CN104651301A

CN104651301A - 羊水细胞及其用途

Info

Publication number: CN104651301A
Application number: CN201510017599.4A
Authority: CN
Inventors: 劳拉·佩林; 罗格·德菲利波; 大卫·沃伯顿
Original assignee: Childrens Hospital Los Angeles
Current assignee: Childrens Hospital Los Angeles
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2009-10-23
Publication date: 2015-05-27
Also published as: CA2741420A1; EP2340303A1; US20110256110A1; CN102224241B; EP2340303A4; AU2009308094A1; CN102224241A; CA2741420C; WO2010047824A1; AU2009308094A2; EP2340303B1

Abstract

本发明涉及羊水细胞及其用途。本发明一般涉及来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞及其亚群，以及其分离方法和用途。本发明还涉及用来源于羊水的c-kit阳性干细胞群预防和治疗肾脏损伤。

Description

羊水细胞及其用途

本申请是申请日为2009年10月23日、申请号为“200980146959.3”、发明名称为“羊水细胞及其用途”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2009/005779的中国国家阶段申请。

相关申请

本申请要求2008年10月24日提交的美国临时申请61/108,313的优先权，该申请通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及从羊水中获得的干细胞和祖细胞以及其分离、培养、分化方法及其用途领域。

背景技术

急性和慢性肾脏疾病是全世界的重大健康问题。患有终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)患者的数量在发达国家和发展中国家中不断增加(Thadhani等，1996)。如美国肾脏数据***2005年年度数据报告所报道，超过400,000美国人患有ESRD，并且超过20,000人正等待肾移植。根据对2020年的预测，预期将有超过500,000美国人患ESRD。

使用羊水作为胎儿遗传性和先天性疾病的安全可靠的筛选工具已经有许多年。在妊娠期中，羊水的体积和组成随着发育中胎儿的生理变化而改变。已经表明羊水的分子组成和营养物质的存在对多种肠细胞类型(例如上皮细胞和粘膜细胞)的增殖和分化具有关键作用(Cellini等，2006)。

羊水与发育中胎儿的隔室(例如肺和胃肠道)之间的接触可以解释羊水环境中不同细胞类型的存在。已经在羊水中发现了来源于所有3个胚层的成熟细胞系，包括间充质细胞、造血细胞以及表达来自特定组织类型(例如脑、心脏和胰腺)之蛋白和多种标志物的细胞(Hoehn和Salk，1982；Gosden，1983；Torricelli等，1993)。但是还需要进一步研究，以根据其来源和功能对这些细胞进行完全分类(Tsangaris等，2004；Bossolasco等，2006；McLaughlin等，2006)。

发明内容

申请人已经通过随着时间跟踪其存在和研究羊水细胞组成在妊娠期间发生的变化对羊水总细胞群进行了表征，集中研究了来源于3个胚层的细胞和器官的祖细胞。已经从羊水中分离出显示出肾脏祖细胞特性的细胞亚群，包括肾小管和肾小球前体。

本发明的一个实施方案提供了经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群。一个实施方案提供了来源于羊水之CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞的克隆群。另一个实施方案提供了还表达E-钙粘蛋白、肾病蛋白(nephrin)、TrkA、PDGFR-α、足糖萼蛋白(podocalixin)或其组合的细胞。在另一个实施方案中，所述细胞具有被诱导分化成后肾细胞、足细胞(podocyte)、肾小球细胞、近端和远端肾小管上皮细胞、基质源性(stromogenic)间充质细胞或系膜细胞的能力。在一个实施方案中，可以在体内或离体诱导所述细胞群分化。

一个实施方案提供了一种组合物，其包含来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群、以及可药用载体和/或培养基。另一个实施方案提供了一种制备组合物的方法，包括将来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞或由其分化的后代与载体(例如细胞培养基)相混合。

另一个实施方案提供了一种产生来源于羊水之肾脏祖细胞群的方法，包括从羊水样品中选择CD24和OB-钙粘蛋白阳性细胞。在一个实施方案中，利用抗CD24抗体和抗OB-钙粘蛋白抗体(例如单克隆抗体、多克隆抗体或者与荧光团或磁性颗粒缀合的抗体)进行所述选择。在另一个实施方案中，进一步对来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞进行针对E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、PDGFR-α、足糖萼蛋白或其组合的选择。在一个实施方案中，所述选择通过流式细胞术进行，例如荧光活化细胞分选或高梯度磁性选择(high gradient magnetic selection)。

一个实施方案提供了通过本文所述任一种方法制备的、经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群。

另一个实施方案提供了一种使富含来源于羊水之肾脏祖细胞的细胞群增殖的方法，包括：从羊水样品中选择至少一个CD24和OB-钙粘蛋白阳性细胞；将所述至少一个细胞加入到培养基中；以及使所述至少一个经选择的细胞在培养基中增殖。在一个实施方案中，所述细胞还表达E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、PDGFR-α、足糖萼蛋白或其组合。

一个实施方案提供了一种使经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群分化的方法，包括使所述细胞群与至少一种分化因子接触，所述分化因子包括但不限于ATRA、维生素3、***、BMP-7、多种不同类型的IV型胶原或其组合。

另一个实施方案提供了一种储存经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群的方法，包括从人对象中获得羊水样品；从所述样品中分离CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群；以及冷冻保存来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞。

