因此，本发明的抗体可用于抑制例如含有抗原的细胞培养物中、具有与本发明的抗体交叉反应的抗原的人对象或其他哺乳动物对象(例如黑猩猩、狒狒、狨猴、猕猴和恒河猴、猪或小鼠)中的特定抗原的活性。在一个实施方案中，本发明的抗体可用于通过使抗体与抗原接触从而抑制抗原活性来抑制抗原活性。在一个实施方案中，抗原是人蛋白分子。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于抑制罹患抗原活性有害的病症的对象中的抗原的方法，其包括向对象施用本发明的抗体，使得对象中的抗原活性被抑制。在一个实施方案中，抗原是人蛋白分子，并且对象是人对象。可选地，对象可以是表达与本发明的抗体结合的抗原的哺乳动物。此外，对象还可以是已经引入抗原的哺乳动物(例如通过施用抗原或通过表达抗原转基因)。可以将本发明的抗体施用于人对象用于治疗目的。此外，本发明的抗体可以施用于表达与抗体交叉反应的抗原的非人哺乳动物(例如灵长类动物、猪或小鼠)，用于兽医目的或作为人类疾病的动物模型。关于后者，此类动物模型可用于评价本发明抗体的治疗效力(例如测试剂量和施用时间历程)。本发明的抗体可用于治疗、抑制与SSEA-4和SSEA-4化的蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病、病症或病况，延缓其进展、预防/延迟其复发，对其进行改善或预防，所述疾病、病症或病况包括但不限于癌症、肌肉病症、泛素途径相关的遗传疾病、免疫/炎性病症、神经障碍和其他泛素途径相关的病症。
在一个方面，本发明的阻断性抗体是SSEA-4特异性的。
在某些实施方案中，向患者施用包含与细胞毒性剂缀合的本发明的抗体的免疫缀合物。在某些实施方案中，所结合的免疫缀合物和/或抗原被细胞表面上表达一种或多种与SSEA-4相关的蛋白的细胞内化，导致免疫缀合物杀死与之相关的靶细胞的治疗效力增加。在一个实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰靶细胞中的核酸。此类细胞毒性剂的实例包括本文提到的任何化学治疗剂(如美登素或卡里奇霉素)、放射性同位素或核糖核酸酶或DNA核酸内切酶。
本发明的抗体可以在治疗中单独使用或与其他组合物组合使用。例如，本发明的抗体可以与另一种抗体和/或佐剂/治疗剂(例如类固醇)共同施用。例如，本发明的抗体可以在治疗方案例如在治疗本文所述的任何疾病中与抗炎药和/或抗菌剂组合，所述疾病包括癌症、肌肉病症、泛素通路相关的遗传病症、免疫/炎性病症、神经障碍和其他泛素通路相关的病症。上述此类组合疗法包括组合施用(其中两种或更多种药剂包含在同一或不同的配制剂中)和单独给药，在这种情况下，本发明的抗体的施用可以在施用辅助治疗之前和/或之后发生。
本发明的抗体(和辅助治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外施用、皮下施用、腹腔内施用、肺内施用和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内施用、静脉内施用、动脉内施用、腹腔内施用或皮下施用。另外，抗体适合通过脉冲输注施用，特别是抗体剂量下降的情况。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射(例如静脉内注射或皮下注射)，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。
在制备和施用抗体时可以考虑本发明的抗体的结合靶标的位置。当结合靶标是细胞内分子时，本发明的某些实施方案提供被引入结合靶标所在的细胞中的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明的抗体可以在细胞内表达为胞内抗体。如Marasco,GeneTherapy 4:11-15(1997)；Kontermann,Methods 34:163-170(2004)；美国专利第6,004,940号和第6,329,173号；美国专利申请公开号2003/0104402和PCT公开号WO2003/077945中所述，本文使用的术语“胞内抗体”指在细胞内表达并且能够选择性结合靶标分子的抗体或其抗原结合部分。通过将编码期望抗体或其抗原结合部分的核酸(缺少通常与编码抗体或抗原结合片段的基因相关的野生型前导序列和分泌信号)引入靶细胞中来实现胞内抗体的细胞内表达。可以使用将核酸引入细胞的任何标准方法，包括但不限于显微注射，弹道注射，电穿孔，磷酸钙沉淀，脂质体和用携带目标核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和牛痘载体进行的转染。可以将编码本发明的抗SSEA-4抗体的全部或部分的一种或多种核酸递送至靶细胞，使得表达一种或多种胞内抗体，其能够在细胞内与SSEA-4结合并调节一种或多种SSEA-4介导的细胞通路。
在另一实施方案中，提供了内化抗体。抗体可以具有增强抗体向细胞的递送的某些特征，或者可以被修饰以具有这些特征。实现此目的的技术在本领域中是已知的。例如，已知抗体的阳离子化促进其摄入细胞中(参见例如美国专利第6,703,019号)。脂质体转染或脂质体也可用于将抗体递送到细胞中。在使用抗体片段的情况下，特异性结合靶蛋白的结合结构域的最小抑制片段通常是有利的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白序列的能力的肽分子。这些肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术产生。参见例如Marasco等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993)。
可通过本领域已知的方法增强调节剂多肽进入靶细胞。例如，某些序列(如源自HIV Tat或触角足(Antennapedia)同源结构域蛋白的那些序列)能够指导异源蛋白跨细胞膜的有效摄取。参见例如Chen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96:4325-4329。
当结合靶标位于脑中时，本发明的某些实施方案提供穿过血脑屏障的抗体或其抗原结合片段。某些神经退行性疾病与血脑屏障的渗透性增加有关，使得抗体或抗原结合片段可以容易地引入脑中。当血脑屏障保持完整时，存在几种本领域已知的用于将分子运输穿过该血脑屏障的方法，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法以及基于受体和通道的方法。
将抗体或抗原结合片段运输穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于完全绕过血脑屏障或通过在血脑屏障中产生开口进行。绕行方法包括但不限于直接注射到脑中(参见例如Papanastassiou等人,Gene Therapy 9:398-406(2002))，间质输注/增强对流递送(参见例如Bobo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994))以及在脑中植入递送装置(参见例如Gill等人,Nature Med.9:589-595(2003)；和Gliadel WafersTM,GuildfordPharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于超声(参见例如美国专利公开号2002/0038086)、渗透压(例如通过施用高渗甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implication of theBlood-Brain Barrier and its Manipulation,第1&2卷,Plenum Press,N.Y.(1989)))，通过例如缓激肽或透化剂A-7透化(参见例如美国专利第5,112,596号、第5,268,164号、第5,506,206号和第5,686,416号)以及用含有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经元(参见例如美国专利公开号2003/0083299)。
将抗体或抗原结合片段运输穿过血脑屏障的基于脂质的方法包括但不限于将抗体或抗原结合片段封装在脂质体中，所述脂质体与结合血脑屏障的血管内皮细胞上的受体的抗体结合片段偶联(参见例如美国专利申请公开号20020025313)，并将抗体或抗原结合片段包被在低密度脂蛋白颗粒(参见例如美国专利申请公开号20040204354)或载脂蛋白E中(参见例如美国专利申请公开号20040131692)。
