CN108624649A - 一种含羊水干细胞分泌物的培养基及其应用 - Google Patents

一种含羊水干细胞分泌物的培养基及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108624649A
CN108624649A CN201810310573.2A CN201810310573A CN108624649A CN 108624649 A CN108624649 A CN 108624649A CN 201810310573 A CN201810310573 A CN 201810310573A CN 108624649 A CN108624649 A CN 108624649A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amniotic fluid
stem cell
fluid stem
cell
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810310573.2A
Other languages
English (en)
Inventor
赵姝灿
陈志胜
郑桂纯
张晓芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan University
Original Assignee
Foshan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan University filed Critical Foshan University
Priority to CN201810310573.2A priority Critical patent/CN108624649A/zh
Publication of CN108624649A publication Critical patent/CN108624649A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种含羊水干细胞分泌物的培养基，其由4.9×105个/ml经接种处理的羊水干细胞和基础培养基组成。本发明克服了传统的将现配含羊水干细胞应用于细胞治疗试验过程操作不便的种种弊端，其将含羊水干细胞分泌物与培养基相结合，实现了保存方便、可批量使用、无需临时现配、避免液氮保存需要适时复苏等，且可有效降低试验过程中细胞转移时受污染的可能性。本发明还可公开了该培养基在癌细胞检测中的应用，其具有促进癌细胞凋亡的作用，为日后临床使用奠定了基础。

