CN109897815A - 一种无需包被的脂肪内皮祖细胞的高效分离和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从人或动物自体脂肪组织中获取内皮祖细胞方法，包含脂肪内皮祖细胞的高效分离和富集，分离过程中无须提前包被培养皿，经体外进行扩增培养，所获得的内皮祖细胞纯度高，细胞干性和增值能力强，具有典型的内皮祖细胞形态，细胞表型以及摄取低密度脂蛋白和血管形成能力。

Description

一种无需包被的脂肪内皮祖细胞的高效分离和培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及内皮祖细胞的分离和纯化，尤其涉及一种从脂肪样本中获取内皮祖细胞的方法。

背景技术

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是能够增殖、迁移、粘附并分化为血管内皮细胞潜能的一种原始细胞，在修复血管内皮和促进血管生成中具有重要的作用。研究显示，EPC在心脑血管疾病、糖尿病血管病变、高血压、肝硬化及以血管生成为靶向的肿瘤治疗药物研究等方面均发挥重要作用。

EPC来源于骨髓，存在于骨髓、脐血、外周血，最新研究表明在脐带、胎盘、脂肪以及脏器的外膜中也发现EPCs的存在。目前，EPC的主要来源为骨髓和脐血。然而骨髓采取不便，而且受到个人身体状况的限制，脐带血来源EPC需要HLA配型，同时同种异体输入可能存在免疫排斥等副作用。脂肪来源丰富，利用胶原酶I消化法获得脂肪源细胞混合物，再利用差速贴壁培养法和差速消化法富集获得EPC，操作简单，易于重复，而且所得细胞培养要求低，体外扩增能力强，增殖时间短，克服了自体来源EPC数量低下，体外扩增缓慢等困难。

相关脂肪来源EPC获得方法的相关报道有传统的磁珠分离法、间充质干细胞分化诱导法和利用特定细胞外基质的诱导贴壁法。磁珠分选的优点是可以从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的目的细胞，然而分选的细胞中磁珠很难去除，影响临床应用，而且磁珠价格昂贵难以实现产业化生产；分化诱导法是利用培养体系诱导经酶消化的脂肪混合种子细胞中的间充质干细胞向EPC细胞分化，然而由该方法获得的EPC分化程度不均，分化操作过程难以控制和重复；利用细胞外基质经过诱导贴壁分选的EPC，一方面贴壁基质费用昂贵，另一方面细胞纯度与贴壁时间长短关系密切，细胞纯度难以控制，而且在EPC的贴壁诱导培养过程中存在动物来源血清的污染。

例如申请号200510029628.5，公开日期为2007年3月21号，发明名称为《一种分离人脂肪组织中EPC的方法》的中国发明专利申请，在其分离过程中使用纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)诱导细胞贴壁，不但费用昂贵，纯度受限，而且后期细胞培养过程中加入了大量的胎牛血清(1％～3％)等异源物质，对后期细胞的临床应用存在很大的安全隐患。又如申请号20171010189.8，公开日期为2017年5月31号，发明名称为《一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法》中把最初分离的细胞首先接种到FN预包被的培养皿中诱导贴壁，利用添加高浓度(10％，V/V)胎牛血清的培养体系培养一段时间，再利用胰蛋白酶消化细胞后，接种到培养瓶中进行差速贴壁培养(24h)和差速消化培养获得EPC细胞。此方法不但操作程序繁琐而且存在FN和血清等异源成分。

发明内容：

本发明提供一种无需包被的从脂肪中获取内皮祖细胞的方法，其特征在于经胶原酶消化脂肪获取的单个细胞，接种培养4～12h进行一次贴壁培养，培养后去除贴壁的细胞，将未贴壁的细胞置于另一培养瓶中继续进行二次贴壁培养，培养时间36～60h后去除未贴壁细胞，即为所得的内皮祖细胞。

其中，一次贴壁培养时间为6-10h，最优选为8h。发明人发现按已知技术的贴壁24h，其效果并不理想，经研究发现24h贴壁的细胞中含有大量间充质样干细胞，原代细胞不纯而且后期培养过程中存在目的细胞被覆盖的风险，发明人对贴壁时间进行了一系列的摸索，发现所述的培养合适的时间为4～12h，优选8h效果更佳。

优选地，二次贴壁培养时间为45-55h，最优选为48h。

优选地，所述的胶原酶为I型胶原酶，其浓度为0.05～0.2％的Ⅰ型胶原酶，更优选为0.1％的Ⅰ型胶原酶。

分离EPC后，进一步进行富集培养操作：对上述分离到的EPC细胞，利用胰蛋白酶消化，发现分散的非克隆的长梭形间充质样细胞卷边脱落，而EPC克隆无漂浮迹象，用生理盐水冲洗去除后，再加入胰蛋白酶消化，待鹅卵石样细胞收缩变圆后离心收集细胞，获得富集的原代EPC。