将抗体或抗原结合片段运输穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但不限于使用糖皮质激素阻断剂来增加血脑屏障的渗透性(参见例如美国专利申请公开号2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通道(参见例如美国专利申请公开号2005/0089473)、抑制ABC药物转运蛋白(参见例如美国专利申请公开号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体和调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见例如美国专利申请公开号2003/0129186)以及使抗体阳离子化(参见例如美国专利第5,004,697号)。
本发明的抗体组合物将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用时程以及从业医生所知的其他因素。抗体不必是，但任选地是用一种或多种目前用于预防或治疗讨论中的病症的药剂来配制。这些其他药剂的有效量取决于配制剂中存在的本发明的抗体的量、病症或治疗的类型以及上面论述的其他因素。这些通常以与本文所述的相同剂量和施用途径使用，或者以本文所述剂量的约1％至99％或以通过经验/临床确定为适当的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的适当剂量(当单独使用或与其他试剂如化学治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、抗体是用于预防目的还是治疗目的施用、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的应答以及主治医师的判断。抗体适合一次或在一系列治疗中向患者施用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体可以是向患者施用的初始候选剂量，不管例如是通过一次或多次单独施用还是通过连续输注。对于疾病的预防或治疗，一种典型的日剂量可以为约1μg，本发明的抗体的适当剂量(数天或更长，取决于病况，治疗通常将持续至出现期望的疾病症状的抑制。一个示例性的抗体剂量范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任意组合)中的一种或多种剂量。这些剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如使得患者接受约2至约20或例如约6剂量的抗体)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。示例性给药方案包括施用约4mg/kg的初始负荷剂量，然后施用约2mg/kg抗体的每周维持剂量。但是，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和分析可以容易地监测该疗法的进展。
制品
在本发明的另一方面中，提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质的制品。制品包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳这样的组合物，该组合物本身或当与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病况，并且其可以具有无菌进入口(例如容器可以是通过皮下注射针头的静脉内溶液袋或具有塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书表明该组合物用于治疗所选病况。此外，制品可包括(a)其内含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；(b)其内含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明该实施方案中的制品还可包含包装说明书，其表明该组合物可用于治疗特定病况。可选地或此外，制品还可包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受的缓冲剂，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
在某些实施方案中，所治疗的对象是哺乳动物。在某些实施方案中，对象是人。在某些实施方案中，对象是家养动物，如狗、猫、牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方案中，对象是伴侣动物，如狗或猫。在某些实施方案中，对象是家畜动物，如牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方案中，对象是动物园动物。在另一实施方案中，对象是研究动物，如啮齿动物、狗或非人灵长类动物。在某些实施方案中，对象是非人转基因动物，如转基因小鼠或转基因猪。
药物组合物和配制剂
在制备如本文所述的抗体后，可以产生“预冻干配制剂”。用于制备配制剂的抗体优选为基本纯的并且理想地基本上同质的(即不含污染性蛋白等)。“基本上纯的”蛋白意为基于组合物的总重量，包含至少约90重量％，优选至少约95重量％的蛋白的组合物。“基本上同质的”蛋白意为基于组合物的总重量，包含至少约99重量％的蛋白的组合物。在某些实施方案中，蛋白是抗体。
考虑到所需剂量体积、施用方式等，确定预冻干配制剂中抗体的量。在所选蛋白是完整抗体(全长抗体)的情况下，约2mg/mL至约50mg/mL，优选约5mg/mL至约40mg/mL以及最优选约20-30mg/mL是示例性起始蛋白浓度。蛋白通常存在于溶液中。例如，蛋白可以存在于pH为约4-8，优选约5-7的pH缓冲溶液中。示例性缓冲剂包括组氨酸、磷酸盐、Tris、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其他有机酸。缓冲剂浓度可为约1mM至约20mM或约3mM至约15mM，这取决于例如缓冲剂和配制剂(例如复溶配制剂)的期望等渗性。优选的缓冲剂是组氨酸，这是因为如下所示，这可以具有冻干保护特性。显示琥珀酸盐是另一种可用的缓冲剂。
将冻干保护剂添加到预冻干配制剂中。在优选实施方案中，冻干保护剂是非还原糖，如蔗糖或海藻糖。预冻干配制剂中冻干保护剂的量通常使得在复溶后所得配制剂是等渗的。但是，高渗复溶配制剂也可能是合适的。此外，冻干保护剂的量不能太低，使得在冻干时发生不可接受量的蛋白降解/聚集。在冻干保护剂是糖(例如蔗糖或海藻糖)并且蛋白质是抗体的情况下，预冻干配制剂中的示例性冻干保护剂浓度为约10mM至约400mM，优选约30mM至约300mM，以及最优选约50mM至约100mM。
针对每种蛋白质和冻干保护剂组合，选择蛋白质与冻干保护剂的比例。在抗体作为所选蛋白质以及糖(例如蔗糖或海藻糖)作为用于产生具有高蛋白质浓度的等渗复溶配制剂的冻干保护剂的情况下，冻干保护剂与抗体的摩尔比可以为约100至约1500摩尔冻干保护剂比1摩尔抗体，并且优选约200至约1000摩尔冻干保护剂比1摩尔抗体，例如约200至约600摩尔冻干保护剂比1摩尔抗体。
在本发明的优选实施方案中，已发现将表面活性剂添加到预冻干配制剂中是可取的。可选地或此外，可将表面活性剂添加到冻干配制剂和/或复溶配制剂中。示例性表面活性剂包括非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠(sodium octylglycoside)；十二烷基-、肉豆蔻基-、亚油酰基-或硬脂酰基-硫代甜菜碱；十二烷基-、肉豆蔻基-、亚油酰基-或硬脂酰基-肌氨酸；亚油酰基-、肉豆蔻基-或十六烷基-甜菜碱；月桂酰胺丙基(lauroamidopropyl)-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰基丙基-、棕榈丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基钠或甲基油烯基-牛磺酸二钠；以及MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙烯和丙二醇的共聚物(例如Pluronics，PF68等)。添加的表面活性剂的量使得它减少复溶蛋白的聚集并使复溶后颗粒的形成最小化。例如，表面活性剂可以以约0.001-0.5％，优选约0.005-0.05％的量存在于预冻干配制剂中。
在本发明的某些实施方案中，将冻干保护剂(例如蔗糖或海藻糖)和填充剂(例如甘露醇或甘氨酸)的混合物用于制备预冻干配制剂。填充剂可以允许产生均匀的冻干饼而其内没有过多的空隙等。