Description

一种含羊水干细胞分泌物的培养基及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种培养基。
背景技术
羊水中的细胞是一群处于胚胎发育早期的细胞群，从中分离的羊水干细胞(Amniotic Fluid-derived Stem Cells，hAFSCs)是介于胚胎干细胞(Embryonic Stemcells，ES)和成体干细胞之间的细胞类型，表达ES细胞和成体干细胞的标志，具有相似的多向分化潜能，并且具有分化为三个胚层来源的不同细胞的能力。与胚胎干细胞不同的是，AFSCs在体内不形成肿瘤或畸胎瘤，且AFSCs不存在组织相容性和免疫排斥等问题。在未来治疗应用，再生医学以及研究中，使用AFSCs将会更加有利。
目前细胞治疗在临床中的使用越来越多，但是在细胞临床治疗使用中，细胞消耗量很大，并且有研究表明异体接种的细胞并没有在患者体内存活很久。伴随接种细胞的死亡，患者的疾病会得到不同程度的治疗，这就意味着细胞分泌的物质会在疾病治疗中起到一定的作用。MSCs的分泌物质对多种实验性器官和组织创伤模型如心肌梗塞、急性肾小管损伤、脑缺血和皮肤损伤有较好的促进创伤愈合和功能恢复的治疗效果，其作用机制主要是抑制细胞死亡、促进细胞分化、增殖而实现受损组织的修复。现有技术中将羊水干细胞引入到细胞治疗中已获得一定成效，然而因细胞治疗对细胞消耗量很大，而羊水干细胞在大量培养时容易存在未知病原体感染风险等问题，且培养成本很高，因此仍无法对其推广应用。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种含有羊水干细胞分泌物的培养基，同时提供该培养基在检测癌细胞上的应用。
本发明所采取的技术方案是：一种含羊水干细胞分泌物的培养基，其由4.9×105个/ml经接种处理的羊水干细胞和基础培养基组成。
作为上述方案的进一步改进，所述基础培养基按质量百分比计由5％的人血清白蛋白注射液和95％的DMEM组成。
作为上述方案的进一步改进，所述羊水干细胞选自第三代的羊水干细胞。
作为上述方案的进一步改进，所述接种处理为将所述羊水干细胞置于明胶包被的细胞培养皿进行8h细胞贴壁处理后弃去上层液体，再用PBS洗涤三次。
作为上述方案的进一步改进，所述细胞培养皿为100mm的细胞培养皿。
一种如上所述的含羊水干细胞分泌物的培养基在癌细胞检测中的应用。
本发明的有益效果是：本发明克服了传统的将现配含羊水干细胞应用于细胞治疗试验过程操作不便的种种弊端，其将含羊水干细胞分泌物与培养基相结合，实现了保存方便、可批量使用、无需临时现配、避免液氮保存需要适时复苏等，且可有效降低试验过程中细胞转移时受污染的可能性。
本发明适用于细胞治疗过程中对癌细胞的检测，其具有促进癌细胞凋亡的作用，为日后临床使用奠定了基础。
附图说明
图1是本发明羊水干细胞的生长曲线图；
图2是本发明羊水干细胞表面标志物的免疫荧光鉴定结果图；
图3是本发明羊水干细胞的成脂成骨分化结果图；
图4是本发明羊水干细胞培养与癌细胞共培养过程中癌细胞的凋亡基因检测图。
(图4A为与羊水干细胞共培养三天的Hela细胞凋亡检测、图4B为羊水干细胞分泌物培养液培养三天的Hela细胞凋亡检测、图4C是普通培养基培养三天后的hela细胞凋亡检测的对照组图)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
所述的无血清培养基购于LONZA公司；
所述的胰酶、脂肪形成分化诱导培养基(ADM)和成骨分化诱导培养基(ODM)购于Gibco公司；
所述的DAPI购于Invitrogen公司；
所述的油红O、茜素红染色液购于Solarbio公司；
所述的AnexinV-IFTC凋亡检测试剂盒购于BD Pharmingen公司；
所述的双抗、DMEM购于Hylone公司；
所述的血清购于BI公司；
所述的Transwell板购于Corning公司。
一、羊水干细胞的分离培养
(1)羊水干细胞的原代培养：羊水样品与加有EDTA的PBS进行1:1稀释；1200r/min离心5min；弃上清，加入羊水专用培养基反复吹打混匀；接种在明胶包被的培养皿；以37℃，5％CO2的环境条件培养4～5天即可观察到羊水干细胞生长。
(2)羊水干细胞的传代培养：当原代羊水干细胞达到80～90％汇合时，弃去细胞培养液；用PBS洗涤三次；用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶覆盖细胞使细胞得到解离；待细胞回缩变圆并从培养皿上开始脱落时用含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化；将混合液反复吹打直至贴壁细胞从培养皿上脱落形成细胞悬液1200rpm下离心5min；弃去液体后加入培养基轻柔吹匀使细胞散开，从而对原代羊水干细胞进行传代培养。
二、羊水干细胞生长曲线的绘制
取第三代、第六代的羊水干细胞进行计数，并根据所得数据绘制生长曲线，以1×104接种至24孔板内，每间隔24h取三个孔，并记下平均数。得图1所示的羊水干细胞生长曲线图。
三、羊水干细胞的鉴定
(1)免疫荧光鉴定
取第三代的羊水干细胞干细胞，接种在明胶包被的24孔板上，待达到70％融合时，弃去培养液，用PBS洗涤两次；在24孔板内加入3.7％多聚甲醛溶液固定30min，并用含有5％FBS的PBS洗涤细胞三次(每次洗涤10min)；在24孔板内加入透化剂(0.1％TritonX-100，PBS)室温孵育15min后弃去，用PBS洗三遍，每次5min；在24孔板内加入封闭液(10％FBS：PBS)37℃封闭1h后弃去，PBS洗三次，每次5min；
在4℃下与针对CD44和CD90(1:200，Santa Cruz，CA)的一抗孵育过夜，除去一抗后，用含有5％FBS的PBS洗涤细胞三次(每次洗涤10min)；室温下在黑暗中，加入用FITC标记的二抗(1：500，Santa Cruz，CA)1h，用PBS洗三次，每次5min；最后将样品在避光条件下用DAPI孵育5min，用PBS洗三遍，每次5min；
加入抗荧光淬灭剂后在荧光显微镜下分析得图2所示的免疫荧光鉴定结果图。
(2)AFSCs的多向分化鉴定
在第三次传代时以相同密度接种至六孔板的其中三个孔内，标记1、2、3，其中1、2两孔为实验组，3孔为对照，当细胞生长至80％的汇合时，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞三次。将脂肪形成分化诱导培养基加入1孔中；将成骨分化诱导培养基加入2孔中；将完全培养基中加入3孔对照组细胞中。
培养基每3～4天完全更换。在诱导14天后，观察到1孔出现明显的大量钙结节时通过茜素红染色测定成骨能力，在诱导17天后观察到2孔中产生大量油脂时通过油红O染色评价脂肪生成能力。在光学显微镜下观察并拍照，得到如图3所示的分化结果图。
四、本发明含羊水干细胞分泌物的培养基的制备
取第三代的羊水干细胞以4.9×105个/ml接种于明胶包被的100mm的细胞培养皿，待8h细胞贴壁后，弃去上层液体，PBS洗涤三次；加入7ml基础培养基培养48h，该基础培养基按质量百分比计由5％的人血清白蛋白注射液和95％的DMEM组成，经0.22μm过滤后，得含羊水干细胞分泌物的培养基。
五、应用于癌细胞检测
(1)Hela细胞的培养
Hela细胞购置于中国科学院细胞库(细胞株编号101460)，传代培养同上述羊水干细胞，培养基由1％双抗、10％血清、89％DMEM组成。
(2)Hela细胞与羊水干细胞的共培养
将羊水干细胞1×106个/ml置于0.4μm孔径Transwell板的小室内，每个小室加入70μl，加入4×105个/ml Hela细胞于共培养板的下层，每孔加入500μl，共培养72h后，弃去上层液体，PBS洗涤三次；0.25％％胰蛋白酶覆盖细胞使细胞得到解离，1000rpm下离心5min后收集细胞备用。
(3)Hela细胞与含羊水干细胞分泌物的培养基共培养
将收集的Hela细胞，用6ml普通培养基重悬并接种至明胶包被的100mm细胞培养板，控制每个板的细胞为1.0×106个，待细胞贴壁后，更换为6ml本发明的含羊水干细胞分泌物的培养基，培养72h后收集细胞备用。
(4)三种培养方式培养的Hela细胞的凋亡检测
用400μl的1×Binding Buffer悬浮三组不同培养方式的Hela细胞,浓度大约为1×106个/ml；将5μl Annexin V-FITC加入细胞悬液，小心混匀，5℃左右避光放置15min后，将10μl PI(Propidine Iodide，PI)加入细胞悬液，小心混匀，5℃左右避光放置5min。1h后用流式细胞仪检测细胞调亡率，其检测结果如图4所示。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。

