JP2019513144A - 抗体、医薬組成物及び方法 - Google Patents

抗体、医薬組成物及び方法 Download PDF

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チェン，イー−ジュイ
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オービーアイ ファーマ，インコーポレイテッド
オービーアイ ファーマ，インコーポレイテッド
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Abstract

ステージ特異的胎児抗原４（ＳＳＥＡ−４）に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、並びにその使用方法が本明細書で開示される。使用方法には、限定されないが、がん療法及び診断が含まれる。本開示の抗体は、一定のがん細胞表面に結合することができる。本明細書に開示される抗体の代表的な標的には、癌腫、例えば乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆道がん、肝がん、頬側がん、胃がん、結腸がん、上咽頭がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫及び／又は脳腫瘍が含まれ得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／３１４８４１号の優先権を主張する。前記出願の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、炭水化物抗原に対する抗体及びその結合フラグメント、並びに例えば抗体をコードする核酸、相補的核酸、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞、並びに、前記抗体及び／又は結合フラグメントを含む医薬組成物を含めてそれらを作製及び使用する方法に関する。さらに、がん細胞を抑制するのに有効な量の抗体を対象に投与する方法が、提供される。具体的には、ステージ特異的胎児抗原４（ＳＳＥＡ−４）に結合する抗体、並びに関連する組成物及び使用方法が、本明細書で開示される。使用方法には、限定されないが、がん療法及び診断が含まれる。
多数の表面炭水化物が、悪性腫瘍細胞で発現されている。例えば、Ｇｌｏｂｏ Ｈは、種々の上皮がん上で過剰発現することが示されており、乳がん及び小細胞肺癌における腫瘍侵攻性及び予後不良と関連している。以前の研究は、乳がん細胞及び乳がん幹細胞において、Ｇｌｏｂｏ Ｈ及びステージ特異的胎児抗原３（ＳＳＥＡ−３、Ｇｂ５とも呼ばれる）が観察されたことを示した（ＷＷ Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ａｎｄ ＳＳＥＡ３ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ １ ａｎｄ ２ ｉｎ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．」ＰＮＡＳ，１０５（３３）：１１６６７−１１６７２，２００８）。これらの知見は、がんに有効な治療及び／又は予防の医学的に満たされていないニーズが依然として存在するため、腫瘍関連炭水化物抗原に対する抗体の開発の理論的根拠を裏付けている。がんに関連する及び／又はがんを予測するグリカンマーカーを同定し、広範囲のがんの診断及び治療に使用するためのマーカーに対する抗体を開発することは、非常に興味深い。
ＷＷ Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ａｎｄ ＳＳＥＡ３ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ １ ａｎｄ ２ ｉｎ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．」ＰＮＡＳ，１０５（３３）：１１６６７−１１６７２，２００８
本開示は、ステージ特異的胎児抗原４（ＳＳＥＡ−４）が広範囲のがんで豊富に発現されるが、正常細胞では発現されないという発見に基づく。ＳＳＥＡ−４を発現するがんには、それだけに限らないが、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆道がん、肝がん、頬側がん、胃がん、結腸がん、上咽頭がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍が含まれる。
一態様では、本開示は、ＳＳＥＡ−４に特異的な抗体又はその結合フラグメントを特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１に結合する。
一定の態様では、本開示は、１Ｊ１ｓ（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１２２６７９で寄託された）、１Ｇ１ｓ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７８で寄託された）、２Ｆ２０ｓ（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１２２６７６で寄託された）として示されるハイブリドーマクローン及びそれらから産生される抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
一態様では、本開示は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する（表１）。いくつかの態様では、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列は、天然配列を含むか又はこれを除外する。いくつかの態様では、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列は、天然配列を含むか又はこれを除外する。
一定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントがさらに、表１に示される（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３：
それぞれ、
（ｉ）配列番号１３から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号１５から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号１７から選択されるＨ−ＣＤＲ３；
を含み、（ｉｖ）〜（ｖｉ）から選択されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３：
それぞれ、
（ｉｖ）配列番号６から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号８から選択されるＬ−ＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号１０から選択されるＬ−ＣＤＲ３
を含む。
一定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントが重鎖領域を含み、重鎖領域が、配列番号１３、１５又は１７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントが軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、配列番号６、８又は１０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、天然配列を除外する。一定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、天然配列を含む。
一定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントがさらに、表１に示される（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるＨ−ＦＷ１、Ｈ−ＦＷ２、Ｈ−ＦＷ３及びＨ−ＦＷ４：
それぞれ、
（ｉ）配列番号１２から選択されるＨ−ＦＷ１；
（ｉｉ）配列番号１４から選択されるＨ−ＦＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号１６から選択されるＨ−ＦＷ３、
（ｉｖ）配列番号１８から選択されるＨ−ＦＷ４；
を含み、（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）から選択されるＬ−ＦＷ１、Ｌ−ＦＷ２、Ｌ−ＦＷ３及びＬ−ＦＷ４：
それぞれ、
（ｖ）配列番号５から選択されるＬ−ＦＷ１；
（ｖｉ）配列番号７から選択されるＬ−ＦＷ２；
（ｖｉｉ）配列番号９から選択されるＬ−ＦＷ３、
（ｖｉｉｉ）配列番号１１から選択されるＬ−ＦＷ４
を含む。
一態様では、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７９で寄託された１Ｊ１ｓとして示されるハイブリドーマによって産生される、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一態様では、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７９で寄託された１Ｊ１ｓとして示されるハイブリドーマを提供する。
一定の態様では、本開示は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する（表２）。いくつかの態様では、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列は、天然配列を含むか又はこれを除外する。いくつかの態様では、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＬＨ）のアミノ酸配列は、天然配列を含むか又はこれを除外する。
一定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントがさらに、表２に示される（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３：
それぞれ、
（ｉ）配列番号３１から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号３３から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号３５から選択されるＨ−ＣＤＲ３；
を含み、（ｉｖ）〜（ｖｉ）から選択されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３：
それぞれ、
（ｉｖ）配列番号２４から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号２６から選択されるＬ−ＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号２８から選択されるＬ−ＣＤＲ３
を含む。
一定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントが重鎖領域を含み、重鎖領域が、配列番号３１、３３又は３５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントが軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、配列番号２４、２６又は２８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントが天然配列を含むか又はこれを除外する。
一定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントがさらに、表２に示される（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるＨ−ＦＷ１、Ｈ−ＦＷ２、Ｈ−ＦＷ３及びＨ−ＦＷ４：
それぞれ、
（ｉ）配列番号３０から選択されるＨ−ＦＷ１；
（ｉｉ）配列番号３２から選択されるＨ−ＦＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号３４から選択されるＨ−ＦＷ３、
（ｉｖ）配列番号３６から選択されるＨ−ＦＷ４；
を含み、（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）から選択されるＬ−ＦＷ１、Ｌ−ＦＷ２、Ｌ−ＦＷ３及びＬ−ＦＷ４：
それぞれ、
（ｖ）配列番号２３から選択されるＬ−ＦＷ１；
（ｖｉ）配列番号２５から選択されるＬ−ＦＷ２；
（ｖｉｉ）配列番号２７から選択されるＬ−ＦＷ３、
（ｖｉｉｉ）配列番号２９から選択されるＬ−ＦＷ４
を含む。
一態様では、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７８で寄託された１Ｇ１ｓとして示されるハイブリドーマによって産生される抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一態様では、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７８で寄託された１Ｇ１ｓとして示されるハイブリドーマを提供する。
一定の態様では、本開示は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号４０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する（表３）。いくつかの態様では、配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列は、天然配列を含むか又はこれを除外する。いくつかの態様では、配列番号４０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列は、天然配列を含むか又はこれを除外する。
一定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントがさらに、表３に示される（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３：
それぞれ、
（ｉ）配列番号４９から選択されるＨ−ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号５１から選択されるＨ−ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）配列番号５３から選択されるＨ−ＣＤＲ３；
を含み、（ｉｖ）〜（ｖｉ）から選択されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３：
それぞれ、
（ｉｖ）配列番号４２から選択されるＬ−ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号４４から選択されるＬ−ＣＤＲ２；及び
（ｖｉ）配列番号４６から選択されるＬ−ＣＤＲ３
を含む。
一定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントが重鎖領域を含み、重鎖領域が、配列番号４９、５１又は５３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントが軽鎖領域を含み、軽鎖領域が、配列番号４２、４４又は４６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントが天然配列を含むか又はこれを除外する。
一定の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントがさらに、表３に示される（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるＨ−ＦＷ１、Ｈ−ＦＷ２、Ｈ−ＦＷ３及びＨ−ＦＷ４：
それぞれ、
（ｉ）配列番号４８から選択されるＨ−ＦＷ１；
（ｉｉ）配列番号５０から選択されるＨ−ＦＷ２；
（ｉｉｉ）配列番号５２から選択されるＨ−ＦＷ３、
（ｉｖ）配列番号５４から選択されるＨ−ＦＷ４；
を含み、（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）から選択されるＬ−ＦＷ１、Ｌ−ＦＷ２、Ｌ−ＦＷ３及びＬ−ＦＷ４：
それぞれ、
（ｖ）配列番号４１から選択されるＬ−ＦＷ１；
（ｖｉ）配列番号４３から選択されるＬ−ＦＷ２；
（ｖｉｉ）配列番号４５から選択されるＬ−ＦＷ３、
（ｖｉｉｉ）配列番号４７から選択されるＬ−ＦＷ４
を含む。
一態様では、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７６で寄託された２Ｆ２０ｓとして示されるハイブリドーマによって産生される抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一態様では、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７６で寄託された２Ｆ２０ｓとして示されるハイブリドーマを提供する。
一定の実施形態では、代表的な抗体又はその抗原結合フラグメントが、１つ以上の炭水化物抗原に結合することができる可変ドメインを含む。
一定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントが、炭水化物抗原ＳＳＥＡ−４（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）（ＳＳＥＡ−４六糖）を標的とする。
一定の態様では、本開示は、配列番号３、配列番号２１又は配列番号３９から選択されるＶＨ及び配列番号４、配列番号２２又は配列番号４０から選択されるＶＬを含む抗体又はその結合フラグメントを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３、２１又は３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号４、２２又は４０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントが、天然配列を含んでも除外してもよい。
一定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントが、（ａ）免疫グロブリン分子全体；
（ｂ）ｓｃＦｖ；
（ｃ）Ｆａｂフラグメント；
（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２；又は
（ｅ）ジスルフィド結合Ｆｖ
から選択される。
一定の実施形態では、抗体がヒト化抗体である。
一定の実施形態では、抗体がＩｇＧ又はＩｇＭである。
一態様では、本開示は、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
一定の実施形態では、医薬組成物が、少なくとも１種のさらなる治療剤をさらに含む。
一態様では、本開示は、がん細胞の増殖を抑制する方法であって、有効量の代表的な医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、がん細胞の増殖が抑制される方法を提供する。
一定の実施形態では、本開示は、対象のがんを治療する方法を提供する。本方法は、有効量の本明細書に記載される代表的な抗体を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
一定の実施形態では、がんが、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆道がん、肝がん、頬側がん、胃がん、結腸がん、上咽頭がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍からなる群から選択される。
一態様では、本開示は、対象のがんを病期分類する方法であって、
（ａ）ＳＳＥＡ−４の発現を検出する１種以上の抗体を、対象から得られた細胞又は組織試料に適用するステップと；
（ｂ）１種以上の抗体と細胞又は組織試料の結合をアッセイするステップと；
（ｃ）結合を正常対照と比較して、対象におけるがんの存在を判定するステップと；
（ｄ）正常なベースライン指数と比較した対応する抗体結合の相対レベルに基づいて、疾患進行段階を分類するステップと
を含む方法を提供する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の説明に示す。本発明の他の特徴及び／又は利点は、図面、いくつかの実施形態の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
ビヒクル、１０ｍＬ／ｋｇ×１０、腹腔内、１週間に２回の処理後３６日目のＨＰＡＣ移植腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌード雄マウスの写真である。 Ｇｌｏｂｏ Ｈ−２Ｃ２、０．４ｍｇ／ｋｇ×１０、腹腔内、１週間に２回の処理後３６日目のＨＰＡＣ移植腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌード雄マウスの写真である。 市販のＳＳＥＡ−４抗体（ＭＣ−８１３−７０）、０．４ｍｇ／ｋｇ×１０、腹腔内、１週間に２回の処理後３６日目のＨＰＡＣ移植腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌード雄マウスの写真である。 １Ｇ１ｓ、０．４ｍｇ／ｋｇ×１０、腹腔内、１週間に２回の処理後３６日目のＨＰＡＣ移植腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌード雄マウスの写真である。 １Ｊ１ｓ、０．４ｍｇ／ｋｇ×１０、腹腔内、１週間に２回の処理後３６日目のＨＰＡＣ移植腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌード雄マウスの写真である。 ２Ｆ２０ｓ、０．４ｍｇ／ｋｇ×１０、腹腔内、１週間に２回の処理後３６日目のＨＰＡＣ移植腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌード雄マウスの写真である。 ３６日間にわたる抗体注射の間の腫瘍体積の測定値のグラフである。ＳＳＥＡ−４抗体１Ｇ１ｓ、２Ｆ２０ｓ及び１Ｊ１ｓの効果をＨＰＡＣ腫瘍で測定した。市販のＳＳＥＡ−４抗体（ＭＣ−８１３−７０）及びビヒクル（ＰＢＳ）も測定した。 フローサイトメトリーヒストグラムを示す図である。試験抗体（緑色線）又はアイソタイプ対照（黒色線）で２×１０５個細胞／チューブを染色し、引き続いてＦＩＴＣ結合二次抗体とインキュベートした。 フローサイトメトリーヒストグラムを示す図である。試験抗体（緑色線）又はアイソタイプ対照（黒色線）で２×１０５個細胞／チューブを染色し、引き続いてＦＩＴＣ結合二次抗体とインキュベートした。 フローサイトメトリーヒストグラムを示す図である。試験抗体（緑色線）又はアイソタイプ対照（黒色線）で２×１０５個細胞／チューブを染色し、引き続いてＦＩＴＣ結合二次抗体とインキュベートした。 フローサイトメトリーヒストグラムを示す図である。試験抗体（緑色線）又はアイソタイプ対照（黒色線）で２×１０５個細胞／チューブを染色し、引き続いてＦＩＴＣ結合二次抗体とインキュベートした。 種々のがん細胞株及び非がん細胞株に対する代表的なＳＳＥＡ−４抗体１Ｊ１ｓ、１Ｇ１ｓ、２Ｆ２０ｓ及び市販のクローンＭＣ−８１３−７０のＦＡＣＳ結合アッセイ結果を示す図である。試験したがん細胞株は、ＭＣＦ−７（乳がん）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（乳がん）、ＨＰＡＣ（膵臓がん）、ＬＮ−１８（神経膠芽腫）及びＬＬ−２（ルイス肺癌）であった。試験した非腫瘍原性細胞株は、ＨＫ２（腎臓、皮質／近位尿細管）、ＮＬ−２０（気管支上皮）、ＴＨＬＥ−３（肝臓、正常細胞）及びＨｕＭＥＣ（ヒト乳腺上皮細胞）であった。 脂質１に結合したＳＳ系列糖及びＧｂ系列糖の構造を示す図である。 滴定ＥＬＩＳＡによるエピトープの特徴付けを示す図である。（Ａ）市販のＳＳＥＡ−４抗体（ＭＣ−８１３−７０）、（Ｂ）１Ｇ１ｓ、（Ｃ）１Ｊ１ｓ、（Ｄ）２Ｆ２０ｓ。 滴定ＥＬＩＳＡによるエピトープの特徴付けを示す図である。（Ａ）市販のＳＳＥＡ−４抗体（ＭＣ−８１３−７０）、（Ｂ）１Ｇ１ｓ、（Ｃ）１Ｊ１ｓ、（Ｄ）２Ｆ２０ｓ。 滴定ＥＬＩＳＡによるエピトープの特徴付けを示す図である。（Ａ）市販のＳＳＥＡ−４抗体（ＭＣ−８１３−７０）、（Ｂ）１Ｇ１ｓ、（Ｃ）１Ｊ１ｓ、（Ｄ）２Ｆ２０ｓ。 滴定ＥＬＩＳＡによるエピトープの特徴付けを示す図である。（Ａ）市販のＳＳＥＡ−４抗体（ＭＣ−８１３−７０）、（Ｂ）１Ｇ１ｓ、（Ｃ）１Ｊ１ｓ、（Ｄ）２Ｆ２０ｓ。 化学発光サンドイッチＥＬＩＳＡ分析によるビオチン化糖を用いた交差反応性試験を示す図である。 ３７日間にわたる抗体組み合わせ注射の間の腫瘍体積の測定値のグラフである。抗体２Ｃ２（抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ）及び１Ｊ１ｓ（抗ＳＳＥＡ４）の効果をＨＰＡＣ腫瘍で測定した。
広範囲のがんの診断及び治療に使用するためのマーカーに向けられた抗体方法及び組成物が提供される。抗ＳＳＥＡ−４抗体が本明細書において開発及び開示された。使用方法には、限定されないが、がん療法及び診断が含まれる。本明細書に記載される抗体は、広範囲のＳＳＥＡ−４発現がん細胞に結合し、それによってがんの診断及び治療を容易にすることができる。抗体によって標的とされ得る細胞には、癌腫、例えば皮膚がん、血液がん、リンパ節がん、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん等が含まれる。
定義
本発明の実施には、特に指示しない限り、当技術分野の技能の範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の慣用的な技術が使用される。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）；及びＨａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、多糖類又はオリゴ糖を指す。グリカンはまた、本明細書において、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド、糖プロテオーム（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ）、ペプチドグリカン、リポ多糖又はプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を指すためにも使用される。グリカンは、通常、単糖間のＯ−グリコシド結合のみからなる。例えば、セルロースはβ−１，４−結合Ｄ−グルコースで構成されるグリカン（又はより具体的にはグルカン）であり、キチンはβ−１，４−結合Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで構成されるグリカンである。グリカンは、単糖残基のホモポリマー又はヘテロポリマーであり得、直鎖状又は分枝状であり得る。グリカンは、糖タンパク質及びプロテオグリカンのように、タンパク質に結合して見られ得る。それらは一般的に、細胞の外面に見られる。Ｏ−及びＮ−結合グリカンは、真核生物において極めて一般的であり、原核生物においてもあまり一般的ではないが見出され得る。Ｎ結合型グリカンは、シークオンにおいてアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に結合して見られる。シークオンは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列であり、ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することができる任意の物質として定義される。
本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、免疫原、抗原又はワクチンが免疫応答を誘発する能力を指す。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体の抗原結合部位と接触する抗原分子の部分として定義される。
本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、生物が引き起こす疾患に対する免疫を与えるために使用される、病原生物全体（死滅若しくは弱毒化）又はこのような生物の成分、例えばタンパク質、ペプチド又は多糖類からなる抗原を含有する調製物を指す。ワクチン調製物は、天然、合成又は組換え由来の調製物のいずれか１つを含んでも除外してもよい。組換え由来の調製物は、例えば、組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。
本明細書で使用される場合、「抗原特異的」という用語は、特定の抗原又は抗原のフラグメントの供給が特異的細胞増殖をもたらすような細胞集団の特性を指す。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、結合対（例えば、抗体と抗原）間の相互作用を指す。種々の例で、特異的結合は、約１０−６モル／リットル、約１０−７モル／リットル若しくは約１０−８モル／リットル又はそれ未満の親和定数によって具体化することができる。
本明細書で使用される「実質的に類似」、「実質的に同じ」、「同等」又は「実質的に同等」という句は、当業者が２つの値の間の差を前記値によって測定される生物学的特徴（例えば、Ｋｄ値、抗ウイルス効果等）の状況内で生物学的及び／又は統計学的有意性がほとんど又は全くないとみなすような、２つの数値（例えば、一方が分子に関連し、他方が参照／比較分子に関連する）間の十分に高い程度の類似性を示す。前記２つの値の間の差は、例えば、参照／比較分子についての値の関数として約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満及び／又は約１０％未満である。
本明細書で使用される「実質的に減少した」又は「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの値の間の差を前記値によって測定される生物学的特徴（例えば、Ｋｄ値）の状況内で統計学的に有意であるとみなすような、２つの数値（一般的に、一方が分子に関連し、他方が参照／比較分子に関連する）間の十分に高い程度の差を示す。前記２つの値の間の差は、例えば、参照／比較分子についての値の関数として約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超及び／又は約５０％超である。
本明細書で使用される「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の全非共有結合相互作用の合計の強度を指す。特に指示しない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般的に、抗原にゆっくり結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般的に、抗原に速く結合し、長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当技術分野で公知であり、そのいずれも本発明の目的のために使用することができる。具体的な例示的な実施形態を以下に記載する。
一定の実施形態では、本発明による「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」が、以下のアッセイによって記載される目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原で行われる放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で最少濃度の（１２５Ｉ）標識抗原でＦａｂを平衡化し、次いで、結合抗原を抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで捕捉することによって、Ｆａｂの抗原に対する溶液結合親和性を測定する（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５−８８１）。アッセイのための条件を確立するために、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍＬの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、室温（約２３℃）で２〜５時間、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号２６９６２０）において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を目的のＦａｂの系列希釈と混合する（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかしながら、確実に平衡に達するようにするために、インキュベーションがより長期間（例えば、６５時間）続いてもよい。その後、混合物を、室温で（例えば、１時間）インキュベートするために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイに使用するために選択する。別の実施形態によると、約１０応答単位（ＲＵ）で、固定化抗原ＣＭ５チップを用いて、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって、Ｋｄ又はＫｄ値を測定する。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）まで希釈した後、５μＬ／分の流量で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成する。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。各実験で、スポットを活性化し、タンパク質を固定化することなくエタノールアミンをブロッキングして、参照差し引きに使用した。動力学測定のために、約２５μＬ／分の流量で、２５℃で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中にＦａｂの２倍系列希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を注入する。会合及び解離センサーグラムを同時に適合させることによって、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５−８８１を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超えた場合、会合速度を、攪拌キュベットを用いて分光計、例えばストップフロー装備分光計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ ｆｏｒｍ）の２５℃での蛍光発光強度の増加又は減少を測定する蛍光消光技術（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）を使用することによって決定することができる。
本発明による「会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）」すなわち「会合の速度（ｒａｔｅ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」すなわち会合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」すなわち「ｋｏｎ」を、固定化抗原ＣＭ５チップを用いて、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００若しくはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いて、上記の同じ表面プラズモン共鳴技術を用いて決定することもでき、又は本発明による「会合速度」若しくは「ｋｏｎ」を、供給業者の指示に従って、同じ表面プラズモンＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて決定することもできる。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）まで希釈した後、５μＬ／分の流量で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成する。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。動力学測定のために、約２５μＬ／分の流量で、２５℃で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中にＦａｂの２倍系列希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を注入する。会合及び解離センサーグラムを同時に適合させることによって、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５−８８１を参照されたい。しかしながら、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超えた場合、会合速度を、攪拌キュベットを用いて分光計、例えばストップフロー装備分光計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、増加する濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ ｆｏｒｍ）の２５℃での蛍光発光強度の増加又は減少を測定する蛍光消光技術（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）を使用することによって決定することができる。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことを意図している。ベクターの１つのタイプが「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプはファージベクターである。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。一定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、一定のベクターは、それらが作動可能に連結している遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」と「ベクター」とが互換的に使用され得る。