一个实施方案提供了一种预防或治疗肾脏疾病或损伤的方法，包括向对象(例如哺乳动物，包括人类)施用治疗疾病或损伤有效量的来源于羊水之CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞或由其分化的后代。另一个实施方案提供了一种预防或治疗肾脏疾病或损伤的方法，包括向对象施用治疗疾病或损伤有效量的从羊水中分离和纯化之c-kit阳性细胞或者由其分化的后代。

在一个实施方案中，通过局部或全身注射施用所述细胞。在另一个实施方案中，所述疾病包括糖尿病性肾病、膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化症、膜增生性肾小球肾炎、弥漫增生性肾小球肾炎、膜性局灶节段性肾小球硬化症、轻度肾小球病变、系膜增殖性肾小球肾炎、管内增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、高密度沉积性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、缺血性肾病、基于***性疾病的肾小球疾病、基于血管疾病的肾小球疾病、基于代谢性疾病的肾小球疾病、遗传性肾脏病变或移植肾小球病变。在一个实施方案中，所述疾病是奥尔波特综合征。在一个实施方案中，所述损伤是物理性创伤的结果(例如由于外科手术或事故或化学物质(例如过量使用化学品))。

另一个实施方案提供了由本文所公开任一种方法生产的、经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群，其用于医学治疗。在一个实施方案中，所述医学治疗是治疗由于损伤或疾病所致的肾脏伤害。

一个实施方案提供了由本文所公开任一种方法生产的、经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群在制备用于治疗由于损伤或疾病所致肾脏伤害的药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物包含生理学上可接受的载体和/或细胞培养基。

附图说明

图1显示用于通过RT-PCR和Western印迹分析对人羊水细胞群中3个胚层和器官祖细胞进行表征之标志物的图。

图2显示用于通过RT-PCR和Western印迹分析对人羊水细胞群中多能细胞进行表征之标志物的图。

图3显示用于通过RT-PCR和Western印迹分析对肾脏定向分化为之人羊水细胞群和其衍生亚群进行表征之标志物的图。

图4显示通过RT-PCR(A)和Western印迹(B)测定3个胚层之标志物随时间的表达。

图5显示CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺细胞群与CD24^-OB-钙粘蛋白^-选择进行比较的RT-PCR。

图6显示通过RT-PCR(A)和Western印迹(B)测定不同孕龄样品中肾脏祖细胞标志物的表达。

图7显示CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺衍生亚群的RT-PCR。

图8显示总羊水细胞群(A，B)和CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺细胞群(C，D)的形态。

图9显示通过RT-PCR(A)和Western印迹(B)测定不同孕龄样品中祖细胞标志物的表达。

图10描述了显示中胚层、内胚层和外胚层标志物表达的实时PCR。

图11显示多能细胞、造血细胞和间充质细胞标志物的实时PCR。

图12显示祖细胞标志物的实时PCR。

图13显示肾脏祖细胞的实时PCR。

图14显示实验中使用的人引物、产物大小和退火温度的列表。

图15A-C：A.hAFSC细胞群的形态。在培养基中传代40次后，在亮视野(10×)中细胞呈纤维母细胞样外观。B.注射前hAFSC的RT-PCR。无早期和成熟肾脏标志物的表达。使用β-肌动蛋白作为看家基因(390bp)。C.传代38次后hAFSC的核型。细胞没有表现出任何异常，并且具有正常的核型。

图16A-D：A.nu/nu小鼠肾脏的组织切片(H&E)。皮层易于与髓质区分开。以箭头标示的肾小管和肾小球呈现正常的形态(10×)。B.甘油-横纹肌溶解诱导ATN 3天后nu/nu小鼠肾脏的组织切片(H&E)。肾小球仍然存在(箭头)并且没有损伤，而肾小管受损(10×)。C.nu/nu小鼠肾脏的组织切片(PAS染色)。肾小管和肾小球是完整的，并且与受损体相比呈现正常的形态。(D)值得注意的是管腔内管型(intraluminar cast)形成(箭头)、刷状边缘被破坏(箭头)以及结构被破坏。

图17A-D：A.对照(左侧未受感染的hAFSC)和经编码萤光素酶的慢病毒转导的hAFSC(右侧)暴露于萤光素酶的底物(萤光素)中，并且经发光测定，萤光素酶在AFSC中的体外表达持续至20pds后。B.测定在生物发光成像下检测到之最少量AFSC的体外实验。已确定1×10⁵个细胞是为了检测信号而可注射的最少细胞数。C.向受损nu/nu小鼠肾脏注射后生物发光检测AFSC的体内实验。将1.2×10⁶个AFSC直接注射到右肾中，用左肾作为对照。第1个小图显示刚刚注射后萤光素酶的表达。5小时后信号非常强(第2个小图)，24小时后也是如此(第3个小图)。信号在约第6天开始减弱(第5个小图)，并且在随后几天不明显(第6-7个小图)。如第8个小图所显示，其在第20天后再次出现。D.RT-PCR表明与注射前(阳性对照)和未经注射(阴性对照)肾脏的细胞相比，经注射的肾脏中存在萤光素酶序列(500bp)。用β-肌动蛋白作为看家基因(390bp)。E.hAFSC注射3周后肾脏的免疫荧光染色。红色荧光(箭头)证实存在表达萤光素酶的hAFSC。细胞核用dapi染色(20×)。