Claims (6)

1.一种含羊水干细胞分泌物的培养基，其特征在于：由4.9×105个/ml经接种处理的羊水干细胞和基础培养基组成。
2.根据权利要求1所述的一种含羊水干细胞分泌物的培养基，其特征在于：所述基础培养基按质量百分比计由5％的人血清白蛋白注射液和95％的DMEM组成。
3.根据权利要求1所述的一种含羊水干细胞分泌物的培养基，其特征在于：所述羊水干细胞选自第三代的羊水干细胞。
4.根据权利要求1所述的一种含羊水干细胞分泌物的培养基，其特征在于：所述接种处理为将所述羊水干细胞置于明胶包被的细胞培养皿进行8h细胞贴壁处理后弃去上层液体，再用PBS洗涤三次。
5.根据权利要求1所述的一种含羊水干细胞分泌物的培养基，其特征在于：所述细胞培养皿为100mm的细胞培养皿。
6.一种如权利要去1～5任一项所述的含羊水干细胞分泌物的培养基在癌细胞检测中的应用。
CN201810310573.2A 2018-04-09 2018-04-09 一种含羊水干细胞分泌物的培养基及其应用 Pending CN108624649A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810310573.2A CN108624649A (zh) 2018-04-09 2018-04-09 一种含羊水干细胞分泌物的培养基及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810310573.2A CN108624649A (zh) 2018-04-09 2018-04-09 一种含羊水干细胞分泌物的培养基及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108624649A true CN108624649A (zh) 2018-10-09