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによって、若しくは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列が非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後、例えば標識との結合によってさらに修飾され得る。他のタイプの修飾には、例えば、「キャップ」、アナログによる天然ヌクレオチドの１つ以上の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）及び荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等）を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合（例えば、αアノマー核酸等）を有するもの並びにポリヌクレオチド（複数可）の未修飾形態が含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換されていても、標準的な保護基によって保護されていても若しくは追加のヌクレオチドとの追加の結合を準備するために活性化されていてもよいし、又は固体若しくは半固体支持体と結合していてもよい。５’及び３’末端ＯＨは、リン酸化又は１〜２０個の炭素原子のアミン若しくは有機キャッピング基部分で置換され得る。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボースを含む当技術分野で一般的に公知のリボース又はデオキシリボース糖の類似の形態、１〜２０個の炭素原子のアミン又は有機キャッピング基部分で置換された炭素環類似体も含有することができる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、側部を含有することができる。１個以上のホスホジエステル結合が別の連結基によって置換されていてもよい。これらの代替の連結基には、それだけに限らないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各Ｒ又はＲ’は独立に、Ｈ又は任意にエーテル（１〜２０個の炭素原子）を含有する置換若しくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である）によって置換された実施形態が含まれる。他のヒドロキシルはまた、同一である必要がある標準的な保護ヌクレオチドに誘導体化され得る。上記の記載は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、一般に、典型的には必ずしもそうではないが、約２００ヌクレオチド長未満の短い一本鎖合成ポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドに同等に及び完全に適用可能である。
本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特異的抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と一般に抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで産生され、骨髄腫によって高レベルで産生される。
本明細書で使用される「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、広義で互換的に使用され、モノクローナル抗体（例えば完全長又はインタクトモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、それらが所望の生物学的活性を示す限り二重特異性抗体）を含み、本明細書でさらに詳細に記載される一定の抗体フラグメントも含み得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟であり得る。
本明細書で使用される抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは、一般的に、抗体の最も可変性の部分であり、抗原結合部位を含有する。
本明細書で使用される「可変」という用語は、可変ドメインの一定の部分が抗体間で配列が大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮されている。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、βシート構造を連結するループを形成する、場合によってはβシート構造の一部を形成する３つのＣＤＲによって連結された、βシート構造を主にとる４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、及びその名前が容易に結晶化する能力を反映する残存「Ｆｃ」フラグメントを産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小限の抗体フラグメントである。２本鎖Ｆｖ種において、この領域は、緊密で非共有結合的に１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種では、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインを、軽鎖及び重鎖が２本鎖Ｆｖ種のものと類似の「二量体」構造に会合することができるように、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合させることができる。この構造において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。まとめると、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも親和性が低いが、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有する。
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１個以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における少数の残基の付加によってＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’のための本明細書中の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、もともと、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」を、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型の１つに割り当てることができる。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）を異なるクラスに割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主要なクラスの免疫グロブリンが存在し、これらのいくつかをサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメイン（ｂｕｌｉｎｓと呼ばれる）を、異なるクラスに割り当てることができる。異なるクラスの免疫グロブリンの５つの三次元立体配置が周知であり、一般的に、例えば、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．（２０００）に記載されている。抗体は、抗体と１つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合又は非共有結合によって形成される、より大きな融合分子の一部であり得る。
「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、実質的にインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義される抗体フラグメントを指さない。これらの用語は、特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
本明細書で使用される「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部分のみを含み、その部分は、インタクト抗体中に存在する場合にその部分に通常関連する機能の少なくとも１つ、及びほとんど又は全てを保持する。一実施形態では、抗体フラグメントがインタクト抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体フラグメント、例えばＦｃ領域を含むものが、インタクト抗体中に存在する場合にＦｃ領域に通常関連する生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも１つを保持する。一実施形態では、抗体フラグメントが、インタクト抗体と実質的に類似のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体フラグメントは、フラグメントにインビボでの安定性を付与することができるＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含み得る。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る可能性のある天然の突然変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語句は、抗体の特徴が個別の抗体の混合物ではないことを示す。このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一標的結合ポリペプチド配列の選択を含む方法によって得られた。一定の実施形態では、モノクローナル抗体が天然配列を除外し得る。いくつかの態様では、選択方法が、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからのただ１つのクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を、例えば、標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養におけるその産生を改善するため、インビボでその免疫原性を低下させるため、多重特異性抗体を作製するためにさらに変化させることができること、及び変化した標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。異なる決定基（例えば、エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていない点で有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）参照）及びヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有するヒト又はヒト様抗体を動物で産生する技術（例えば、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）及びＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）参照）を含む種々の技術によって作製され得る。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びに所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを含む（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
本発明の抗体はまた、本発明の抗体から生成されたキメラ化又はヒト化モノクローナル抗体も含む。
抗体は、完全長であってもよく、又はそれだけに限らないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ−ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ−ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂフラグメント（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９））、ＣＤＲ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、直鎖抗体、単鎖抗体分子及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む抗原結合部分を有する抗体の１つのフラグメント（又は複数のフラグメント）を含んでもよい。組換え法又は合成リンカーを使用して抗体フラグメントを連結することによって生成される単鎖抗体も本発明に包含される。Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４２：４２３−４２６．Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５：５８７９−５８８３。
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、単一特異性、二重特異性又は多重特異性であり得る。
ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ又はＩｇＥを含む全ての抗体アイソタイプが本発明に包含される（全てのクラス及びサブクラスが本発明に包含される）。抗体又はその抗原結合部分は、哺乳動物（例えば、マウス、ヒト）抗体又はその抗原結合部分であり得る。抗体の軽鎖はカッパ型又はラムダ型であり得る。
したがって、本発明の抗がん抗体は、重鎖若しくは軽鎖可変領域と組み合わせて、本発明の抗体に組み込むことができる、非マウス起源の、好ましくはヒト起源の、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域又はそれらの任意の部分を含む。
参照抗体によって生成される抗体の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％＞、少なくとも約８８％＞、少なくとも約８９％＞、少なくとも約９０％＞、少なくとも約９１％＞、少なくとも約９２％＞、少なくとも約９３％＞、少なくとも約９４％＞、少なくとも約９５％＞、少なくとも約９６％＞、少なくとも約９７％＞、少なくとも約９８％＞、少なくとも約９９％＞又は約１００％相同であり、炭水化物抗原（例えば、ＳＳＥＡ−４）に結合することもできる、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を有する抗体。相同性は、アミノ酸配列レベル又はヌクレオチド配列レベルのいずれかで存在し得る。いくつかの態様では、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のいずれかに対する列挙された相同性を有する抗体の配列が、天然抗体配列を除外するだろう。いくつかの態様では、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のいずれかに対する列挙された相同性を有する抗体の配列が、天然抗体配列を含むだろう。
一定の実施形態では、表１〜３のＣＤＲに対応するＣＤＲが配列変異を有する。例えば、１、２、３、４、５、６、７若しくは８個の残基又はＣＤＲ中の全残基の２０％未満、３０％未満若しくは４０％未満が置換されている又は欠失しているＣＤＲが、炭水化物抗原に結合する抗体（又はその抗原結合部分）に存在し得る。
抗体又は抗原結合部分はペプチドであってもよい。このようなペプチドは、生物学的活性、例えば炭水化物抗原の結合を示す、ペプチドの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、類似体、オルソログ、ホモログ及び誘導体を含み得る。ペプチドは、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸、関連しない生物系でのみ自然に生じるアミノ酸、哺乳動物系由来の修飾アミノ酸等を含む）、置換結合並びに当技術分野で公知の他の修飾を有するペプチドを含有し得る。
特定のアミノ酸が置換、欠失又は付加された抗体又はその抗原結合部分も本発明の範囲内にある。代表的な実施形態では、これらの交替は、結合親和性などのペプチドの生物学的特性に実質的な効果を有さない。別の代表的な実施形態では、抗体が、抗原に対する抗体の結合親和性を改善するためなどのフレームワーク領域のアミノ酸置換を有し得る。さらに別の代表的な実施形態では、選択された少数のアクセプターフレームワーク残基を、対応するドナーアミノ酸によって置換することができる。ドナーフレームワークは、成熟又は生殖系列のヒト抗体フレームワーク配列又はコンセンサス配列であり得る。表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）．Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２４３：３０７−３１（１９９４）．Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−４５（１９９２）に提供されている。
抗体又はその抗原結合部分を、誘導体化又は別の機能性分子に連結することができる。例えば、抗体を、別の抗体、検出可能な薬剤、細胞傷害剤、医薬品、別の分子との会合を媒介することができるタンパク質若しくはペプチド（例えば、ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ）、アミノ酸リンカー、シグナル配列、免疫原性担体又はタンパク質精製に有用なリガンド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ及びブドウ球菌プロテインＡなどの１つ以上の他の分子実体と（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的相互作用等によって）機能的に連結することができる。あるタイプの誘導体化タンパク質は、２つ以上のタンパク質（同じタイプ又は異なるタイプの）を架橋することによって生成される。適切な架橋剤は、適切なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）によって分離された２つの異なる反応性基を有するヘテロ二官能性又はホモ二官能性（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）のものを含む。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１１１から入手可能である。タンパク質を誘導体化（又は標識）することができる有用な検出可能な薬剤には、蛍光化合物、種々の酵素、補欠分子族、発光物質、生物発光物質及び放射性物質が含まれる。非限定的な、代表的な蛍光検出可能な薬剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン及びフィコエリトリンが含まれる。タンパク質又は抗体を、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化することもできる。タンパク質を、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン）で誘導体化することもできる。
本抗体又はその抗原結合部分の機能的に活性な変異体をコードする核酸も本発明に包含される。これらの核酸分子は、中程度のストリンジェンシー、高いストリンジェンシー又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、本抗体又はその抗原結合部分のいずれかをコードする核酸とハイブリダイズし得る。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．６．３．１−６．３．６，１９８９に見出すことができる。本明細書で言及される特異的ハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：１）中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で６×ＳＳＣ、引き続いて６０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄；２）高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：約４５℃で６×ＳＳＣ、引き続いて６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄；及び３）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件：６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、引き続いて６５℃で０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上洗浄。
本抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸を、適切な発現系で発現され得る発現ベクターに導入し、引き続いて発現した抗体又はその抗原結合部分を単離又は精製することができる。任意に、本抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸を、無細胞翻訳系で翻訳させることができる。米国特許第４８１６５６７号明細書、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）。
本抗体又はその抗原結合部分を、所望の抗体の軽鎖及び重鎖（又はその一部）をコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞によって産生させることができる。抗体を、標準的な技術を用いて、これらの培養上清及び／又は細胞から単離及び精製することができる。例えば、宿主細胞を、抗体の軽鎖、重鎖又はその両方をコードするＤＮＡで形質転換することができる。組換えＤＮＡ技術を使用して、結合に必要でない（例えば、定常領域）軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡのいくらか又は全部を除去してもよい。
本核酸を、原核細胞及び真核細胞、例えば細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ））、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む種々の適切な細胞で発現させることができる。いくつかの哺乳動物細胞株が当技術分野で公知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が含まれる。細胞の非限定的な例としては、それだけに限らないが、サル腎臓細胞（ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７）、ＨＥＫ２９３、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ、例えばＢＨＫ２１）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、ＰｅｒＣ６、ＢＳＣ−１、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、メイディン・ダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）、骨髄腫及びリンパ腫細胞の親細胞、誘導体及び／又は改変された変異体を含む哺乳等物起源の又は哺乳動物様の特徴を有する全ての細胞株が挙げられる。改変された変異体は、例えば、グリカンプロファイル改変及び／又は部位特異的組み込み部位誘導体を含む。
本発明はまた、本明細書に記載される核酸を含む細胞を提供する。細胞は、ハイブリドーマ又はトランスフェクタントであり得る。
又は、本抗体又はその抗原結合部分を、当技術分野で周知の固相法によって合成することができる。Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｂｙ Ｅ． Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄ．Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ），ｃｈａｐｔｅｒ ７。Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）。Ｇ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．１ ａｎｄ Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８０），ｐｐ．３−２５４。Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８４）。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体が、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。以下の総説論文及びその中に引用されている参考文献も参照されたい：Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）。
「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列中で超可変である及び／又は構造的に規定されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つの超可変領域を含む；３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。いくつかの超可変領域描写が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。
本明細書で使用される「フレームワーク」又は「ＦＷ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「Ｋａｂａｔのような可変ドメイン残基の番号付け」又は「Ｋａｂａｔのアミノ酸位置の番号付け」という用語及びその変形は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編成の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮又は挿入に対応して、より少ないアミノ酸を含んでも又は追加のアミノ酸を含んでもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸インサート（例えば、Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃ等）を含み得る。所与の抗体について、その抗体の配列の相同性領域における「標準的」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアラインメントによって、残基のＫａｂａｔ番号付けを決定することができる。
本明細書で使用される「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
本明細書で使用される「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメント（ＶＨ−ＶＬ）を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を形成させる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により十分に記載されている。
本明細書中で使用される「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する、及び／又は本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
本明細書で使用される「親和性成熟抗体」は、変化（複数可）を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらすその１つ以上のＨＶＲにおける１つ以上の変化を有するものである。一実施形態では、親和性成熟抗体が、標的抗原に対してナノモル濃度又はピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手順によって産生される。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発が、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）によって記載されている。
本明細書で使用される「ブロッキング抗体」又は「アンタゴニスト抗体」は、それが結合する抗原の生物学的活性を抑制又は低減するものである。一定のブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に抑制する。
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」は、目的のポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
本明細書中で使用される「障害」は、本発明の抗体による治療から利益を得るであろう任意の状態である。これには、哺乳動物を当の障害にかかりやすくする病理学的状態を含む慢性及び急性の障害又は疾患が含まれる。本明細書において治療される障害の非限定的な例としては、がんが挙げられる。
本明細書で使用される「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖と関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害が、がんである。
本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性であれ良性であれ、全ての新生物細胞の成長及び増殖、並びに全ての前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」及び「腫瘍」という用語は、本明細書中で言及されるように互いに排他的ではない。
本明細書で使用される「がん」及び「がん性」という用語は、典型的には未制御の細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指す又は記載する。がんの例としては、それだけに限らないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられる。このようながんのより具体的な例としては、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、肝がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、白血病及び他のリンパ増殖性障害、並びに様々な種類の頭頸部がんが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療」とは、治療される個体又は細胞の自然経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理学の経過の間に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、炎症及び／又は組織／臓器の損傷の予防又は減少、疾患進行速度の減少、疾患状態の改善又は緩和及び寛解又は予後改善が含まれる。一定の実施形態では、本発明の抗体を使用して疾患又は障害の発達を遅延させる。
本明細書で使用される場合、「抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）」とは、化学療法剤、薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はそれらのフラグメント）又は放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害剤と結合した抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞表面抗原」とは、ＭＨＣ−関連ペプチド抗原の特異的認識のためにＴ細胞によって使用される全てのＴ細胞の原則的規定マーカーであるＴ細胞抗原受容体（ＴｃＲ）を含む、当技術分野で公知の代表的なＴ細胞表面マーカーを含み得る抗原を指す。ＴｃＲに関連する例は、その同族ＭＨＣ／抗原複合体とのＴｃＲ結合後の細胞内シグナルの伝達に関与するＣＤ３として知られるタンパク質の複合体である。Ｔ細胞表面抗原の他の例は、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＣＤ４４を含む（又は除外する）ことができる。
本明細書で使用される「個体」又は「対象」は脊椎動物である。一定の実施形態では、この脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物には、それだけに限らないが、家畜（例えば、ウシ）、スポーツ動物、ペット（ネコ、イヌ及びウマなど）、霊長類、マウス及びラットが含まれる。一定の実施形態では、脊椎動物がヒトである。
本明細書で使用される治療の目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、飼育動物及び家畜並びに動物園の動物、スポーツ動物又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。一定の実施形態では、哺乳動物がヒトである。
本明細書で使用される「有効量」とは、所望の治療又は予防結果を達成するのに必要な投与量及び期間で有効な量を指す。
本発明の物質／分子の「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重並びに物質／分子が個体において所望の応答を誘発する能力などの因子によって変化し得る。治療上有効量はまた、物質／分子の毒性又は有害効果を治療上有益な効果が上回るものである。「予防上有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに必要な投与量及び期間で有効な量を指す。典型的には、必ずしもそうではないが、予防用量が疾患の前又は初期の対象において使用されるので、予防上有効量は治療上有効量未満となるだろう。
本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を抑制する若しくは妨げる及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）、酵素及びそれらのフラグメント、例えば核酸分解酵素、抗生物質及び毒素、例えば小分子毒素又は細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）、及び以下に開示される種々の抗腫瘍又は抗がん剤を含むことを意図している。他の細胞傷害剤を以下に記載する。殺腫瘍剤は腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
本明細書で使用される「化学療法剤」は、がんの治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（Ｒ）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（Ｒ））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（Ｒ））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（Ｒ））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコディクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロラムファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンなどのニトロソ尿素；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ダインマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダインマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（Ｒ）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルテストロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシン及びアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（Ｒ）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（Ｒ）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（Ｒ））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えばＴＡＸＯＬ（Ｒ）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒフリー、パクリタキセルのアルブミン設計ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌ．）及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（Ｒ）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、フランス）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（Ｒ））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（Ｒ））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（Ｒ））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（Ｒ））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（Ｒ））；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体；並びにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの併用療法の略語）、ＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ及びロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））による治療レジメンの略語）などの上記の２つ以上の組み合わせが挙げられる。
ＳＳＥＡ−４を標的とする抗体
本開示の一態様は、ＳＳＥＡ−４関連抗原を標的とする新規な抗体を特徴とする。
ｍＡｂ １Ｊ１ｓ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７９）は、ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７９）によって産生されるモノクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体は、抗体１Ｊ１ｓと同じＶＨ及びＶＬ鎖を含有してもよい。１Ｊ１ｓと同じエピトープに結合する抗体も本開示の範囲内である。
典型例並びにそれらのアミノ酸構造／配列及び核酸構造／配列を以下に提供する：
Figure 2019513144
ｍＡｂ １Ｇ１ｓ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７８）は、ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７８）によって産生されるマウスモノクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体は、抗体１Ｇ１ｓと同じＶＨ及びＶＬ鎖を含み得る。１Ｇ１と同じエピトープに結合する抗体も本開示の範囲内である。
典型例並びにそれらのアミノ酸及び核酸構造／配列を以下に提供する：
Figure 2019513144
ｍＡｂ ２Ｆ２０ｓ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７６）は、ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７６）によって産生されるモノクローナル抗体である。本明細書に記載される抗体は、抗体２Ｆ２０ｓと同じＶＨ及びＶＬ鎖を含み得る。２Ｆ２０ｓと同じエピトープに結合する抗体も本開示の範囲内である。
典型並びにそれらのアミノ酸及び核酸構造／配列を以下に提供する：
Figure 2019513144
「１Ｊ１ｓ抗体」又は「ｍＡｂ １Ｊ１ｓ」又は「クローン１Ｊ１ｓ由来の抗体」は、クローン１Ｊ１ｓによって発現される抗体、又は他の様式で合成されるが、クローン１Ｊ１ｓによって発現される抗体と同じＣＤＲを有しそして任意に選択的に同じフレームワーク領域を有する抗体を指す。