图18A-F：A.hAFSC注射1周后肾脏的冷冻切片。在由表面标志物CM-Dil产生的红色荧光下，细胞很明显。细胞核用DAPI染色(30×)。B.hAFSC注射3周后肾脏的双免疫荧光染色。Aqp2的阳性表达通过红色荧光显示，而绿色荧光则显示萤光素酶的表达。对肾小管中同时表达两种标志物的细胞进行双重染色(箭头)。细胞核用DAPI染色(30×)。C.hAFSC注射3周后肾脏的免疫荧光染色。红色荧光显示经表面标志物CM-DiI标记的hAFSC。值得注意的是，hAFSC定位于肾小管结构附近。绿色荧光显示hAFSC中花生凝集素(Peanut Agglutinin)的表达。细胞核用DAPI染色(40×)。D.hAFSC注射3周后肾脏的免疫荧光染色。红色荧光显示经表面标志物CM-Dil标记的hAFSC。值得注意的是，hAFSC定位于肾小管结构附近。绿色荧光显示hAFSC中双花扁豆凝集素(Dolichus Biflorus Agglutinin)的表达(箭头)。细胞核用dapi染色(40×)。E.hAFSC注射3周后肾脏的免疫荧光染色。红色荧光显示经表面标志物CM-DiI标记的hAFSC。值得注意的是，hAFSC定位于肾小球结构附近。绿色荧光显示hAFSC中胶质细胞源性神经营养因子(Glial DerivedNeurotrophic Factor)的表达(箭头)。细胞核用DAPI染色(40×)。EhAFSC注射3周后的RT-PCR。细胞表达NPHS1、AQP2、PAX2、OCLN，用ACTB作为看家基因。

图19描述了显示当向患有甘油诱导之ATN的nu/nu小鼠注射hAFSC时在3天期间内hAFSC对血肌酸酐之影响的图。对照组(仅有损伤以及损伤加上载体对照PBS)显示在48h至72h之间肌酸酐水平的增加，而经hAFSC处理的小鼠则没有显示峰图，其维持与生理参数0.6mg/dl相近的肌酸酐水平。

图20提供了一组柱状图，其详细描述了与向肾中注射hAFSC同时与肌内注射甘油以诱导ATN的小鼠相比，在对照小鼠(绿色)、患有甘油诱导之横纹肌溶解ATN的小鼠(蓝色)肾脏中表达的小鼠和人类细胞因子谱(鼠源细胞因子以红色阴影条显示，人源细胞因子以红色条显示)。数值为平均值±SD。细胞因子基于其在炎症期间主要的生物学活性分成4个广义功能组：1.抗炎性；2.促炎性；3.化学吸引剂；以及4.多种生物学作用。在24h和48h评估了小鼠全肾中表达的细胞因子谱。

图21描述了通过实时PCR测定的在亚群AKPC中表达之基因的总结。

图22描述了在羊水(AF)中鉴定出的不同细胞谱系。

具体实施方式

申请人已通过跟踪羊水总细胞群随时间的存在并研究羊水细胞组成在妊娠期间发生的变化对羊水总细胞群进行了表征，集中研究了来源于3个胚层的细胞和器官的祖细胞。已经从羊水中分离出了显示肾脏祖细胞(包括肾小管和肾小球前体)特性的细胞亚群。这些细胞已经用于例如医学治疗和研究中。

定义

本文中使用的下列术语定义为下述含义：

“祖细胞”是在干细胞分化过程中产生的细胞，具有其终末分化的后代的一些但非所有特性。所定义的祖细胞，例如“肾脏祖细胞”，是指某谱系(肾脏的)，而不是特定的或终末分化的细胞类型。

术语“经分离”或“经富集的群”是指不与一种或多种细胞或者一种或多种细胞组分相关联的细胞，所述一种或多种细胞组分与体内在细胞相关联。

“对象”是脊椎动物，例如哺乳动物，包括人。哺乳动物包括但不限于人、农场动物、运动动物(sport animal)和伴侣动物。术语“动物”包括狗、猫、鱼、沙鼠、豚鼠、仓鼠、马、兔、猪、小鼠、猴(例如猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩)、大鼠、绵羊、山羊、牛和鸟。能够受益于本发明细胞和方法的对象包括但不限于由于物理性损伤或疾病相关损伤而导致肾细胞功能丧失的那些对象。

“有效量”一般是指提供所期望的局部或全身效果和/或性能的量，特别是用于治疗目标病症时。例如，有效量是足以产生有益或所期望之临床效果的量。所述剂量可以一次或多次施用，并且可以包括任意预选的细胞量。可以基于每个对象各自的因素来精确确定被认为是有效剂量的量，所述因素包括其身材大小、年龄、损伤大小以及从损伤发生或患病开始计的时间长短。本领域技术人员，特别是医生，应当能够确定构成有效剂量的细胞数量。

“扩增”是指细胞增殖而不分化。

本文中使用的“进行性肾病”是指随时间推移(例如天、周、月、年)而导致肾功能丧失的任意肾病。

“肾功能”一般是指肾脏的生理学性质，例如滞留蛋白从而防止蛋白尿症(例如尿肌酸酐，蛋白质的***量大于约0.15克/24小时)的能力。可以例如通过肾小球滤过率(例如肌酸酐清除)、尿蛋白***、血尿氮素、血清或血浆肌酸酐或者其任意组合来对肾功能进行评估。