优选地，其中是采用0.05-0.25％胰蛋白酶(w/v)(优选0.1％)进行消化。在富集培养阶段每3天换液一次，当细胞融合度率至80％～90％时即传代。

作为优选方式，本发明方法中所述培养时采用的培养基为IMDM培养基，α-MEM，DMEM，或者DMEM/F12培养基，其中含有血小板裂解物和VEGF，EGF和bFGF。更优选地，所述培养中血管内皮生长因子VEGF，上表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF添加量各为8～12ng/mL，优选为10ng/mL，血小板裂解液为3～7‰(V/V)，优选为5‰(V/V)。

上述人或者动物脂肪为自体脂肪，以避免在后期细胞移植使用中可能的异体排斥反应。

进一步地，本发明提供的自体脂肪内皮祖细胞的分离培养方法，其包括下述步骤：

1.收集脂肪组织；

2.加入Ⅰ型胶原酶，振荡消化至无明显组织块；

3.培养基洗涤后离心去上清；

4.将上述离心获得细胞进行诱导贴壁培养，贴壁时间分别为4-12h，把未贴壁细胞转移至等量培养板或者培养瓶中；

5.细胞二次贴壁培养，去除未贴壁细胞，继续培养至出现鹅卵石样EPC克隆；

6.用胰酶消化轻拍去除容易脱落的间充质干细胞，再用胰蛋白酶继续消化至待鹅卵石样细胞集落收缩变圆，得到富集的原代脂肪来源EPC。

任选地进一步包括传代培养步骤。

任选地，进一步包括传代培养步骤。

更具体地操作步骤如下:

1.无菌收集脂肪至生物安全柜，转入包含等量体积PBS的50ml离心管中，充分混匀，1000r/min离心10min，收集上层脂肪组织，洗涤两次，漂洗去除组织中的组织液和血细胞；

2.加入等体积的0.1％的Ⅰ型胶原酶，置于37℃摇床，振荡消化30min～1h30min(优选1h)至无明显组织块，消化过程中每30min摇晃混匀一次；

3.用70～100微米滤网过滤，细胞计数，培养基洗涤后1000r/min离心5min，去上清；

4.将上述离心获得细胞用含有血小板裂解物和VEGF，EGF和bFGF的IMDM培养基(或者α-MEM，DMEM，DMEM/F12)调整细胞悬液浓度为5×10⁵/cm²，将细胞接种于NUC二维塑料培养板，如6孔板，或培养瓶，如T25，T75，T175等，置于体积分数5％CO₂、37℃条件下进行诱导贴壁实验，贴壁时间分别为4～12h，把未贴壁细胞转移至等量培养板或者培养瓶中；

5.细胞二次贴壁48h后，全量换液，去除未贴壁细胞，添加等量新鲜培养基，每3天换液1次，5～7d出现短梭形细胞集落，8～10d鹅卵石样EPC克隆融合度达到80％左右；

6.用0.05-0.25％胰酶(w/v)(优选0.1％)的37℃消化1min，轻拍去除容易脱落的间充质干细胞，用生理盐水冲洗后，再加入等量胰酶继续消化2min，待鹅卵石样细胞集落收缩变圆，得到富集的原代脂肪来源EPC；

任选地进一步包括下述传代培养步骤：7.对原代EPC细胞离心收集，计数，按照1*10⁴/cm²接种。每3天换液一次，当细胞融合度>80％，用0.1％胰蛋白酶消化2min传代，进行后续扩增培养。细胞融合率至80％～90％时即传代，取少量细胞进行流式细胞检测，核型检测，分析细胞体外长期培养的干性维持能力和稳定性。

本发明的主要有优点在于:

本发明方法分离的EPC分离和培养过程中无需提前包被培养皿，突破和克服了现有的技术偏见，通过实验偶然发现不经细胞外基质包被的EPC细胞也能实现完整贴壁，伸展和增值，一方面减少了外来包被蛋白的材料成本，另外一方面也避免了外来蛋白引入的污染风险。结合通过贴壁时间的探索，找到最佳贴壁时间(尤其是一次贴壁培养时间)，由此得到本发明的分离方法操作简单，成本低廉，易于重复并形成完整的SOP，实现快速规模化生产。本发明的方法中分选难度不大、经济、实用性强、对操作要求不高，培养获得的细胞具有内皮样细胞特征，呈现鹅卵石样细胞形状，并在5～7天明显观察到EPC克隆呈现。进一步，在分离和培养EPC过程中均使用的无动物源无血清的培养体系，成分明确，生物安全性更高。