本開示の一態様は、ＳＳＥＡ−４に特異的な新規な抗体を特徴とする。抗ＳＳＥＡ−４抗体は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１（ＳＳＥＡ−４六糖）に結合する。
本明細書中に記載される抗体のいずれも、完全長抗体又はその抗原結合フラグメントであり得る。いくつかの例では、抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又は単鎖Ｆｖフラグメントである。いくつかの例では、抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又は単鎖Ｆｖフラグメントである。いくつかの例では、抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は単鎖抗体である。
本明細書に記載される抗体のいずれも、（ａ）組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体又は抗体の誘導体である；（ｂ）ヒト、マウス、ヒト化若しくはキメラ抗体、抗原結合フラグメント又は抗体の誘導体である；（ｃ）ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤアイソタイプ及び／又はそのサブクラスの単鎖抗体フラグメント、マルチボディ、Ｆａｂフラグメント及び／又は免疫グロブリンである；（ｄ）以下の特徴の１つ以上を有する：（ｉ）がん細胞のＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを媒介する；（ｉｉ）がん細胞のアポトーシスを誘導及び／又は促進する；（ｉｉｉ）がん細胞の標的細胞の増殖を抑制する；（ｉｖ）がん細胞の食作用を誘導及び／又は促進する；並びに／又は（ｖ）細胞傷害剤の放出を誘導及び／又は促進する；（ｅ）腫瘍特異的炭水化物抗原である腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合する；（ｆ）非がん細胞、非腫瘍細胞、良性がん細胞及び／又は良性腫瘍細胞上で発現される抗原に結合しない；並びに／又は（ｇ）は、がん幹細胞及び正常がん細胞上で発現される腫瘍関連炭水化物抗原に特異的に結合する、の１つ以上の特徴を有する。
好ましくは、抗体のそれぞれの抗原への結合が特異的である。「特異的」という用語は、一般的に、結合対の１つのメンバーが、その特異的結合対（複数可）以外の分子に有意な結合を示さない、例えば約３０％未満、好ましくは２０％、１０％又は１％未満の本明細書で指定されるもの以外の他の分子との交差反応性を有する状況を指すために使用される。
抗体は、高い親和性（低いＫＤ値）で標的エピトープに適切に結合し、好ましくはＫＤはナノモル範囲以下である。親和性は、当技術分野で公知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴によって測定することができる。
抗体調製の例
本明細書に記載されるＧｌｏｂｏ Ｈエピトープ及びＳＳＥＡ−４エピトープに結合することができる代表的な抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
宿主動物の免疫化及びハイブリドーマ技術
一実施形態では、本発明は、炭水化物抗原（例えば、Ｇｌｏｂｏ Ｈ）に特異的に結合する抗体を発現するハイブリドーマを作製する方法を提供する。この方法は、以下のステップ：炭水化物抗原（例えば、Ｇｌｏｂｏ Ｈ）を含む組成物で動物を免疫化するステップと；動物から脾細胞を単離するステップと；脾細胞からハイブリドーマを生成するステップと；Ｇｌｏｂｏ Ｈに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するステップとを含む。Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５。Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８。
一実施形態では、炭水化物抗原を使用してマウスを皮下免疫化する。１回以上の追加免疫を与えても与えなくてもよい。血漿中の抗体の力価は、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）又はフローサイトメトリーによって監視することができる。十分な力価の抗炭水化物抗原抗体を有するマウスを、融合に使用する。マウスを、屠殺及び脾臓の除去の３日前に抗原で追加免疫してもしなくてもよい。マウス脾細胞を単離し、ＰＥＧでマウス骨髄腫細胞株に融合させる。次いで、得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングする。細胞を蒔き、次いで、選択培地中でインキュベートする。次いで、個々のウェル由来の上清を、ヒト抗炭水化物抗原モノクローナル抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。抗体分泌ハイブリドーマを反復し、再度スクリーニングし、抗炭水化物抗原抗体について依然として陽性であれば、限界希釈によってサブクローニングすることができる。
炭水化物抗原の１つ以上の免疫原性を増加させるために使用され得るアジュバント。アジュバントの非限定的な例としては、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、０．５％＞ｗ／ｖトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ ８５））、ＣｐＧ含有核酸、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ａ−ガラクトシル−セラミド又はその合成アナログ（例えば、Ｃ３４、ＵＳ８，２６８，９６９参照）、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａ製の抽出物、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６４：７１３；ＷＯ９０／０３１８４；Ｗ０９６／１１７１１；ＷＯ００／４８６３０；Ｗ０９８／３６７７２；ＷＯ００／４１７２０；ＷＯ０６／１３４４２３及びＷＯ０７／０２６１９０参照）、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、Ｑｕｉｌ Ａ、インターロイキン、フロイント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（−２’−ｄｉｐ−アルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）及びＲＩＢＩ（２％＞スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する）が挙げられる。
抗ＳＳＥＡ−４抗体に対する代表的なポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加を調べる免疫化哺乳動物から血液を採取し、任意の慣用的な方法によって血液から血清を分離することによって調製することができる。ポリクローナル抗体にはポリクローナル抗体を含有する血清が含まれ、ポリクローナル抗体を含有する画分を血清から単離することができる。
ポリクローナル抗体は、一般的に、関連する抗原及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射によって、宿主動物（例えば、ウサギ、マウス、ウマ又はヤギ）で産生される。二官能性又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２等を使用して、関連する抗原を免疫化する種中で免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又は大豆トリプシン阻害剤に結合することが有用となり得る。
所望の抗体を産生するために、任意の哺乳動物を抗原で免疫化することができる。一般に、げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）又は霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）の動物を使用することができる。げっ歯目の動物には、例えば、マウス、ラット及びハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えば、ウサギが含まれる。霊長目の動物には、例えば、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、ヒヒ及びチンパンジーが含まれる。
抗原で動物を免疫化する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射又は皮下注射は、哺乳動物の免疫化のための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適切な量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等に希釈及び懸濁することができる。所望であれば、抗原懸濁液を、適切な量のフロイント完全アジュバントなどの標準的なアジュバントと混合し、エマルジョンにし、次いで、哺乳動物に投与することができる。ペプチド又はコンジュゲート１ｍｇ又は１μｇ（それぞれウサギ又はマウスについて）を３容量のフロイント不完全アジュバントと組み合わせることによって、抗原、免疫原複合体又は誘導体に対して動物を免疫化する。
適切な量のフロイントの不完全アジュバントと混合した抗原を４〜２１日毎に数回投与することによって、力価が定常に達するまで動物を追加免疫することができる。動物を、複数の部位での皮下注射によって、元の量の１／５〜１／１０のフロイントの完全アジュバント中ペプチド又はコンジュゲートで追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。適切な担体を免疫化に使用することもできる。上記のように免疫化した後、所望の抗体の量の増加について標準的な方法によって血清を調査する。好ましくは、動物を、同じ抗原の複合体で追加免疫するが、異なるタンパク質に及び／又は異なる架橋試薬を通して結合してもよい。複合体はまた、タンパク質融合物として組換え細胞培養において作製することができる。また、ミョウバンなどの凝集剤が、免疫応答を高めるために好適に使用される。
過去２０〜３０年にわたり、ヒトインビボ治療用途のためのキメラ、ヒト化又はヒト抗体を調製するためのいくつかの方法論が開発されている。最もよく使用及び証明されている方法論は、ハイブリドーマ法を用いてマウスｍＡｂを調製し、次いで、ＶＨ及びＶＬドメインのフレームワーク領域並びにｍＡｂの定常ドメインを、ヒトＶＨ及びＶＬドメインの最も相同なヒトフレームワーク領域並びに望ましいヒトγ免疫グロブリンアイソタイプ及びサブクラスの定常領域に変えることによって、ｍＡｂをヒト化するものである。臨床的に使用されるＸｏｌａｉｒなどの多くのｍＡｂは、ヒトγ１、κアイソタイプ及びサブクラスのヒト化ｍＡｂであり、この方法論を使用して調製される。
一定の実施形態では、抗体を慣用的なハイブリドーマ技術によって作製することができる。Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えばハムスター又はウサギを上記のように免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘発する。又は、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。
モノクローナル抗体を調製するために、抗原で免疫化した哺乳動物から免疫細胞を採取し、上記のように血清中の所望の抗体レベルの上昇を調べ、細胞融合に供する。細胞融合に使用される免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記免疫細胞と融合させる他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは薬物によって融合細胞を選択するための獲得特性を有する骨髄腫細胞が含まれる。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性である細胞である。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、サンディエゴ、Ｃａｌｉｆ．米国から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、並びにアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．米国から入手可能なＳＰ−２細胞由来のものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
上記免疫細胞及び骨髄腫細胞を、公知の方法、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）に従って融合することができる。リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。細胞融合によって得られる、得られたハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン含有培地）などの標準的な選択培地中でそれらを培養することによって選択することができる。細胞培養を、典型的には、所望のハイブリドーマ（非融合細胞）を除いて他の全ての細胞を死滅させるのに十分な時間である数日〜数週間、ＨＡＴ培地中で継続する。次いで、標準的な限界希釈を行って、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニング及びクローニングする。
こうして調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合していない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を抑制する１種以上の物質を含有する適切な培養培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防ぐヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイによって決定する。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び／又は免疫蛍光における吸光度の測定を使用して、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ＥＬＩＳＡでは、本発明の抗体をプレートに固定化し、本発明のタンパク質をプレートに適用し、次いで、所望の抗体を含有する試料、例えば抗体産生細胞の培養上清又は精製抗体を適用する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を適用し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄後、ｐ−ニトロフェニルホスフェートなどの酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して試料の抗原結合活性を評価する。Ｃ末端又はＮ末端フラグメントなどのタンパク質のフラグメントをこの方法で使用することができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、本発明による抗体の活性を評価することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。
上記のものを含む慣用的な方法のいずれかを適用して、本明細書に記載されるエピトープに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定し、さらなる特徴付けのために選択することができる。
所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に適した培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。サブクローニングによって分泌されたモノクローナル抗体を、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの慣用的な免疫グロブリン精製手順によって培養培地、腹水又は血清から適切に分離する。
さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物中で腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。例えば、その後、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔に移植し、腹水を収穫することができる。
得られたモノクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡ若しくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー又は本発明のタンパク質がカップリングしたアフィニティーカラムによって精製することができる。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製及び検出だけでなく、本発明のタンパク質のアゴニスト及びアンタゴニストの候補としても使用することができる。さらに、この抗体を、本発明のタンパク質に関連する疾患のための抗体治療に適用することができる。
組換え技術
このようにして得られるモノクローナル抗体はまた、遺伝子工学技術を使用して組換え的に調製することもできる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ Ｃ．Ａ．Ｋ． ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｗ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＬＴＤ，１９９０参照）。抗体をコードするＤＮＡを、抗体を産生するハイブリドーマ又は免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入し、宿主細胞に導入して組換え抗体を調製することができる。本発明は、上記のように調製された組換え抗体も提供する。
得られた抗体を人体に投与する場合（抗体治療）、免疫原性を低下させるためにヒト抗体又はヒト化抗体が好ましい。例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を、タンパク質、タンパク質発現細胞又はそれらの溶解物から選択される抗原で免疫化することができる。次いで、抗体産生細胞を動物から採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得て、これからタンパク質に対するヒト抗体を調製することができる。又は、抗体を産生する免疫化リンパ球などの免疫細胞を、癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体を調製するために使用することができる。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用的な手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及び配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。いったん単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に配置し、次いで、発現ベクターを、免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説論文には、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）が含まれる。
上記のハイブリドーマ細胞によって産生される抗体をコードするＤＮＡを、慣用的な技術によって遺伝子改変して、遺伝子改変抗体を産生することができる。ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体及び二重特異性抗体などの遺伝子改変抗体は、例えば、慣用的な組換え技術を介して産生することができる。次いで、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１）又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部若しくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、ＤＮＡを修飾することができる。このようにして、標的抗原の結合特異性を有する遺伝子改変抗体、例えば「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体を調製することができる。
「キメラ抗体」を産生するために開発された技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４；及びＴａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２を参照されたい。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドを抗体の定常ドメインと置換する、又はそれらを抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換して、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位及び異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
キメラ又はハイブリッド抗体は、架橋剤を含むものを含む合成タンパク質化学で公知の方法を使用してインビトロで調製することもできる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用して又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することができる。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列で置換することによって行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクト未満のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」法によると、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。そのため、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に同じ枠組みを使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａｅｔａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
抗体が抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によると、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び種々の概念的ヒト化産物の分析方法によって調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体配座構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これら表示の精査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性などの所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及びインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに直接的及び最も実質的に関与する。
又は、免疫化により、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが現在可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイのこのような生殖系列突然変異体マウスへの移入は、抗原曝露時にヒト抗体の産生をもたらすだろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーから誘導することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１））。
本明細書に記載される抗ＳＳＥＡ−４抗体（重鎖、軽鎖又はその両方を含む）をコードする核酸、核酸の１つ以上を含む発現ベクターなどのベクター及び１つ以上のベクターを含む宿主細胞のいずれもまた、本開示の範囲内にある。いくつかの例では、ベクターが、本明細書に記載される抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの例では、ベクターが、本明細書に記載される抗ＳＳＥＡ−４抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の例では、ベクターが、その発現を単一のプロモーター又は２つの別個のプロモーターによって制御することができる、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば本明細書に記載される組換え技術を介して、本明細書に記載される抗Ｇｌｏｂｏ Ｈａｎｄ抗ＳＳＥＡ−４抗体のいずれかを産生する方法もここで提供される。
抗体を調製するための他の技術
一定の実施形態では、完全ヒト抗体を、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するよう操作された市販のマウスを使用することによって得ることができる。より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）又はより堅牢な免疫応答を生成するように設計されたトランスジェニック動物を、ヒト化抗体又はヒト抗体の作製に使用することもできる。このような技術の例には、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（ＲＴＭ）並びにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（ＲＴＭ）及びＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）がある。又は、抗体を、ファージディスプレイ技術によって組換え的に作製することができる。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５６５，３３２；５，５８０，７１７；５，７３３，７４３；及び６，２６５，１５０；並びにＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５を参照されたい。又は、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３）を使用して、非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及び抗体フラグメントをインビトロで産生することができる。
インタクト抗体（すなわち、完全長抗体）の抗原結合フラグメントは、慣用的な方法によって調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂフラグメントのペプシン消化によって生成することができる。
又は、本明細書に記載される抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ及び抗ＳＳＥＡ−４抗体を、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して生成される抗体ファージライブラリー（例えば、単鎖抗体ファージライブラリー）から単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）。これらに続く刊行物が、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））を記載している。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替である。
本明細書に記載されるように得られた抗体を、均質になるまで精製することができる。例えば、抗体の分離及び精製を、一般的なタンパク質に使用される分離及び精製法に従って行うことができる。例えば、それだけに限らないが、アフィニティークロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などのカラムクロマトグラフィーの適切に選択され、組み合わせられた使用によって、抗体を分離及び単離することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。上記のように得られた抗体の濃度を、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等によって測定することができる。アフィニティーを除く代表的なクロマトグラフィーには、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。クロマトグラフィー手順は、ＨＰＬＣ又はＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、１つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること又は「エピトープマッピング」である。例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １１ ｏｆ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９に記載される抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子フラグメント発現アッセイ及び合成ペプチドに基づくアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングする及び特徴付けるための当技術分野で公知の多くの方法が、存在する。さらに、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、直鎖状エピトープ（例えば、アミノ酸の単一伸長に含有される）であってもよく、又は必ずしも単一伸長（一次構造直鎖状配列）に含有されないアミノ酸の三次元相互作用によって形成される、立体配座エピトープであってもよい。種々の長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸長）のペプチドを単離又は合成（例えば、組換え的に）し、抗体との結合アッセイに使用することができる。別の例では、抗体が結合するエピトープを、標的抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗体による結合を決定することによって系統的スクリーニングで決定することができる。遺伝子フラグメント発現アッセイによると、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームを、ランダムに又は特異的な遺伝子構築によって断片化し、抗原の発現されたフラグメントと試験すべき抗体との反応性を決定する。遺伝子フラグメントを、例えば、ＰＣＲによって生成し、次いで、放射性アミノ酸の存在下で、インビトロでタンパク質に転写及び翻訳することができる。次いで、抗体と放射性標識抗原フラグメントの結合を、免疫沈降及びゲル電気泳動によって決定する。ファージ粒子の表面上に提示されるランダムペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を使用することによって、一定のエピトープを同定することもできる。又は、重複ペプチドフラグメントの定義されたライブラリーを、単純な結合アッセイにおいて試験抗体への結合について試験することができる。
さらなる例では、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメインスワッピング実験及びアラニンスキャニング突然変異誘発を行って、エピトープ結合に要求される、十分な及び／又は必要な残基を、同定することができる。例えば、候補抗体の結合エピトープ中の種々の残基が、密接に関連しているが抗原的に異なるタンパク質（例えば、ニューロトロフィンタンパク質ファミリーの別のメンバー）からの配列で置換（交換）されている標的抗原の突然変異体を使用して、ドメインスワッピング実験を行うことができる。抗体と突然変異体標的タンパク質の結合を評価することによって、抗体結合に対する特定の抗原フラグメントの重要性を評価することができる。
又は、抗体が他の抗体と同じエピトープ（例えば、本明細書に記載されるＭＣ４５抗体）に結合するかどうかを決定するために、同じ抗原に結合することが知られている他の抗体を使用して競合アッセイを行うことができる。競合アッセイは、当業者に周知である。
例示的な適切な一般的抗体産生方法のさらなる態様
動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ又はウマ）においてモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体並びにそのフラグメントを作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。「抗体」という用語は、インタクト免疫グロブリン分子並びにそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）及びｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄ，ｅｔ． ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４）を含む。
本明細書で開示される組成物は、本開示を読めば当業者によって特定可能な追加の活性剤、担体、ビヒクル、賦形剤又は補助剤と共に医薬組成物中に含まれ得る。
医薬組成物は、好ましくは、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む。このような医薬組成物中で、本明細書で開示される組成物は、「活性化合物」（「活性剤」とも呼ばれる）を形成する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。補助活性化合物も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、その意図した投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば局所）、経粘膜及び直腸投与が含まれる。非経口、皮内又は皮下施用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び張性調節剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は複数回投与バイアルに封入することができる。
少なくとも１つの抗ＳＳＥＡ−４抗体又は抗ＳＳＥＡ−４抗体をコードする配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物が、提供される。一定の実施形態では、組成物は、医薬組成物であり得る。本明細書で使用される場合、組成物は、１つ以上のＳＳＥＡ−４に結合する１つ以上の抗体、及び／又は１つ以上のＳＳＥＡ−４に結合する１つ以上の抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野で周知の緩衝液を含む薬学的に許容される賦形剤などの適切な担体をさらに含み得る。
一実施形態では、抗ＳＳＥＡ−４抗体がモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ＳＳＥＡ−４抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント）が提供される。これらの抗体フラグメントを、酵素消化などの伝統的な手段によって作製することができる、又は組換え技術によって生成することができる。このような抗体フラグメントは、キメラ、ヒト化又はヒトであり得る。これらのフラグメントは、以下に示される診断及び治療目的に有用である。
目的の抗体を得ることができるファージディスプレイライブラリーを生成するための種々の方法が当技術分野で公知である。目的の抗体を生成する１つの方法は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載されるファージ抗体ライブラリーの使用を通すものである。
本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、所望の活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングすることによって作製することができる。原則として、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の種々の断片を提示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによってパニングする。所望の抗原に結合することができるＦｖフラグメントを発現するクローンを抗原に吸着させ、よってライブラリー中の非結合クローンから分離する。次いで、結合クローンを抗原から溶出し、抗原吸着／溶出のさらなるサイクルによってさらに濃縮することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体のいずれも、目的のファージクローンを選択するための適切な抗原スクリーニング手順を設計し、引き続いて、目的のファージクローンからのＦｖ配列及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載される適切な定常領域（Ｆｃ）配列を使用して完全長抗ＳＳＥＡ−４抗体クローンを構築することによって得ることができる。
抗体の抗原結合ドメインは、共に３つの超可変ループ又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を提供するそれぞれ軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）からの約１１０個のアミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域から形成される。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、ＶＨ及びＶＬが短い可撓性ペプチドを介して共有結合している単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして、又はそれらがそれぞれ定常ドメインと融合し、非共有結合的に相互作用するＦａｂフラグメントとして、ファージ上に機能的に提示され得る。本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖをコードするファージクローン及びＦａｂをコードするファージクローンを、集合的に「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーでランダムに組換え、次いで、これをＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように抗原結合クローンについて検索することができる。免疫化された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。又は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるように、ナイーブレパートリーをクローニングして、免疫化を全く伴わずに広範囲の非自己及び自己抗原に対するヒト抗体の単一供給源を提供することができる。最終的に、ナイーブライブラリーを、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）によって記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、高度可変性ＣＤＲ３領域をコードするランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用してインビトロで再配列を達成することによって合成的に作成することもできる。