Family

ID=63704803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810310573.2A Pending CN108624649A (zh) 2018-04-09 2018-04-09 一种含羊水干细胞分泌物的培养基及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108624649A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676452A (zh) * 2012-04-26 2012-09-19 天津美德太平洋科技有限公司 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用
CN104651301A (zh) * 2008-10-24 2015-05-27 洛杉矶儿童医院 羊水细胞及其用途
CN105112366A (zh) * 2015-08-18 2015-12-02 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基
CN104450610B (zh) * 2014-11-28 2017-05-24 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法
CN106983704A (zh) * 2016-01-20 2017-07-28 北京泰盛生物科技有限公司 间充质干细胞培养物或其培养上清的用途
CN107488628A (zh) * 2017-09-18 2017-12-19 佛山科学技术学院 一种简便快捷的羊水干细胞培养方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104651301A (zh) * 2008-10-24 2015-05-27 洛杉矶儿童医院 羊水细胞及其用途
CN102676452A (zh) * 2012-04-26 2012-09-19 天津美德太平洋科技有限公司 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用
CN104450610B (zh) * 2014-11-28 2017-05-24 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法
CN105112366A (zh) * 2015-08-18 2015-12-02 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基
CN106983704A (zh) * 2016-01-20 2017-07-28 北京泰盛生物科技有限公司 间充质干细胞培养物或其培养上清的用途
CN107488628A (zh) * 2017-09-18 2017-12-19 佛山科学技术学院 一种简便快捷的羊水干细胞培养方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAPIL DEV等: "Isolation, culturing and characterization of feeder-independent amniotic fluid stem cells in buffalo (Bubalus bubalis)", 《RESEARCH IN VETERINARY SCIENCE》 *
丛姗等: "人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离、体外培养及诱导分化", 《农业生物技术学报》 *
南通大学教务处主编: "《学海图南 南通大学优秀毕业论文设计（论文）集》", 31 August 2013 *
李志勇主编: "《细胞工程学》", 30 June 2008 *
潘国宗主编: "《中华医学百科全书 临床医学 消化病学》", 31 July 2015 *
韦安慧: "人羊水来源干细胞的实验研究", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107007541A (zh) 外泌体在皮肤美白制剂中的应用
CN102191218B (zh) 一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞的培养方法
CN105861430A (zh) 一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用
CN108359636A (zh) 一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法
CN105219707B (zh) 一种复苏脂肪间充质干细胞的方法
CN103667349B (zh) 一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法
CN104450611A (zh) 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法
CN103966159B (zh) 人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法
CN101215545A (zh) 利用骨髓间充质干细胞诱导获得神经前体细胞的方法
CN108300689A (zh) 一种分离与原代培养胎盘壁蜕膜间充质干细胞的方法
CN107267451A (zh) 一种原代牙髓干细胞的制备方法及构建牙髓干细胞库的方法
CN107254432A (zh) 一种同时分离尿源性干细胞两种亚群的培养基、分离方法及应用
CN101215546A (zh) 利用骨髓间充质干细胞诱导获得内耳毛细胞前体的方法
CN105062970B (zh) 一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导剂及诱导分化完全培养基
CN103396995B (zh) 一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法
CN107287156A (zh) 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用
CN103396985A (zh) 诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法与应用
CN107083359A (zh) 干细胞培养基及干细胞分离方法
CN109897815A (zh) 一种无需包被的脂肪内皮祖细胞的高效分离和培养方法
CN110079501A (zh) 小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法
CN108486039A (zh) 小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法
CN107236705B (zh) 一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系
CN117511874A (zh) 诱导脐血干细胞向神经干细胞分化的方法
CN103215218B (zh) 一种分离培养内皮克隆形成细胞的方法
CN106755101A (zh) 一种将马蹄内翻足患者尿液脱落细胞重编程为iPS细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination