CN102482643B - 人胚胎干细胞的分化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过将胰腺内分泌前体细胞群移植到动物体内来降低动物血糖水平的方法。

Description

人胚胎干细胞的分化
相关专利申请的交叉引用
本发明要求于2009年7月20日提交的专利申请61/226,923的优先权。
技术领域
本发明提供通过将胰腺内分泌前体细胞群移植到动物体内来降低动物血糖水平的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞表达多种标志物，例如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在PDX1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDX1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes49：157，2000)报道，小鼠胚胎干细胞衍生的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖恢复正常。
在一个例子中，Hori等人(PNAS99：16105，2002)公开了用磷酸肌醇3-激酶的抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。
又如，Blyszczuk等人(PNAS100：998，2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生产胰岛素的细胞。
Micallef等人报道，视黄酸可以调控胚胎干细胞定向形成PDX1阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸是诱导PDX1表达最有效的(Diabetes54：301，2005)。
Miyazaki等人报道过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡糖激酶、神经元素3、p48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes53：1030，2004)。
Skoudy等人报道，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到了最大的效果。他们还观察到，胰岛素和Pdx1mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nMFGF7处理导致了Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。
Shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细胞(GenesCells.2005年6月；10(6)：503-16)。
Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号传导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury[阳性]/HNF3β[阳性]内胚层细胞(US2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006年)声称：“Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。
与可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806；WO99/20741；WO01/51616)。
在一个例子中，Benvenistry等人声称：“我们得出结论认为，Pdx1的过表达提高了胰腺富集基因的表达，胰岛素表达的诱导可能需要另外的仅存在于体内的信号”(Benvenistry等人，StemCells2006；24：1923-1930)。
又如，US2008/0241107A1对一种分泌胰岛素的细胞的制备方法提出了权利要求，该方法包括：a)获取不产生胰岛素的细胞；以及b)用含有高葡萄糖的培养基来温育此细胞，其中该细胞可分泌胰岛素。
因此，仍明显需要开发用于建立能扩增以满足目前临床需要，同时又保持分化成胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜力的多能干细胞系的条件。我们已采用替代方法，以提高使人胚胎干细胞朝胰腺内分泌细胞分化的效率。
发明內容
在一个实施例中，本发明提供了通过将胰腺内分泌前体细胞群移植到动物体内来降低动物血糖水平的方法。
附图说明
图1示出了不同基础培养基对NKX6.1(分图a)、PDX1(分图b)、PTF1α(分图c)和NGN3(分图d)表达的影响。在第4阶段第3天采集重复样品进行实时PCR分析。这些图表示各基因相对于DMEM/F12的诱导倍数。
图2示出了在第4阶段第3天用DMEM/F12(分图a、c、e和g)处理的细胞和用DMEM-高葡萄糖(分图b、d、f和h)处理的细胞的胰腺标志物PDX1(分图a和b)、NKX6.1(分图c和d)、CDX2(分图e和f)和NGN3(分图g和h)的免疫荧光图像，其中处理方法如实例1中所述。
图3示出了根据实例2中所述的方法处理的细胞样品的PDX1(分图a)、NKX6.1(分图b)、PTF1α(分图c)、NGN3(分图d)、PAX4(分图e)和NKX2.2(分图f)的表达。在指示的时间采集重复样品进行实时PCR分析。这些图表示各基因相对于在第3阶段第1天的基因表达的诱导倍数。
图4示出了根据实例2中所述的方法处理的细胞中胰岛素(INS)、胰高血糖素(GCG)、PDX1、NKX6.1、NGN3、MAFB和NEUROD的表达。收集重复样品用于实时PCR分析。这些图表示各基因相对于在第3阶段第4天的基因表达的诱导倍数。浅灰色柱条表示从第3阶段第4天收获的细胞中取得的样品的数据。深灰色柱条表示从第4阶段第3天收获的细胞中取得的样品的数据。黑色柱条表示从第5阶段第5天收获的细胞中取得的样品的数据。
图5示出了根据实例3中所述的方法处理的细胞中PDX1、NKX6.1、NGN和PTF1α的表达。在第4阶段第3天采集重复样品进行实时PCR分析。这些图表示在第4阶段第3天各基因相对于处理组1的基因表达的诱导倍数。浅灰色柱条表示从T1(处理1)组收获的细胞中取得的样品的数据。白色柱条表示从T2(处理2)组收获的细胞中取得的样品的数据。深灰色柱条表示从T3(处理3)组收获的细胞中取得的样品的数据。黑色柱条表示从T4(处理4)组收获的细胞中取得的样品的数据。分图b示出了根据实例3中所述的方法处理的细胞中胰岛素的表达。在第4阶段第3天(S4，D3)和第4阶段第8天(S4，D8)采集重复样品进行实时PCR分析。这些图表示在第4阶段第3天各基因相对于处理组1(T1)的基因表达的诱导倍数。
图6示出了移植的内分泌前体细胞的葡萄糖刺激人C肽释放动力学。具体地讲，该图示出了施用葡萄糖60分钟后人C肽(y轴)的水平。x轴指示动物编号和移植后的天数。
图7示出了移植的内分泌前体细胞的葡萄糖刺激人C肽释放动力学。具体地讲，该图示出了施用葡萄糖60分钟后人C肽(y轴)的水平(分图a)，以及施用葡萄糖前后人C肽的水平(分图b)。x轴指示动物编号和移植后的天数。
图8示出了移植的内分泌前体细胞的葡萄糖刺激人C肽释放动力学。具体地讲，该图示出了施用葡萄糖60分钟后人C肽(y轴)的水平。x轴指示动物编号和移植后的天数。
图9示出了移植的内分泌前体细胞的葡萄糖刺激人C肽释放动力学。具体地讲，该图示出了施用葡萄糖60分钟后人C肽(y轴)的水平(分图a)，以及施用葡萄糖前后人C肽的水平(分图b)。x轴指示动物编号和移植后的天数。
图10示出了移植的内分泌前体细胞的葡萄糖刺激人C肽释放动力学。具体地讲，该图示出了施用葡萄糖60分钟后人C肽(y轴)的水平(分图a)，以及施用葡萄糖前后人C肽的水平(分图b)。x轴指示动物编号和移植后的天数。
图11示出了植入后第3周移植物样品的形态学和免疫荧光分析。a)人细胞核抗原和DAPI的染色；b)CK19和PDX1的染色中显示的连续切片的显微图。
图12示出了植入后第3周(分图a)、第10周(分图b)和第13周(分图c)针对胰岛素和胰高血糖素染色的移植物样品的形态学和免疫荧光分析。分图d示出了植入后第13周针对PDX1和胰岛素染色的移植物样品的形态学和免疫荧光分析。分图e示出了植入后第13周针对NEUROD1和胰岛素染色的移植物样品的形态学和免疫荧光分析。