繊維状ファージを使用して、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって抗体フラグメントを提示する。抗体フラグメントは、例えばＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）によって記載されるように、ＶＨ及びＶＬドメインが可撓性ポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上に結合している単鎖Ｆｖフラグメント、又は例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）に記載されるように、一方の鎖がｐＩＩＩと融合しており、他方が細菌宿主細胞周辺質に分泌され、そこでＦａｂコートタンパク質構造が組み立てられ、それが野生型コートタンパク質のいくつかを置換することによってファージ表面上に提示される、Ｆａｂフラグメントとして提示され得る。
一般に、抗体遺伝子フラグメントをコードする核酸は、ヒト又は動物から採取した免疫細胞から得られる。抗ＳＳＥＡ−４クローンのためにバイアスされたライブラリーが所望される場合、対象をＳＳＥＡ−４で免疫化して抗体応答を生じさせ、脾臓細胞及び／又は循環Ｂ細胞又は他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をライブラリー構築のために回収する。一実施形態では、抗ヒトＳＳＥＡ−４クローンのためにバイアスされたヒト抗体遺伝子フラグメントライブラリーが、ＳＳＥＡ−４免疫化がＳＳＥＡ−４に対するヒト抗体を産生するＢ細胞を生じるように、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する（及び機能的内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスにおいて抗ヒトＳＳＥＡ−４抗体応答を産生することによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製を以下に記載する。
例えばＳＳＥＡ−４アフィニティークロマトグラフィーによる細胞分離又は蛍光色素標識／ＳＳＥＡ−４への細胞の吸着、引き続く蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって、適切なスクリーニング手順を使用して、ＳＳＥＡ−４特異抗体を発現するＢ細胞を単離することによって、抗ＳＳＥＡ−４反応性細胞集団のさらなる濃縮を得ることができる。
又は、免疫化されていないドナーからの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの使用は、可能性のある抗体レパートリーのより良い表示を提供し、ＳＳＥＡ−４が抗原性でない任意の動物（ヒト又は非ヒト）種を使用した抗体ライブラリーの構築も可能にする。インビトロ抗体遺伝子構築物を組み込んだライブラリーについては、幹細胞を対象から採取して、再配列されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。目的の免疫細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ目（ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ及び鳥類の種などの種々の動物種から得ることができる。
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を目的の細胞から回収し、増幅する。再配列されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡをリンパ球から単離し、引き続いてＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：３８３３−３８３７（１９８９）に記載されるように再配列されたＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端に一致するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、それによって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することによって、所望のＤＮＡを得ることができる。Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）及びＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）に記載されるように、成熟Ｖドメインをコードするエキソンの５’末端においてバックプライマーを用いそしてＪセグメント内に基づきフォワードプライマーを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡからＶ遺伝子を増幅することができる。しかしながら、ｃＤＮＡから増幅するために、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：８８−８９（１９９１）に記載されるように、バックプライマーはまたリーダーエキソンに基づくことができ、フォワードプライマーは、Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：５７２８−５７３２（１９８９）に記載されるように定常領域内とすることができる。相補性を最大化するために、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）又はＳａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に記載されるように、縮重をプライマーに組み込むことができる。一定の実施形態では、例えばＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）の方法に記載されるように、又はＯｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：４４９１−４４９８（１９９３）の方法に記載されるように、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての利用可能なＶＨ及びＶＬ配列を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的とするＰＣＲプライマーを使用することによって、ライブラリー多様性が最大化される。増幅されたＤＮＡを発現ベクターにクローニングするために、希少制限部位を、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に記載されるように一方の末端にタグとして、又はＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるようにタグ付きプライマーを用いたさらなるＰＣＲ増幅によって、ＰＣＲプライマー内に導入することができる。
合成的に再配列されたＶ遺伝子のレパートリーを、Ｖ遺伝子セグメントからインビトロで誘導することができる。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大部分が、クローンニング及び配列決定されており（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６−７９８（１９９２）に報告されている）、マッピングされている（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，３：８８−９４ （１９９３）に報告されている；これらのクローニングセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの全ての主なコンフォメーションを含む）を使用して、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーを用いて多様なＶＨ遺伝子レパートリーを産生することができる。ＶＨレパートリーを、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）に記載されるように単一長の長いＨ３ループで注目された全ての配列多様性を用いて作製することもできる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定されており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１４５６−１４６１（１９９３）に報告されている）、これを使用して合成軽鎖レパートリーを作製することができる。ある範囲のＶＨ及びＶＬフォールド並びにＬ３及びＨ３長さに基づく合成Ｖ遺伝子レパートリーは、かなりの構造的多様性の抗体をコードするだろう。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡの増幅後、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントを、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）の方法に従ってインビトロで再配列することができる。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーをいくつかの方法で一緒に組み合わせることによって、抗体フラグメントのレパートリーを構築することができる。各レパートリーを異なるベクター中で作製することができ、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１２８：１１９−１２６（１９９３）に記載されるようにインビトロで、又はコンビナトリアル感染、例えばＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載されるｌｏｘＰシステムによってインビボで、ベクターを組み合わせることができる。インビボ組換え手法は、大腸菌形質転換効率によって課せられるライブラリーサイズへの制限を克服するためにＦａｂフラグメントの二本鎖性質を利用する。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリーを、一方がファージミド中及び他方がファージベクターに、別々にクローニングする。次いで、各細胞が異なる組み合わせを含有し、ライブラリーサイズが存在する細胞の数（約１０１２クローン）によってのみ制限されるように、２つのライブラリーをファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせる。両ベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一レプリコン上で組み換えられ、ファージビリオンに共パッケージングされる（ｃｏ−ｐａｃｋａｇｅｄ）ように、インビボ組換えシグナルを含有する。これらの巨大なライブラリーは、優れた親和性の多数の多様な抗体を提供する。
又は、レパートリーを、例えばＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように、同じベクターに順次クローニングする、又は例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるように、ＰＣＲによって一緒に組み立てて、次いで、クローニングすることができる。ＰＣＲアセンブリを使用して、ＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを、可撓性ペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと連結して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成することもできる。さらに別の技術では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：３８３１−３８３７（１９９２）に記載されるように、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」を使用して、ＰＣＲによってリンパ球内でＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせ、次いで、連結遺伝子のレパートリーをクローニングする。
ライブラリーのスクリーニングは、任意の当技術分野で公知の技術によって達成することができる。例えば、ＳＳＥＡ−４標的を使用して、吸着プレートのウェルをコーティングし、吸着プレートに固定された宿主細胞上で発現させる、又は細胞選別に使用する、又はストレプトアビジンでコーティングされたビーズによる捕捉のためにビオチンに結合する、又はファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の公知の方法に使用することができる。
ファージライブラリー試料を、ファージ粒子の少なくとも一部と吸着剤の結合に適した条件下で、固定化ＳＳＥＡ−４と接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件を、生理学的条件を模倣するように選択する。固相に結合したファージを洗浄し、次いで、例えばＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように酸によって、又は例えばＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されるようにアルカリによって、又は例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）の抗原競合方法と同様の手順で、ＳＳＥＡ−４３／抗原競合によって、溶出する。ファージを、１ラウンドの選択で２０〜１０００倍濃縮することができる。さらに、濃縮ファージを、細菌培養で成長させることができ、さらなるラウンドの選択に供することができる。
選択の効率は、洗浄中の解離の速度論、及び単一ファージ上の複数の抗体フラグメントが抗原と同時に関与し得るかどうかを含む多くの因子に依存する。短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相での抗原の高いコーティング密度の使用によって、速い解離速度論（及び弱い結合親和性）を有する抗体を保持することができる。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合を好む。遅い解離速度論（及び優れた結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）及びＷＯ９２／０９６９０に記載されるような長い洗浄及び一価ファージディスプレイ、並びにＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるような抗原の低いコーティング密度の使用によって、促進することができる。
ＳＳＥＡ−４に関して、わずかに異なる親和性であっても、異なる親和性のファージ抗体間で選択することが可能である。しかしながら、（例えば、上記の親和性成熟技術のいくつかにおいて行われるような）選択された抗体のランダム突然変異が、多くの突然変異体をもたらす可能性が高く、ほとんどが抗原に結合し、高い親和性を有するものが少ない。ＳＳＥＡ−４を制限することにより、まれな高親和性ファージが競合する可能性がある。全ての高親和性突然変異体を保持するために、ファージを過剰のビオチン化ＳＳＥＡ−４とインキュベートすることができるが、ＳＳＥＡ−４の標的モル親和定数より低いモル濃度のビオチン化ＳＳＥＡ−４とインキュベートすることができる。次いで、高親和性結合ファージを、ストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズによって捕捉することができる。このような「平衡捕捉」は、低い親和性の過剰なファージからわずか２倍高い親和性の突然変異体クローンの単離を可能にする感度で、それらの結合親和性に従って抗体を選択することを可能にする。固相に結合したファージを洗浄するのに使用される条件を、解離速度論に基づいて識別するように操作することもできる。
抗ＳＳＥＡ−４クローンを選択することができる。一実施形態では、本発明は、ＳＳＥＡ−４リガンドとＳＳＥＡ−４との間の結合を遮断するが、ＳＳＥＡ−４リガンドと第２のタンパク質との間の結合を遮断しない抗ＳＳＥＡ−４抗体を提供する。このような抗ＳＳＥＡ−４抗体に対応するＦｖクローンを、（１）上記のＢ（Ｉ）（２）節に記載されるようにファージライブラリーから抗ＳＳＥＡ−４クローンを単離し、任意に適切な細菌宿主中で集団を成長させることにより、ファージクローンの単離集団を増幅するステップ；（２）それぞれ、ブロッキング活性及び非ブロッキング活性が望まれるＳＳＥＡ−４及び第２のタンパク質を選択するステップ；（３）抗ＳＳＥＡ−４ファージクローンを固定化ＳＳＥＡ−４に吸着させるステップ；（４）過剰の第２のタンパク質を使用して、第２のタンパク質の結合決定基と重複又は共有するＳＳＥＡ−４結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出するステップ；及び（５）ステップ（４）の後に吸着されたままであるクローンを溶出するステップによって、選択することができる。任意に、所望のブロッキング／非ブロッキング特性を有するクローンを、本明細書に記載される選択手順を１回以上繰り返すことによってさらに濃縮することができる。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡを、慣用的な手順（例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡ鋳型から目的の重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）を使用して容易に単離及び配列決定する。いったん単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に配置し、次いで、発現ベクターを、免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞における所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説には、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ，１３０：１５１（１９９２）が含まれる。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡを、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列はＫａｂａｔら、（前出）から得ることができる）と組み合わせて、完全長又は部分長重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用することができること、及びこのような定常領域を任意のヒト又は動物種から得ることができることが認識される。Ｆｖクローンをある動物（ヒトなど）種の可変ドメインＤＮＡから誘導し、次いで、別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合して「ハイブリッド」のためのコード配列（複数可）を形成する（完全長重鎖及び／又は軽鎖は本明細書で使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる）。一実施形態では、ヒト可変ＤＮＡに由来するＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、全てのヒト、完全長又は部分長重鎖及び／又は軽鎖をコードする配列（複数可）を形成する。
ナイーブライブラリー（天然又は合成のいずれか）によって産生された抗体は中程度の親和性であり得るが、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４）、上記に記載されるように、二次ライブラリーから構築及び再選択することによって親和性成熟をインビトロで模倣することもできる。いくつかの態様では、抗体が、天然抗体配列を除外し得る。いくつかの態様では、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）の方法又はＧｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）の方法で、エラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９）に報告されている）を使用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。さらに、例えば選択された個々のＦｖクローンにおいて目的のＣＤＲに及ぶランダム配列を有するプライマーを用いるＰＣＲを使用して、１つ以上のＣＤＲをランダムに突然変異し、高親和性クローンをスクリーニングすることによって、親和性成熟を行うことができる。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域で突然変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを作製する方法を記載した。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるように、ファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを、免疫化されていないドナーから得られた天然Ｖドメイン変異体のレパートリーと再結合し、数ラウンドの鎖リシャッフリングで高親和性についてスクリーニングするものである。この技術は、１０−９Ｍの範囲の親和性を有する抗体及び抗体フラグメントの産生を可能にする。
抗ＳＳＥＡ−４抗体を生成する他の方法
抗体の親和性を生成及び評価する他の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７；Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）；Ｅｎｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２８：７１６−７３４（１９８９）；Ａｂｒａｈｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，４：３９０１（１９８５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４（１９７６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載されている。
一般的な方法
一般に、本発明は親和性成熟ＳＳＥＡ−４抗体を提供する。これらの抗体は、ＳＳＥＡ−４に対する親和性及び特異性が増加している。この親和性及び感受性の増加によって、本発明の分子を、（ａ）本発明の分子の増加した感度及び／又は（ｂ）本発明の分子によるＳＳＥＡ−４の強固な結合によって利益を受ける用途及び方法に使用することが可能になる。
一実施形態では、１つ以上のＳＳＥＡ−４活性の部分的又は完全な遮断が望まれるＳＳＥＡ−４媒介障害の治療に有用なＳＳＥＡ−４抗体である。一実施形態では、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体を使用してがんを治療する。
本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、質量分析又は遺伝子操作を必要とせずに、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ又は免疫顕微鏡などの直接的及び慣用的な生体分子アッセイにおけるエピトープの高感度でありかつ特異的な検出を可能にする。同様に、これは、これらの経路の正常な機能の観察と解明の両方、及び経路が異常に機能している場合の検出において、有意な利点を提供する。
本発明のＳＳＥＡ−４抗体を使用して、疾患の発達及び病因における役割を決定することもできる。例えば、上記のように、本発明のＳＳＥＡ−４抗体を使用して、１つ以上の疾患状態と相関し得るＴＡＣＡが正常に一時的に発現しているかどうかを決定することができる。
本発明のＳＳＥＡ−４抗体をさらに使用して、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体が特異的ではないＳＳＥＡ−４の正常な活性を妨害することなく、１つ以上のＳＳＥＡ−４が異常に調節されている又は異常に機能している疾患を治療することができる。
別の態様では、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体が、種々の細胞型及び組織におけるがん状態の検出のための試薬としての有用性を見出している。
さらに別の態様では、本抗ＳＳＥＡ−４抗体が、本発明の本抗体と類似の遮断活性パターンを有するＳＳＥＡ−４アンタゴニストの開発に有用である。例えば、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体を使用して、同じＳＳＥＡ−４結合特徴及び／又はＳＳＥＡ−４経路を遮断する能力を有する他の抗体を決定及び同定することができる。
さらなる例として、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体を使用して、直鎖状及び立体配座エピトープを含む、本明細書に例示される抗体と実質的に同じＳＳＥＡ−４の抗原決定基に結合する他の抗ＳＳＥＡ−４抗体を同定することができる。
本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体を、ＳＳＥＡ−４が、１つ以上の結合対とＳＳＥＡ−４との結合の遮断において抗体と類似の薬学的効果を示すＳＳＥＡ−４の小分子アンタゴニストをスクリーニングするのに関与する生理学的経路に基づくアッセイに使用することができる。
抗体の生成は、ハイブリドーマ技術及びバインダー分子のファージディスプレイライブラリーのスクリーニングなどの、本明細書に記載される技術を含む当技術分野の慣用的な技術を使用して達成することができる。これらの方法は、当技術分野で十分に確立されている。
簡潔には、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、所望の活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングすることによって作製することができる。原則として、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の種々の断片を提示するファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによってパニングする。所望の抗原に結合することができるＦｖフラグメントを発現するクローンを抗原に吸着させ、よってライブラリー中の非結合クローンから分離する。次いで、結合クローンを抗原から溶出し、抗原吸着／溶出のさらなるサイクルによってさらに濃縮することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体のいずれも、目的のファージクローンを選択するための適切な抗原スクリーニング手順を設計し、引き続いて、目的のファージクローンからのＦｖ配列及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載される適切な定常領域（Ｆｃ）配列を使用して完全長抗ＳＳＥＡ−４抗体クローンを構築することによって得ることができる。
一実施形態では、本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体がモノクローナル抗体である。本明細書で提供される抗ＳＳＥＡ−４抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント並びにこれらの変異体などの抗体フラグメントも、本発明の範囲内に包含される。これらの抗体フラグメントを、酵素消化などの伝統的な手段によって作製することができる、又は組換え技術によって生成することができる。このような抗体フラグメントは、キメラ、ヒト又はヒト化であり得る。これらのフラグメントは、本明細書に示される実験、診断及び治療目的に有用である。
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得ることができる。すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る可能性のある天然の突然変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語句は、抗体の特徴が個別の抗体の混合物ではないことを示す。
本発明の抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を含む、当技術分野で公知の種々の方法を使用して作製することができる、又はこれらを組換えＤＮＡ法によって作製することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７）。
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗体の組換え産生のために、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、慣用的な手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、部分的には使用される宿主細胞に依存する。宿主細胞には、それだけに限らないが、原核生物又は真核生物（一般に哺乳動物）起源の細胞が含まれる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用することができること、及びこのような定常領域を任意のヒト又は動物種から得ることができることが認識される。
原核宿主細胞を使用した抗体産生
ベクター構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列を、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離し、配列決定することができる。又は、ヌクレオチド合成装置又はＰＣＲ技術を使用して、ポリヌクレオチドを合成することができる。いったん得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、原核宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入する。利用可能でありかつ当技術分野で公知である多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅若しくは発現又はその両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、種々の成分を含有する。ベクター成分には、一般的に、それだけに限らないが、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート及び転写終結配列が含まれる。
一般に、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターを、これらの宿主に関連して使用する。ベクターは、通常、複製部位並びに形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を有する。例えば、大腸菌を、典型的には、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージはまた、内因性タンパク質の発現のために微生物生物によって使用され得るプロモーター含有し得るよう、又は含有するよう改変され得る。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、ＣａｒｔｅｒらのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６４８，２３７に記載される。
さらに、宿主微生物と適合性のレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主に関連する形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ（商標）−１１などのバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用することができる組換えベクターの作製に利用することができる。
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含んでもよい。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核プロモーターは、典型的には誘導性と構成型の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば栄養素の有無又は温度変化に応答してその制御下でシストロンの転写レベルの上昇を開始するプロモーターである。
種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが、周知である。選択されたプロモーターを、制限酵素消化を介して供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターとの両方を使用して、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を指示することができる。一定の実施形態では、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現される標的遺伝子の多い転写及び高い収量が可能になるので、異種プロモーターが利用される。
原核宿主での使用に適したプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーターが含まれる、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して高収量の標的遺伝子を発現する。細菌における制限酵素を介して源ＤＮＡからプロモーターを除去することによって（他の公知の細菌又はファージプロモーターなど）も同様に適している。それらのヌクレオチド配列は公開されているので、必要な制限部位を供給するためのリンカー又はアダプターを使用して、当業者が標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作動可能に連結することが可能である（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９）。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンが、膜を横切る発現ポリペプチドの転位を指示する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってもよく、又はベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに固有のシグナル配列を認識も処理もしない原核宿主細胞については、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ又は耐熱性毒素ＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核シグナル配列によって置換する。本発明の一実施形態では、発現系の両シストロンに使用されるシグナル配列が、ＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
本発明による免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質中で起こり得るので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点で、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が発現され、折り畳まれ、組み立てられて、細胞質内に機能性免疫グロブリンを形成する。一定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ−株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、それによって、発現されたタンパク質サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てを可能にする。Ｐｒｏｂａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
本発明の抗体はまた、分泌され、適切に組み立てられた本発明の抗体の収量を最大化するために、発現されたポリペプチド成分の量比を調節することができる発現系を使用することによって、産生することもできる。このような調節は、少なくとも部分的に、ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって達成される。
翻訳強度を調節するための１つの技術は、ＳｉｍｍｏｎｓらのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４０，５２３に開示されている。それは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。所与のＴＩＲについて、一連のアミノ酸又は核酸配列変異体を一定範囲の翻訳強度で作製し、それによって特定の鎖の所望の発現レベルに対してこの因子を調節する便利な手段を提供することができる。ＴＩＲ変異体は、アミノ酸配列を変更し得るコドン変化をもたらす慣用的な突然変異誘発技術によって生成することができる。一定の実施形態では、ヌクレオチド配列の変化がサイレントである。ＴＩＲにおける変更には、例えば、シグナル配列の変更と一緒に、シャイン・ダルガーノ配列の数又は間隔の変更が含まれ得る。突然変異シグナル配列を生成するための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の初めに「コドンバンク」を生成することである。これは、各コドンの第３のヌクレオチド位置を変えることによって達成することができる；さらに、ロイシン、セリン及びアルギニンなどのいくつかのアミノ酸は、バンクを作る際に複雑さを増し得る複数の第１及び第２の位置を有する。この突然変異誘発の方法は、Ｙａｎｓｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１−１５８に記載されている。
一実施形態では、その中の各シストロンについて一定範囲のＴＩＲ強度を有するベクターのセットが生成される。この限定されたセットは、種々のＴＩＲ強度の組み合わせの下で、各鎖の発現レベルと所望の抗体産物の収量の比較を提供する。ＴＩＲ強度は、ＳｉｍｍｏｎｓらのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４０，５２３に詳細に記載されているように、レポーター遺伝子の発現レベルを定量化することによって決定することができる。翻訳強度比較に基づいて、所望の個々のＴＩＲを選択して本発明の発現ベクター構築物に組み込む。