其他药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，如Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.Ed.(1980)中描述的那些，可以包含在预冻干配制剂(和/或冻干配制剂和/或复溶配制剂)中，条件是它们不会不利地影响配制剂的期望特征。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度下对接受者无毒，并且其包括：另外的缓冲剂；防腐剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂如EDTA；金属配合物(例如锌-蛋白配合物)；可生物降解的聚合物，如聚酯；和/或成盐抗衡离子，如钠。
本文所述的药物组合物和配制剂优选是稳定的。“稳定的”配制剂/组合物是其内抗体在储存时基本上保持其物理和化学稳定性以及完整性的配制剂/组合物。用于测量蛋白稳定性的多种分析技术可在本领域中获得，并综述于Peptide and Protein DrugDelivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)；和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中。可以在选定的温度下持续一段选定的时间测量稳定性。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这在冻干和复溶之前或之后，通过无菌过滤膜过滤容易地实现。可选地，整个混合物的无菌性可以通过例如在约120℃下对除蛋白外的成分进行高压灭菌约30分钟来完成。
在将蛋白、冻干保护剂和其他任选组分混合在一起后，将配制剂冻干。可获得许多不同的冷冻干燥器用于此目的，如(Hull,USA)或(Leybold-Heraeus,Germany)冷冻干燥器。通过冷冻配制剂并随后在适于初步干燥的温度下从冰冻内容物中升华冰来完成冷冻干燥。在这种条件下，产品温度低于配制剂的共晶点或崩塌温度。通常，在范围通常为约50至250毫托的合适压力下，初步干燥的搁板温度的范围为约-30至25℃(假设产品在初步干燥期间保持冷冻)。配制剂、容纳样品的容器的大小和类型(例如玻璃小瓶)以及液体的体积将主要决定干燥所需的时间，其可以为几小时至几天(例如40-60小时)。二次干燥阶段可在约0-40℃下进行，这主要取决于容器的类型和大小以及所用蛋白的类型。但是，在此发现可能不需要二次干燥步骤。例如，冻干的整个除水阶段的搁板温度可为约15-30℃(例如约20℃)。二次干燥所需的时间和压力将是产生合适的冻干饼的时间和压力，这取决于例如温度和其它参数。二次干燥时间由产品中期望的残留水分水平决定，并且通常需要至少约5小时(例如10-15小时)。压力可以与初步干燥步骤期间使用的压力相同。冷冻干燥条件可根据配制剂和小瓶大小而变化。
在一些情况下，可取的是将容器中的蛋白配制剂冻干，其中要进行蛋白复溶以避免转移步骤。在这种情况下，容器可以是例如3、5、10、20、50或100cc的小瓶。作为一般提议，冻干法将产生冻干的配制剂，其中其水分含量小于约5％，并且优选小于约3％。
在期望的阶段，通常在将蛋白质施用于患者时，可以用稀释剂复溶冻干的配制剂，使得复溶配制剂中的蛋白质浓度为至少50mg/mL，例如约50mg/mL至约400mg/mL，更优选约80mg/mL至约300mg/mL，最优选约90mg/mL至约150mg/mL。复溶配制剂中的这种高蛋白质浓度被认为在旨在皮下递送复溶配制剂时特别有用。但是，对于其他施用途径，如静脉内施用，可能需要复溶配制剂中较低的蛋白浓度(例如在复溶配制剂中约5-50mg/mL或约10-40mg/mL蛋白)。在某些实施方案中，复溶配制剂中的蛋白浓度显著高于预冻干配制剂中的蛋白浓度。例如，复溶配制剂中的蛋白浓度可以是预冻干配制剂中的蛋白浓度的约2-40倍，优选3-10倍，并且最优选3-6倍(例如至少3倍或至少4倍)。
复溶通常在约25℃的温度下进行以确保完全水合，但是可以根据需要采用其他温度。复溶所需的时间将取决于例如稀释剂的类型、赋形剂和蛋白质的量。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏液或右旋糖溶液。稀释剂任选地包括防腐剂。上文已经描述了示例性的防腐剂，其中芳族醇如苯甲醇或酚醇是优选防腐剂。通过评估不同防腐剂浓度与蛋白的相容性和防腐剂效力测试来确定所用防腐剂的量。例如，如果防腐剂是芳族醇(如苯甲醇)，它可以以约0.1-2.0％，优选约0.5-1.5％，但最优选约1.0-1.2％的量存在。优选地，每小瓶的复溶配制剂含有少于6000个尺寸>10μm的颗粒。
治疗应用
本文描述了治疗方法，其包括向需要这种治疗的对象施用治疗有效量的包含本文所述的一种或多种抗体的组合物。
在某些实施方案中，需要治疗的对象(例如人患者)被诊断患有、疑似患有癌症或具有患癌症的风险。癌症的实例包括但不限于肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、***、卵巢癌和***癌。在某些实施方案中，癌症是肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、结肠癌或胰腺癌。在一些优选实施方案中，癌症是脑癌或多形性成胶质细胞瘤(GBM)。
在优选实施方案中，抗体能够靶向表达SSEA-4的癌细胞。在某些实施方案中，抗体能够靶向癌细胞上的SSEA-4。在某些实施方案中，抗体能够靶向癌症中的SSEA-4。
该治疗导致肿瘤尺寸的减小、恶性细胞的消除、转移的预防、复发的预防、播散性癌症的减少或杀死、存活的延长和/或肿瘤癌症进展时间的延长。
在某些实施方案中，治疗还包括在所述施用抗体之前、期间或之后向所述对象施用另外的疗法。在某些实施方案中，另外的疗法是用化学治疗剂进行的治疗。在某些实施方案中，另外的疗法是辐射疗法。
本发明的方法在治疗和预防早期肿瘤中特别有利，从而防止进展到更晚期的阶段，导致与晚期癌症相关的发病率和死亡率降低。本发明的方法还有利于预防肿瘤复发或肿瘤(例如在移除原发肿瘤后持续存在的休眠肿瘤)再生或者减少或预防肿瘤的出现。
在某些实施方案中，本文公开的方法可用于治疗或预防癌症，例如其中癌症的特征在于增加的Globo H、SSEA-3和/或SSEA-4表达。在某些实施方案中，癌症包括癌症干细胞。在某些实施方案中，癌症是癌症前期和/或恶性癌症和/或治疗难治癌症。在某些实施方案中，癌症是脑癌。
对于本发明的方法，癌症可以是液体肿瘤、实体瘤，所述液体肿瘤例如如白血病和淋巴瘤，所述实体瘤例如乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、肺癌、肾细胞癌、神经胶质瘤(例如间变型星形细胞瘤、间变型少突星形细胞瘤、间变型少突神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM))、肾癌、***癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、类癌、头颈癌、黑色素瘤和卵巢癌。在一个实施方案中，癌症是脑癌或GBM。为了实践本文公开的方法，可以通过合适的途径向需要治疗的对象(例如人)施用有效量的上述含有至少一种本文所述的抗体的药物组合物/配制剂，所述合适的途径如静脉内施用，例如作为弹丸剂或通过一段时间连续输注，通过肌肉内、腹腔内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径施用。用于液体配制剂的市售喷雾器(包括喷射喷雾器和超声喷雾器)可用于施用。液体配制剂可以直接雾化，并且冻干粉末可以在复溶后雾化。可选地，可以使用碳氟化合物配制剂和定量吸入器雾化抗体，或者所述抗体可以作为冻干和研磨的粉末被吸入。
通过本文描述的方法治疗的对象可以是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物包括但不限于农场动物、参加体育运动的动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人对象可以是患有癌症、有患癌症的风险或疑似患有癌症的人患者，所述癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌、胆管癌、肝癌、颊癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、肾癌、***癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、口腔癌、神经内分泌癌、肾上腺癌、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤或脑肿瘤。可通过常规医学检查鉴定患有癌症的对象。