具体实施方式
为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分成下列描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞还由它们的以下能力来表征：从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多个胚层的组织的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多数的组织(如果不是所有的组织的话)的能力。
干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但在特定组织、器官或生理***内能产生所有的细胞(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代细胞包括：HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能够产生比多能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)不足的地位的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”或“第1阶段细胞”或“第1阶段”是指表达至少一种下列标志物的细胞：SOX-17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达至少一种下列标志物的细胞：PDX1、HNF-1β、PTF1α、HNF6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。
如本文所用，“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”是指表达至少一种下列标志物的细胞：NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、MAFB、胰岛素、胰高血糖素或生长抑素。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞、胰腺激素分泌细胞和β细胞谱系的细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。
如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多肽的可检测水平，在所关注细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”指能够表达下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“胰腺内分泌前体细胞”是指定形内胚层谱系中能够表达NGN3并可进一步分化为内分泌***细胞(包括但不限于胰岛激素表达细胞)的专能细胞。与较少特异性分化的定形内胚层谱系细胞(如PDX1阳性胰腺内胚层细胞)相比，内分泌前体细胞无法分化成与其一样多的不同细胞、组织和/或器官类型。
如本文所用，“胰腺激素生成细胞”指能够生成至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可以表达一种或多种阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可使用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物(Thomson等人，Science282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用VectorRed作为底物显影来检测，如生产商所描述(VectorLaboratories，BurlingameCalif)。未分化的多能干细胞还通常表达Oct-4和TERT，这可通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自三个胚层的细胞类型。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。
可以使用标准G带技术并与已公布的相应灵长类物种的核型相比较来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的类型包括确立多能细胞系。非限制性例子是确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。作为另一种选择，在培养***中培养多能干细胞，所述培养***基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行实质分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
Amit等人(Biol.Reprod68：2150-2156，2003)公开了衍生自人***的饲养细胞层。
又如，Inzunza等人(StemCells23：544-549，2005)公开了来自人出生后***成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。US6642048声称：“本发明包括从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的***系和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养基以及用该调理培养基培养干细胞的方法”。
又如，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞维持、增殖和分化的条件培养基。WO2005014799声称：“通过鼠细胞(特别是分化并永生化的转基因肝细胞，称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性对根据本发明制备的培养基进行调理”。
又如，US20070010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学成分确定的培养基。
一种备选的培养***采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprodDOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19目)公开了一种无饲养细胞的无血清培养***，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
又如，US20050233446公开了一种用于培养干细胞，包括未分化的灵长类原始干细胞的限定培养基。在溶液中，此培养基与培养中的干细胞相比基本上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行实质上非分化性生长所必需的。
又如，US6800480声称：“在一个实施例中，提供了用于以基本上未分化状态培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，其包括低渗透压、低内毒素基础培养基，此培养基对于支持灵长类来源的原始干细胞的生长是有效的。该基础培养基混合了有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质。该培养基还包含非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子”。
又如，US20050244962描述：“在一个方面，本发明提供了一种培养灵长类胚胎干细胞的方法。在基本上不含哺乳动物胎血清(优选也基本上不含任何动物血清)的培养物中，并在存在由不只是成纤维细胞饲养层的来源提供的成纤维细胞生长因子情况下培养干细胞。在优选的形式中，通过添加足量的成纤维细胞生长因子，使得之前为维持干细胞培养物所需的成纤维细胞饲养层变为非必需的”。