本发明的方法分离的EPC纯度高，CD31阳性率高达95％以上，细胞干性和增值能力强，具有典型的EPC低密度脂蛋白摄取性能和血管形成能力，可直接作为内皮种子细胞应用于组织工程领域中作用于个体化细胞治疗修复血管损伤和以血管生成为靶向的肿瘤治疗药物研究等方面。分离的EPC细胞干性和增值能力强，每3天细胞可以扩增3～4倍，可以连续稳定扩增10代以上，并能保持细胞纯度和核型稳定。另外，分离方法中脂肪原材料来源广泛，属于自体组织来源，不存在道德伦理问题，并且无后期细胞移植使用中的异体排斥反应。

附图说明

图1 8h组的原代EPC细胞集落。

图2 8h组的细胞表型和细胞核型。

图3 8h组的EPC吞噬蛋白能力验证。

图4 8h组的EPC的血管形成能力验证。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但不构成对本发明限制。

实施例1脂肪来源EPC的分离，提取和富集

1.完全培养基的配置:完全培养基是在IMDM无血清培养基中分别加入：血管内皮生长因子VEGF，上表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF各10ng/mL和5‰(V/V)血小板裂解液。

2.人脂肪细胞的收集:无菌条件下收集成人脂肪40ml至生物安全柜，平均转入2个50ml离心管中，分别加入20ml的PBS，充分混匀后1000r/min离心10min，收集上层脂肪组织，按照以上方式洗涤两次，漂洗去除组织中的组织液和血细胞。

3.向包含20ml脂肪的50ml离心管中加入各20ml胶原酶I(0.1％)，放置37℃的振荡摇床消化1h至无明显的组织块，消化过程中每30min摇晃混匀一次。

4.用70微米滤网过滤，并用IMDM培养基洗涤后1000r/min离心5min后获得脂肪来源的干细胞。

5.EPC的差速贴壁培养

将上述离心获得细胞用完全培养基重悬后调整细胞浓度为5×10⁵/cm²，将细胞接种于6孔培养板Thermo(NUC货号140675)(无需进行包被)，分为7组，每组3个复孔，共接种21孔，置于体积分数5％CO₂、37℃条件下培养。分别经过0，2，4，8，12，24，48h的诱导贴壁后，把未贴壁的细胞转移至等量培养板中，并更换新鲜培养基。

将上述不同贴壁时间组分离转移的细胞经48h二次贴壁后，使用完全培养基全量换液，每三天全量换液1次，大约培养5d左右，其中一次贴壁8h组最早出现明显的2-5个铺路石样EPC集落(图1)，继续培养2-3天后，细胞集落逐渐密集。细胞沿边缘快速增值呈现典型的鹅卵石样细胞克隆形态，10-12d后细胞融合度达到80％左右。

这里发现在细胞培养过程中不同贴壁时间分离组细胞中或多或少存在间充质样长梭形的非克隆细胞，细胞形态明显异于鹅卵石样的EPC，而且由于杂细胞的干扰，存在后期细胞培养过程中目的细胞被占据和污染的风险，种子EPC中间充质样长梭形细胞越多，导致目的细胞逐渐被占据的风险越大。同时，一次贴壁时间对去除杂细胞的影响较大，尤其0h，24h和48h组都分别在培养过程中先后出现大量的非克隆样的长梭形细胞，而8h组细胞中一直是鹅卵样克隆细胞集落占主导地位，目的细胞形态和数量最佳。因此根据鹅卵石样细胞集落的生长情况进行后续的传代消化操作。

实施例2 EPC的差速消化富集

根据前述研究结果，因此通过采取8h组获得的原代EPC进行细胞差速贴壁时间来富集获得高纯度的原代EPC。

对于实施例1中各组二次贴壁后的EPC细胞，当鹅卵石样细胞集落融合度达到≥80％时，经PBS缓慢冲洗细胞后，利用0.1％(m/v)胰蛋白酶在37℃的消化1min，发现分散的非克隆的长梭形间充质样细胞卷边脱落，而EPC克隆无漂浮迹象，用生理盐水冲洗去除后，再加入等量胰酶继续消化2min，待鹅卵石样细胞收缩变圆后离心收集细胞，获得富集的原代EPC。

这里采用差速消化分离法富集培养脂肪组织的EPCs，培养7～10天后，细胞克隆数增多，克隆增大，10～12天细胞可以进行初次传代，可通过胰蛋白酶消化收集EPC细胞克隆。利用脂肪干细胞(adipose stem cells，ASCs)和EPCs对胰蛋白酶的敏感性不同，ASCs对胰蛋白酶较敏感，在消化酶作用下能够易于脱落，而EPCs不易脱落，实现ASCs和EPCs分离。加入0.1％(w/v)胰蛋白酶37℃，1min后，ASC能完全脱落，而EPC克隆贴壁紧密无变圆和脱落迹象产生，收集漂浮的脂肪干细胞并经过流式鉴定高表达CD90，CD105，CD44和CD73等，验证其主要为脂肪来源的间充质干细胞。在培养瓶中加入等量胰蛋白酶继续消化2min后，得到富集的原代EPC细胞。