本文使用的“有效量”指单独或与一种或多种其他活性剂组合赋予对象治疗效果所需的每种活性剂的量。如本领域技术人员所认识到的，有效量可根据下述发生改变：所治疗的具体病况、病况的严重程度、个体患者的参数(包括年龄、身体状况、尺寸、性别和体重、治疗持续时间、同时治疗的性质(如果有的话)、具体施用途径和健康从业者的知识和专长中的相似因素)。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以仅通过常规实验解决。通常优选使用最大剂量的各个组分或其组合，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。但是，本领域普通技术人员将会理解，出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因，患者可坚持较低剂量或可耐受剂量。
经验方面的考虑因素，例如半衰期，通常将有助于确定剂量。例如，与人免疫***相容的抗体(例如人源化抗体或完全人抗体)可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主的免疫***攻击。施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且通常但不是必须基于癌症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可选地，本文所述抗体的持续连续释放配制剂可能是合适的。用于实现持续释放的多种配制剂和装置是本领域已知的。
在一个实例中，可以在已经给予一次或多次抗体施用的个体中凭经验确定如本文所述的抗体的剂量。给予个体增量剂量的抗体。为了评估抗体的效力，可以根据常规实践追踪疾病(例如癌症)的指标。
通常，对于施用本文所述的任何抗体，初始候选剂量可为约2mg/kg。出于本公开的目的，典型的日剂量的范围可以为约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg至30mg/kg至100mg/kg或更高中的任何剂量，这取决于上述因素。对于数天或更长时间的重复施用，根据病况，持续治疗直至出现期望的症状抑制或直至达到足够的治疗水平以减轻癌症或其症状。示例性给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，随后施用约1mg/kg抗体的每周维持剂量，或者随后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。但是，其他剂量方案可能是有用的，这取决于从业者希望实现的药代动力学衰变模式。例如，考虑每周1-4次给药。在某些实施方案中，可以使用范围为约3μg/mg至约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg以及约2mg/kg)的给药。在某些实施方案中，给药频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次或每3个月一次或更长时间一次。通过常规技术和分析可以容易地监测该疗法的进展。给药方案包括使用的抗体可随时间变化。
出于本公开的目的，本文所述抗体的合适剂量将取决于所用的特异性抗体(或其组合物)、癌症的类型和严重程度、抗体是用于预防还是治疗目的施用、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的应答以及主治医师的判断。本文所述的抗体的施用在预选时间段内可以基本上连续或者可以是一系列间隔给药，例如在发展癌症之前、期间或之后。
本文使用的术语“治疗”指向患有癌症、具有癌症症状或癌症易感性的对象应用或施用包含一种或多种活性剂的组合物，目的是治愈、痊愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进或影响癌症、癌症的症状或癌症易感性。
缓解癌症包括延迟癌症的发展或进展或者降低癌症严重程度。缓解癌症并不一定需要治愈结果。如其中所使用的，“延迟”癌症的发展意为推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓癌症的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于癌症和/或被治疗个体的历史。“延迟”或缓解癌症发展或延迟癌症发作的方法是这样的方法，当与不使用该方法相比时，所述方法降低给定时间范围内一种或多种癌症症状发展的可能性(风险)和/或降低给定时间范围内的症状程度。这种比较通常基于使用足以给出统计学显著结果的许多对象进行的临床研究。
癌症的“发展”或“进展”意为癌症的初始临床表现和/或随后的进展。可以使用本领域熟知的标准临床技术检测和评估癌症的发展。但是，发展也指可能无法察觉的进展。出于本公开的目的，发展或进展指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。本文使用的癌症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
可以使用医药领域的普通技术人员已知的常规方法向对象施用药物组合物，这取决于待治疗的疾病类型或疾病部位。该组合物还可以通过其他常规途径施用，例如口服施用、肠胃外施用、通过吸入喷雾施用、局部施用、直肠施用、鼻部施用、颊部施用、***施用或通过植入的储库施用。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。此外，它可以通过可注射的储库施用途径向对象施用，如使用1个月、3个月或6个月的可注射或可生物降解材料和方法。
可注射的组合物可含有多种载体，如植物油、二甲基乙酰胺(dimethylactamide)、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用水溶性抗体，由此输注含有抗体和生理学可接受的赋形剂的药物配制剂。生理学可接受的赋形剂可包括例如5％右旋糖、0.9％盐水、林格氏液或其他合适的赋形剂。肌肉内制剂(例如抗体的合适可溶性盐形式的无菌配制剂)可以溶解于药物赋形剂中，并进行施用，所述药物赋形剂如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液。
诊断应用
本文描述了用于诊断对象中的癌症的方法，其包括(a)将包含一种或多种检测SSEA-4的表达的单克隆抗体的组合物应用于获自对象的细胞或组织样品；(b)分析单克隆抗体与细胞或组织样品的结合；以及(c)将结合与正常对照进行比较，以确定对象中癌症的存在。
用于检测和诊断的癌症的实例包括但不限于肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、***、卵巢癌和***癌。在某些实施方案中，癌症是肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、结肠癌或胰腺癌。
在某些实施方案中，抗体能够检测表达Globo H、SSEA-3和SSEA-4的癌细胞。在某些实施方案中，抗体能够检测癌细胞上的Globo H和SSEA。在某些实施方案中，抗体能够检测癌症中的SSEA。在某些实施方案中，癌症是脑癌或多形性成胶质细胞瘤(GBM)，并且抗体是抗SSEA-4单克隆抗体。
SSEA-4特异性单克隆抗体可单独或组合用于体外和体内诊断分析，以检测表达SSEA-4的癌细胞。在某些实施方案中，使SSEA-4特异性单克隆抗体与来自患有或疑似患有癌症的个体的生物样品接触，并且确定与样品中的细胞结合的抗体，当高于或低于正常抗体结合时表明个体患有癌症。在某些实施方案中，生物样品是血液样品或血液级分(例如血清、血浆、血小板、红细胞、白细胞)。在某些实施方案中，生物样品是例如来自疑似肿瘤部位或来自已知受影响的组织的组织样品(活组织检查)，例如以确定已知肿瘤的边界。在某些实施方案中，生物样品获自炎症部位。
通常进行活组织检查以从组织获得样品，即非流体细胞类型。应用的活组织检查技术将取决于待评价的组织类型(例如***、皮肤、结肠、***、肾、肺、膀胱、***、肝脏、骨髓、气道或肺)。在癌症的情况下，该技术还将取决于肿瘤的大小和类型(例如固体、悬浮的或血液)以及其他因素。例如，在Harrison's Principles of Internal Medicine,Kasper等人编辑,第16版,2005,第70章以及全部V部分中论述了活组织检查技术。