在另外的例子中，WO2005065354公开了一种基本上无饲养细胞和无血清的成分确定的等渗培养基，其包含：a.基础培养基；b.bFGF，其量足以支持实质上未分化的哺乳动物干细胞生长；c.胰岛素，其量足以支持实质上未分化的哺乳动物干细胞生长；和d.抗坏血酸，其量足以支持实质上未分化的哺乳动物干细胞生长。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基质是(BectonDickenson)。是得自Engelbreth-HolmSwarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可用如下组分制备，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco货号11965-092；敲除达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KODMEM)，Gibco货号10829-018；Ham′sF12/50％DMEM基础培养基；200mML-谷氨酰胺，Gibco货号15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma货号M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco货号13256-029。
胰腺内分泌前体细胞的形成
在一个实施例中，本发明提供产生胰腺内分泌前体细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，和
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成胰腺内分泌前体细胞。
适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)和人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，Sweden)。同样适用于本发明的是表达至少一种下列多能细胞特征性标志物的细胞：ABCG2、CRIPTO、CD9、FOXD3、Connexin43、Connexin45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、NODAL、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、HNF1β、HNF6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌前体细胞特征性标志物选自NGN3、NKX6.1、NeuroD、ISL1、PDX1、PAX4、NKX2.2或ARX。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌前体细胞特征性标志物的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D'Amour等人，NatureBiotechnology23，1534-1541(2005)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development131，1651-1662(2004)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据McLean等人，StemCells25，29-38(2007)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D'Amour等人，NatureBiotechnology24，1392-1401(2006)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与激活素A和血清一起培养，再然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在NatureBiotechnology23，1534-1541(2005)中进行了公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2005中进行了公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A和Wnt配体的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后移除Wnt配体并将所述细胞与激活素A和血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在NatureBiotechnology24，1392-1401(2006)中进行了公开。
例如，可根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/736,908的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/779,311的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为60/990,529的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为61/076,889的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为No.61/076,900的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为61/076,908的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据系列号为61/076,915的美国专利申请中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的表征
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在进行特定方案之前或之后检测该标志物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能细胞的分化。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印迹、原位杂交(参见例如“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(Ausubel等人编辑，2001年增刊))，以及免疫测定如切片材料的免疫组织化学分析、蛋白质印迹，以及对于可在完整细胞中接触到的标志物，有流式细胞分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，UsingAntibodies：ALaboratoryManual，NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress(1998))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且其他特征有待继续辨别。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种如下物质的表达：ABCG2、CRIPTO、FOXD3、Connexin43、Connexin45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过使处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(如CXCR4)来纯化分化的细胞。
从表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成表达胰腺内胚层谱系 特征性标志物的细胞
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D'Amour等人，NatureBiotechnology24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
可通过用成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号传导途径抑制剂KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，并随后将所述细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在NatureBiotechnology24，1392-1401(2006)中进行了公开。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/736,908的美国专利申请中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/779,311的美国专利申请中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，通过根据系列号为60/990,529的美国专利申请中所公开的方法处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的表征
胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内胚层谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内胚层谱系特征性性质。胰腺内胚层谱系特异性标志物包括一种或多种转录因子的表达，这些因子例如有HLXB9、PTF1α、PDX1、HNF6或HNF1β。
可通过将处理过的细胞群暴露于可特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印迹、原位杂交(参见例如“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(Ausubel等人编辑，2001年增刊))，以及免疫测定如切片材料的免疫组织化学分析、蛋白质印迹，以及对于可在完整细胞中触及的标志物，有流式细胞分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，UsingAntibodies：ALaboratoryManual，NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress(1998))。
从表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞形成胰腺内分泌前体细胞
在本发明的一个方面，通过在补充有能够抑制BMP的因子和TGF-β受体I激酶抑制剂的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成胰腺内分泌前体细胞。
在一个实施例中，能够抑制BMP的因子为成头蛋白。成头蛋白可以约100pg/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，成头蛋白以100ng/ml的浓度使用。
在一个实施例中，TGF-β受体I激酶抑制剂为ALK5抑制剂II(Calbiochem，Ca)。ALK5抑制剂II可以约0.1μM至约10μM的浓度使用。在一个实施例中，ALK5抑制剂II以1μM的浓度使用。
在一个实施例中，培养基为含有4500mg/L葡萄糖和1％B27的DMEM。
在一个实施例中，将细胞在培养基中培养约4天。
可通过将处理过的细胞群暴露于可特异性识别由胰腺内分泌前体细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印迹、原位杂交(参见例如“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(Ausubel等人编辑，2001年增刊))，以及免疫测定如切片材料的免疫组织化学分析、蛋白质印迹，以及对于可在完整细胞中触及的标志物，有流式细胞分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，UsingAntibodies：ALaboratoryManual，NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress(1998))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且其他特征有待继续辨别。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种如下物质的表达：ABCG2、CRIPTO、FOXD3、Connexin43、Connexin45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过使处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(如CXCR4)来纯化分化的细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、HNF-1β、PTF1α、HNF6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌前体细胞特征性标志物选自NGN3、NKX6.1、NEUROD、ISL1、PDX1、PAX4、NKX2.2、PAX6或ARX。
从胰腺内分泌前体细胞形成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞
在一个实施例中，可使通过本发明的方法制备的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
可通过本领域的任何方法或者本发明提出的任何方法，使胰腺内分泌前体细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过在含有毒蜥外泌肽4的培养基中培养胰腺内分泌前体细胞，然后移除含有毒蜥外泌肽4的培养基，随后在含有毒蜥外泌肽1、IGF1和HGF的培养基中培养该细胞来使根据本发明方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中进行了公开。
例如，可通过在含有DAPT(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4的培养基中培养胰腺内分泌前体细胞来使根据本发明方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中进行了公开。
例如，可通过在含有毒蜥外泌肽4的培养基中培养胰腺内分泌前体细胞来使根据本发明方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中进行了公开。
例如，可通过下列方法将根据本发明的方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/736,908中的美国专利申请所公开的方法，利用抑制Notch信号传导途径的因子处理胰腺内分泌前体细胞。
例如，可通过下列方法将根据本发明的方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为11/779,311的美国专利申请中所公开的方法，利用抑制Notch信号传导途径的因子处理胰腺内分泌前体细胞。
例如，可通过下列方法将根据本发明的方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为60/953,178的美国专利申请中所公开的方法，利用抑制Notch信号传导途径的因子处理胰腺内分泌前体细胞。
例如，可通过下列方法将根据本发明的方法得到的胰腺内分泌前体细胞进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：根据转让给LifeScan，Inc.的系列号为No.60/990,529的美国专利申请中所公开的方法，利用抑制Notch信号传导途径的因子处理胰腺内分泌前体细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、PAX6、NGN3和NKX2.2。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰内分泌系特征性标志物的细胞为胰内分泌细胞。胰内分泌细胞可为表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰内分泌细胞可为分泌胰激素的细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞可表达PDX1和至少一种下列转录因子：NGN-3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4和PAX6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