本発明の抗体を発現するのに適した原核宿主細胞には、古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）及び真正細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例としては、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）（例えば、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、腸内細菌、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（例えば、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、根粒菌属（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）、ビトレオシラ属（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）又はパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例としては、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７）ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ受託番号２７３２５）及びその誘導体（遺伝子型Ｗ３１１０ｈｍａｎｎを有する株３３Ｄ３、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ受託Ｎ大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌大腸菌ＣＣ３１４４６）ｅｎｏｄ大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１６０８）を含む）も適している。これらの例は、限定的ではなく例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上記の細菌のいずれかの誘導体を構築する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。細菌の細胞におけるレプリコンの複製能を考慮して、適切な細菌を選択することが一般に必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、大腸菌、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）又はサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を宿主として好適に使用することができる。典型的には、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、望ましくは追加のプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物に組み込んでもよい。
抗体産生
宿主細胞を、上記の発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された慣用的な栄養培地で培養する。
形質転換は、ＤＮＡが染色体外要素として又は染色体組み込み体によって複製可能となるように、原核宿主にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、このような細胞に適切な標準的技術を使用して形質転換を行う。塩化カルシウムを使用するカルシウム処理が、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞に一般的に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。使用されるさらに別の技術は電気穿孔である。
本発明のポリペプチドを産生するために使用される原核細胞は、当技術分野で公知の培地で増殖され、選択された宿主細胞の培養に適している。適切な培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）＋必要な栄養補助剤が挙げられる。一定の実施形態では、培地が、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づいて選択された選択剤も含有する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のために培地にアンピシリンを添加する。
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に必要な栄養補助剤を、単独で又は複合窒素源などの別の栄養補助剤若しくは培地との混合物として導入される適切な濃度で含めてもよい。任意選択的に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸塩、ジチオエリスリトール及びジチオスレイトールからなる群から選択される１種以上の還元剤を含有し得る。
原核宿主細胞を、適切な温度で培養する。大腸菌増殖については、例えば、それだけに限らないが、約２０℃〜約３９℃、約２５℃〜約３７℃を含む温度範囲及び約３０℃で増殖が起こる。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９に及ぶ任意のｐＨとなり得る。大腸菌の場合、ｐＨは約６．８〜約７．４又は約７．０となり得る。
誘導性プロモーターを本発明の発現ベクターに使用する場合、タンパク質発現がプロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写を制御するためにＰｈｏＡプロモーターを使用する。したがって、形質転換された宿主細胞を、誘導のためにリン酸制限培地で培養する。一実施形態では、リン酸制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照されたい）。当技術分野で公知のように、使用されるベクター構築物に従って、種々の他の誘導物質を使用することができる。
一実施形態では、本発明の発現されたポリペプチドが宿主細胞の周辺質に分泌され、そこから回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に、浸透圧ショック、超音波処理又は溶解などの手段によって、微生物を破壊することを含む。いったん細胞が破壊されると、細胞片又は細胞全体を、遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質を、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。又は、タンパク質を培養培地中に輸送し、そこで単離することができる。細胞を培養物から除去し、培養上清を濾過し、さらに精製するために濃縮する。発現したポリペプチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイなどの一般的に知られている方法を使用してさらに単離及び同定することができる。
本発明の一態様では、抗体産生を、発酵工程によって大量に行う。組換えタンパク質を産生するために、種々の大規模流加発酵手順が利用可能である。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、例えば約１０００〜１０００００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素及び栄養素、特にグルコース（一般的な炭素／エネルギー源）を分配するために攪拌機インペラーを使用する。小規模発酵とは、一般的に、容積が約１００リットル以下であり、約１リットル〜約１００リットルに及び得る発酵槽での発酵を指す。
発酵工程では、タンパク質発現の誘導を、典型的には、細胞が適切な条件下で、細胞が初期の静止期（例えば、約１８０〜２２０のＯＤ５５０）にある所望の密度まで増殖した後に、開始する。当技術分野で公知であり、上記のように、使用されるベクター構築物に従って、種々の誘導物質を使用することができる。誘導前に細胞を短期間増殖させることができる。細胞を通常、約１２〜５０時間誘導するが、より長い又はより短い誘導時間を使用してもよい。
本発明のポリペプチドの産生収量及び品質を改善するために、種々の発酵条件を改変することができる。例えば、分泌された抗体ポリペプチドの適切な組み立て及び折り畳みを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシス，トランス−イソメラーゼ）などのシャペロンタンパク質を過剰発現するさらなるベクターを使用して、宿主原核細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞中で産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び可溶性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７４：１９６０１−１９６０５；ＧｅｏｒｇｉｏｕらのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０８３，７１５；ＧｅｏｒｇｉｏｕらのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０２７，８８８；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性であるもの）のタンパク質分解を最小化するために、タンパク質分解酵素を欠く一定の宿主株を本発明のために使用することができる。例えば、宿主細胞株を、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びそれらの組み合わせなどの公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子において遺伝子突然変異（複数可）をもたらすよう改変することができる。いくつかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が入手可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、上記；ＧｅｏｒｇｉｏｕらのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２６４，３６５；ＧｅｏｒｇｉｏｕらのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５０８，１９２；Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
一実施形態では、タンパク質分解酵素が欠損し、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株が、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。
抗体精製
一実施形態では、本明細書で産生された抗体タンパク質をさらに精製して、さらなるアッセイ及び使用のために実質的に均質な調製物を得る。当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製法を、使用することができる。以下の手順は、適切な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いたゲル濾過。
一態様では、固相に固定化されたプロテインＡを、本発明の抗体産物の免疫親和性精製のために使用する。プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に高親和性で結合する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の４１ｋＤ細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。プロテインＡが固定化される固相は、ガラス若しくはシリカ表面を含むカラム、又は制御された細孔ガラスカラム又はケイ酸カラムであり得る。いくつかの用途では、グリセリンなどの試薬でカラムをコーティングして、汚染物質の非特異的付着を可能な限り防止する。
精製の第１のステップとして、上記のような細胞培養に由来する調製物をプロテインＡ固定化固相に適用して、目的の抗体のプロテインＡへの特異的結合を可能にすることができる。次いで、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合した汚染物質を除去する。最後に、目的の抗体を溶出によって固相から回収する。
真核宿主細胞を使用した抗体産生
ベクター成分は、一般的に、それだけに限らないが、以下の１つ以上を含む：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列。
（ｉ）シグナル配列成分
真核宿主細胞で使用するためのベクターはまた、目的の成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドを含有することもできる。選択される異種シグナル配列は、一般的に、宿主細胞によって認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレームで抗体をコードするＤＮＡに連結する。
（ｉｉ）複製起点
一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない。例えば、ＳＶ４０起点は、典型的には、単にそれが初期プロモーターを含有するために使用され得る。
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）関連する場合に、栄養要求性欠損を補完する、又は（ｃ）複合培地から利用可能でない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を阻止するために薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、よって選択レジメンを生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ（例えば、霊長類メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等などの抗体核酸を吸収する能力のある細胞の同定を可能にするものである。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で形質転換体の全てを培養することによって、最初に同定することができる。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適切な宿主細胞には、例えば、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）が含まれる。
又は、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質及び別の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８などの選択マーカーのための選択剤を含有する培地中での細胞増殖によって選択することができる。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９６５，１９９を参照されたい。
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。プロモーター配列は真核生物について知られている。事実上全ての真核遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）である。ほとんどの真核遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列の全てを、真核発現ベクターに適切に挿入する。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチド転写は、プロモーターが宿主細胞系と適合性である限り、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーターから、又は熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御することができる。
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして好都合に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させるためのシステムは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４１９，４４６に開示されている。このシステムの変形は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６０１，９７８に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。又は、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復をプロモーターとして使用することができる。
（ｖ）エンハンサー要素成分
高等真核生物による本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、通常、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させることができる。現在、多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）から知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のためのエレメントの増強については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列に対して５’又は３’位でベクターにスプライシングされ得るが、一般的にプロモーターから５’の部位に位置する。
（ｖｉ）転写終結成分
真核宿主細胞で使用される発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。このような配列は、一般に、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び時には３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書のベクター中のＤＮＡをクローニング又は発現するのに適した宿主細胞には、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載される高等真核細胞が含まれる。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の伝播は、慣用的手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３又は懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
宿主細胞を、抗体産生用の上記の発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された慣用的な栄養培地で培養する。
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５；若しくは５，１２２，４６９；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；又はＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｒｅ．３０，９８５に記載される培地のいずれかを宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源を補足することができる。任意の他の必要な栄養補助剤も、当業者に知られている適切な濃度で含めてよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内で産生され得る、又は培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、宿主細胞又は溶解フラグメントのいずれかの粒子状片を、一般的に、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去する。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清を、一般的に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を、前記ステップのいずれかに含めて、タンパク質分解を阻害することができ、抗生物質を含めて、外来性汚染物質の増殖を防止することができる。
細胞から調製された抗体組成物を、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは、一般的に許容される精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡなどのアフィニティー試薬の適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧが、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成することができるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も、回収する抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製ステップ（複数可）の後、目的の抗体及び汚染物質を含む混合物を、必要に応じて、一般的に低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）で行われる、例えば約２．５〜４．５のｐＨでの溶離緩衝液を使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、さらなる精製ステップに供することができる。
一般に、研究、試験及び臨床用途で使用するための抗体を調製するための技術及び方法論は、当技術分野で十分に確立されている、上記と一致する及び／又は目的の特定の抗体について、当業者に適切とみなされる通りであることに留意すべきである。
活性アッセイ
本発明の抗体を、当技術分野で公知の種々のアッセイによって、それらの物理学的／化学的特性及び生物学的機能について特徴付けることができる。
本開示の抗体、又はその抗原結合フラグメント、変異体若しくは誘導体を、抗原に対するそれらの結合親和性に関して記載又は特定することもできる。炭水化物抗原に対する抗体の親和性を、任意の適切な方法（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ− Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及び本明細書に記載される方法）を用いて実験的に決定することができる。特定の抗体−炭水化物抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定すると、変化し得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋａ）の測定は、好ましくは、抗体及び抗原並びに標準化された緩衝液の標準化溶液を用いて行う。
本抗体又はその抗原結合部分は、インビトロ及びインビボの治療的、予防的及び／又は診断的有用性を有する。例えば、これらの抗体を、培養中の細胞に、例えばインビトロ若しくはエキソビボで、又は対象に、例えばインビボで投与して、がんを治療、抑制、再発防止及び／又は診断することができる。
精製された抗体を、それだけに限らないが、Ｎ−末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによってさらに特徴付けることができる。
必要に応じて、抗体を生物学的活性について分析する。一定の実施形態では、本発明の抗体を、それらの抗原結合活性について試験する。当技術分野で公知であり、本明細書で使用され得る抗原結合アッセイには、限定されないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、ナノ粒子イムノアッセイ、アプタマーイムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用した、任意の直接的又は競合的結合アッセイが含まれる。
抗体フラグメント
本発明は、抗体フラグメントを包含する。一定の状況では、抗体全体ではなく抗体フラグメントを使用する利点がある。フラグメントのサイズが小さいほど、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセスが改善され得る。
抗体フラグメントを産生するための種々の技術が開発されている。伝統的に、これらのフラグメントは、インタクト抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））。しかしながら、これらのフラグメントは、現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体フラグメントは全て、大腸菌で発現され、大腸菌から分泌され得るので、大量のこれらのフラグメントの容易な産生を可能にしている。抗体フラグメントを、上で論じられる抗体ファージライブラリーから単離することができる。又は、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。別の手法によると、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８６９，０４６に記載されている。抗体フラグメントを産生するための他の技術は、当業者に明らかであろう。他の実施形態では、一般的に好まれる抗体が単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５７１，８９４；及び５，５８７，４５８を参照されたい。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けているインタクト結合部位を有する唯一の種である；したがって、それらはインビボでの使用中の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質を、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築することができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ． Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、（前出）を参照されたい。抗体フラグメントはまた、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６４１，８７０に記載される「直鎖抗体」であってもよい。このような直鎖抗体フラグメントは、単一特異性又は二重特異性であり得る。
ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する種々の方法は、当技術分野で公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）に従って、ヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列で置換することによって行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクト未満のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために重要となり得る。いわゆる「最良適合」法によると、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。そのため、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして受け入れられる（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に、同じ枠組みを使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３）。
抗体が抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが、一般的にさらに望ましい。この目的を達成するために、１つの方法によると、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び種々の概念的ヒト化産物の分析方法によって調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体配座構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これら表示の精査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性などの所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及びインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を与えることに直接的及び最も実質的に関与する。
ヒト抗体
本発明のヒト抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を、上記の公知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることによって構築することができる。又は、本発明のヒトモノクローナル抗ＳＳＥＡ−４抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生について、ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって記載されている。
免疫化により、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが現在可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイのこのような生殖系列突然変異体マウスへの移入は、抗原曝露時にヒト抗体の産生をもたらすだろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。
遺伝子シャッフリングを使用して、非ヒト、例えばげっ歯類抗体からヒト抗体を誘導することもでき、ここではヒト抗体が、開始非ヒト抗体と類似の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によると、上記のファージディスプレイ技術によって得られた非ヒト抗体フラグメントの重鎖又は軽鎖可変領域のいずれかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換して、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの集団を作製する。抗原による選択は、ヒト鎖が一次ファージディスプレイクローン中の対応する非ヒト鎖の除去で破壊された抗原結合部位を修復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂの単離をもたらす。すなわち、エピトープがヒト鎖パートナーの選択を支配（インプリント）する。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの方法を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ ＷＯ９３／０６２１３参照）。ＣＤＲ移植による非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲもＣＤＲ残基も有さない完全ヒト抗体を提供する。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。一定の実施形態では、二重特異性抗体がヒト又はヒト化抗体である。一定の実施形態では、結合特異性の一方が特異的リジン結合を含むＳＳＥＡ−４に対するものであり、他方が任意の他の抗原に対するものである。一定の実施形態では、二重特異性抗体が、２つの異なるリジン結合を有する２つの異なるＳＳＥＡ−４に結合し得る。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２本の重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の非選択組み合わせために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィーステップによって通常行われる正しい分子の精製はかなり面倒であり、産物収率は低い。同様の手順が、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）に開示されている。
異なる実施形態によると、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合は、例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。一定の実施形態では、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合の少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体及び所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物にコトランスフェクトする。これは、構築に使用される３本のポリペプチド鎖の不等比率が最適収量を提供する実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相互比率を調整する際に大きな柔軟性を提供する。しかしながら、等比率の少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合、又は比が特に重要でない場合、１つの発現ベクターに２本又は３本全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
一実施形態では、二重特異性抗体が、一方のアームの第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）とで構成される。二重特異性分子の半分のみの免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するので、この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが分かった。この手法はＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体産生のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
別の手法によると、抗体分子対の間の界面を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するように操作することができる。この界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１本以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換する。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に、大きな側鎖（複数可）と同一又は類似のサイズの代償的な「空洞」が作り出される。これが、ホモ二量体などの他の望ましくない最終生成物よりもヘテロ二量体の収量を増加させるための機構を提供する。
二重特異性抗体には、架橋又は「ヘテロコンジュゲート（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方をアビジンにカップリングし、他方をビオチンにカップリングすることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化すること（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６７６，９８０）、及びＨＩＶ感染症の治療について（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３及びＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は当技術分野で周知であり、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６７６，９８０に、いくつかの架橋技術と共に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生する技術も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体を、化学結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクト抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、産生されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンで還元することによってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
近年の進歩により、化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができる大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接回収が容易になった。Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントを大腸菌から別々に分泌させ、インビトロで指向性化学的カップリングに供して二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体及び正常ヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合すると同時に、ヒト***腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘因することができた。
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製及び単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法を、抗体ホモ二量体の産生に利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替の機構を提供している。フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つのフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対形成するよう強いられ、それによって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
三価以上の抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも速く内部移行（及び／又は異化）することができる。本発明の抗体は、３つ以上の抗原結合部位（例えば、４価抗体）を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外のもの）であってもよく、これは本発明のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に製造することができる。多価抗体は、二量体化ドメイン及び３つ以上の抗原結合部位を含むことができる。二量体化ドメインは、例えば、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又はからなる）。このシナリオでは、抗体がＦｃ領域及びＦｃ領域に対してアミノ末端である３つ以上の抗原結合部位を含む。一実施形態では、多価抗体が、例えば、３〜約８又は４つの抗原結合部位を含む（又はからなる）。多価抗体は少なくとも１本のポリペプチド鎖（例えば、２本のポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖（複数可）が２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃ（式中、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃの１本のポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である）を含み得る。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ−ＣＨ１−可撓性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書の多価抗体は、少なくとも２つ（例えば、４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含み得る。本明細書の多価抗体は、例えば、約２〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書で企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意に、ＣＬドメインをさらに含む。