检测抗体与样品中的细胞结合的任何方法均可用于本发明的诊断分析。检测抗体结合的方法是本领域熟知的，例如流式细胞术、荧光显微术、ELISA等。在某些实施方案中，该方法包括在确定步骤之前制备用于检测的生物样品。例如，可以将细胞亚群(例如白细胞)与来自个体的其余样品(例如其他血液成分)分离或者可以悬浮组织中的细胞以便于检测。
在某些实施方案中，测定样品中表达SSEA-4的细胞的百分比并与对照进行比较，例如来自已知患有癌症的个体或个体组的样品(阳性对照)或来自已知未患癌症的个体或个体组的样品(正常，未患病或阴性对照)。在某些实施方案中，对照是针对给定组织建立的标准范围的SSEA-4表达。高于或低于正常百分比的表达SSEA-4的细胞或者更高或更低的表达水平表明该个体患有癌症。
在一个实施方案中，提供了用于检测生物样品(如血液样品或组织样品)中的SSEA-4的试剂盒。例如，为了确认对象中的癌症诊断，可以进行活组织检查以获得用于组织学检查的组织样品。可选地，可以获得血液样品以检测SSEA-4的存在。用于检测多肽的试剂盒通常包含一种或多种特异性结合SSEA-4的抗体，例如本文公开的任何抗体。在进一步的实施方案中，标记抗体(例如用荧光标记、放射性标记或酶标记)。
在一个实施方案中，试剂盒包括公开一种或多种特异性结合SSEA-4的抗体的使用方法的说明材料。说明材料可以以电子形式(如计算机磁盘或光盘)书写或者可以是视觉的(如视频文件)。试剂盒还可以包括另外的组分以促进所设计的试剂盒的特定应用。因此，例如，试剂盒可以另外包含检测标记的工具(如用于酶标记的酶底物，检测荧光标记的过滤器组，诸如第二抗体的适当的二级标记等)。该试剂盒可以另外包括缓冲液和常规用于实施特定方法的其他试剂。这些试剂盒和适当的内容物是本领域技术人员所熟知的。
确定细胞表面标志物是否存在的方法是本领域熟知的。例如，抗体可以与其他化合物缀合，包括但不限于酶、磁珠、胶体磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物或药物。抗体还可用于免疫分析，如但不限于放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)或免疫组织化学分析。抗体也可用于荧光激活的细胞分选(FACS)。FACS采用多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道以及阻抗通道，以及其他更复杂的检测水平，以分离或分选细胞(参见美国专利第5,061,620号)。如本文所公开的，任何与SSEA-4结合的单克隆抗体均可用于这些分析中。因此，抗体可用于常规免疫分析中，包括但不限于ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、蛋白质印迹或免疫沉淀。
分期和/或确定肿瘤预后的方法
本公开另一方面的特征在于对人患者的肿瘤进行分期和/或确定预后的方法，该方法包括：(a)将包含检测由SSEA组成的标志物的表达的一种或多种抗体的组合物应用于获自患者的细胞或组织样品；(b)分析单克隆抗体与细胞或组织样品的结合；(c)将测试样品中标志物的表达水平与参照样品中的水平进行比较，以及(d)基于步骤(c)中鉴定的结果确定患者中肿瘤的阶段和/或预后。
无需进一步详细说明，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，将本文引用的所有出版物均通过引用并入。
实施例
实施例1：杂交瘤融合和筛选
进行经典的杂交瘤融合。小鼠接收其用与OBI-821皂素佐剂缀合的SSEA-4-DT-CRM197(白喉毒素交叉反应材料197)进行的第一次免疫。通过在左腹部和右腹部部位(100μL/部位)皮下(s.c.)注射向每只小鼠施用指定的治疗。对小鼠给药四次(第0天、第7天、第14天和第23天)。在第0天(给药前)、第10天、第17天、第26天和处死日(第35天，通过面部静脉和心脏穿孔收集一定体积的全血)之前，在没有抗凝血剂的情况下通过面部静脉获得血液样品(约0.1mL全血/时间点/动物)。将凝结的血液样品离心(1500×g，15分钟，4℃)，以及将血清分离并转移到eppendorf管中。测试所有血清样品的抗SSEA-4抗体滴度。发现5只小鼠产生高水平的抗SSEA-4 IgG和IgM，并将其用于产生杂交瘤。遵循和Milstein(和Milstein C，1975)的方法，将小鼠骨髓瘤细胞用于与小鼠脾细胞融合。利用每孔0.2μg SSEA-4-脂质1，通过亲和ELISA筛选杂交瘤上清液。将商业SSEA-4抗体(MC-813-70)(Biolegend；Cat#330402)用作阳性对照。用未稀释的上清液测量杂交瘤克隆的OD。选择背景×2。前三个杂交瘤克隆是1G1s、1J1s和2F20s。
实施例2：裸鼠中示例性抗体的抗肿瘤活性测量
在人胰腺癌的异种移植肿瘤模型中，将HPAC细胞皮下(sc)移植进BALB/c雄性裸鼠中，并且当平均肿瘤大小达到50-120mm3时，通过腹腔内(ip)注射以0.4mg/kg施用测试物，每周两次，持续5周。监测肿瘤大小并每周记录两次，持续36天。以每周两次记录死亡率、体重以及明显的动物毒性迹象，持续36天。肿瘤生长计算为T/C(处理/对照)×100％。
测试物质和给药模式
以液体形式制备1.45mg/mL、1mg/mL或0.5mg/mL的测试物质。每天在给药前通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)稀释储液以获得指定的给药浓度(0.04mg/mL)来新鲜制备测试物质。以10mL/kg的剂量体积腹腔内(i.p.)施用测试物质，每周两次，持续5周。
表4.示例类型的配制剂
(a)这是基于目测
S：可溶；SS：微溶；I：不溶(悬浮或沉淀)
(b)Y：将配制剂保存在棕色管或小瓶中或者用铝箔覆盖。
N：不防光
(c)RT：新鲜制备并在20-25℃下储存。
4℃：新鲜制备并在冰箱中储存或在冰上保存。
细胞系
制备HPAC肿瘤细胞系(ATCC CRL-2119，人胰腺癌)，并在以0.1mL1×106个细胞/小鼠皮下移植进BALB/c雄性裸鼠右侧之前，在Eurofins Panlabs Taiwan Ltd.培养。
动物
从BioLasco Taiwan(Charles River Laboratories Licensee)获得6-7周龄，体重18-22g的BALB/c雄性裸鼠。在具有12小时光/暗循环的良好控制温度(20-24℃)和湿度(30-70％)的环境中维持所有动物。允许自由获得标准实验室饮食[MFG(Oriental YeastCo.，Ltd.，Japan)]和高压蒸汽处理的自来水。本研究的所有方面，包括试验场所、实验和动物处置一般按照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals:第8版”(National Academies Press,Washington,D.C.,2011)在我们的AAALAC认证的实验动物设施中进行。此外，动物护理和使用方案由Eurofins Panlabs Taiwan，Ltd的IACUC审查并批准。
化学品
DMEM/F12培养基(Invitrogen，USA)、表皮生长因子(R&D Systems，USA)、胎牛血清(Invitrogen，USA)、胰岛素(Sigma，USA)、氢化可的松(Sigma，USA)和青霉素/链霉素溶液(Invitrogen，USA)。
仪器
动物笼(Tecniplast,Italy)、烧杯1000mL(Kimax,USA)、卡尺(Mitutoyo,Japan)、II级生物安全柜(NuAire,USA)、离心机5810R(Eppendorf,Germany)、μ培养箱(FormaScientific Inc.,USA)、独立通风笼(IVC，36微型隔离器***)(Tecniplast,Italy)、小鼠秤#Z-40(Taconic，USA)、不锈钢钳(Klappenecker,Germany)和垂直层流(Tsao-Hsin,Taiwan)。
方法
使用6-7周龄且重18-22g的BALB/c雄性裸鼠。将人胰腺癌肿瘤细胞HPAC(ATCCCRL-2119,1.0×106，0.1mL)皮下注射到动物右侧。随后将动物分成6组，每组由5只动物组成。当平均肿瘤大小达到50-120mm3时，开始施用测试物质和媒介物(设定为第1天)。在每次给药之前新鲜制备测试物质(0.4mg/kg)。通过腹腔内注射(i.p.)施用测试物质和媒介物，每周两次，持续5周。在施用测试物质或媒介物之前，每周两次记录肿瘤大小、体重和死亡率，持续36天。在研究结束时拍摄携带生长的肿瘤的动物的照片(图1-6)。
根据椭球公式(ellipsoid formula)测定肿瘤体积(mm3)：长度×(宽度)2×0.5。使用下式计算肿瘤生长(T/C)：T/C＝(Tn)/(Cn)×100％，其中C1(Cn)是对照组中第n天的肿瘤体积，以及T1(Tn)是处理组中第n天的肿瘤体积。T/C值≤42％被认为是显著的抗肿瘤活性。
结果
表5-1.裸鼠中的肿瘤、异种移植物、胰腺、HPAC
表5-2.裸鼠中的肿瘤、异种移植物、胰腺、HPAC(续表)
腹腔内施用测试物质，每周两次，持续5周。每周两次测量肿瘤大小并记录，持续36天。将肿瘤生长计算为T/C(处理/对照)×100％。
T/C值≤42％被认为是显著的抗肿瘤活性。此外，应用双因素方差分析，随后进行Bonferroni检验以确定与第1组(媒介物，PBS)相比*P<0.05的统计学显著性差异。
图1-6显示了持续36天施用不同测试化合物的裸鼠的照片。计算的肿瘤抑制能力为1G1s 19.6％，1J1s 33.8％和2F20s 32.5％。这表明1J1s和2F20s具有较好的肿瘤抑制能力(图7)。
实施例3：通过FACS确定示例性抗体与MCF7的细胞结合能力
细胞培养
在含有2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，Cat#25030081)和1mM丙酮酸钠(Invitrogen,Cat#11360070)，并补充有0.01mg/mL胰岛素(Sigma,Cat#SI-I9278-5mL)、10％胎牛血清(Invitrogen,Cat#16000044)的最低必需培养基(Invitrogen,Cat#10370021)中培养MCF-7细胞。
细胞染色
通过从含有单层细胞的测试样品瓶中丢弃培养基来悬浮测试细胞。将细胞用5mLPBS冲洗两次。向瓶中添加1mL 0.05％胰蛋白酶，涡旋以覆盖所有表面积，并置于37℃O2培养箱中保持5-10分钟。添加5mL完全生长培养基。通过轻轻移液吸出细胞。将细胞悬液转移至15mL锥形管中。将管以200g离心5分钟。离心后移除上清液并搅拌细胞沉淀。
细胞计数
向细胞沉淀中添加1-2mL FACS缓冲液并通过吸打充分混合。将细胞添加到具有细胞-过滤器盖的5mL聚苯乙烯圆底管(Falcon,Cat#352235)中，以获得完整且有活力的单细胞。将10μL细胞悬液转移到微量离心管中。添加10μL台盼蓝溶液(0.4％台盼蓝)并通过吸打充分混合，然后在血细胞计数器上计数活细胞。将细胞浓度调节至4×106个细胞/mL，然后将50μL细胞悬液移液至聚苯乙烯圆管中，以使每管含有2×105个细胞。
第一抗体
表6.示例性第一抗体
将第一抗体在FACS缓冲液中稀释至10μg/mL的最终抗体浓度。将50μL抗体稀释液添加到50μL细胞悬液中，以达到每管有0.5μg抗体。轻轻涡旋各管以充分混合细胞悬液和第一抗体，然后将管置于冰上孵育约30分钟。用1mL FACS缓冲液填充每管，并通过400g离心5分钟各洗涤一次。通过真空抽吸丢弃上清液，小心抽吸动作并避免可能引起细胞损失的接触管底部。
第二抗体
对于1G1s、1J1s和2F20s分析，用于分析设置的第二抗体是1mg，山羊抗小鼠IgG，人ads-FITC(Southern Biotech，Cat#1030-02)。将第二抗体在FACS缓冲液中稀释至4μg/mL的最终抗体浓度。向每管中添加100μL稀释的第二抗体，然后将各管轻轻涡旋以充分混合细胞悬液和第二抗体。将管置于冰上并避光孵育约30分钟的时间。然后，用1mL FACS缓冲液填充各管，并通过400g离心5分钟各洗涤一次。通过真空抽吸丢弃上清液，小心抽吸动作并避免可能引起细胞损失的接触管底部。将300μL4％的多聚甲醛固定液添加到各管中，并将管置于冰上，同时避光，孵育约30分钟。用1mL FACS缓冲液填充每管，并通过400g离心5分钟各洗涤一次。然后，通过真空抽吸丢弃上清液，小心抽吸动作并避免可引起细胞损失的接触管底部。将测试细胞管用400μL FACS缓冲液重悬，然后在4±2℃冰箱中避光储存。
流式细胞术分析
在染色后立即进行流式细胞术。为了进行数据分析，通过FCS Express 4 FlowResearch软件分析MCF7细胞结合百分比。在直方图中，对同种型对照进行门控并定义5％的门控细胞是背景。基于背景的设置，确定测试细胞管结合区域(M1)的百分比。在该设置下，高于同种型对照的5％或更高的测试细胞被认为是阳性结合MCF7细胞。图8A显示了HPAC细胞上100％的商业SSEA-4抗体(MC-813-70)。图8B显示了HPAC细胞上99.59％的1J1s。图8C显示了HPAC细胞上55.56％的2F20s。图8D显示了HPAC细胞上95.76％的1G1s。这表明对于HPAC细胞(胰腺细胞系)，1J1s具有最佳的细胞结合亲和力。另外，图9显示了示例性SSEA-4抗体对多种癌细胞系和非癌细胞系的FACS结合分析结果。它还表明对于MCF-7(乳腺癌)、MDA-MB231(乳腺癌)和HK2(肾、皮质/近端小管)，1J1s具有最佳的细胞结合亲和力。
实施例4：用SSEA-4、SS系列糖和Gb系列糖通过ELISA分析对示例性抗SSEA4IgG抗体进行的表位定位
试剂/缓冲液制备
包被抗原
将SSEA4-脂质1、SSEA4-神经酰胺、SS系列糖-脂质1和Gb系列糖-脂质1粉末溶于含100％乙醇的玻璃瓶中，并在4℃下储存直至使用。将10×封闭缓冲液(Sigma,Cat#B6429)在双蒸水(d.d.H2O)中稀释至1x以备使用。洗涤缓冲液：将0.5mL吐温20添加到1L PBS中以得到含0.05％吐温20的PBS。
第一抗体
将商业MC-813-70 SSEA4抗体(BioLegend,Cat#330402)、1G1s、1J1s和2F20sSSEA4抗体以10μg/mL稀释于含封闭缓冲液的Eppendorf管中。
第二抗体
将山羊抗小鼠IgG-AP(Southern Biotech,Cat#1030-04)再水化以在d.d.H2O中制备2.0mL 0.3mg/mL溶液。将1.0mL甘油(ACS级或更好)添加到2mL eppendorf中以达到eppendorf的1mL刻度标记。将0.5mL再水化的抗体转移到甘油中，充分混合并在-20±2℃冰箱中储存。
底物溶液
在使用前，将最初储存在4℃的底物溶液(用于ELISA的碱性磷酸酶黄色(pNPP)液体底物***,Sigma,Cat#P7998)在37℃水浴中加热。
板包被
将20μg各SSEA4-脂质1、SSEA4-神经酰胺、脂质1缀合的SS/Gb系列糖(包被抗原)添加到5mL乙醇中并轻轻混合(0.2μg糖/孔×100孔板＝20μg；50μL/孔×100孔＝5mL)。将50μL包被的抗原移液到冰上各个板的每个孔中。将板标记，盖上盖子并室温孵育过夜。向各孔中添加100μL封闭缓冲液，并在室温(22-26℃)孵育约30分钟。
将120μL 1：50稀释的第一抗体(10μg/mL)移液到第2列顶部孔中。然后，对于第2列剩余孔，添加180μL，使第一列(第1列)留空用作空白。将60μL 10μg/mL第一抗体从第一孔转移到第二孔(2.5μg/mL抗SSEA-4抗体)中。通过反复吸打使孔中的物质混合。重复该过程并制备以下孔的第一抗体稀释液(四倍稀释)：第一孔＝10μg/mL(1:50稀释)，第二孔＝2.5μg/mL(1：200稀释)，第三孔＝0.625μg/mL(1：800稀释)，第4孔＝0.156μg/mL(1：3200稀释)，第5孔＝0.039μg/mL(1：12800稀释)，第6孔＝0.01μg/mL(1：51200稀释)，第7孔＝0.025μg/mL(1：204800稀释)，第8孔＝0.0006μg/mL(1：819200稀释)。
在用封闭缓冲液孵育抗原包被的板30分钟后，通过抽吸移除封闭缓冲液，并用200μL洗涤缓冲液洗涤各孔3次。将来自稀释板的50μL稀释的阳性对照(商业SSEA-4抗体MC-813-70)和示例性第一抗体添加到测试板的孔中，用于各SSEA4包被抗原。将测试板覆盖，标记，并在室温孵育约1小时。孵育后，吸出孔中的物质，并用200μL洗涤缓冲液洗涤孔三次。
将25μL第二抗体添加到4975μL封闭缓冲液(1：200稀释)中并轻轻混合(50μL/孔×100孔板＝5mL)。将50μL第二抗体溶液移液到各孔中。将板覆盖，标记，并在室温孵育约45分钟。孵育后，从所有孔中吸出第二抗体溶液，并用200μL洗涤缓冲液洗涤所有孔四次。
将100μL底物溶液移液到各孔中并在37±2℃孵育20分钟，通过添加50μL终止溶液(碱性磷酸酶终止溶液,Sigma,Cat#A5852)终止，充分混合，然后在ELISA酶标仪上在405nm处对板进行读取。
数据分析
对数据进行统计分析并使用GraphPad Prism 6软件通过Sigmoidal剂量应答(可变斜率)方法绘制曲线，以及由重复的结果计算平均值和SD。第二抗体仅作为阴性对照。