疗法
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病，或有发展1型糖尿病风险的患者的方法。在一个实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞移植到患者体内。在一个替代实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使该多能干细胞体外分化成胰腺内分泌前体细胞，以及将该胰腺内分泌前体细胞植入到患者体内。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有2型糖尿病，或有发展2型糖尿病风险的患者的方法。在一个实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使该多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞移植到患者体内。在一个替代实施例中，本方法涉及对多能干细胞进行培养，使该多能干细胞体外分化成胰腺内分泌前体细胞，以及将该胰腺内分泌前体细胞植入到患者体内。
如果合适，可用有利于该植入细胞存活和功能的药剂或生物活性剂对患者进行进一步处理。这些试剂可包括(例如)胰岛素、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、高血糖素样肽-I(GLP-1)和高血糖素样肽-II、GLP-1和2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂例如美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
可使多能干细胞在移植进接受者前分化成胰岛素生成细胞。在一个特定的实施例中，在移植进接受者之前，使多能干细胞完全分化成β-细胞。作为另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进接受者中。可在该接受者中发生进一步分化。
可将定形内胚层细胞或，作为另一选择，胰腺内胚层细胞，或作为另一种选择，β细胞作为分散细胞进行移植，或可使这些细胞形成簇，可将这些细胞簇输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞移植进接受者中的合适位置内。植入位点包括(例如)肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与之同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，利用生长因子使所施用的细胞在体内分化。这些因子可由内源性细胞分泌并原位暴露于所施用的细胞。可通过本领域已知的内源生长因子或外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。
移植中所用的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及培养多能干细胞、使培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将该细胞掺入三维支持物中。在移植进患者前，可使细胞在该支持物上体外维持。作为另一种选择，可将容纳有该细胞的支持物直接移植进患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、屏障物和贮器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生，以及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和非织造结构形式的合成材料和天然材料适用于实践本发明的方法。参见，例如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布的专利申请2004/0062753A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。
为了形成掺有药剂的支承体，可在形成支承体前将药剂与聚合物溶液混合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药物载体的情况下进行。药物可以液体、细分固体或任何其他合适的物理形式存在。作为另一种选择，可将赋形剂添加至支持物中以改变药剂的释放速率。在一个备选实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物(例如在美国专利6,509,369中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物(例如在美国专利6,793,945中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物(例如在美国专利6,331,298中所公开的化合物)掺入支持物中。
支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、IGF-II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、nodal、成头蛋白、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凯萨林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、层粘连蛋白、含有粘附性细胞外基质蛋白例如纤粘蛋白和玻璃粘连蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。
可通过将细胞简单地沉积在该支架上来实现将本发明细胞掺入支架中。细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1Pt2)：3-9(1988))。已经发展了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶用于将软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998))。用于细胞接种的另一种方法是利用离心，这种离心产生最小的应力给接种的细胞并增强接种效率。例如，Yang等人开发了细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，称为离心细胞固定(CentrifugationalCellImmobilization，CCI)。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例
实例1
胰腺内分泌前体细胞群的形成。
在MATRIGEL(按1∶30稀释)涂布的平板上培养人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.在补充有2％BSA(目录号：152401，MPBiomedical，Ohio)和100ng/ml激活素A(R&DSystems，MN)加20ng/mlWNT-3a(目录号：1324-WN-002，R&DSystems，MN)加8ng/mlbFGF(目录号：100-18B，PeproTech，NJ)的RPMI培养基(目录号：22400，Invitrogen，Ca)中培养一天，然后用补充有2％BSA和100ng/ml激活素A加8ng/mlbFGF的RPMI培养基再处理两天(第1阶段)，接下来
b.用DMEM/F12(目录号：11330，Invitrogen，Ca)+2％BSA+50ng/mlFGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.用表1中所示的补充有1％B27(目录号：17504-044，Invitrogen，CA)+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD(目录号：239804，Calbiochem，CA)+2μM视黄酸(RA)(Sigma，MO)+100ng/ml成头蛋白(R&DSystems，MN)的不同基础培养基培养4天(第3阶段)，然后