抗体変異体
一定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列改変（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって又はペプチド合成によって調製される。このような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴を有する限り、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行って最終構築物に到達させることができる。アミノ酸変化は、配列が作製された時点で対象の抗体アミノ酸配列に導入することができる。
突然変異誘発の好ましい位置である抗体の一定の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって記載されるように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、標的残基の残基又は群を同定し（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置換して、アミノ酸と抗原の相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置を、置換部位に又は置換部位のためのさらなる又は他の変異体を導入することによって精査する。よって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されているが、突然変異そのものの性質を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で行い、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入には、１個の残基〜１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体又は細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えばＡＤＥＰＴの場合）又はポリペプチドに対する抗体のＮ−又はＣ−末端との融合が含まれる。
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基によって置換されている。置換突然変異誘発のための最大の関心のある部位には超可変領域が含まれるが、フレームワーク変化も考慮される。
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）例えばシート若しくはヘリックスコンフォメーションとしての、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対する効果、が有意に異なる置換を選択することによって、達成される。アミノ酸を側鎖の特性の類似性に従って、グループ分けすることができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｏ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
又は、天然残基を、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。このような置換残基を、保存的置換部位に、又は残りの（非保存的）部位に導入することができる。
１つの種類の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般的に、さらなる開発のために選択された得られた変異体（複数可）は、それらが産生される親抗体に対して改変された（例えば、改善された）生物学的特性を有するであろう。このような置換変異体を産生するための簡便な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を含む。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成する。このようにして産生された抗体を、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）の少なくとも一部との融合物として提示する。次いで、ファージディスプレイされた変異体を、本明細書に開示されるように、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補超可変領域部位を同定するために、スキャニング突然変異誘発（例えば、アラニンスキャニング）を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。又は若しくはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原との間の接触点を同定することが有益となり得る。このような接触残基及び隣接残基が、本明細書に詳述されたものを含む当技術分野で公知の技術による置換の候補である。いったんこのような変異体を産生したら、変異体のパネルを、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で公知の技術を使用したスクリーニングに供して、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、それだけに限らないが、天然供給源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）又は抗体の前もって調製された変異体若しくは非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（若しくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変異誘発による調製が含まれる。いくつかの態様では、核酸分子が天然配列を除外する。
本発明の抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸改変を導入し、それによってＦｃ領域改変体を産生することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む１つ以上のアミノ酸位置でのアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
免疫複合体
別の態様では、本発明は、化学療法剤、薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はそれらのフラグメント）又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害剤に結合した抗体を含む免疫複合体又は抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。
細胞傷害剤又は細胞増殖抑制剤、すなわちがんの治療において腫瘍細胞を死滅又は抑制するための薬物（Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９７５，２７８）を局所送達するための抗体−薬物複合体の使用によって、薬物部分の腫瘍への標的化送達及びその中での細胞内蓄積が可能になり、これらの非コンジュゲート薬剤の全身投与は、排除しようとする腫瘍細胞と同様に正常細胞への許容できないレベルの毒性をもたらし得る（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） Ｌａｎｃｅｔ ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，」ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ． Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６）。それによると、最小の毒性で最大の有効性が求められる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方が、これらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。これらの方法で使用される薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート及びビンデシンが含まれる（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）上記）。抗体−毒素複合体に使用される毒素には、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊｏｕｒ． ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、マイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３）及びカリチアマイシン（Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ（１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：３３３６−３３４２）などの小分子毒素が含まれる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって、それらの細胞傷害性及び細胞増殖抑制効果をもたらし得る。いくつかの細胞傷害性薬物は、大きな抗体又はタンパク質受容体リガンドに結合すると、不活性又は低活性となる傾向がある。
抗体誘導体
本発明の抗体を、当分野で公知であり、容易に利用可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変することができる。一実施形態では、抗体の誘導体化に適した部分が水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、それだけに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）、ポリビニルアルコール並びにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分枝状であっても非分枝状であってもよい。抗体に結合したポリマーの数は変化してもよく、２つ以上のポリマーが結合している場合、ポリマーは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、それだけに限らないが、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
別の実施形態では、放射線に曝露することによって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分がカーボンナノチューブである（Ｋａｍら ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長であってよく、それだけに限らないが、通常の細胞に害を及ぼさないが、抗体−非タンパク質性部分に近い細胞が死滅する温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含む。
医薬製剤
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では、医薬組成物が、本抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸と、薬学的に許容される担体とを含む。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合性である任意の及び全ての溶媒、分散媒、等張及び吸収遅延剤などが含まれる。一実施形態では、組成物が対象のがん細胞を抑制するのに有効である。
本医薬組成物の投与経路には、それだけに限らないが、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経口、局所、皮下、皮内、経皮、真皮下、非経口、直腸、脊髄又は表皮投与が含まれる。
本発明の医薬組成物を、液体溶液若しくは懸濁液のいずれかとしての注射剤として、又は注射前に液体ビヒクル中の溶液若しくは懸濁液に適した固体形態として調製することができる。医薬組成物を、リポソームビヒクル又は持続的送達のために使用される他の粒子状担体にカプセル化された固体形態、乳化又は有効成分で調製することもできる。例えば、医薬組成物は、医薬組成物の徐放を可能にする、油エマルジョン、油中水型エマルジョン、水中油中水型エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長滞留エマルジョン、粘着性エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、リポソーム、マイクロ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子及び種々の天然又は合成ポリマー、例えば非吸収性不透過性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニルコポリマー及びＨｙｔｒｅｌ（Ｒ）コポリマー、膨潤性ポリマー、例えばヒドロゲル、又は吸収性ポリマー、例えばコラーゲン及び一定のポリ酸又はポリエステル、例えば吸収性縫合を作製するために使用されるものの形態であり得る。
本抗体又はその抗原結合フラグメントを、哺乳動物対象に送達するための医薬組成物に製剤化する。医薬組成物は、単独で及び／又は薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤若しくは担体と混合して投与される。適切なビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど及びそれらの組み合わせである。さらに、ビヒクルは、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤又はアジュバントなどの補助物質を含有することができる。薬学的に許容される担体は、本発明の医薬組成物の吸収速度又はクリアランス速度を、例えば、安定化する、又は増加若しくは減少させるように作用する生理学的に許容される化合物を含有することができる。生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、スクロース若しくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、界面活性剤、リポソーム担体、又は賦形剤又は他の安定剤及び／又は緩衝剤が含まれ得る。生理学的に許容される他の化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤又は保存剤が含まれる。例えば、ｔｈｅ ２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）を参照されたい。本発明の医薬組成物はまた、薬理学的作用物質、サイトカイン又は他の生物応答修飾物質などの補助物質を含むことができる。
さらに、医薬組成物を、中性又は塩形態の医薬組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（活性ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）が含まれ、これは例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基から形成される塩を、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知である又は明らかとなるだろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい。
医薬組成物を、対象の年齢、体重及び状態、使用される特定の組成物、並びに投与経路、組成物を予防的又は治癒的目的に使用するかどうかに適したスケジュール及び期間にわたって、単回投与治療又は複数回投与治療で投与することができる。例えば、一実施形態では、本発明による医薬組成物を、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、隔週（ｑｏｗ）、１週間に１回（ｑｗ）、１週間に２回（ｂｉｗ）、１週間に３回（ｔｉｗ）、１週間週に４回、１週間に５回、１週間に６回、１日おきに（ｑｏｄ）、１日１回（ｑｄ）、１日に２回（ｑｉｄ）又は１日に３回（ｔｉｄ）投与する。
本発明による抗体の投与期間、すなわち医薬組成物を投与する期間は、種々の因子、例えば対象の応答等のいずれかに応じて変化し得る。例えば、医薬組成物を、約１秒以上〜１時間以上、１日〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１ヶ月間〜約２ヶ月間、約２ヶ月間〜約４ヶ月間、約４ヶ月間〜約６ヶ月間、約６ヶ月間〜約８ヶ月間、約８ヶ月間〜約１年間、約１年間〜約２年間若しくは約２年間〜約４年間、又はそれ以上に及ぶ期間にわたって投与することができる。
投与の容易さ及び投与量の均一性のために、投薬単位形態の経口又は非経口医薬組成物を使用することができる。本明細書で使用される投与単位形態とは、治療される対象の単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトで使用するための投与量の範囲を公式化する際に使用することができる。一実施形態では、このような化合物の投与量が、毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。別の実施形態では、治療上有効用量を最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半数阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、用量を動物モデルで製剤化することができる。Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２５：３５−４５，２００３。Ｎｉｋｕｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４（１２）：１２３−５３，２０００。
本発明の抗体又は抗原結合部分の治療上又は予防上有効量についての代表的な非限定的な範囲は、約０．００１〜約６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜約９ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約２ｍｇ／ｋｇ体重、約３〜約８ｍｇ／ｋｇ体重、約４〜約７ｍｇ／ｋｇ体重、約５〜約６ｍｇ／ｋｇ体重、約８〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重、約８．３〜約１２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約４〜約６ｍｇ／ｋｇ約４．２〜約６．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１．６〜約２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜約３ｍｇ／ｋｇ体重又は約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
医薬組成物を、有効量の本抗体又はその抗原結合部分を含有するように製剤化し、その量は、治療される動物及び治療される状態に依存する。一実施形態では、本抗体又はその抗原結合部分を、約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、約０．１ｍｇ〜約９ｇ、約１ｍｇ〜約８ｇ、約２ｍｇ〜約７ｇ、約３ｍｇ〜約６ｇ、約１０ｍｇ〜約５ｇ、約２０ｍｇ〜約１ｇ、約５０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．０１μｇ〜約１０ｇ、約０．０５μｇ〜約１．５ｍｇ、約１０μｇ〜約１ｍｇのタンパク質、約３０μｇ〜約５００μｇ、約４０μｇ〜約３００μｇ、約０．１μｇ〜約２００μｇ、約０．１μｇ〜約５μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇに及ぶ用量で投与する。任意の特定の対象の具体的な用量レベルは、特定のペプチドの活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路及び***速度、薬物の組み合わせ及び治療を受けている特定の疾患の重症度に依存し、過度の実験をすることなく当業者によって決定され得る。
本発明の抗体を含む治療用製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と混合することによって（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ． Ｅｄ．（１９８０））、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態で保管用に調製される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書の製剤は、それだけに限らないが、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含む、治療している特定の適応症に必要な２種以上の活性化合物を含有することもできる。このような分子は、意図した目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
有効成分を、例えばコアセルベーション技術によって若しくは界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン未クロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンに封入することもできる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、本発明の免疫グロブリンを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸リュープロリドで構成された注射可能なミクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日超にわたる分子の放出を可能にするが、一定のヒドロゲルは、タンパク質をより短期間放出する。カプセル化免疫グロブリンが長時間体内に残っていると、それらは３７℃で湿気にさらされた結果として変性又は凝集し、生物学的活性の喪失又は免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが判明した場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって安定化を達成することができる。
使用
本発明の抗体は、例えば、インビトロ、エキソビボ及びインビボの治療方法において、使用され得る。本発明の抗体は、インビトロ、エキソビボ及び／又はインビボで特異的抗原活性を部分的に又は完全に遮断するためのアンタゴニストとして使用することができる。さらに、本発明の抗体の少なくともいくつかは、他の種からの抗原活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体を、本発明の抗体が交差反応する抗原を有するヒト対象又は他の哺乳動物対象（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ又はマウス）において、例えば抗原を含有する細胞培養物中の特異的抗原活性を阻害するために使用することができる。一実施形態では、本発明の抗体を、抗原活性が阻害されるように抗体と抗原を接触させることによって抗原活性を阻害するために使用することができる。一実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質分子である。
一実施形態では、抗原活性が有害である障害に罹患している対象の抗原を阻害する方法であって、対象の抗原活性が阻害されるように本発明の抗体を対象に投与するステップを含む方法に、本発明の抗体を使用することができる。一実施形態では、抗原がヒトタンパク質分子であり、対象がヒト対象である。又は、対象が本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳動物であってもよい。さらに、対象が、抗原が導入された哺乳動物（例えば、抗原の投与又は抗原導入遺伝子の発現により）であってもよい。本発明の抗体を、治療目的のためにヒト対象に投与することができる。さらに、本発明の抗体を、獣医学的目的のために又はヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類、ブタ又はマウス）に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するために有用であり得る（例えば、投与量及び投与の時間経過の試験）。本発明の抗体を使用して、それだけに限らないが、がん、筋肉障害、ユビキチン経路関連遺伝性障害、免疫／炎症性障害、神経学的障害及び他のユビキチン経路関連障害を含む、ＳＳＥＡ−４及びＳＳＥＡ−４化タンパク質の異常な発現及び／又は活性に関連する疾患、障害又は状態を治療、抑制、進行を遅延、再発を予防／遅延、回復又は予防することができる。
一態様では、本発明のブロッキング抗体がＳＳＥＡ−４に特異的である。
一定の実施形態では、細胞傷害剤と結合した本発明の抗体を含むイムノコンジュゲートが患者に投与される。一定の実施形態では、ＳＳＥＡ−４に関連する１つ以上のタンパク質をその細胞表面上で発現する細胞によって、細胞傷害剤が結合した免疫複合体及び／又は抗原が内在化され、会合している標的を死滅させる際の免疫複合体の治療効果の増大が得られる。一実施形態では、細胞傷害剤が、標的細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞傷害剤の例としては、本明細書に記載される化学療法剤（マイタンシノイド若しくはカリチアマイシンなど）、放射性同位体、又はリボヌクレアーゼ若しくはＤＮＡエンドヌクレアーゼのいずれかが挙げられる。
本発明の抗体を、単独で又は他の組成物と組み合わせて、治療に使用することができる。例えば、本発明の抗体を、別の抗体及び／又はアジュバント／治療剤（例えば、ステロイド）と同時投与することができる。例えば、本発明の抗体を、治療スキームにおいて、例えばがん、筋肉障害、ユビキチン経路関連遺伝性障害、免疫／炎症性障害、神経学的障害及び他のユビキチン経路関連障害を含む、本明細書に記載される疾患のいずれかの治療において、抗炎症剤及び／又は消毒剤と組み合わせることができる。上記の併用療法には、組み合わせ投与（２種以上の薬剤が同じ又は別個の製剤に含まれる）及び別個の投与（この場合、本発明の抗体の投与が、補助療法の投与前及び／又は後に行われ得る）が含まれる。
本発明の抗体（及び補助治療剤）は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内、並びに局所治療のために所望される場合、病変内投与を含む任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。さらに、抗体は、パルス注入によって、特に抗体の用量を減少させて、適切に投与される。投与は、部分的には、投与が短時間であるか慢性であるかに応じて、任意の適切な経路によって、例えば注射（例えば、静脈内又は皮下注射）によって行うことができる。
本発明の抗体の結合標的の位置を、抗体の調製及び投与において考慮することができる。結合標的が細胞内分子である場合、本発明の一定の実施形態は、結合標的が位置する細胞内に導入される抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明の抗体を、細胞内抗体として細胞内で発現させることができる。本明細書で使用される「細胞内抗体」という用語は、Ｍａｒａｓｃｏ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１１−１５（１９９７）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４：１６３−１７０（２００４）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．６，００４，９４０及び６，３２９，１７３；米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号明細書及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２００３／０７７９４５に記載されるように、細胞内で発現され、標的分子に選択的に結合することができる抗体又はその抗原結合部分を指す。細胞内抗体の細胞内発現は、所望の抗体又はその抗原結合部分（抗体又は抗原結合フラグメントをコードする遺伝子に通常付随する野生型リーダー配列及び分泌シグナルを欠く）をコードする核酸を標的細胞に導入することによって行われる。それだけに限らないが、微量注入、衝撃注入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム並びに目的の核酸を運ぶレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びワクシニアベクターによるトランスフェクションを含む、核酸を細胞に導入する標準的な方法を使用することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ−４抗体の全部又は一部をコードする１つ以上の核酸を、ＳＳＥＡ−４への細胞内結合及び１つ以上のＳＳＥＡ−４媒介細胞経路の調節が可能である１つ以上の細胞内抗体が発現されるように、標的細胞に送達することができる。
別の実施形態では、内在化抗体が提供される。抗体は、抗体の細胞内への送達を増強する一定の特徴を有することができる、又はこのような特徴を有するよう改変され得る。これを達成するための技法は、当技術分野で公知である。例えば、抗体のカチオン化が、細胞内へのその取り込みを促進することが知られている（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，７０３，０１９参照）。リポフェクション又はリポソームを使用して、抗体を細胞に送達することもできる。抗体フラグメントを使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害フラグメントが一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成することができる及び／又は組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照されたい。
モジュレーターポリペプチドの標的細胞への侵入を、当技術分野で公知の方法によって増強することができる。例えば、一定の配列、例えばＨＩＶ Ｔａｔ又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質由来のものは、細胞膜を横切る異種タンパク質の効率的な取り込みを指示することができる。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９），９６：４３２５−４３２９を参照されたい。
結合標的が脳内に位置する場合、本発明の一定の実施形態は、血液−脳関門を横切る抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一定の神経変性疾患は、抗体又は抗原結合フラグメントが脳に容易に導入され得るように、血液−脳関門の透過性の増加と関連する。血液−脳関門が無傷のままである場合、それだけに限らないが、物理的方法、脂質に基づく方法並びに受容体及びチャネルに基づく方法を含む、血液−脳関門を横切って分子を輸送するためのいくつかの先行技術の手法が存在する。
血液−脳関門を横切って抗体又は抗原結合フラグメントを輸送する物理的方法には、それだけに限らないが、血液脳関門を完全に迂回すること、又は血液−脳関門に開口部を作製することが含まれる。迂回法には、それだけに限らないが、脳への直接注射（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：３９８−４０６（２００２））、組織内注入／対流増加送達（例えば、Ｂｏｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２０７６−２０８０（１９９４））及び脳内への送達装置の移植（例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−５９５（２００３）；及びＧｌｉａｄｅｌ Ｗａｆｅｒｓ（商標）、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ参照）が含まれる。障壁に開口部を作製する方法には、それだけに限らないが、超音波（例えば、米国特許公開第２００２／００３８０８６号明細書参照）、浸透圧（例えば、高張マンニトールの投与による（Ｎｅｕｗｅｌｔ，Ｅ． Ａ．，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ １ ＆ ２，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））、例えばブラジキニン又は透過剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ）Ａ−７による透過処理（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，１１２，５９６、５，２６８，１６４、５，５０６，２０６及び５，６８６，４１６参照）、及び抗体又は抗原結合フラグメントをコードする遺伝子を含有するベクターによる血液−脳関門にまたがるニューロンのトランスフェクション（例えば、米国特許公開第２００３／００８３２９９号明細書参照）が含まれる。
抗体又は抗原結合フラグメントを血液−脳関門を横切って輸送する脂質に基づく方法には、それだけに限らないが、抗体又は抗原結合フラグメントを、血液−脳関門の血管内皮上の受容体に結合する抗体結合フラグメントにカップリングするリポソームにカプセル化すること（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号明細書参照）及び低密度リポタンパク質粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号明細書参照）又はアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号明細書参照）中に抗体又は抗原結合フラグメントをコーティングすることが含まれる。
血液−脳関門を予後切って抗体又は抗原結合フラグメントを輸送する受容体及びチャネルに基づく方法には、それだけに限らないが、血液−脳関門の透過性を増加させるためにグルココルチコイド遮断薬を使用すること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号明細書、同第２００３／０１６２６９５号明細書及び同第２００５／０１２４５３３号明細書参照）；カリウムチャネルを活性化すること（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号明細書参照）、ＡＢＣ薬物輸送体を阻害すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号明細書参照）；抗体をトランスフェリンでコーティングし、１つ以上のトランスフェリン受容体の活性を調節すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号明細書参照）及び抗体をカチオン化すること（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，００４，６９７参照）が含まれる。
本発明の抗体組成物は、良好な医療行為に合致した様式で製剤化、投薬及び投与される。これに関連して考慮すべき因子には、治療している特定の障害、治療している特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師に知られている他の因子が含まれる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意で、当の障害を予防又は治療するために現在使用されている１種以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する本発明の抗体の量、障害又は治療の種類及び上で論じられる他の因子に依存する。これらは一般的に、本明細書に記載されるのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投与量の約１〜９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投与量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の適切な投与量（単独で又は化学療法剤などの他の薬剤と組み合わせて使用する場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。抗体は、一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与する。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によっても又は連続注入によっても、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に投与するための最初の候補投与量となり得る。１つの典型的な１日投与量は、疾患の予防又は治療のため約１μｇ、本発明の抗体の適切な投与量（条件に応じて数日又はそれ以上で）に及び、治療は一般的に疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続されるだろう。抗体の１つの代表的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量を患者に投与することができる。このような用量を断続的に、例えば毎週又は３週間毎に投与することができる（例えば、患者が抗体の約２〜約２０回、又は例えば約６回の投与を受けるように）。最初のより高い負荷用量に続いて、１回以上のより低い用量を投与することができる。代表的な投与レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量、引き続いて約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投与レジメンが有用であり得る。この療法の進行は、慣用的な技術及びアッセイによって容易に監視される。
製品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器と、容器上又は容器に付随したラベル又は添付文書とを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、単独であるか又は状態の治療、予防及び／若しくは診断に有効な別の組成物と組み合わせられる組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針によるストッパーを有する静脈用溶液バッグ又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）その中に含有される組成物を有する第１の容器であって、組成物が本発明の抗体を含む容器と；（ｂ）その中に含有される組成物を有する第２の容器であって、組成物がさらなる細胞傷害剤又は治療剤を含む容器とを含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、組成物を使用して特定の状態を治療することができることを示す添付文書をさらに含み得る。又は、若しくはさらに、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の観点から望ましい他の物質をさらに含み得る。
一定の実施形態では、治療される対象が哺乳動物である。一定の実施形態では、対象がヒトである。一定の実施形態では、対象がイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又はヤギなどの飼育動物である。一定の実施形態では、対象がイヌ又はネコなどのコンパニオンアニマルである。一定の実施形態では、対象がウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ又はヤギなどの家畜動物である。一定の実施形態では、対象が動物園の動物である。別の実施形態では、対象がげっ歯類、イヌ又は非ヒト霊長類などの研究動物である。一定の実施形態では、対象がトランスジェニックマウス又はトランスジェニックブタなどの非ヒトトランスジェニック動物である。
医薬組成物及び製剤
本明細書に記載される抗体の調製後、「凍結乾燥前（ｐｒｅ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）製剤」を製造することができる。製剤を調製するための抗体は、好ましくは、本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均質である（すなわち、汚染タンパク質等を含まない）。「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量基準で、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の総重量基準で、少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。一定の実施形態では、タンパク質が抗体である。
凍結乾燥前製剤中の抗体の量は、所望の投与量、投与の様式等を考慮して決定される。選択されるタンパク質がインタクト抗体（完全長抗体）である場合、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２０〜３０ｍｇ／ｍＬが代表的な出発タンパク質濃度である。タンパク質は一般的に溶液中に存在する。例えば、タンパク質は、約４〜８、好ましくは約５〜７のｐＨでｐＨ緩衝溶液中に存在し得る。代表的な緩衝剤には、ヒスチジン、リン酸塩、トリス、クエン酸塩、コハク酸塩及び他の有機酸が含まれる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液及び製剤（例えば、再構成された製剤）の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ又は約３ｍＭ〜約１５ｍＭとなり得る。好ましい緩衝液は、以下で実証されるように、凍結乾燥保護（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）特性を有することができるという点で、ヒスチジンである。コハク酸塩が別の有用な緩衝液であることが、示された。
凍結乾燥保護剤を、凍結乾燥前製剤に添加する。好ましい実施形態では、凍結乾燥保護剤が、スクロース又はトレハロースなどの非還元糖である。凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤の量は、一般的に、再構成時に得られる製剤が等張性となるようなものである。しかしながら、高張性再構成製剤も適切となり得る。さらに、凍結乾燥時に許容されない量のタンパク質の分解／凝集が起こるほど、凍結乾燥保護剤の量が低すぎてはならない。凍結乾燥保護剤が糖（スクロース又はトレハロースなど）であり、タンパク質が抗体である場合、凍結乾燥前製剤の代表的な凍結乾燥保護剤濃度は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、好ましくは３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、最も好ましくは約５０ｍＭ〜約１００ｍＭである。
タンパク質と凍結乾燥保護剤の比は、各タンパク質及び凍結乾燥保護剤の組み合わせについて選択される。選択されたタンパク質としての抗体及び高タンパク質濃度を有する等張性再構成製剤を生成するための凍結乾燥保護剤としての糖（例えば、スクロース又はトレハロース）の場合、凍結乾燥保護剤と抗体のモル比は、約１００〜約１５００モルの凍結乾燥保護剤対１モルの抗体、好ましくは約２００〜約１０００モルの凍結乾燥保護剤対１モルの抗体、例えば約２００〜約６００モルの凍結乾燥保護剤対１モルの抗体となり得る。
本発明の好ましい実施形態では、凍結乾燥前製剤に界面活性剤を添加することが望ましいことが分かっている。又は、若しくはさらに、界面活性剤を凍結乾燥製剤及び／又は再構成製剤に添加してもよい。代表的な界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又は８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−又はステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−又はステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−又はセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−又はイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−又はイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−又は２ナトリウムメチルオレイル−タウレート；及びＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭシリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール及びエチレンとプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８等）が含まれる。添加される界面活性剤の量は、再構成タンパク質の凝集を減少させ、再構成後の微粒子の形成を最小化するようなものである。例えば、界面活性剤は、約０．００１〜０．５％、好ましくは約０．００５〜０．０５％の量で凍結乾燥前製剤中に存在し得る。
本発明の一定の実施形態では、凍結乾燥保護剤（スクロース又はトレハロースなど）と充填剤（例えば、マンニトール又はグリシン）の混合物がを凍結乾燥前製剤の調製に使用する。充填剤は、中に過剰なポケット等を有さない均一な凍結乾燥ケークの製造を可能にすることができる。
他の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されるものを、製剤の所望の特徴に悪影響を及ぼさない限り、凍結乾燥前製剤（及び／又は凍結乾燥製剤及び／又は再構成製剤）に含めてもよい。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、追加の緩衝剤；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生分解性ポリマー；及び／又はナトリウムなどの塩形成対イオンを含む。
本明細書に記載される医薬組成物及び製剤は、好ましくは安定である。「安定な」製剤／組成物は、中の抗体が保管時にその物理的及び化学的な安定性及び完全性を本質的に保持するものである。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技術が当技術分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に総説されている。選択された期間、選択された温度で安定性を測定することができる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。又は、混合物全体の無菌性は、例えばタンパク質を除く成分を約１２０℃で約３０分間オートクレーブ処理することによって達成することができる。
タンパク質、凍結乾燥保護剤及び他の任意成分を一緒に混合した後、製剤を凍結乾燥する。Ｈｕｌｌ５０（Ｒ）（Ｈｕｌｌ、米国）又はＧＴ２０（Ｒ）（Ｌｅｙｂｏｌｄ−Ｈｅｒａｅｕｓ、ドイツ）凍結乾燥機などの多くの様々な凍結乾燥機がこの目的のために利用可能である。凍結乾燥は、製剤を凍結し、その後、一次乾燥に適した温度で凍結内容物から氷を昇華させることによって達成される。この条件下では、生成物の温度は、製剤の共晶点又は崩壊温度より低い。典型的には、一次乾燥のための棚温度は、典型的には約５０〜２５０ｍＴｏｒｒに及ぶ適切な圧力で約−３０〜２５℃に及ぶ（一次乾燥中に生成物が凍結したままである限り）。試料を保持する容器（例えば、ガラスバイアル）の処方、サイズ及び種類並びに液体の体積は、主に乾燥に必要な時間を指示し、数時間〜数日（例えば、４０〜６０時間）に及び得る。二次乾燥段階を、主に容器の種類及びサイズ並びに使用されるタンパク質の種類に応じて約０〜４０℃で行うことができる。しかしながら、二次乾燥ステップが必要でない場合があることが、本明細書で分かった。例えば、凍結乾燥の水除去段階全体にわたる棚温度は、約１５〜３０℃（例えば、約２０℃）となり得る。二次乾燥に必要な時間及び圧力は、例えば、温度及び他のパラメータに依存して、適切な凍結乾燥ケークを生成するものである。二次乾燥時間は、生成物中の所望の残留水分レベルによって指示され、典型的には少なくとも約５時間（例えば、１０〜１５時間）かかる。圧力は、一次乾燥ステップ中に使用される圧力と同じであってもよい。凍結乾燥条件は、製剤及びバイアルのサイズに応じて変えることができる。
場合によっては、輸送ステップを回避するために、タンパク質の再構成を行うべき容器中でタンパク質製剤を凍結乾燥することが望ましい場合がある。この例の容器は、例えば、３、５、１０、２０、５０又は１００ｃｃバイアルであり得る。一般的な提案として、凍結乾燥は、その水分含量が約５％未満、好ましくは約３％未満である凍結乾燥製剤をもたらす。
所望の段階で、典型的には、タンパク質を患者に投与する時期になったら、凍結乾燥製剤を、再構成製剤中のタンパク質濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約８０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約９０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈剤で再構成することができる。再構成製剤中のこのような高タンパク質濃度は、再構成製剤の皮下送達を意図する場合に特に有用であると考えられる。しかしながら、静脈内投与などの他の投与経路については、再構成製剤中のより低濃度のタンパク質が望ましい場合もある（例えば、再構成製剤中約５〜５０ｍｇ／ｍＬ又は約１０〜４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質）。一定の実施形態では、再構成製剤中のタンパク質濃度が、凍結乾燥前製剤のタンパク質濃度よりも有意に高い。例えば、再構成製剤中のタンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤の約２〜４０倍、好ましくは３〜１０倍、最も好ましくは３〜６倍（例えば、少なくとも３倍又は少なくとも４倍）であり得る。
再構築は、一般的に、完全な水和を確実にするために約２５℃の温度で行われるが、所望であれば他の温度を使用してもよい。再構成に必要な時間は、例えば、希釈剤の種類、賦形剤（複数可）及びタンパク質の量に依存する。希釈剤の例としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー溶液又はデキストロース溶液が挙げられる。希釈剤は、任意に保存剤を含有する。代表的な保存剤は上に記載されており、ベンジルアルコール又はフェノールアルコールなどの芳香族アルコールが好ましい保存剤である。使用される保存剤の量は、タンパク質との適合性についての様々な保存剤濃度の評価及び保存剤有効性試験によって決定される。例えば、保存剤が芳香族アルコール（ベンジルアルコールなど）である場合、それは約０．１〜２．０％、好ましくは約０．５〜１．５％、最も好ましくは約１．０〜１．２％の量で存在することができる。好ましくは、再構成製剤は、１０μｍサイズ超である１バイアルあたり６０００個未満の粒子を有する。
治療的適用
本明細書に記載される１つ以上の抗体を含む治療上有効量の組成物を、このような治療を必要とする対象に投与するステップを含む治療方法が本明細書に記載される。
一定の実施形態では、治療を必要とする対象（例えば、ヒト患者）が、がんと診断されるか、がんを有する疑いがあるか又はがんのリスクがある。がんの例としては、それだけに限らないが、肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん及び前立腺がんが挙げられる。一定の実施形態では、癌が肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん又は膵臓がんである。いくつかの好ましい実施形態では、がんが脳がん又は多形性膠芽腫（ＧＢＭ）がんである。
好ましい実施形態では、抗体がＳＳＥＡ−４発現がん細胞を標的とすることができる。一定の実施形態では、抗体が、がん細胞上のＳＳＥＡ−４を標的とすることができる。一定の実施形態では、抗体が、がん中のＳＳＥＡ−４を標的とすることができる。
治療は、腫瘍サイズの減少、悪性細胞の排除、転移の予防、再発の予防、播種性がんの減少若しくは死滅、生存の延長及び／又は腫瘍がん進行までの時間の延長をもたらす。
一定の実施形態では、治療が、抗体の投与の前、間又は後に、前記対象に追加の療法を投与するステップをさらに含む。一定の実施形態では、追加の療法が化学療法剤による治療である。一定の実施形態では、追加の療法が放射線療法である。
本発明の方法は、早期段階の腫瘍を治療及び予防し、それによってより進行した期への進行を予防して、進行がんに関連する罹患率及び死亡率の減少をもたらすことにおいて、特に有利である。本発明の方法はまた、腫瘍の再発若しくは腫瘍の再成長、例えば原発腫瘍の除去後に持続する潜伏腫瘍の予防、又は腫瘍の発生の減少若しくは予防においても有利である。
一定の実施形態では、本明細書に開示される方法が、がんの治療又は予防に、例えばＧｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３及び／又はＳＳＥＡ−４発現の増加を特徴とする場合に有用である。一定の実施形態では、がんが、がん幹細胞を含む。一定の実施形態では、がんが、前がん及び／又は悪性がん及び／又は治療耐性がんである。一定の実施形態では、がんが脳がんである。
本発明の方法については、がんが、液性腫瘍、例えば白血病及びリンパ腫、固形腫瘍、例えば乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、肺がん、腎細胞がん、神経膠腫（例えば、退形成性星細胞腫、退形成性乏突起星細胞腫、退形成性乏突起膠腫、多形性膠芽腫（ＧＢＭ））、腎臓がん、前立腺がん、肝がん、膵臓がん、軟部組織肉腫、カルチノイド癌、頭頸部がん、黒色腫及び卵巣がんであり得る。一実施形態では、がんが脳がん又はＧＢＭである。本明細書に開示される方法を実施するために、本明細書に記載される少なくとも１つの抗体を含有する有効量の上記の医薬組成物／製剤を、例えばボーラスとしての静脈内投与又は一定期間にわたる連続注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、経口、吸入又は局所経路などの適切な経路を介して、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することができる。ジェットネブライザー及び超音波ネブライザーを含む液体製剤用の商業的に入手可能なネブライザーが投与に有用である。液体製剤は直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末は再構成後に噴霧することができる。又は、抗体を、フルオロカーボン製剤及び定量吸入器を使用してエアゾール化する、又は凍結乾燥及び粉砕粉末として吸入することができる。
本明細書に記載される方法によって治療される対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。哺乳動物には、それだけに限らないが、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス及びラットが含まれる。治療を必要とするヒト対象は、それだけに限らないが、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆道がん、肝がん、頬側がん、胃がん、結腸がん、上咽頭がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍を含むがんを有するか、がんのリスクがあるか又はがんを有する疑いがある、ヒト患者であり得る。がんを有する対象は、慣用的な健康診断によって同定することができる。
本明細書で使用される「有効量」とは、単独で又は１種以上の他の活性剤と組み合わせて、対象に治療効果を与えるのに必要な各活性剤の量を指す。有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、健康状態、サイズ、性別及び体重を含む個々の患者パラメータ、治療の持続期間、ある場合には併用療法の性質、具体的な投与経路並びに医療従事者の知識及び専門技術内の同様の因子である特定の条件に応じて変化する。これらの因子は、当業者に周知であり、慣用的な実験のみで対処することができる。個々の成分又はそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、信頼できる医学的判断による最高の安全な用量を使用することが一般的に好ましい。しかしながら、医学的理由、心理的理由又は事実上他の理由により、患者がより低い用量又は許容される用量を主張することができることが、当業者によって理解されるであろう。
半減期などの経験的考察が、一般的に用量の決定に寄与する。例えば、ヒト免疫系と適合性である抗体、例えばヒト化抗体又は完全ヒト抗体を使用して、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防ぐことができる。投与の頻度は、治療経過にわたって決定及び調節され得、一般的には、必ずしもそうではないが、がんの治療及び／又は抑制及び／又は改善及び／又は遅延に基づく。又は、本明細書に記載される抗体の持続連続放出製剤が適切となり得る。徐放を達成するための種々の製剤及び装置が当技術分野で公知である。
一例では、本明細書に記載される抗体についての投与量を、抗体の１回以上の投与を与えられた個体において経験的に決定することができる。個体に漸増投与量の抗体を与える。抗体の有効性を評価するために、疾患（例えば、がん）の指標を慣用的診療により追跡することができる。
一般的に、本明細書に記載される抗体のいずれかの投与について、初期候補投与量は約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本開示の目的のために、典型的な１日投与量は、上記の因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上となり得るだろう。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、所望の症状抑制が起こるまで、又は十分な治療レベルが達成されてがん若しくはその症状を緩和するまで、治療を維持する。代表的な投与レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量、引き続いて約１ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量、又は引き続いて隔週での約１ｍｇ／ｋｇの維持用量を投与することを含む。しかしながら、医師が達成したい薬物動態崩壊のパターンに応じて、他の投与レジメンが有用となり得る。例えば、１週間に１〜４回投与することが考えられる。一定の実施形態では、約３μｇ／ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇに及ぶ投与（例えば、約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ及び約２ｍｇ／ｋｇ）を使用することができる。一定の実施形態では、投与頻度が、毎週１回、２週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎又は１０週間毎；又は毎月１回、２ヶ月毎又は３ヶ月毎又はそれ以上である。この療法の進行は、慣用的な技術及びアッセイによって容易に監視される。使用される抗体を含む投与レジメンは、時間とともに変化し得る。
本開示の目的のために、本明細書に記載される抗体の適切な投与量は、使用される特異的抗体（又はその組成物）、がんの種類及び重症度、抗体が予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する応答、及び主治医の裁量に依存する。本明細書に記載される抗体の投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的であってもよく、又は例えば、がんを発達する前、間若しくは後の一連の間隔を空けた投与であってもよい。
本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、がん、がんの症状又はがんの素因を治癒させる、癒す、緩和する、軽減する、変化させる、矯正する、回復する、改善する又は影響を及ぼす目的で、がん、がんの症状又はがんの素因を有する対象に１種以上の活性剤を含む組成物を施用又は投与することを指す。
癌を緩和することは、がんの発達若しくは進行を遅延すること又はがんの重症度を減少させることを含む。癌を緩和することは必ずしも治癒結果を必要としない。そこに使用される場合、がんの発達を「遅延させること」とは、がんの進行を延期する、妨げる、遅くする、遅延させる、安定化する及び／又は延期することを意味する。この遅延は、がんの病歴及び／又は治療される個体に応じて、様々な長さの時間であり得る。がんの発達を「遅延させる」若しくは緩和する、又はがんの発達を遅延させる方法は、この方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠内でがんの１つ以上の症状を生じる可能性（リスク）を低下させる、及び／又は所与の時間枠内で症状の程度を減少させる方法である。このような比較は、典型的には、統計的に有意な結果をもたらすのに十分な数の対象を使用した臨床研究に基づく。
がんの「発達」又は「進行」は、がんの初期徴候及び／又は続く進行を意味する。がんの発達は、当技術分野で周知の標準的な臨床技術を使用して検出可能であり、評価することができる。しかしながら、発達はまた、検出できない進行も指す。本開示の目的のために、発生又は進行は、症状の生物学的経過を指す。「発達」には、発生、再発及び発症が含まれる。本明細書で使用される場合、がんの「発症」又は「発生」には、初期発症及び／又は再発が含まれる。
医学分野の当業者に公知の慣用的な方法を使用して、治療する疾患の種類又は疾患の部位に応じて、医薬組成物を対象に投与することができる。この組成物を、他の慣用的な経路を介して投与すること、例えば経口、非経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、経鼻、頬側、経膣又は移植リザーバーを介して投与することもできる。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。さらに、それは、１ヶ月、３ヶ月又は６ヶ月のデポー注射可能又は生分解性材料及び方法を使用するなどの注射可能なデポー投与経路を介して対象に投与することができる。
注射用組成物は、植物油、ジメチルラクトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール及びポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）などの種々の担体を含有し得る。静脈内注射については、水溶性抗体をドリップ法によって投与することができ、それによると抗体及び生理学的に許容される賦形剤を含有する医薬製剤が注入される。生理学的に許容される賦形剤には、例えば、５％デキストロース、０．９％生理食塩水、リンガー溶液又は他の適切な賦形剤が含まれ得る。筋肉内製剤、例えば、抗体の適切な可溶性塩形態の滅菌製剤を、注射用水、０．９％生理食塩水又は５％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解し、投与することができる。
診断的適用
対象のがんを診断する方法であって、（ａ）ＳＳＥＡ−４の発現を検出する１つ以上のモノクローナル抗体を含む組成物を、対象から得られた細胞又は組織試料に適用するステップと；（ｂ）モノクローナル抗体と細胞又は組織試料の結合をアッセイするステップと；（ｃ）結合を正常対照と比較して、対象におけるがんの存在を判定するステップとを含む方法が本明細書に記載される。
検出及び診断のためのがんの例としては、それだけに限らないが、肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、卵巣がん及び前立腺がんが挙げられる。一定の実施形態では、癌が肉腫、皮膚がん、白血病、リンパ腫、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん又は膵臓がんである。
一定の実施形態では、抗体が、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４発現がん細胞を検出することができる。一定の実施形態では、抗体が、がん細胞上のＧｌｏｂｏ Ｈ及びＳＳＥＡを検出することができる。一定の実施形態では、抗体が、がん中のＳＳＥＡを検出することができる。一定の実施形態では、がんが脳がん又は多形性膠芽腫（ＧＢＭ）がんであり、抗体が抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体である。
ＳＳＥＡ−４特異的モノクローナル抗体を、ＳＳＥＡ−４発現がん細胞を検出するためのインビトロ及びインビボ診断アッセイのために、単独で又は組み合わせて使用することができる。一定の実施形態では、ＳＳＥＡ−４特異的モノクローナル抗体を、がんを有する又はがんを有する疑いのある個体からの生物学的試料と接触させ、試料中の細胞に結合した抗体を測定し、正常な抗体結合より高い又は低い場合には個体ががんを有することを示す。一定の実施形態では、生物学的試料が、血液試料又は血液画分（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球、白血球）である。一定の実施形態では、生物学的試料が、例えば疑いのある腫瘍部位から、又は例えば、公知の腫瘍の境界を決定するための、罹患していることが知られている組織からの組織試料（生検）である。一定の実施形態では、生物学的試料を炎症部位から得る。
生検は、典型的には、組織、すなわち非流体細胞型から試料を得るために行われる。適用される生検技術は、評価される組織型（例えば、***、皮膚、結腸、前立腺、腎臓、肺、膀胱、リンパ節、肝臓、骨髄、気道又は肺）に依存する。がんの場合、この技術はまた、数ある要因の中でも、腫瘍のサイズ及び種類（例えば、固形、懸濁又は血液）に依存する。生検技術は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｋａｓｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１６ｔｈ ｅｄ．，２００５，Ｃｈａｐｔｅｒ ７０，ａｎｄ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ Ｐａｒｔ Ｖに論じられている。
試料中の細胞との抗体結合を検出する任意の方法を、本診断アッセイに使用することができる。抗体結合を検出する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、ＥＬＩＳＡ等である。一定の実施形態では、この方法が、決定ステップの前に検出用の生物学的試料を調製するステップを含む。例えば、細胞（例えば、白血球）の亜集団を個体からの試料の残り（例えば、他の血液成分）から分離することができる、又は組織内の細胞を、検出を容易にするために懸濁することができる。
一定の実施形態では、試料中のＳＳＥＡ−４発現細胞の百分率を決定し、対照、例えば、がんを有することが知られている個体若しくは個体群（陽性対照）、又はがんを有さないことが知られている個体若しくは個体群（正常、非疾患若しくは陰性対照）からの試料と比較する。一定の実施形態では、対照が、所与の組織について確立されたＳＳＥＡ−４発現の標準的な範囲である。／ＳＳＥＡ−４発現細胞の正常な百分率より高い若しくは低い、又はより高い若しくはより低い発現レベルは、個体ががんを有することを示す。
一実施形態では、血液試料又は組織試料などの生物学的試料中のＳＳＥＡ−４を検出するためのキットが提供される。例えば、対象におけるがん診断を確認するために、生検を行って組織学的検査用の組織試料を得ることができる。又は、血液試料を得てＳＳＥＡ−４の存在を検出することができる。ポリペプチドを検出するためのキットは、典型的には、ＳＳＥＡ−４に特異的に結合する１つ以上の抗体、例えば本明細書に開示される抗体のいずれかを含む。さらなる実施形態では、抗体を標識する（例えば、蛍光標識、放射性標識又は酵素標識により）。
一実施形態では、キットが、ＳＳＥＡ−４に特異的に結合する１つ以上の抗体の使用手段を開示する教材を含む。教材は、電子形式（コンピュータディスケット若しくはコンパクトディスクなど）で書かれていてもよく、又はビジュアル（ビデオファイルなど）であってもよい。キットはまた、キットが設計される特定の適用を容易にするための追加の成分を含み得る。よって、例えば、キットは、標識（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）を検出する手段をさらに含有してもよい。キットは、特定の方法を実施するために慣用的に使用される緩衝液及び他の試薬をさらに含み得る。このようなキット及び適切な内容物は、当業者に周知である。
細胞表面マーカーの存在又は非存在を決定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、抗体を、それだけに限らないが、酵素、磁気ビーズ、コロイド磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物又は薬物を含む他の化合物に結合することができる。抗体を、それだけに限らないが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学アッセイなどのイムノアッセイに利用することもできる。抗体を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）に使用することもできる。ＦＡＣＳは、数あるより精巧なレベルの検出の中でも複数のカラーチャネル、低角及び鈍角光散乱検出チャネル、並びにインピーダンスチャネルを使用して、細胞を分離又は選別する（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，０６１，６２０参照）。本明細書で開示される、ＳＳＥＡ−４に結合するモノクローナル抗体のいずれも、これらのアッセイに使用することができる。よって、抗体を、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウエスタンブロット又は免疫沈降を含む慣用的なイムノアッセイに使用することができる。
腫瘍の病期分類をする及び／又は予後を判定する方法
本開示の別の態様は、ヒト患者の腫瘍の病気分類をする及び／又は予後を判定する方法であって、（ａ）ＳＳＥＡ−４からなるマーカーの発現を検出する１つ以上の抗体を含む組成物を、ヒト患者から得られた細胞又は組織試料に適用するステップと；（ｂ）モノクローナル抗体と細胞又は組織試料の結合をアッセイするステップと；（ｃ）試験試料中のマーカーの発現レベルを参照試料中のレベルと比較するステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）で同定された結果に基づいて、患者の腫瘍の病期及び／又は予後を判定するステップとを含む方法を特徴とする。
さらなる詳述なしに、当業者であれば、上記説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。そのため、以下の具体的な実施形態は、単なる例示と解釈されるべきであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書に引用される全ての刊行物は、本明細書で言及される目的又は主題のために参照として組み込まれる。
［実施例１］
ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
古典的ハイブリドーマ融合を行った。マウスに、ＯＢＩ−８２１サポニンアジュバントと結合したＳＳＥＡ−４−ＤＴ−ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素交差反応物質１９７）による最初の免疫化を受けさせた。各マウスに、左と右両方の腹部部位（１００μＬ／部位）に皮下（ｓ．ｃ．）注射を介して指定される処理を投与した。マウスに４回（０日目、７日目、１４日目及び２３日目）投与した。０日目前（投与前）、１０日目、１７日目、２６日目及び屠殺日（３５日目、全血量を顔面静脈及び心臓穿孔を通して回収した）に、抗凝固剤を用いないで、顔面静脈を通して、血液試料（約０．１ｍＬの全血／時点／動物）を得た。凝固した血液試料を遠心分離し（１５００×ｇ、１５分間、４℃）、血清を分離し、エッペンドルフチューブに移した。全ての血清試料を抗ＳＳＥＡ−４抗体の力価について試験した。５匹のマウスが高レベルの抗ＳＳＥＡ−４ ＩｇＧ及びＩｇＭを産生することが分かり、ハイブリドーマ産生に使用した。マウス骨髄腫細胞をＫＯｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの手順（ＫＯｈｌｅｒ Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，１９７５）に従ってマウス脾細胞との融合に使用した。ハイブリドーマ上清を１ウェル当たり０．２μｇのＳＳＥＡ−４−脂質１を用いた親和性ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。市販のＳＳＥＡ−４抗体（ＭＣ−８１３−７０）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３３０４０２）が陽性対象として役立った。上清を希釈しないハイブリドーマクローンのＯＤ。バックグラウンドｘ２を選択した。上位３つのハイブリドーマクローンは、１Ｇ１ｓ、１Ｊ１ｓ及び２Ｆ２０ｓであった。
［実施例２］
ヌードマウスにおける代表的な抗体の抗腫瘍活性の測定
ヒト膵臓腺癌の異種移植片腫瘍モデルにおいて、ＨＰＡＣ細胞をＢＡＬＢ／ｃ雄ヌードマウスに皮下（ｓｃ）移植し、試験物質を、平均腫瘍サイズが５０〜１２０ｍｍ３に達したら開始して１週間に２回５週間、腹腔内（ｉｐ）注射によって０．４ｍｇ／ｋｇで投与した。腫瘍サイズを監視し、１週間に２回、３６日間記録した。死亡率、体重及び明白な動物毒性の兆候も、１週間に２回、３６日間記録した。腫瘍成長をＴ／Ｃ（処理／対照）×１００％として計算した。
試験物質及び投与パターン
試験物質を、液体形態で１．４５、１又は０．５ｍｇ／ｍＬで調製した。指定される投与濃度（０．０４ｍｇ／ｍＬ）を得るために、ストック溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈することによって、各投与前日に試験物質を新たに調製した。試験物質を１０ｍＬ／ｋｇの投与量で、１週間に２回、５週間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。
Figure 2019513144
細胞株
ＢＡＬＢ／ｃ雄ヌードマウスの右側腹部への０．１ｍＬの１×１０６個細胞／マウスの皮下移植の前に、ＨＰＡＣ腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１１９、ヒト膵臓腺癌）を調製し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｐａｎｌａｂｓ Ｔａｉｗａｎ Ｌｔｄ．で培養した。
動物
６〜７週齢、体重１８〜２２ｇのＢＡＬＢ／ｃ雄性ヌードマウスをＢｉｏＬａｓｃｏ Ｔａｉｗａｎ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓライセンシー下）から得た。全ての動物を、１２時間の明／暗サイクルで、十分に制御された温度（２０〜２４℃）及び湿度（３０〜７０％）環境に維持した。標準実験用食餌［ＭＦＧ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、日本）］及びオートクレーブ処理した水道水を自由に利用できるようにした。住居、実験及び動物の処分を含むこの研究の全ての態様は、ＡＡＡＬＡＣ認定実験室動物施設において、「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ：Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０１１）に一般的に準拠して行った。さらに、動物の飼育及び使用プロトコルは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｐａｎｌａｂｓ Ｔａｉｗａｎ，Ｌｔｄ．のＩＡＣＵＣによって総説及び承認された。
化学物質
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、上皮成長因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、インスリン（Ｓｉｇｍａ、米国）、ヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ、米国）及びペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）。
装置
動物ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ、イタリア）、１０００ｍＬビーカー（Ｋｉｍａｘ、米国）、キャリパー（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、日本）、クラスＩＩ生物学用安全キャビネット（ＮｕＡｉｒｅ、米国）、遠心分離機５８１０Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）、μインキュベーター（Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、米国）、個別換気ケージ（ＩＶＣ、３６ミニ隔離飼育器システム）（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ、イタリア）、マウススケール番号Ｚ−４０（Ｔａｃｏｎｉｃ、米国）、ステンレス鉗子（Ｋｌａｐｐｅｎｅｃｋｅｒ、ドイツ）及び垂直層流（Ｔｓａｏ−Ｈｓｉｎ、台湾）。
方法