图10显示了与脂质1缀合的截短的SSEA-4：SS系列糖和Gb系列糖的结构。图11显示了SSEA-4第一抗体的表位定位结果。截短的聚糖末端抗原显示1J1s和2F20s识别需要完整的SSEA-4结构。另一方面，由于最后的化合物结构(N-乙酰神经氨酸；NeuAc)，商业SSEA-4抗体MC-813-70和1G1s还识别SSEA-4和SS5。这意味着糖还原端的第一个化合物结构(葡萄糖)对表位识别不太重要。
实施例5：通过SSEA-4-脂质1包被化学发光夹心ELISA分析与示例性生物素化的糖的交叉活性
试剂
原样使用封闭缓冲液SuperBlock(ThermoFisher,Cat#37515)。将SSEA-4第一抗体(1G1s、1J1s、2F20s和MC-813-70)在SuperBlock中以2.5μg/mL稀释。洗涤缓冲液：将0.5mL吐温20添加到1L PBS中以制备含0.05％吐温20的PBS。第二抗体：在SuperBlock中以1：50000稀释山羊抗小鼠IgG-HPR(Jackson ImmunoResearch,Cat#109-035-003)。将生物素化的糖(以下列出的)和D-生物素(Carbosynth，Cat#FB02633)溶解在1x PBS(Sigma，Cat#P5493-4L)中以制备1mg/mL储液。
表7.肿瘤相关糖类(包被抗原)列表
板包被
将市售的链霉亲和素HBC包被的96孔黑色板(ThermoSci，Cat#15503)用200μL/孔的洗涤缓冲液(Sigma,Cat#P5493)洗涤一次。将生物素化的糖储液在1x PBS中稀释至1ng/mL。将一定体积的稀释的生物素化糖添加到测试板中(50μL/孔；50ng/孔)。将测试板室温孵育2小时。用200μL洗涤缓冲液洗涤孔一次。向各孔添加200μL SuperBlock，并室温孵育1小时。
第一抗体
表8.示例性的第一抗体
孵育后，吸出孔中的物质并用200μL洗涤缓冲液洗涤孔一次。将50μL 2.5μg/mL第一抗体添加到各板中。将测试板覆盖，标记，并室温孵育约1小时。孵育后，吸出孔中的物质并用200μL洗涤缓冲液洗涤孔四次。
第二抗体
将50μL第二抗体溶液移液到各孔中。将板覆盖，标记，并室温孵育约45分钟。孵育后，从所有孔中吸出第二抗体溶液，并用200μL洗涤缓冲液洗涤所有孔5次。
将100μL底物溶液(ThermoSci,Cat#PIE37074)移液到各孔中，并室温孵育1至5分钟。用ELISA酶标仪(Molecular Devices，SpectraMax L)在470nm处对板进行读取。
数据分析
使用GraphPad Prism 6软件对数据进行统计分析。由一式三份的结果计算平均值和SD。
图12显示SSEA-4抗体的ELISA亲和力分析结果。示例性SSEA-4抗体(包括1G1s、1J1s、2F20s和商业MC-813-70)显示出与其他肿瘤相关糖的最小相互作用，并且对SSEA-4抗原(SSEA4和SSEA4-b-N-Sp)具有特异性。它显示了本发明中的SSEA4-抗体的结合特异性。
实施例6：裸鼠中与Globo H抗体组合的示例性抗体的抗肿瘤活性的测量
在人胰腺癌异种移植肿瘤模型中，将HPAC细胞皮下(sc)移植进BALB/c雄性裸鼠中，并且当平均肿瘤大小达到50-120mm3时，通过腹腔内(ip)注射来施用0.1mg/kg、10mg/kg或与0.1mg/kg的两种抗体组合的测试物，每周两次，持续5周。然后每周两次监测肿瘤大小并记录，持续37天。每周两次记录死亡率、体重和明显的动物毒性迹象，持续37天。将肿瘤生长计算为T/C(处理/对照)×100％。
测试物质和给药模式
以液体形式制备1或1.03mg/mL的测试物质。每天在给药前通过用柠檬酸钠缓冲液(25mM柠檬酸钠和100mM NaCl，pH6.5)稀释储液以获得指定的给药浓度(0.01mg/mL或1mg/mL)来新鲜制备测试物质。以10mL/kg的给药体积腹腔内施用测试物质，每周两次，持续5周。
表9.示例类型的配制剂
(a)这是基于目测
S：可溶；SS：微溶；I：不溶(悬浮或沉淀)
(b)Y：将配制剂保存在棕色管或小瓶中或者用铝箔覆盖。
N：不防光
(c)RT：新鲜制备并在20-25℃下储存。
4℃：新鲜制备并在冰箱中储存或在冰上保存。
细胞系
制备HPAC肿瘤细胞系(ATCC CRL-2119，人胰腺癌)，并在以0.1mL1×106个细胞/小鼠皮下移植进BALB/c雄性裸鼠右侧之前，在Eurofins Panlabs Taiwan Ltd.培养。
动物
从BioLasco Taiwan(Charles River Laboratories Licensee)获得6-7周龄，体重18-22g的BALB/c雄性裸鼠。在具有12小时光/暗循环的良好控制温度(20-24℃)和湿度(30-70％)的环境中维持所有动物。允许自由获得标准实验室饮食[MFG(Oriental YeastCo.，Ltd.，Japan)]和高压蒸汽处理的自来水。本研究的所有方面，包括试验场所、实验和动物处置一般按照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals:第8版”(National Academies Press,Washington,D.C.,2011)在我们的AAALAC认证的实验动物设施中进行。此外，动物护理和使用方案由Pharmacology Discovery Services Taiwan Ltd的IACUC审查并批准。
化学品
DMEM/F12培养基(Invitrogen，USA)、表皮生长因子(R&D Systems，USA)、胎牛血清(Invitrogen，USA)、胰岛素(Sigma，USA)、氢化可的松(Sigma，USA)和青霉素/链霉素溶液(Invitrogen，USA)。
仪器
动物笼(Tecniplast,Italy)、烧杯1000mL(Kimax,USA)、卡尺(Mitutoyo,Japan)、II级生物安全柜(NuAire,USA)、离心机5810R(Eppendorf,Germany)、μ培养箱(FormaScientific Inc.,USA)、独立通风笼(IVC，36微型隔离器***)(Tecniplast,Italy)、小鼠秤#Z-40(Taconic，USA)、不锈钢钳(Klappenecker,Germany)和垂直层流(Tsao-Hsin,Taiwan)。
方法
使用6-7周龄且重18-22g的BALB/c雄性裸鼠。将人胰腺癌肿瘤细胞HPAC(ATCCCRL-2119,1.0×106，0.1mL)皮下注射到动物右侧。随后将动物分成6组，每组由8只动物组成。当平均肿瘤大小达到50-120mm3时，开始施用测试物质和媒介物(设定为第1天)。在每次给药之前新鲜制备测试物质(根据表X中的剂量)。通过腹腔内注射施用测试物质和媒介物，每周两次，持续5周。在施用测试物质或媒介物之前，每周两次记录肿瘤大小、体重和死亡率，持续37天。
根据椭球公式测定肿瘤体积(mm3)：长度×(宽度)2×0.5。使用下式计算肿瘤生长(T/C)：T/C＝(Tn)/(Cn)×100％，其中C1(Cn)是对照组中第n天的肿瘤体积，以及T1(Tn)是处理组中第n天的肿瘤体积。T/C值≤42％被认为是显著的抗肿瘤活性。
结果
表10.裸鼠中的肿瘤、异种移植物、胰腺、HPAC
腹腔内施用测试物质，每周两次，持续5周。每周两次测量肿瘤大小并记录，持续37天。将肿瘤生长计算为T/C(处理/对照)×100％。
T/C值≤42％被认为是显著的抗肿瘤活性。此外，应用双因素方差分析，随后进行Bonferroni检验，以确定与第1组(媒介物，PBS)相比*P<0.05的统计学显著性差异。
图13显示了持续37天施用不同的测试化合物的裸鼠的照片。计算的本研究结束时的肿瘤生长抑制(TGI(％)＝(V对照-V测试)/(V对照-V原始)*100)为10.8％(0.1mg/kg 1J1s)、24.4％(10mg/kg 1J1s)、15.4％(10mg/kg 2C2)(0.1mg/kg 2C2未显示对HPAC的抑制能力)。但是，与0.1mg/kg 2C2组合的0.1mg/kg 1J1s显示33.7％的肿瘤生长抑制，甚至高于用单独的1J1s或2C2给药处理的100倍。
虽然已经描述并说明了本发明的具体方面，但是这些方面应该仅被认为是对本发明的说明，而不是限制根据所附权利要求所解释的本发明。出于所有目的，将本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用整体并入本文，如同明确且单独地表明出于所有目的将各单独的出版物或专利申请通过引用整体并入。尽管出于清楚理解的目的已经通过说明和实例相当详细地描述了前述发明，但根据本发明的教导，本领域普通技术人员将容易理解，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可对其作出某些改变和修改。
序列表
<110> 台湾浩鼎生技股份有限公司(OBI PHARMA, INC.)