d.用表1中所示的补充有1％B27(Invitrogen，CA)+100ng/ml成头蛋白+1μMALK5抑制剂II(目录号：616452，Calbiochem，Ca)的不同基础培养基培养3天(第4阶段)。
表1
在分化的第4阶段第3天对培养物进行取样，一式两份，然后利用实时PCR对胰腺标志物的表达进行分析。平行地，固定第4阶段第3天的培养物并针对下列蛋白质进行染色：NKX6.1(目录号：F64A684，DevelopmentalStudiesHybridomaBank，UniversityofIowa)、PDX1、NGN3和CDX2。
根据PCR分析结果，与DMEM/F12中(处理4，表1)或CMRL中(处理3，表1)培养的细胞相比，DMEM培养基中(处理1和处理2，表1)培养的第4阶段第3天的样品显示出NKX6.1、NGN3和PTF1α的表达水平显著提高。在所测试的培养物中观察到PDX1的表达水平无差异。然而，免疫细胞化学表明，在DMEM/F12培养基中培养的细胞中，大部分表达PDX1的细胞也表达了CDX2，这是一种肠内胚层标志物(图2，分图a和e)。相反地，在DMEM培养基中处理的细胞产生了PDX1阳性细胞和CDX2阳性细胞的分离(图2，分图b和f)，其中大部分表达PDX1的细胞不表达CDX2。
此外，从DMEM中处理的细胞中获取的表达PDX1的细胞也表达NKX6.1。如图2所见，到第4阶段结束50至60％的PDX1阳性细胞也表达了NKX6.1(图2的分图d)，20至30％的PDX1阳性细胞表达了NGN3(图2的分图h)。然而，在DMEM中培养的细胞中未观察到NKX6.1和NGN3的共表达。在DMEM/F12或CMRL培养基中培养的细胞中还观察到了PDX1和NGN3的共表达(图2的分图g)，然而，在DMEM/F12或CMRL培养基中处理的细胞中未观察到NKX6.1的表达(图2的分图c)。
这些数据表明，不同的基础培养基有利于不同胰腺内胚层细胞群的产生：使用DMEM/F12，产生了共表达PDX1和CDX2的细胞群，而使用DMEM产生了表达PDX1和NKX6.1但不表达CDX2的细胞群。此外，数据还表明，胰腺基因的表达会随着培养基中葡萄糖浓度的增加而升高。参见图1和图2。
实例2
人胚胎干细胞向胰腺内分泌前体细胞的直接分化。
在MATRIGEL(按1∶30稀释)涂布的平板上培养人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.在补充有2％BSA(目录号：152401，MPBiomedical，Ohio)和100ng/ml激活素A(R&DSystems，MN)加20ng/mlWNT-3a(目录号：1324-WN-002，R&DSystems，MN)加8ng/mlbFGF(目录号：100-18B，PeproTech，NJ)的RPMI培养基(目录号：22400，Invitrogen，Ca)中培养一天，然后用补充有2％BSA和100ng/ml激活素A加8ng/mlbFGF的RPMI培养基再处理两天(第1阶段)，接下来
b.用DMEM/F12(目录号：11330，Invitrogen，Ca)+2％BSA+50ng/mlFGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2M视黄酸(PA)(Sigma，MO)+100ng/ml成头蛋白(R&DSystems，MN)处理四天(第3阶段)，然后
d.用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+100ng/ml成头蛋白+1μMALK5抑制剂II(目录号：616452，Calbiochem，Ca)处理三天(第4阶段)，然后
e.用DMEM(高葡萄糖)+0.5％ITS(Invitrogen，CA)+0.1％BSA+1μMAlk5抑制剂II+100ng/ml成头蛋白+20ng/mlβ细胞素(R&DSystems，MN)处理五天(第5阶段)。
从分化的第2阶段第3天到第4阶段第3天，每天对培养物进行取样，一式两份，然后利用实时PCR对胰腺标志物的表达进行分析。当细胞进入第4阶段后，观察到PDX1、NKX6.1和PTF1α急剧升高(图3的分图a、b和c)。此外，还观察NGN3、PAX4、NKX2.2和NEUROD的显著上调(图3的分图d至f)。PAX4、NKX2.2和NEUROD由NGN3直接调控，这表明胰腺内胚层开始向胰腺内分泌谱系定向。
通过添加TGF-β受体抑制剂、成头蛋白和β细胞素使胰腺内分泌前体细胞体外进一步分化成了胰岛素表达细胞。如图4所示，添加Alk5抑制剂II(TGF-β受体抑制剂)、成头蛋白和β细胞素5天后观察到胰岛素表达水平显著升高。NGN3和PAX4的表达水平有所下降，而PDX1、NKX6.1MAFB和NEUROD的表达水平保持恒定。
实例3
人胚胎干细胞向胰腺内分泌前体细胞直接分化的替代方法。
本实例说明使用Alk5抑制剂II(TGF-β受体家族的抑制剂)和低剂量的外源类视色素，例如可存在于培养基添加物(例如B27)中的视黄醇(维生素A)，使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌前体的替代方法。
在MATRIGEL(按1∶30稀释)涂布的平板上培养第45代人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.在补充有2％BSA、100ng/ml激活素A、20ng/mlWNT-3a和8ng/ml的bFGF的RPMI培养基中处理一天，然后在补充有2％BSA、100ng/ml激活素A和8ng/ml的bFGF的RPMI培养基中再处理两天(第1阶段)，然后
b.用DMEM/F12+2％BSA+50ng/mlFGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+0.1μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白处理四天(处理1，第3阶段)，或
d.用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+0.1μM视黄酸(RA)+1μMAlk5抑制剂+100ng/ml成头蛋白处理四天(处理2，第3阶段)，或
e.DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+1μMAlk5抑制剂+100ng/ml成头蛋白处理四天(处理3，第3阶段)，或
f用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白处理四天(处理4，第3阶段)，然后
g.用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+100ng/ml成头蛋白+1μMALK5抑制剂II处理八天(第4阶段)。
在分化的第4阶段第3天和第8天对培养物进行取样，一式两份，然后利用实时PCR对胰腺标志物的表达进行分析。
在补充有FGF7、成头蛋白和环巴胺-KAAD、ALK5抑制剂II以及补充有低剂量视黄酸(0.1μM)或无外源视黄酸的培养基中处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞诱导了NGN3的表达，并持续上调PDX1和NKX6.1(图5的分图a，处理3和4)。NGN3的表达水平在用高剂量(2μM)视黄酸(分别为图5的分图a，处理4)处理的细胞中类似。这些数据表明，当使用FGF7、成头蛋白和环巴胺-KAAD处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞时，添加Alk5抑制剂II足以诱导胰腺内分泌祖细胞的形成。如图5的分图a所示，在不存在Alk5抑制剂的情况下，在使用低剂量视黄酸(0.1μM)处理的细胞中未观察到NGN3的表达(图5，分图a，处理1)。通过上述处理形成的胰腺内分泌细胞能体外形成胰岛素表达细胞。如图5的分图b所示，使用DMEM(高葡萄糖)+1％B27(Invitrogen，CA)+100ng/ml成头蛋白+1μMALK5抑制剂II处理八天后，所形成的NGN3表达细胞表达了胰岛素。
实例4
胰腺内分泌前体细胞的体内成熟。
在MATRIGEL(按1∶30稀释)涂布的平板上培养第45代人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+20ng/mlWNT-3a+8ng/ml的bFGF处理一天，然后使用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+8ng/ml的bFGF再处理两天(第1阶段)，然后