“足细胞”是肾脏脏层上皮中特化的、高度分化的周细胞样细胞。足细胞形成肾小球过滤屏障的重要组分，对其大小和电荷选择起作用，并且维持大量的过滤表面。“Pedicel”(或者“足突”)从足细胞中延伸出来。这些精巧的足突覆盖在肾小球毛细血管的外基底膜表面上。相邻的足细胞相互交叉，覆盖在与肾小球毛细血管紧密联系的基底膜上；但是，仍然存在间隙或细微的滤过隙。当足细胞收缩时，导致滤过隙关闭。这通过减少过滤可用的表面区域使得肾小球滤过率(GFR)降低。此外，已知足细胞使得基质分子合成肾小球基底膜(GBM)，包括IV型胶原、层粘连蛋白、巢蛋白(entactin)和聚集蛋白(agrin)。足细胞损伤或缺失导致蛋白尿症，其中大量蛋白从血液中流失。此外，足细胞缺失是糖尿病性和非糖尿病性进行性慢性肾病(CKD)的标志。

“自我更新”是指产生复本子代细胞的能力，所述复本子代细胞具有与其来源细胞相同的分化潜能。本文中使用的类似术语是“增殖”。

本文中使用的“治疗”包括治疗、逆转、预防、改善或抑制损伤或疾病相关状况，或者损伤或疾病相关状况的症状。

“共施用”可包括同时和/或依次施用两种或更多种药剂/细胞类型。

术语“包含”、“包括”等具有美国专利法中所描述的含义，其可以指“包含”、“含有”等。本文中使用的“包含”或“包括”等指不受限制的包含或包括。

来源于羊水之肾脏祖细胞的分离、生长和表征

本发明涉及经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群和其分离、培养、分化方法以及其用途。其分离、生长和表征在下面实施例中进行详细描述。

此外，在分离时和分离后，可将本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞群培养于本领域熟知且可由美国典型培养物中心(American Type CultureColletion，ATCC)商购获得的培养基中。这样的培养基包括但不限于Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)、DMEM F12培养基、Eagle’s Minimum Essential Medium、F-12K培养基、Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium或RPMI-1640培养基。本领域技术人员可根据所使用细胞的需要来修改或调整培养基和/或培养基添加物的浓度。还很明显的是，可以使用低葡萄糖配方、有或没有丙酮酸钠的多种培养基。

还可以考虑添加含有哺乳动物血清的细胞培养基。血清常含有生存和增殖所需的细胞因子和组分。血清的实例包括胎牛血清(FBS)、牛血清(BS)、小牛血清(CS)、胎小牛血清(FCS)、新生小牛血清(NCS)、山羊血清(GS)、马血清(HS)、人血清、鸡血清、猪血清、绵羊血清、兔血清、大鼠血清(RS)、血清替代品和牛胚胎液。应当理解，如果认为需要使补体级联反应的组分失活，则可将血清在55-65℃热灭活。还可以调整血清浓度或者从培养基中去除血清，以促进一种或多种所期望细胞类型的存活。在一个实施方案中，将所述来源于羊水的肾脏祖细胞在存在对该物种细胞类型特异性的FBS/或血清的情况下培养。例如，可以用约0.5％至约5％或者更高(包括约5％至约15％)的总血清(例如FBS)浓度使来源于羊水的肾脏祖细胞分离和/或扩增。可以凭经验确定血清浓度。

还可以使用额外的添加物，从而为细胞提供用于最佳生长和增殖的微量元素。这样的添加物包括胰岛素、转铁蛋白、***钠及其组合。这些组分可以包含在盐溶液中，所述盐溶液例如但不限于Hanks’BalancedSalt(HBSS)、Earle’s Salt抗氧化添加剂、添加剂、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、N-2-羟乙基哌嗪-N’-乙磺酸(HEPES)、烟酰胺、抗坏血酸和/或抗坏血酸-2-磷酸酯以及额外的氨基酸。很多细胞培养基已经含有氨基酸；但是一些培养基需要在培养细胞前添加。这样的氨基酸包括但不限于L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-天门冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-肌醇、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。

细胞培养中通常还使用抗生素来减轻细菌、支原体和真菌污染。通常所使用的抗生素或抗霉菌化合物是青霉素/链霉素混合物，但是还可以包括但不限于两性霉素氨苄青霉素、庆大霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、萘啶酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤菌素、利福平、奇霉素(spectinomycin)、四环素、泰乐菌素和博来霉素(zeocin)。

细胞培养中还可以有利地使用激素，其包括但不限于D-醛甾酮、乙烯雌酚(DES)、***、β-***、氢化可的松、胰岛素、催乳素、孕酮、生长激素抑制素/人生长激素(HGH)、促甲状腺素、甲状腺素和L-甲腺原氨酸。β-巯基乙醇也可以添加至细胞培养基中。

脂质和脂质载体也可以用于添加至细胞培养基中，这取决于细胞类型和经分化细胞的命运。这样的脂质和载体可以包括但不限于环糊精(α、β、γ)、胆固醇、与白蛋白缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸和油酸、未缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸-花生四烯酸、与白蛋白未缀合和缀合的油酸等。类似地，白蛋白可以用于无脂肪酸配方中。