实施例3 EPC的连续扩增能力和细胞性能验证

将实施例2获得的原代细胞利用完全培养基进行连续体外扩增，包含以下具体操作：

细胞密度按照1*10⁴/cm²接种到培养板T25(或T75)中，大约每三天细胞融合率至80％-90％，经PBS冲洗后直接用0.1％胰酶消化2min进行扩增，扩增比例在1：3～1：4之间。

为了进一步鉴定不同贴壁时间组所获得的细胞纯度，对不同贴壁时间分离获得的第一代EPC进行流式检测(结果如表1所示)。结果发现，4h、8h和12h组分离EPC中高度表达内皮细胞表面标记CD31，同时表达EPC特异标志物VEGFR-2⁺(CD309)，其中8h的CD31阳性率最高，可达95％以上。其他组细胞都存在高比例CD90和CD105阳性细胞，进一步证明非克隆样的长梭形细胞为脂肪来源的间充质干细胞。

表1.不同贴壁时间获得EPC流式表型对比

其中，8h组利用该培养方法培养上述细胞连续培养至10代，并进行流式分析和核型检测，结果证明其细胞表型和细胞核型保持稳定(图2)。进一步证实了此发明方法获得EPC的体外长期培养的干性维持能力和稳定性，易于进行规模化生产，适宜作为内皮种子细胞应用于组织工程领域。

实施例3 EPC的功能验证

为进一步鉴定实施例2中8h组所分离培养的细胞为EPC，对其吞噬低密度脂蛋白能力和体外血管生成能力进行验证。具体如下：

1.将实施例2中培养的EPC(8h组)使用0.1％胰蛋白酶消化并用PBS洗涤两次，获得细胞沉淀后，使用完全培养液重悬，调整细胞浓度为2×10⁵/mL后接种至24孔板中，各孔加1mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养。第二天，使用完全培养液稀释乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)至浓度为10μg/mL，每孔全量换液添加500μL含Dil-Ac-LDL的EPC培养液，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养10h后弃掉培养基，置于2％多聚甲醛中固定10分钟，PBS漂洗后，使用DAPI染色5min，显微镜下观察并拍照(图3)。如图3所示，显示红色荧光的为处于对数生长期的吞噬了Dil-Ac-LDL的EPC，蓝色标记为细胞核。一方面证明培养的EPC在体外可以吸收低密度脂蛋白，另一方面，显微镜视野下随机选10个视野，红色荧光显示比例高达99.1±1.0％，证明上述分离的细胞纯度极高，细胞增值能力和活力旺盛。

2.准备24孔板，冰浴条件下铺上一层Matrigel，200μl/孔。放入37℃培养箱中孵育1h使之呈胶状固体。然后将实施例2中指数生长期的EPC经过胰蛋白酶消化为单个细胞后接种到Matrigel胶上，10万个/孔。过夜孵育后观察EPC体外三维培养环境中的血管形成能力(图4)。由图4可见，当把EPC接种到matrigel胶体上时，EPC能像其他内皮细胞一样迁移到胶体内部，并形成毛细血管样的结构。

Claims (10)

1.一种无需包被而从脂肪中获取内皮祖细胞的方法，其特征在于，经胶原酶消化脂肪获取的单个细胞，接种培养4～12h进行一次贴壁培养，培养后去除贴壁的细胞，将未贴壁的细胞置于另一培养瓶中继续进行二次贴壁培养，培养时间36～60h后去除未贴壁细胞，即为所得的内皮祖细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括进一步富集培养，其特征在于，对上述分离到的内皮祖细胞，利用胰蛋白酶消化，用生理盐水冲洗去除后，再加入胰蛋白酶消化，待鹅卵石样细胞收缩变圆后离心收集细胞，获得富集的原代内皮祖细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，一次贴壁培养时间为6～10h，最优选为8h。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，二次贴壁培养时间为45-55h，最优选为48h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胶原酶为Ⅰ型胶原酶，其浓度为0.05～0.2％的Ⅰ型胶原酶，更优选为0.1％的Ⅰ型胶原酶。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养时采用的培养基为IMDM培养基，α-MEM，DMEM，或者DMEM/F12培养基，其中添加血小板裂解物和VEGF，EGF和bFGF。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养中血管内皮生长因子VEGF，上表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF添加量各为8～12ng/mL，优选为10ng/mL，血小板裂解液为3～7‰(V/V)，优选为5‰(V/V)。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中是采用0.05-0.25％胰蛋白酶(w/v)(优选0.1％)进行消化。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在富集培养获得原代EPC后，继续传代培养，每3天换液一次，当细胞融合度率至80％～90％时即传代。

10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，所述脂肪为自体脂肪。