b.用DMEM/F12+2％BSA+50ng/mlFGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白处理四天(第3阶段)，然后
d.用DMEM-高葡萄糖+1％B27+100ng/ml成头蛋白+1μMALK5抑制剂II处理三天(第4阶段)。
将体外培养细胞的上述方法(方法1)用于在第8、11、14、17、20和23号动物中移植。参见图6。
同时还对替代分化方案进行了测试，其中在MATRIGEL(按1∶30稀释)涂布的平板上培养第45代人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+20ng/mlWNT-3a+8ng/ml的bFGF处理一天，然后使用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+8ng/ml的bFGF再处理两天(第1阶段)，然后
b.用DMEM/F12+2％BSA+50ng/mlFGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.用DMEM(高葡萄糖)+1％B27+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+2μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+Alk5抑制剂II1μM处理四天(第3阶段)，然后
d.用DMEM(高葡萄糖)+1％B27+100ng/ml成头蛋白+Alk5抑制剂II1μM处理三天(第4阶段)。
用1ml的玻璃吸管以机械方式刮取第4阶段末的细胞，随后将其转移到非贴壁板上培养过夜。收集所得的聚集体，将含有5至8百万个细胞的聚集体移植到免疫低下(SCID/Bg)小鼠的肾囊内。将体外培养细胞的此方法(方法2)用于在第324、326、329、331、333号动物中移植。参见图7中的分图a和b。
同时还对替代分化方案进行了测试，其中在MATRIGEL(按1∶30稀释)涂布的平板上培养第45代人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+20ng/mlWNT-3a+8ng/ml的bFGF处理一天，然后使用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+8ng/ml的bFGF再处理两天(第1阶段)，然后
b.用DMEM/F12+2％BSA+50ng/mlFGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.将细胞在DMEM(高葡萄糖)+1％B27+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+0.1μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+Alk5抑制剂II1μM中培养四天(第3阶段)，然后
d.用DMEM(高葡萄糖)+1％B27处理三天(第4阶段)。
用1ml的玻璃吸管以机械方式刮取第4阶段末的细胞，随后将其转移到非贴壁板上培养过夜。收集所得的聚集体，将含有5至8百万个细胞的聚集体移植到免疫受损(SCID/Bg)小鼠的肾囊内。将体外培养细胞的此方法(方法3)用于在第294、295、296、297号动物中移植。参见图8。
同时还对替代分化方案进行了测试，其中在MATRIGEL(按1∶30稀释)涂布的平板上培养第45代人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+20ng/mlWNT-3a+8ng/ml的bFGF处理一天，然后使用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+8ng/ml的bFGF再处理两天(第1阶段)，然后
b.用DMEM/F12+2％BSA+50ng/mlFGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.将细胞在DMEM(高葡萄糖)+1％B27+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+0.1μM视黄酸(RA)+100ng/ml成头蛋白+Alk5抑制剂II1μM中培养四天(第3阶段)，然后
d.用DMEM(高葡萄糖)+1％B27+100ng/ml成头蛋白+Alk5抑制剂II1μM处理三天(第4阶段)。
用1ml的玻璃吸管以机械方式刮取第4阶段末的细胞，随后将其转移到非贴壁板上培养过夜。收集所得的聚集体，将含有5至8百万个细胞的聚集体移植到免疫受损(SCID/Bg)小鼠的肾囊内。将体外培养细胞的此方法(方法4)用于在第336、338、340、342、344号动物中移植。参见图9中的分图a和b。
同时还对替代分化方案进行了测试，其中在MATRIGEL(按1∶30稀释)涂布的平板上培养第45代人胚胎干细胞系H1的细胞，然后使用以下方案使其分化为胰腺内分泌前体细胞：
a.用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+20ng/mlWNT-3a+8ng/ml的bFGF处理一天，然后使用RPMI培养基+2％BSA+100ng/ml激活素A+8ng/ml的bFGF再处理两天(第1阶段)，然后
b.用DMEM/F12+2％BSA+50ng/mlFGF7处理三天(第2阶段)，然后
c.将细胞在DMEM(高葡萄糖)+1％B27+50ng/mlFGF7+0.25μM环巴胺-KAAD+100ng/ml成头蛋白+Alk5抑制剂II1μM中培养四天(第3阶段)，然后
d.采用DMEM(高葡萄糖)+1％B27+100ng/ml成头蛋白+Alk5抑制剂II(第4阶段)。
用1ml的玻璃吸管以机械方式刮取第4阶段末的细胞，随后将其转移到非贴壁板上培养过夜。收集所得的聚集体，将含有5至8百万个细胞的聚集体移植到免疫受损(SCID/Bg)小鼠的肾囊内。将体外培养细胞的此方法(方法5)用于在第335、337、339、341、343号动物中移植。参见图10中的分图a和b。
从TaconicFarms购买五至六周龄的雄性scid-beige小鼠(C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-LystbgN7)。将小鼠圈养在微隔离笼(microisolatorcage)中，自由获得无菌食物和水。在手术准备中，小鼠通过耳部加标签来辨别，称量其体重，并使用手持式血糖仪(OneTouch，LifeScan)来测定其血糖。
用异氟烷和氧气的混合物麻醉小鼠，用小型动物剪毛剪给手术部位剃毛。在手术前经小鼠皮下给予0.1mg.kgBuprenex。使用70％异丙醇和10％聚维酮-碘进行连续清洗，以准备好手术部位。
使用1mg/ml分散酶对第4阶段末的细胞短暂处理5分钟，然后利用1ml玻璃吸管以机械方式刮取这些细胞，随后将它们转移到非贴壁板上培养过夜。在小鼠的手术前准备期间，将这些细胞在1.5mL离心管中离心，移除大部分上清液，留下的量刚好足以收集细胞沉淀物。将细胞收集进RaininPos-D正位移移液器中，并倒置该移液器以让细胞通过重力沉降。弃去过量的培养基，留下用于移植的浓集细胞制剂。
为了移植，将24G×3/4″静脉留置管用于穿透肾囊，移除针头。然后在肾囊下推进导管至肾脏的远极。将Pos-D移液枪头牢固置于导管的插孔中，将5百万个细胞从移液器通过肾囊下的导管分配，并递送至肾脏的远极。通过低温烧灼而封闭肾囊，使肾回复至其初始解剖位置。平行地，用Post-D移液枪头将含有5百万个细胞的细胞聚集体加载至50μl装置中。该50μl装置购自TheraCyte，Inc(Irvine，CA)。加入之后，用A型医用聚硅氧烷粘合剂(DowCorning，目录号：129109)对装置进行密封，然后皮下植入SICD/Bg小鼠(第3和4号动物)。通过用5-0vicryl缝线连续缝合来闭合肌肉，并用缝合夹闭合皮肤。在手术后给小鼠皮下给予1.0mg.kgMetacam。使小鼠脱离麻醉并让其完全恢复。