培养中的细胞可以保持在悬浮液中或者贴壁于固体载体(例如胞外基质组分和合成物或者生物聚合物)。细胞通常需要促进其依附于固体载体的附加因子(例如粘附因子)，例如I型、II型和IV型胶原、伴刀豆球蛋白A、硫酸软骨素、纤连蛋白、“超级纤连蛋白”和/或纤连蛋白样聚合物、明胶、层粘连蛋白、多聚D和多聚L赖氨酸、Matrigel^TM、凝血酶敏感蛋白(thrombospondin)和/或玻璃粘连蛋白。

细胞的维持条件还可以含有允许细胞(例如本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞)保持未分化形式的细胞因子。在细胞必须保持自我更新的未分化状态的情况下，培养基中含有表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其组合是有利的。本领域技术人员应当清楚，分化前应当从培养基中去除使细胞自我更新(例如，以产生与所来源细胞具有相同分化潜能的复制子细胞；本文中使用的类似术语是“增殖”)而不分化的添加物。还很明显的是，并非所有细胞均需要这些因子。事实上，这些因子可以根据细胞类型引发不期望的作用。

可以基于本文中描述的标志物(基因和/或蛋白质)对本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞进行选择。因此，阳性选择方法可以单独使用，也可以与上面描述的用于鉴定和/或分离本发明细胞的方法一起使用。阳性选择方法可以包括利用显微镜和/或其他检测方法的视觉筛选，其包括但不限于免疫印迹、免疫荧光和/或酶联免疫吸附测定。其他阳性选择方法还可以包括但不限于附加选择性培养技术(例如可变的细胞密度或CO₂量)、流式细胞术、RT-PCR和/或基于微芯片的细胞分离方法。还可以使用阴性筛选方法。

诱导来源于羊水的肾脏祖细胞分化

利用合适的生长因子、化学因子和/或细胞因子，可以诱导本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞分化形成多种细胞。经过CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺的初步选择，从来源于后肾间充质组织的不同细胞谱系中分离得到了5个不同的祖细胞亚群。

用分别表达足糖萼蛋白和肾病蛋白的两个细胞群鉴定了足细胞祖细胞。为了使细胞分化更加完全，使用不同组合的ATRA(1-10μM)、维生素D3(100nM)和/或***(最初24-28小时为100nM)培养接种于IV型胶原覆盖之孔中的细胞。

通过PDGF受体α的表达来鉴定间充质祖细胞，并且通过将PDGFα和/或PDGFβ加入培养基中来使其分化。

用E-钙粘蛋白⁺亚群选择肾小球上皮细胞的祖细胞，用BMP-7使其成熟，而通过将VEGF加入培养基中使表达TrKA的基质源性间充质细胞分化。

来源于羊水的肾脏祖细胞的用途

本发明中来源于羊水的肾脏祖细胞可以用来产生肾脏谱系，其包括但不限于足细胞、肾小球细胞类型、远端和近端肾小管上皮细胞以及间充质细胞。

因此，一个实施方案提供了用于提供肾脏细胞的方法，所述细胞可包括但不限于足细胞、肾小球细胞类型、远端和近端肾小管上皮细胞以及间充质细胞，该方法包括在分化因子存在下使本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞分化并分离细胞。所述分化因子可以是但不限于ATRA、维生素3、***、BMP-7和/或多种不同类型的IV型胶原或其组合。分化可以发生于体外、体内或离体中。

本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞和其他难以培养的细胞可以受益于与其他细胞类型的共培养。这样的共培养方法来自下述发现：某些细胞可以提供允许细胞分化成特定谱系或细胞类型的未经鉴定的细胞因子。这些细胞因子还可以诱导细胞表面受体的表达，其中的一些细胞表面受体可容易地被单克隆抗体所识别。通常可以基于本领域技术人员希望诱导的谱系类型来选择共培养的细胞，并且本领域技术人员有能力选择合适的共培养细胞。

可以利用本领域熟知的方法来鉴定并随后分离已分化的细胞(从其未分化形式分离)。可以通过在已分化细胞数量多于未分化细胞数量的条件下选择性地培养细胞，来鉴定已被诱导分化的细胞。这些条件包括例如延长细胞在培养基中生长的时间，从而促进所期望的细胞类型存活。很多原代细胞在一段时间后会衰老而不能***，或者死亡。其他条件包括调整血清类型和浓度，或者在诱导分化成其它细胞类型的生长因子和/或细胞因子的存在或不存在下培养细胞。还可以通过调整血清浓度或者从培养基中去除血清来有利地实现分化。其他诱导分化的方法可包括但不限于在培养过程中调节培养基的酸度以及氧和二氧化碳水平。

类似地，可以通过形态学变化和未分化形式中不存在的特征(例如细胞大小、细胞突起的数量和胞内细胞器分布的复杂性)来鉴定已分化的细胞。还可以考虑通过特异性细胞表面标志物(例如细胞受体和跨膜蛋白)的表达来鉴定经分化之细胞的方法。可以使用抗这些细胞表面标志物的单克隆抗体来鉴定已分化的细胞。可以通过荧光激活细胞分选术(FACS)和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测这些细胞。从特定基因转录水平上调的观点来看，已分化的细胞常常显示与未分化细胞不同的基因表达水平。还可以使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来监测响应于分化的基因表达变化。此外，可以使用利用微阵列技术的全基因组分析来鉴定已分化的细胞。