６〜７週齢及び体重１８〜２２ｇのＢＡＬＢ／ｃヌード雄マウスを使用した。ヒト膵臓腺癌腫瘍細胞ＨＰＡＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１１９、０．１ｍＬ中１．０×１０６個）を動物の右側腹部に皮下注射した。その後、動物を、各群が５匹の動物からなる６群に分けた。試験物質及びビヒクルの投与を、平均腫瘍サイズが５０〜１２０ｍｍ３に達した時に開始した（１日目として設定）。各投与の前に試験物質（０．４ｍｇ／ｋｇ）を新たに調製した。試験物質及びビヒクルを、１週間に２回、５週間、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって投与した。腫瘍サイズ、体重及び死亡率を、試験物質又はビヒクルの投与前３６日間、１週間に２回記録した。成長した腫瘍を有する動物の写真を試験終了時に撮影した（図１〜図６）。
腫瘍体積（ｍｍ３）を、楕円体の式：長さｘ（幅）２×０．５に従って決定した。腫瘍成長（Ｔ／Ｃ）を、以下の式を用いて計算した：Ｔ／Ｃ＝（Ｔｎ）／（Ｃｎ）×１００％（式中、Ｃ１（Ｃｎ）は対照群におけるｎ日目の腫瘍体積であり、Ｔ１（Ｔｎ）は処理群におけるｎ日目の腫瘍体積である）。Ｔ／Ｃ値≦４２％を有意な抗腫瘍活性とみなした。
結果
Figure 2019513144
Figure 2019513144
Figure 2019513144
試験物質を１週間に２回、５週間、腹腔内投与した。腫瘍サイズを測定し、１週間に２回、３６日間記録した。腫瘍成長をＴ／Ｃ（処理／対照）×１００％として計算した。
Ｔ／Ｃ値≦４２％を有意な抗腫瘍活性とみなした。さらに、二元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてボンフェローニ検定を適用して、＊Ｐ＜０．０５で１群（ビヒクル、ＰＢＳ）と比較した統計学的有意差を確認した。
図１〜図６は、様々な試験化合物を３６日間投与したヌードマウスの写真を示す。腫瘍抑制能力は、１Ｇ１ｓで１９．６％、１Ｊ１ｓで３３．８％及び２Ｆ２０ｓで３２．５％と計算された。それは、１Ｊ１ｓと２Ｆ２０ｓの両方がより優れた腫瘍抑制能力を有することを示した（図７）。
［実施例３］
ＦＡＣＳによるＭＣＦ７を用いた代表的な抗体の細胞結合能力の測定
細胞培養
ＭＣＦ−７細胞を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２５０３００８１）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１３６００７０）を含み、０．０１ｍｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＩ−Ｉ９２７８−５ｍＬ）、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６００００４４）を補足した最小必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７００２１）で培養した。
細胞染色
単層細胞を含有する試験試料フラスコから培地を捨てることによって、試験細胞を懸濁させた。細胞をＰＢＳ５ｍＬで２回すすいだ。０．０５％トリプシン１ｍＬをフラスコに添加し、全表面積を覆うように渦巻かせ、３７℃のＣＯ２インキュベーターに５〜１０分間入れた。完全増殖培地５ｍＬを添加した。ピペット操作によって穏やかに細胞を吸引した。細胞懸濁液を１５ｍＬコニカルチューブに移した。チューブを２００ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを攪拌した。
細胞計数
ＦＡＣＳ緩衝液１〜２ｍＬを細胞ペレットに添加し、ピペット操作によって十分攪拌した。細胞を、細胞−ストレーナーキャップ（Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５２２３５）を有する５ｍＬポリスチレン丸底チューブに添加して、インタクトな生単細胞を得た。細胞懸濁液１０μＬを微量遠心管に移した。トリパンブルー溶液（０．４％トリパンブルー）１０μＬを添加し、ピペット操作によって十分混合し、次いで、生細胞を血球計数器で計数した。細胞濃度を４×１０６個細胞／ｍＬに調整し、細胞懸濁液５０μＬをポリスチレン丸チューブにピペット操作で入れて１チューブあたり２×１０５個細胞とした。
一次抗体
Figure 2019513144
一次抗体をＦＡＣＳ緩衝液に希釈して１０μｇ／ｍＬの最終抗体濃度にした。抗体希釈液５０μＬを細胞懸濁液５０μＬに添加して、１チューブあたり０．５μｇの抗体とした。各チューブを穏やかにボルテックスして、細胞懸濁液と第１の抗体ウェルを混合し、次いで、チューブを約３０分間インキュベートするために氷上に置いた。全てのチューブをＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬで満たし、４００ｇで５分間遠心分離することによってそれぞれ１回洗浄した。吸引作用に注意し、細胞損失を引き起こし得るチューブの底に触れるのを避けて、上清を真空吸引によって捨てた。
二次抗体
アッセイ設定に使用される二次抗体：１ｍｇ、ヤギ抗マウスＩｇＧ、１Ｇ１ｓ、１Ｊ１ｓ及び２Ｆ２０ｓアッセイ用のヒトａｄｓ−ＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０３０−０２）。二次抗体をＦＡＣＳ緩衝液に希釈して４μｇ／ｍＬの最終抗体濃度にした。希釈二次抗体１００μＬを全てのチューブに添加し、次いで、各チューブを穏やかにボルテックスして、細胞懸濁液と二次抗体を十分混合した。チューブを氷上に置き、約３０分間のインキュベーション時間の間、光を避けた。次いで、全てのチューブをＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬで満たし、４００ｇで５分間遠心分離することによってそれぞれ１回洗浄した。吸引作用に注意し、細胞損失を引き起こし得るチューブの底に触れるのを避けて、上清を真空吸引によって捨てた。４％パラホルムアルデヒド固定溶液３００μＬを全てのチューブに添加し、約３０分間のインキュベーションのために、光を避けながら氷上に置いた。全てのチューブをＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬで満たし、４００ｇで５分間遠心分離することによってそれぞれ１回洗浄した。次いで、吸引作用に注意し、細胞損失を引き起こし得るチューブの底に触れるのを避けて、上清を真空吸引によって捨てた。試験細胞チューブをＦＡＣＳ緩衝液４００μＬで再懸濁し、次いで、光を避けて４±２℃の冷蔵庫に保管した。
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリーを染色直後に行った。データ分析を行うために、ＭＣＦ７細胞結合の百分率を、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ４ Ｆｌｏｗ Ｒｅｓｅａｒｃｈソフトウェアによって分析した。ヒストグラムプロットでは、アイソタイプ対照をゲーティングし、ゲーティング細胞の５％がバックグラウンドであると定義した。バックグラウンドの設定に基づいて、試験細胞チューブの結合領域（Ｍ１）の百分率を決定した。この設定では、アイソタイプ対照より５％以上の試験細胞を、ＭＣＦ７細胞の陽性結合とみなした。図８Ａは、ＨＰＡＣ細胞上の１００％の市販のＳＳＥＡ−４抗体（ＭＣ−８１３−７０）を示す。図８Ｂは、ＨＰＡＣ細胞上の９９．５９％の１Ｊ１ｓを示す。図８Ｃは、ＨＰＡＣ細胞上の５５．５６％の２Ｆ２０ｓを示す。図８Ｄは、ＨＰＡＣ細胞上の９５．７６％の１Ｇ１ｓを示す。それは、１Ｊ１ｓがＨＰＡＣ細胞（膵臓細胞株）上で最良の細胞結合親和性を有することを示す。さらに、図９は、種々のがん細胞株及び非がん細胞株に対する代表的なＳＳＥＡ−４抗体のＦＡＣＳ結合アッセイ結果を示す。それはまた、１Ｊ１ｓがＭＣＦ−７（乳がん）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（乳がん）及びＨＫ２（腎臓、皮質／近位尿細管）に対して最良の細胞結合親和性を有することを示す。
［実施例４］
ＳＳＥＡ−４、ＳＳ系列及びＧｂ系列糖を用いたＥＬＩＳＡ分析による代表的な抗ＳＳＥＡ４ ＩｇＧ抗体のエピトープマッピング
試薬／緩衝液調製
コーティング抗原
ＳＳＥＡ４−脂質１、ＳＳＥＡ４−セラミド、ＳＳ系列糖−脂質１及びＧｂ系列糖−脂質１粉末をガラス瓶中の１００％エタノールに溶解し、使用するまで４℃で保管した。１０倍ブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ６４２９）を、使用するために再蒸留水（ｄ．ｄ．Ｈ２Ｏ）で１倍希釈した。洗浄緩衝液：Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．５ｍＬをＰＢＳ１Ｌに添加して、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を作製した。
一次抗体
市販のＭＣ−８１３−７０ＳＳＥＡ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３０４０２）、１Ｇ１ｓ、１Ｊ１ｓ及び２Ｆ２０ｓ ＳＳＥＡ４抗体を、エッペンドルフチューブ中１０μｇ／ｍＬでブロッキング緩衝液に希釈した。
二次抗体
ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０３０−０４）を再水和して、ｄ．ｄ．Ｈ２Ｏ中０．３ｍｇ／ｍＬ溶液２．０ｍＬを作製した。グリセリン１．０ｍＬ（ＡＣＳ等級以上）を２ｍＬエッペンドルフに添加してエッペンドルフの１ｍＬのスケール目盛に到達させた。再水和抗体０．５ｍＬをグリセリンに移し、十分混合し、−２０±２℃の冷蔵庫で保管した。
基質溶液
もともと４℃で保管していた基質溶液（ＥＬＩＳＡ用のアルカリホスファターゼイエロー（ｐＮＰＰ）液体基質系、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ７９９８）を、使用前に３７℃の水浴中で加温した。
プレートコーティング
個々のＳＳＥＡ４−脂質１ ２０μｇ、ＳＳＥＡ４−セラミド、脂質１結合ＳＳ／Ｇｂ系列糖（コーティング抗原）をエタノール５ｍＬに添加し、穏やかに混合した（０．２μｇ糖／ウェル×１００−ウェルプレート＝２０μｇ；５０μＬ／ウェル×１００ウェル＝５ｍＬ）。コーティング抗原５０μＬを氷上で個々のプレートの各ウェルにピペット操作で入れた。プレートを標識し、蓋で覆い、室温で一晩インキュベートした。ブロッキング緩衝液１００μＬを各ウェルに添加し、室温（２２〜２６℃）で約３０分間インキュベートした。
１：５０希釈一次抗体（１０μｇ／ｍＬ）１２０μＬをカラム２の上部ウェルにピペット操作で入れた。次いで、１８０μＬをカラム２ウェルの残りについて添加し、最初のカラム（カラム１）をブランク用に空のままにした。１０μｇ／ｍＬ一次抗体６０μＬを第１のウェルから第２のウェルに移した（２．５μｇ／ｍＬ抗ＳＳＥＡ−４抗体）。ウェルを繰り返しピペット操作によって混合した。工程を繰り返し、一次抗体希釈（４倍希釈）の以下のウェルを作製した：第１のウェル＝１０μｇ／ｍＬ（１：５０希釈）、第２のウェル＝２．５μｇ／ｍＬ（１：２００希釈）、第３のウェル＝０．６２５μｇ／ｍＬ（１：８００希釈）、第４のウェル＝０．１５６μｇ／ｍＬ（１：３２００希釈）、第５のウェル＝０．０３９μｇ／ｍＬ（１：１２８００希釈）、第６のウェル＝０．０１μｇ／ｍＬ（１：５１２００希釈）、第７のウェル＝０．０２５μｇ／ｍＬ（１：２０４８００希釈）、第８のウェル＝０．０００６μｇ／ｍＬ（１：８１９２００希釈）。
抗原コーティングプレートをブロッキング緩衝液と３０分間インキュベートした後、ブロッキング緩衝液を吸引除去し、各ウェルを洗浄緩衝液２００μＬで３回洗浄した。希釈陽性対照５０μＬ（市販のＳＳＥＡ−４抗体ＭＣ−８１３−７０）及び代表的な一次抗体を、希釈プレートから、個々のＳＳＥＡ４コーティング抗原の試験プレートのウェルに添加した。試験プレートを覆い、標識し、室温で約１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、洗浄緩衝液２００μＬで３回洗浄した。
二次抗体２５μＬをブロッキング緩衝液４９７５μＬ（１：２００希釈）に添加し、穏やかに混合した（５０μＬ／ウェル×１００ウェルプレート＝５ｍＬ）。二次抗体溶液５０μＬを各ウェルにピペット操作で入れた。プレートを覆い、標識し、室温で約４５分間インキュベートした。インキュベーション後、二次抗体溶液を全てのウェルから吸引し、全てのウェルを洗浄緩衝液２００μＬで４回洗浄した。
基質溶液１００μＬを各ウェルにピペット操作で入れ、３７±２℃で２０分間インキュベートし、停止溶液５０μＬ（アルカリホスファターゼ停止溶液、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ５８５２）を添加して停止させ、十分混合し、次いで、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４０５ｎｍで読み取った。
データ解析
データを統計解析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用してシグモイド用量−反応（可変勾配）法によって曲線を描き、２連結果から平均及びＳＤを計算した。二次抗体は陰性対照としてのみであった。
図１０は、脂質１と結合した切断ＳＳＥＡ−４：ＳＳ系列糖及びＧｂ系列糖の構造を示す。図１１は、一次ＳＳＥＡ−４抗体のエピトープマッピング結果を示す。切断グリカン末端抗原は、完全なＳＳＥＡ−４構造が１Ｊ１ｓ及び２Ｆ２０ｓ認識に必要であることを示した。一方、市販のＳＳＥＡ−４抗体ＭＣ−８１３−７０及び１Ｇ１ｓは、最後の化合物構造（Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＮｅｕＡｃ）に起因してＳＳＥＡ−４とＳＳ５の両方も認識する。それは、糖の還元末端における第１の化合物構造（グルコース）が、エピトープ認識にはあまり重要でないことを意味する。
［実施例５］
ＳＳＥＡ−４−脂質１コーティング化学発光サンドイッチＥＬＩＳＡ分析による代表的なビオチン化糖との交差活性
試薬
ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ、ブロッキング緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３７５１５）をそのまま使用した。一次ＳＳＥＡ−４抗体（１Ｇ１ｓ、１Ｊ１ｓ、２Ｆ２０ｓ及びＭＣ−８１３−７０）を２．５μｇ／ｍＬでＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋに希釈した。洗浄緩衝液：Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．５ｍＬをＰＢＳ１Ｌに添加して、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を作製した。二次抗体：１：５００００希釈のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ中ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＰＲ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−００３）。ビオチン化糖（以下に列挙する）及びＤ−ビオチン（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ、カタログ番号ＦＢ０２６３３）を１ｘ ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ５４９３−４Ｌ）に溶解して１ｍｇ／ｍＬのストックを作製した。
Figure 2019513144
Figure 2019513144
プレートコーティング
９６ウェルの市販のストレプトアビジンＨＢＣコーティング黒色プレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉ、カタログ番号１５５０３）を２００μＬ／ウェルのウェル洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ５４９３）で１回洗浄した。ビオチン化糖ストックを１×ＰＢＳ中１ｎｇ／ｍＬに希釈した。希釈したビオチン化糖の体積を試験プレートに添加した（５０μＬ／ウェル；５０ｎｇ／ウェル）。試験プレートを室温で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液２００μＬで１回洗浄した。ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ２００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。
一次抗体
Figure 2019513144
インキュベーション後、ウェルを吸引し、洗浄緩衝液２００μＬで１回洗浄した。２．５μｇ／ｍＬ一次抗体５０μＬを個々のプレートに添加した。試験プレートを覆い、標識し、室温で約１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、洗浄緩衝液２００μＬで４回洗浄した。
二次抗体。
二次抗体溶液５０μＬを各ウェルにピペット操作で入れた。プレートを覆い、標識し、室温で約４５分間インキュベートした。インキュベーション後、二次抗体溶液を全てのウェルから吸引し、全てのウェルを洗浄緩衝液２００μＬで５回洗浄した。
基質溶液１００μＬ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉ、カタログ番号ＰＩＥ３７０７４）を各ウェルにピペット操作で入れ、室温で１〜５分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ）を用いて４７０ｎｍでプレートを読み取った。
データ解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを用いてデータを統計解析した。平均及びＳＤを３連結果から計算した。
図１２は、ＳＳＥＡ−４抗体のＥＬＩＳＡ親和性アッセイ結果を示す。１Ｇ１ｓ、１Ｊ１ｓ、２Ｆ２０ｓ及び市販のＭＣ−８１３−７０を含む代表的なＳＳＥＡ−４抗体は、他の腫瘍関連糖と最小の相互作用を示し、ＳＳＥＡ−４抗原（ＳＳＥＡ４及びＳＳＥＡ４−ｂ−Ｎ−Ｓｐ）に特異的である。それは、本発明におけるＳＳＥＡ４−抗体の結合特異性を示した。
［実施例６］
ヌードマウスにおけるＧｌｏｂｏ Ｈ抗体と組み合わせた代表的な抗体の抗腫瘍活性の測定
ヒト膵臓腺癌の異種移植片腫瘍モデルにおいて、ＨＰＡＣ細胞をＢＡＬＢ／ｃ雄ヌードマウスに皮下（ｓｃ）移植し、試験物質を、平均腫瘍サイズが５０〜１２０ｍｍ３に達したら開始して１週間に２回５週間、腹腔内（ｉｐ）注射によって０．１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇの両抗体の組み合わせで投与した。次いで、腫瘍サイズを監視し、１週間に２回、３７日間記録した。死亡率、体重及び明白な動物毒性の兆候も、１週間に２回、３７日間記録した。腫瘍成長をＴ／Ｃ（処理／対照）×１００％として計算した。
試験物質及び投与パターン
試験物質を、液体形態で１又は１．０３ｍｇ／ｍＬで調製した。指定される投与濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬ）を得るために、ストック溶液をクエン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭクエン酸ナトリウム及び１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で希釈することによって、各投与前日に試験物質を新たに調製した。試験物質を１０ｍＬ／ｋｇの投与量で、１週間に２回、５週間、腹腔内投与した。
Figure 2019513144
細胞株
ＢＡＬＢ／ｃ雄ヌードマウスの右側腹部への０．１ｍＬの１×１０６個細胞／マウスの皮下移植の前に、ＨＰＡＣ腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１１９、ヒト膵臓腺癌）を調製し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｐａｎｌａｂｓ Ｔａｉｗａｎ Ｌｔｄ．で培養した。
動物
６〜７週齢、体重１８〜２２ｇのＢＡＬＢ／ｃ雄性ヌードマウスをＢｉｏＬａｓｃｏ Ｔａｉｗａｎ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓライセンシー下）から得た。全ての動物を、１２時間の明／暗サイクルで、十分に制御された温度（２０〜２４℃）及び湿度（３０〜７０％）環境に維持した。標準実験用食餌［ＭＦＧ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、日本）］及びオートクレーブ処理した水道水を自由に利用できるようにした。住居、実験及び動物の処分を含むこの研究の全ての態様は、ＡＡＡＬＡＣ認定実験室動物施設において、「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ：Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０１１）に一般的に準拠して行った。さらに、動物の飼育及び使用プロトコルは、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｔａｉｗａｎ，Ｌｔｄ．のＩＡＣＵＣによって総説及び承認された。
化学物質
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、上皮成長因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、インスリン（Ｓｉｇｍａ、米国）、ヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ、米国）及びペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）。
装置
動物ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ、イタリア）、１０００ｍＬビーカー（Ｋｉｍａｘ、米国）、キャリパー（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、日本）、クラスＩＩ生物学用安全キャビネット（ＮｕＡｉｒｅ、米国）、遠心分離機５８１０Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）、μインキュベーター（Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、米国）、個別換気ケージ（ＩＶＣ、３６ミニ隔離飼育器システム）（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ、イタリア）、マウススケール番号Ｚ−４０（Ｔａｃｏｎｉｃ、米国）、ステンレス鉗子（Ｋｌａｐｐｅｎｅｃｋｅｒ、ドイツ）及び垂直層流（Ｔｓａｏ−Ｈｓｉｎ、台湾）。
方法
６〜７週齢及び体重１８〜２２ｇのＢＡＬＢ／ｃヌード雄マウスを使用した。ヒト膵臓腺癌腫瘍細胞ＨＰＡＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１１９、０．１ｍＬ中１．０×１０６個）を動物の右側腹部に皮下注射した。その後、動物を、各群が８匹の動物からなる６群に分けた。試験物質及びビヒクルの投与を、平均腫瘍サイズが５０〜１２０ｍｍ３に達した時に開始した（１日目として設定）。試験物質（表Ｘの投与による）を、各投与前に新たに調製した。試験物質及びビヒクルを、１週間に２回、５週間、腹腔内注射によって投与した。腫瘍サイズ、体重及び死亡率を、試験物質又はビヒクルの投与前３７日間、１週間に２回記録した。
腫瘍体積（ｍｍ３）を、楕円体の式：長さｘ（幅）２×０．５に従って決定した。腫瘍成長（Ｔ／Ｃ）を、以下の式を用いて計算した：Ｔ／Ｃ＝（Ｔｎ）／（Ｃｎ）×１００％（式中、Ｃ１（Ｃｎ）は対照群におけるｎ日目の腫瘍体積であり、Ｔ１（Ｔｎ）は処理群におけるｎ日目の腫瘍体積である）。Ｔ／Ｃ値≦４２％を有意な抗腫瘍活性とみなした。
結果
Figure 2019513144
Figure 2019513144
試験物質を１週間に２回、５週間、腹腔内投与した。腫瘍サイズを測定し、１週間に２回、３７日間記録した。腫瘍成長をＴ／Ｃ（処理／対照）×１００％として計算した。
Ｔ／Ｃ値≦４２％を有意な抗腫瘍活性とみなした。さらに、二元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてボンフェローニ検定を適用して、＊Ｐ＜０．０５で１群（ビヒクル、ＰＢＳ）と比較した統計学的有意差を確認した。
図１３は、様々な試験化合物を３７日間投与したヌードマウスの写真を示した。この試験の終了時の腫瘍成長抑制（ＴＧＩ（％）＝（Ｖ対照−Ｖ試験）／（Ｖ対照−Ｖ最初）×１００）は、０．１ｍｇ／ｋｇ １Ｊ１ｓで１０．８％、１０ｍｇ／ｋｇ １Ｊ１ｓで２４．４％、１０ｍｇ／ｋｇ ２Ｃ２で１５．４％（０．１ｍｇ／ｋｇ ２Ｃ２はＨＰＡＣの抑制能力を示さなかった）と計算された。しかしながら、０．１ｍｇ／ｋｇ ２Ｃ２と組み合わせた０．１ｍｇ／ｋｇ １Ｊ１ｓは、３３．７％の腫瘍成長抑制を示し、１Ｊ１ｓ又は２Ｃ２単独による処理の１００倍投与よりもさらに高かった。
本発明の具体的な態様を記載及び例示してきたが、このような態様は、本発明の単なる例示とみなされるべきであり、添付の特許請求の範囲に従って解釈される本発明を限定するものとみなされるべきではない。本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物又は特許出願が全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることを具体的及び個別的に示されているかのように、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。上記の発明を、理解を明確にする目的で、例示及び実施例によってある程度詳細に記載してきたが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、そこに一定の変更及び修正を行うことができることが容易に明らかになるだろう。

Claims (50)

  1. 配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
    を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 重鎖及び軽鎖を含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    前記重鎖が、配列番号１３、１５又は１７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 軽鎖及び重鎖を含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    前記軽鎖領域が、配列番号６、８又は１０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７９で寄託された１Ｊ１ｓとして示されるハイブリドーマによって産生される抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７９で寄託された１Ｊ１ｓとして示されるハイブリドーマ。
  6. 配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
    を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. 重鎖及び軽鎖を含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    前記重鎖が、配列番号３１、３３又は３５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  8. 軽鎖及び重鎖を含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    前記軽鎖が、配列番号２４、２６又は２８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７８で寄託された１Ｇ１ｓとして示されるハイブリドーマによって産生される抗体又はその抗原結合フラグメント。
  10. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７８で寄託された１Ｇ１ｓとして示されるハイブリドーマ。
  11. 配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は配列番号４０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
    を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  12. 重鎖及び軽鎖を含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    前記重鎖が、配列番号４９、５１又は５３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  13. 軽鎖及び重鎖を含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    前記軽鎖が、配列番号４２、４４又は４６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同性の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  14. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７６で寄託された２Ｆ２０ｓとして示されるハイブリドーマによって産生される抗体又はその抗原結合フラグメント。
  15. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７６で寄託された２Ｆ２０ｓとして示されるハイブリドーマ。
  16. 可変ドメインが、１つ以上の炭水化物抗原に結合することができる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  17. 炭水化物抗原がＳＳＥＡ−４（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌα１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１）（ＳＳＥＡ−４六糖）である、請求項１６に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  18. 配列番号３、配列番号２１又は配列番号３９から選択されるＶＨ及び配列番号４、配列番号２２又は配列番号４０から選択されるＶＬを含む抗体又はその結合フラグメント。
  19. （ａ）免疫グロブリン分子全体；（ｂ）ｓｃＦｖ；（ｃ）Ｆａｂフラグメント；（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２；又は（ｅ）ジスルフィド結合Ｆｖから選択される、請求項１〜１８に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  20. 抗体がヒト化抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  21. ＩｇＧ又はＩｇＭである、請求項２０に記載の抗体。
  22. ＳＳＥＡ−４に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ドメインをさらに含む、請求項２０に記載の抗体。
  23. ＣＡＲドメインが、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８及び／又はＣＤ２８の膜貫通ドメインの配列を含む；並びに前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ及びＣＤ３ζの１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの配列を含む、請求項２２に記載の抗体。
  24. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント及び少なくとも１種の薬学的に許容される担体
    を含む医薬組成物。
  25. 少なくとも１種のさらなる治療剤をさらに含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 対象のがんを治療する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体及び／又はＧｌｏｂｏシリーズの抗体の組み合わせを含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
  27. がん細胞の増殖を抑制する方法であって、有効量の請求項２４に記載の医薬組成物及び／又はＧｌｏｂｏシリーズの抗体の組み合わせを、それを必要とする対象に投与するステップを含み、がん細胞の増殖が抑制される、方法。
  28. 対象のがん診断のための方法であって、
    （ａ）対象から体液試料又は細胞試料を得るステップ、
    （ｂ）前記試料を、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４又はＧｌｏｂｏ−Ｈからなる群から選択されるがんマーカーのパネルの発現を検出することができる１つ以上の抗体と接触させるステップ；
    （ｃ）前記１つ以上の抗体と前記細胞又は前記試料の結合をアッセイするステップ；及び
    （ｄ）抗体結合のレベルを測定及び正常対照と比較することによって、アッセイにおける前記対象のがん状態を評価して、前記対象におけるがんの存在を決定するステップ
    を含む方法。
  29. 患者の腫瘍の予後を監視することによってヒト患者を治療する方法であって、
    （ａ）前記患者から体液試料又は細胞／組織試料を得るステップ；
    （ｂ）前記試料を、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４又はＧｌｏｂｏ−Ｈからなる群から選択される１つ以上のマーカーを検出することができる１つ以上の抗体と接触させるステップ；
    （ｃ）前記抗体と前記細胞又は前記細胞／組織試料の結合レベルをアッセイするステップ；
    （ｄ）前記試験試料中の前記マーカーのレベルを測定し、参照試料中のレベルと比較するステップ；
    （ｅ）ステップ（ｄ）における決定に基づいて前記患者の腫瘍の病期及び／又は予後を決定するステップ；及び
    （ｆ）（ｅ）に基づいて前記患者の免疫療法の治療計画を調整するステップ
    を含む方法。
  30. がんが、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆道がん、肝がん、頬側がん、胃がん、結腸がん、上咽頭がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍からなる群から選択される、請求項２６〜２８に記載の方法。
  31. Ｇｌｏｂｏシリーズの抗体が、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ、抗ＳＳＥＡ３又は抗ＳＳＥＡ４抗体である、請求項２６又は２７に記載の方法。
  32. 対象がヒトである、請求項２６〜２８に記載の方法。
  33. 細胞が、がん幹細胞である、請求項２７〜２９に記載の方法。
  34. 試料が、血清、血液、血漿、細胞、細胞培地、唾液、尿、リンパ節液、腫瘍生検又は組織培養物からなる群から選択される、請求項２８又は２９に記載の方法。
  35. 対象を撮像する方法であって、
    （ａ）有効量の請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体を投与するステップであって、前記抗体は造影剤に結合しているステップ；及び
    （ｂ）前記対象において前記造影剤を検出及び測定するステップ；及び
    （ｃ）ディスプレイ上に画像を作成及び表示するステップ
    を含む方法。
  36. 造影剤が発蛍光団、色素、ＭＲＩ造影剤又は放射性核種である、請求項３５に記載の方法。
  37. 対象ががんを有し、がん転移を検出する方法としてさらに定義される、請求項３５に記載の方法。
  38. 対象がヒトである、請求項３５に記載の方法。
  39. アッセイが、抗体ベースのアッセイ又はアレイである、請求項２８〜３８に記載の方法。
  40. 治療剤及びＳＳＥＡ−４に結合する抗体又は抗原結合フラグメントを含む抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であって、前記治療剤がリンカーによって前記抗体又は前記抗原結合フラグメントと共有結合している、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
  41. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、請求項１〜２３から選択される、請求項４０に記載のＡＤＣ。
  42. がんを治療する方法であって、有効量の請求項４０に記載のＡＤＣを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
  43. がんが、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆道がん、肝がん、頬側がん、胃がん、結腸がん、上咽頭がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. Ｇｌｏｂｏシリーズの抗原に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＴ細胞表面抗原に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む、請求項１〜２３に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
  45. Ｇｌｏｂｏシリーズの抗原がＧｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ−３又はＳＳＥＡ−４を含む、請求項４４に記載の二重特異性抗体又は抗原結合部分。
  46. Ｔ細胞表面抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ４４を含む、請求項４４に記載の二重特異性抗体又は抗原結合部分。
  47. がんを治療する方法であって、有効量の請求項４４に記載の二重特異性抗体又は抗原結合部分を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
  48. がんが、乳がん、肺がん、食道がん、直腸がん、胆道がん、肝がん、頬側がん、胃がん、結腸がん、上咽頭がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、精巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、口腔がん、神経内分泌がん、副腎がん、甲状腺がん、骨がん、皮膚がん、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫又は脳腫瘍からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 請求項１〜２３に記載の均質な抗体の集団を作製する方法であって、
    （ａ）モノクローナル抗体をα−フコシダーゼ及び少なくとも１種のエンドグリコシダーゼと接触させるステップ；
    （ｂ）単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体を産生するステップ；及び
    （ｃ）一般的なグリカンを抗体のＦｃ領域のＧｌｃＮＡｃに付加して、前記グリコフォームを有する均質な抗体を形成するステップ
    を含む、方法。
  50. 均質な抗体が、ＳＳＥＡ−４に結合する、請求項４９に記載の方法。
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