在移植之后，每周称重小鼠一次，每周测量血糖两次。在移植之后的多个时间间隔，给小鼠腹膜内给予3g/kg葡萄糖，并在注射葡萄糖后60分钟经由眶后窦抽取血液进装有少量肝素的离心管中。离心血液，将血浆置于第二离心管中，在干冰上冷冻，然后在-80℃下保存直至进行人c肽测定。使用Mercodia/ALPCODiagnotics超敏C肽ELISA(目录号80-CPTHU-E01，AlpcoDiagnostics，NH)根据制造商的说明测定人C肽水平。
人C-肽最早在移植后4周在动物血清中检测到，其会随时间而增加。三个月结束时，对这些动物禁食约15-20小时，然后通过眶后静脉抽取血样(施用葡萄糖之前)。然后通过腹膜内注射向每只动物注射剂量为约3g/kg的葡萄糖(30％的右旋糖溶液)，并在注射葡萄糖后约60分钟时抽取血液。通过在微型容器中进行离心使血清与血细胞分离。利用超灵敏人特异性C肽ELISA板(目录号：80-CPTHU-E01，AlpcoDiagnostics，NH)对一式两份的25μl血清进行ELISA分析。人C-肽的检测结果表明从移植细胞产生了胰岛素分泌。
在移植60天后，在所有接受含胰腺内分泌前体细胞的移植物的动物中，在响应葡萄糖刺激下，检测到了低血清水平的人C-肽(低于0.5ng/ml)。在移植后的两到三个月之间，在那些动物中，葡萄糖刺激的人血清水平快速升高(图6至图10)。通常，那些接受细胞簇移植物的动物也会响应葡萄糖(图7的分图b，图9的分图b和图10的分图b)。
对不同时间点收获的移植物进行组织学检查，结果表明小鼠肾囊下存在人细胞(如使用人细胞核抗原染色检测到的)。参见图11中的分图a和b。在移植后的第三周观察到肾囊下移植的细胞形成管状结构。参见图11的分图a。管状结构的数量随时间增加。大部分管状结构含有高水平的PDX1和CK19(图11的分图b)。这表明胰腺内分泌前体细胞能够在体内进一步分化。
由于管中PDX1的表达对明确最终形成内分泌胰腺的祖细胞群非常重要，因此确定了移植物中PDX1与胰岛素或胰高血糖素的共表达。最早在移植后的第3周在移植物中观察到了胰岛素和胰高血糖素表达细胞(图12的分图a)。大部分内胚层激素表达细胞在PDX1细胞从管状结构中迁出时形成。大约在第10周的时间点在移植物中检测到了大量的胰岛素阳性细胞，大部分胰岛素阳性细胞表达PDX1和NKX6.1(图12的分图b)。这些数据与上文报告的C肽表达日期相关联。在第20周，胰岛素阳性细胞的数量显著增加，使得在移植物中检测到了大量只表达胰岛素的单细胞。大部分胰岛素表达细胞也表达了PDX1(图12的分图c)、NKX6.1(图12的分图b)以及NEUROD(图12的分图e)。据报道，PDX1和NKX6.1有利于维持成熟β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素释放。
在独立的对照实验中，动物接受了根据实例1中描述的方法的在DMEM/F12中已分化到第4阶段末的细胞。直至移植后的第3个月，仍未在接受这些细胞的任何动物的血清中观察到人C肽。此外，PCR和免疫组织化学分析未显示胰岛素、PDX1或NKX6.1的表达。然而，移植后的第3个月在移植物中观察到了大量的胰高血糖素阳性细胞。
实例5
移植物的组织学检查。
基本上按照之前实例中所述的方法，对从接受移植物的动物中收获的移植物进行组织学检查。
将在之前实例中处理的动物的移植物从动物体中解剖出来，使用PBS-/-(不含Mg++和Ca++，Invitrogen)洗涤两次，然后转移至4％多聚甲醛/PBS并在4℃下固定约2至3小时，在1个小时后更换PBS(-)。然后将移植物在4℃在30％蔗糖/PBS(-)中下平衡过夜，接下来将其包埋于OCT配混物(SAKURA，#4583、)中，再用干冰进行冷冻。使用恒冷切片机将移植组织切成10微米的切片，将这些切片保存在-80℃下。
为了分析，将冷冻的切片在室温下解冻，一旦解冻后，将切片在Shandon玻片盒内用PBS洗涤两次。使用PBS+0.5％Triton-X对组织切片透化处理20分钟，然后用2ml的PBS进行洗涤。然后用含有4％鸡血清/PBS的封闭溶液温育这些切片。将玻片在室温下温育约1个小时。通过用2ml的PBS洗涤3次将封闭溶液除去。再次将这些切片与在4％鸡血清中稀释的一抗在4℃下在Shandon玻片盒中温育过夜。
在与一抗温育后，用2ml的PBS洗涤玻片三次。再次将这些切片与在4％鸡血清中稀释的合适二抗放入Shandon玻片盒内在室温下温育。大约30分钟至1小时后，用2ml的PBS对这些切片洗涤3次，然后从Shandon玻片盒中将其取出并使含DAPI的Vectashield进行包埋。分析了针对胰腺激素分泌细胞的其他典型标志物(包括转录因子PDX1)的另外的抗体。参见下表2。
表2：针对胰腺激素和转录因子的抗体。
抗体 宿主 稀释度 供应商
胰岛素 兔 1∶100 Cell Signaling
PDX1 山羊 1∶100 Santa Cruz
胰高血糖素 小鼠 1∶100 Sigma
CK19 小鼠 1∶100 Dako
在整篇文档中引用的出版物据此全文以引用方式并入。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下恰当理解的权利要求书的限定。

Claims (8)

1.表达NKX6.1和PDX1的胰腺内分泌前体细胞群在制备用于降低动物血糖水平的药物中的用途，其中胰腺内分泌前体细胞通过人胚胎干细胞逐步分化而获得；其中所述逐步分化包括在含有4500mg/L葡萄糖、1％B27、TGF-β受体I激酶抑制剂和能够抑制BMP的因子的DMEM培养基中培养细胞以从表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞形成胰腺内分泌前体细胞；并且其中所述人胚胎干细胞是确立的人胚胎干细胞系并且所述人胚胎干细胞不直接来源于人胚胎。
2.表达NKX6.1和PDX1的胰腺内分泌前体细胞在制备用于降低动物血糖水平的药物中的用途，所述胰腺内分泌前体细胞通过包括以下步骤的方法而产生：
培养多能干细胞，
使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，和
使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成胰腺内分泌前体细胞，其中所述多能干细胞在含有4500mg/L葡萄糖、1％B27、TGF-β受体I激酶抑制剂和能够抑制BMP的因子的DMEM的培养基中培养，以从表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞形成胰腺内分泌前体细胞，并且其中所述多能干细胞是确立的人胚胎干细胞系并且所述多能干细胞不直接来源于人胚胎。
3.权利要求1或2的用途，其中TGF-β受体I激酶抑制剂为Alk5抑制剂II。
4.权利要求3的用途，其中Alk5抑制剂II以0.1μM至10μM的浓度使用。
5.用于产生表达NKX2.2和PDX1的胰腺内分泌前体细胞的方法，其包括以下步骤：
培养多能干细胞，
使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，和
使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成胰腺内分泌前体细胞，其中所述多能干细胞在含有4500mg/L葡萄糖、1％B27、TGF-β受体I激酶抑制剂和能够抑制BMP的因子的DMEM的培养基中培养以从表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞形成胰腺内分泌前体细胞，并且其中所述多能干细胞是确立的人胚胎干细胞系并且所述多能干细胞不直接来源于人胚胎。
6.权利要求5的方法，其中TGF-β受体I激酶抑制剂为Alk5抑制剂II。
7.权利要求6的方法，其中Alk5抑制剂II以0.1μM至10μM的浓度使用。
8.一种用于产生表达PDX1和NKX6.1的胰腺内分泌前体细胞的方法，其包括以下步骤：
培养多能干细胞，
将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，和
在含有4500mg/L葡萄糖、1％B27、TGF-β受体I激酶抑制剂和能够抑制BMP的因子的DMEM培养基中使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达PDX1和NKX6.1的胰腺内分泌前体细胞，
其中所述多能干细胞是确立的人胚胎干细胞系并且所述人胚胎干细胞不直接来源于人胚胎。
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