因此，一旦鉴定了已分化的细胞，如有需要，则可将其与其未分化形式分离开。上面详细描述的鉴定方法还提供了分离方法，例如FACS，优选细胞培养方法、ELISA、磁珠及其组合。本发明的一个实施方案涉及利用FACS基于细胞表面抗原表达来鉴定和分离细胞。应当理解，鉴定和分离方法不限于分析已分化的细胞类型，还可以用来鉴定未分化的细胞类型，例如本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞。

本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞还可以用于细胞置换治疗中。可以将本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞施用至对象的目标组织中，以补充功能性细胞或置换已丧失功能的细胞。或者，还涉及提供已分化细胞的方法，其中将本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞在分化因子存在下分化、分离并施用入或施用至对象的身体上。在一个实施方案中，所述已分化细胞是肾脏谱系细胞。

以肾脏质量和/或功能之丧失为特征并且可受益于本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞和方法的疾病状态可以包括但不限于肾脏疾病或损伤。例如，本发明细胞的一个治疗用途是用于治疗患有肾脏疾病的对象、促进对象中新组织的生长或促使对象中受损组织的存活。本发明细胞的治疗用途包括治疗肾脏疾病。所述肾脏疾病可以是例如肾脏肾皮层或者肾髓质中肾小球、肾小管或间质组织之任何变化、损伤或创伤的结果或者影响。所述肾脏疾病可以是急性或慢性的。

如果对象已经被诊断为患有或者被认为患有通常导致与功能性肾单位的进行性丧失相关之肾脏功能进行性丧失的状况，则可以认为所述对象患有慢性肾衰竭或处于慢性肾衰竭的风险中，或者处于需要肾置换治疗的风险中。这样的状况或原因包括但不限于慢性肾衰竭、终末期肾病、高血压性肾硬化症、遗传性肾炎、肾脏发育异常、糖尿病、败血症、脱水、药物(例如由于摄入利尿剂、NSAID(包括布洛芬和萘普生)、抗生素例如氨基糖苷类(庆大霉素、妥布霉素)、锂和含有碘的药物导致的水分过度流失)、由于肾动脉或静脉阻塞而导致的血液供应减少、横纹肌溶解、多发性骨髓瘤、***性红斑狼疮、膀胱梗阻、高血压、***肥大或***癌、肾癌、肿瘤、肾结石等。

在一些实施方案中，所述肾脏疾病是进行性肾脏疾病。在一些实施方案中，所述肾脏疾病是进行性肾小球肾病。特别适于用本文中描述的方法进行治疗的进行性肾小球肾病包括例如糖尿病性肾病(例如作为I型或II型糖尿病或者***性红斑狼疮的结果)、原发性肾小球肾炎(例如膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化症、膜增生性肾小球肾炎、弥漫增生性肾小球肾炎、膜性局灶节段性肾小球硬化症、轻度肾小球病变、系膜增殖性肾小球肾炎(包括IgA肾病)、管内增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、高密度沉积性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎(包括管外肾小球肾炎)和硬化性肾小球肾炎)和继发性肾小球肾炎(例如缺血性肾病、基于***性疾病的肾小球疾病(包括狼疮性肾炎和Goodpasture综合征)、基于血管疾病的肾小球疾病(包括肾小管栓塞)、基于代谢性疾病的肾小球疾病(包括糖尿病性肾病和淀粉样变性)、遗传性肾脏病变(包括奥尔波特综合征，其源于IV型胶原α3、α4或α5链的突变，所述胶原构成肾、耳和眼的基底膜)和经移植的肾小管病变)。其他的肾脏疾病包括Finnish型肾病、缺血-再灌注损伤、先天性肾病综合征、肾盂肾炎、间质性肾炎、急性肾小管坏死、药物或毒物性肾病、急性肾炎综合征、快速进行性肾小球肾炎综合征、复发性和持续性血尿症、以及慢性肾炎综合征。

Alport综合征(AS)是一种明确确定的慢性肾病(CKD)模型，所述慢性肾病导致终末期肾病(ESRD)。AS是一种罕见的遗传性肾小球肾炎，每20,000人中有1人患有这种疾病。它由IV型胶原的遗传缺陷引起，所述缺陷导致不能产生正常的肾小球基底膜(GBM)。肾脏损伤和最终的ESRD与肾小球硬化和肾小管间质性纤维化(与成纤维细胞活化有关)、炎症和胞外基质重组有关。在男性中，慢性肾炎更快发展为ESRD。在一些家庭中，AS可能与听力丧失和其他病症(包括眼、皮肤、血小板、白细胞以及平滑肌肿瘤)有关。约80％的患病家庭显示X染色体伴性遗传，而其余的则是常染色体显性或者隐性遗传。目前，没有明确的治疗方法来延缓Alport综合征患者向ESRD的发展。可以利用两个小鼠模型(常染色体隐性遗传的129col4α3-/-和X染色体伴性遗传的C57BL col4α5-/-)来研究AS。

本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞可以用于多种不同的临床和临床前应用中，其可包括但不限于用于毒物学或基因组学筛选方法、测定酶的水平以及治疗本文中公开的疾病。本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞可以为高通量毒物学或基因组学筛选提供多种已分化的培养细胞类型。这些细胞可以培养于例如96孔或其他多孔培养板中，以在药物基因组学或药物遗传学中为例如靶标细胞因子、化学吸引剂、生长因子或药物组合物的高通量筛选提供***。

因此，本发明提供了本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞用于检测细胞对生物活性(生物学或药物学)试剂之细胞反应(例如毒性)的用途，其包括使细胞的培养物或其分化的后代与一种或多种生物学或药物学试剂相接触，鉴定细胞对一种或多种生物学或药物学试剂的一种或多种细胞反应，并将所述细胞培养物的细胞反应与对照培养物的细胞反应进行比较。

本发明还涉及组织工程器官或其部分或其特定区段，以及涉及组织工程设备，所述设备包含目标组织以及任选的细胞因子、生长因子或诱导分化成所期望细胞类型的分化因子，其中使用本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞来产生肾脏组织。组织工程器官可以与可生物降解的生物相容性支架一起使用，以支持细胞以三维构造生长。由本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞产生的组织工程器官可以移植入需要置换器官或其部分或其特定区段的对象中。本发明还涉及本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞或由其分化的细胞用作生物反应器之一部分的用途。

由本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞产生的同源器官、其部分或区段可以移植入宿主中。同样地，由本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞被诱导分化为多个组织类型而产生的异源器官、其部分或区段可以移植入有需要的对象中。移植可以是自体同源性的，即器官或器官单位所来源细胞的供体是工程组织的接受体。移植可以是异源的，即器官或器官单位所来源细胞的供体不是工程组织的接受体(例如同种异源的或异种的)。

一旦转移入宿主，组织工程器官就可再现宿主自身组织的功能和构造。组织工程器官将在广泛应用中使对象受益，包括治疗癌症和本文中公开的其他疾病、先天性缺陷或由于手术切除引起的损伤。

来源于羊水之肾脏祖细胞的施用

为了本文中描述的目的，可以向对象施用自体同源、同种异源或异种的本发明的来源于羊水之肾脏祖细胞，其可以是已分化或未分化形式，可经遗传改变或未改变，可通过直接注射至组织部位、全身注射、注射至可接受之基质的表面或周围、以封装形式或者与可药用载体组合施用。

可以通过本领域已知的多种方法向对象施用本发明的来源于羊水之肾脏祖细胞。可以通过局部或全身注射向对象施用本发明的来源于羊水之肾脏祖细胞。

在一个实施方案中，将细胞悬浮液抽吸入注射器中并向对象施用。利用该方法可进行多次注射。使用这样的细胞悬浮液方法提供很多优势。例如，这些方法将细胞引入任意预定部位，并且相对无创。

通常，移植入对象的细胞数量是“治疗有效量的”。本文中使用的“治疗有效量”是指为有效治疗特定损伤或所寻求治疗之疾病所需的移植细胞的数目。例如，治疗组织损伤时，移植治疗有效量的细胞通常使得与损伤相关之症状的数量和/或严重程度减少。本领域技术人员应当理解如何确定合适的细胞剂量。

根据需要，可以通过对宿主施用诱导细胞增殖和分化的任意生长因子、细胞因子或药物组合物，来诱导本发明中来源于羊水之肾脏祖细胞及其分化之后代的体内增殖和/分化。这些生长因子、细胞因子或药物组合物包括本领域已知的任意生长因子、细胞因子或药物组合物，包括本文中描述的用于体外增殖和分化的生长因子和细胞因子。

外源性因子(例如细胞因子、分化因子和其他因子)可以在施用本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞之前、之后或同时施用。例如，同时施用的形式可以包括施用前将培养基中的目标因子和/或可药用载体混合。施用的剂量是可变的，可以包括初次施用以及接下来的随后施用；但是不管怎样，其可以由本领域技术人员由本文公开内容、本文中所引用的文件以及本领域知识来确定。

本发明中来源于羊水之肾脏祖细胞的治疗用途中涉及的一个参数是达到最佳效果所需的细胞数量。不同的情况可能需要对注射进目标组织的细胞量进行优化。例如，施用的细胞量可以随所治疗的对象而变化。在一个实施方案中，可以对人对象施用10⁴至10⁸、更优选10⁵至10⁷和最优选3×10⁷个细胞，以及任选的每天50至500μg/kg的细胞因子。但是，可以基于每个患者的各个因素来精确地确定被认为是有效的剂量，包括其身材大小、年龄、组织损伤大小以及从损伤发生开始的时间长短。因此，剂量可以由本领域技术人员由本文公开内容和本领域知识而容易地确定。

本发明中来源于羊水之肾脏祖细胞的治疗用途中涉及的另一个参数是细胞群的纯度。例如，羊水包含混合的细胞群，其可以被纯化至足以产生所期望效果的程度。利用多种众所周知的方法(例如荧光激活细胞分选(FACS))，本领域技术人员可以容易地确定本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞在细胞群中的百分数。在包含本发明的来源于羊水之肾脏祖细胞的细胞群中，纯度的优选范围是约1至约5％、约5至约10％、约10至约15％、约15至约20％、约20至约25％、约25至约30％、约30至约35％、约35至约40％、约40至约45％、约45至约50％、约50至约55％、约55至约60％、约60至约65％、约65至约70％、约70至约75％、约75至约80％、约80至约85％、约85至约90％、约90至约95％、约95至约100％。可以根据细胞群内细胞表面标志物谱来确定细胞的纯度。本领域技术人员可以容易地对剂量进行调整(例如，纯度减少则需要增加剂量)。