<120> 抗体、药物组合物和方法
<130> G3004-00500
<140> 62/314,841
<141> 2016-03-29
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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35 40 45
Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
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Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
20
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Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
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Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser
1 5
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Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
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Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
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Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser
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Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val Ser
1 5 10
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Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser
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<400> 52
Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
1 5 10 15
Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys
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<400> 53
Pro Glu Asn Trp Asp Gly Phe Asp Val
1 5
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<400> 54
Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10

Claims (50)

1.抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域包含与SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少约80％同源性的氨基酸序列。
2.抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链和轻链，其中所述重链包含与选自SEQ ID NO：13、15或17的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。
3.抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链和重链，其中所述轻链区包含与选自SEQ ID NO：6、8或10的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。
4.由以ATCC保藏编号PTA-122679保藏的命名为1J1s的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段。
5.以ATCC保藏编号PTA-122679保藏的命名为1J1s的杂交瘤。
6.抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域包含与SEQ IDNO：21所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有至少约80％同源性的氨基酸序列。
7.抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链和轻链，其中所述重链包含与选自SEQ ID NO：31、33或35的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。
8.抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链和重链，其中所述轻链包含与选自SEQ ID NO：24、26或28的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。
9.由以ATCC保藏编号PTA-122678保藏的命名为1G1s的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段。
10.以ATCC保藏编号PTA-122678保藏的命名为1G1s的杂交瘤。
11.抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域包含与SEQ IDNO：39所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少约80％同源性的氨基酸序列。
12.抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链和轻链，其中所述重链包含与选自SEQ ID NO：49、51或53的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。
13.抗体或其抗原结合片段，其包含：
轻链和重链，其中所述轻链包含与选自SEQ ID NO：42、44或46的氨基酸序列具有至少约80％同源性的互补决定区(CDR)氨基酸序列。
14.由以ATCC保藏编号PTA-122676保藏的命名为2F20s的杂交瘤产生的抗体或其抗原结合片段。
15.以ATCC保藏编号PTA-122676保藏的命名为2F20s的杂交瘤。
16.如权利要求1-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可变结构域能够结合一种或多种糖类抗原。
17.如权利要求16所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述糖类抗原是SSEA-4(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1(SSEA-4六糖)。
18.抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段包含选自SEQ ID No：3、SEQ IDNo：21或SEQ ID No：39的VH和选自SEQ ID No：4、SEQ ID No：22或SEQ ID No：40的VL。
19.如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分选自：(a)整个免疫球蛋白分子；(b)scFv；(c)Fab片段；(d)F(ab’)2；或(e)二硫键连接的Fv。
20.如权利要求1-19中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是人源化抗体。
21.如权利要求20所述的抗体，其中所述抗体是IgG或IgM。
22.如权利要求20所述的抗体，其中所述抗体还包含对SSEA-4特异的嵌合抗原受体(CAR)结构域。
23.如权利要求22所述的抗体，其中所述CAR结构域包含跨膜结构域和细胞内信号转导结构域，其中所述跨膜结构域包含CD8和/或CD28的跨膜结构域序列；并且其中所述细胞内信号转导结构域包含CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS和CD3ζ中的一种或多种的细胞内信号转导结构域序列。
24.药物组合物，其包含：
权利要求1-23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和至少一种药学可接受的载体。
25.如权利要求24所述的药物组合物，其还包含至少一种另外的治疗剂。
26.治疗对象的癌症的方法，所述方法包括向有需要的对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-23中任一项所述的抗体和/或Globo系列抗体的组合。
27.抑制癌细胞增殖的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的权利要求24所述的药物组合物和/或Globo系列抗体的组合，其中癌细胞的增殖被抑制。
28.用于对象的癌症诊断的方法，其包括：
(a)从对象获得体液样品或细胞样品；
(b)使所述样品与能够检测选自SSEA-3、SSEA-4或Globo-H的一组癌症标志物的表达的一种或多种抗体接触；
(c)分析所述一种或多种抗体与所述细胞或所述样品的结合；以及
(d)通过测量抗体结合水平并将其与正常对照比较来评估分析中所述对象的癌症状态，以确定所述对象中癌症的存在。
29.通过监测患者的肿瘤预后来治疗人患者的方法，其中所述方法包括：
(a)从所述患者获得体液样品或细胞/组织样品；
(b)使样品与能够检测选自SSEA-3、SSEA-4或Globo-H的一种或多种标志物的一种或多种抗体接触；
(c)分析所述抗体与所述细胞或所述细胞/组织样品的结合水平；
(d)测量测试样品中的标志物水平并将其与参照样品中的水平比较；
(e)基于步骤(d)中的测定确定所述患者的肿瘤的分期和/或预后；以及
(f)基于(e)调整针对所述患者的免疫疗法的治疗计划。
30.如权利要求26-28所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌、胆管癌、肝癌、颊癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、肾癌、***癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、口腔癌、神经内分泌癌、肾上腺癌、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤或脑肿瘤。
31.如权利要求26-27所述的方法，其中所述Globo系列抗体是抗Globo H抗体、抗SSEA-3抗体或抗SSEA-4抗体。
32.如权利要求26-28所述的方法，其中所述对象是人。
33.如权利要求27-29所述的方法，其中所述细胞是癌症干细胞。
34.如权利要求28-29所述的方法，其中所述样品选自血清、血液、血浆、细胞、细胞培养基、唾液、尿液、***流体、肿瘤活组织检查或组织培养物。
35.对对象成像的方法，其包括：
(a)施用有效量的权利要求1-23中任一项所述的抗体，其中所述抗体与显像剂缀合；和
(b)检测并测定所述对象中的所述显像剂；以及
(c)在显示器上生成并显示图像。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述显像剂是荧光团、染料、MRI造影剂或放射性核素。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述对象患有癌症，所述方法被进一步限定为检测癌症转移的方法。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述对象是人。
39.如权利要求28-38所述的方法，其中所述分析是基于抗体的分析或阵列。
40.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含治疗剂和结合SSEA-4的抗体或抗原结合片段，其中所述治疗剂通过接头与所述抗体或所述抗原结合片段共价缀合。
41.如权利要求40所述的ADC，其中所述抗体或抗原结合片段选自权利要求1-23。
42.治疗癌症的方法，所述方法包括根据需要施用有效量的权利要求40所述的ADC。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌、胆管癌、肝癌、颊癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、肾癌、***癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、口腔癌、神经内分泌癌、肾上腺癌、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤或脑肿瘤
44.如权利要求1-23所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其包含特异性结合Globo系列抗原的第一结合结构域和特异性结合T细胞表面抗原的第二结合结构域。
45.如权利要求44所述的双特异性抗体或抗原结合部分，其中所述Globo系列抗原包含Globo H、SSEA-3或SSEA-4。
46.如权利要求44所述的双特异性抗体或抗原结合部分，其中所述T细胞表面抗原包含CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L或CD44。
47.治疗癌症的方法，所述方法包括根据需要施用有效量的权利要求44所述的双特异性抗体或抗原结合部分。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌、胆管癌、肝癌、颊癌、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、肾癌、***癌、卵巢癌、***、子宫内膜癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、口腔癌、神经内分泌癌、肾上腺癌、甲状腺癌、骨癌、皮肤癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤或脑肿瘤。
49.制备权利要求1-23所述的同质抗体群体的方法，其包括：
(a)使单克隆抗体与α-岩藻糖苷酶和至少一种内切糖苷酶接触；
(b)产生具有单一N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的去岩藻糖基化抗体；以及
(c)向抗体Fc区的GlcNAc添加通用聚糖，以与所述糖型形成同质抗体。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述同质抗体与SSEA-4结合。
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