当施用本发明的治疗组合物时，通常将其制成单位剂量的可注射形式(溶液、混悬液、乳液)。适于注射的药物制剂包括无菌的液体溶液和分散体系。载体可以是含有例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇液体等)及其适宜混合物的溶剂或分散介质。

此外，可以添加增强组合物之稳定性、无菌性和等渗性的多种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。多种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)可以确保防止微生物作用。在很多情况下，包含等渗剂(例如蔗糖、氯化钠等)是理想的。使用延缓吸收剂(例如硬脂酸铝和明胶)可以带来可注射药物形式的持久吸收。但是根据本发明，所使用的任何载体、稀释剂或添加剂均须与细胞相容。

根据需要，可以通过将所需量的实施本发明所用的细胞加入到含有多种量的其它成分的合适溶剂中，来制备无菌注射溶液。包含本发明之祖细胞的组合物的实例包括用于施用的液体制剂，包括混悬液；以及用于肌内或静脉内施用(例如注射施用)的制剂，例如无菌混悬液或乳液。这样的组合物可以与适宜的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物还可以是冻干的。根据施用途径和所需制剂，所述组合物可包含辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝剂或增强粘性的添加剂、防腐剂、调味剂、色素等。可以参照标准文章(例如“REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985，其通过引用并入本文)来制备合适的制剂，而无需进行过度的实验。

本发明的组合物可以以液体制剂的形式方便地提供，例如等渗水溶液、混悬液、乳液或粘性组合物，可将其缓冲至所选的pH值。液体制剂一般比凝胶剂、其他粘性组合物和固体组合物更易于制备。此外，液体组合物在某种程度上更便于施用，特别是通过注射施用。另一方面，可以在合适的粘性范围内制备粘性组合物，以提供与特定组织的较长接触时间。

适宜载体和其他添加剂的选择取决于施用的确切途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，组合物制备成溶液、悬液、凝胶或者另一种液体形式，例如缓释形式或者充液形式)。

除细胞之外，溶液、混悬液和凝胶一般含有大量的水(例如纯化灭菌水)。还可以存在少量的其他成分，例如pH值调节剂(例如碱，如NaOH)、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂和胶凝剂(例如甲基纤维素)。组合物可以是等渗的，即其可具有与血液和泪液相同的渗透压。

可以利用氯化纳或其他可药用试剂(例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或者其他无机或有机溶质)来实现本发明组合物之所期望等渗性。

如果需要，可以利用可药用增稠剂来使组合物的粘性保持在所选水平上。甲基纤维素易于得到、较为经济且易于使用。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆(carbomer)等。增稠剂的浓度取决于所选试剂。重点是使用能够达到所选粘性的量。一般通过加入这样的增稠剂由溶液制备粘性组合物。

可以使用可药用防腐剂或细胞稳定剂来增加组合物的有效期。如果使用防腐剂，则本领域技术人员有能力选择不影响本文中所描述来源于羊水之肾脏祖细胞的活力或者效力的组合物。

本领域技术人员公认，组合物的组分应当选择为化学惰性的。这对于化学和药学原理领域的技术人员来说不存在问题，或者，可以由本文所公开的内容和其中所引用的文件，通过参考标准教科书或者进行简单的实验(不涉及过度的实验)来容易地避免问题。

组合物可以以剂量并且通过医学和兽医学领域技术人员熟知的技术施用，其中考虑到例如年龄、性别、体重和特定患者的病症以及用于施用的组合物形式(例如固体与液体相比)等因素。由本文所公开的内容、本其中所引用的文件以及本领域知识，本领域技术人员不需要进行过度的实验即可确定用于人或其他哺乳动物的剂量。

初次施用及进一步剂量或者连续施用的适宜方案也是可变的，并且可以包括初次施用接着是随后施用；但是不管怎样，其可以由本领域技术人员由本文公开的内容、其中所引用的文件和本领域知识来确定。

经遗传学修饰的本发明的来源于羊水之肾脏祖细胞

本发明的来源于羊水之肾脏祖细胞或其分化的后代可以进行遗传学改变。可以通过使用本领域技术人员已知的多种重组方法将异源DNA或RNA引入细胞中，来对本文中所述的来源于羊水之肾脏祖细胞或其分化的后代进行遗传学修饰。这些方法一般分成4个主要类型：(1)病毒转移，包括使用DNA或RNA病毒载体，例如逆转录病毒包括慢病毒、猴痘病毒40(SV40)、腺病毒、α病毒(例如包括辛德毕斯病毒(Sindbis virus)和牛***瘤病毒)；(2)化学转移，包括磷酸钙转染和DEAE右旋糖苷转染方法；(3)膜融合转移，利用载有DNA的膜载体，例如脂质体、红细胞血影和原生质体；和(4)物理转移技术，例如微注射、微粒、电穿孔、核转染或直接的“裸”DNA转移。

可以通过***预先选择的经分离DNA、将细胞基因组片段置换为预先选择的经分离DNA、或者使细胞基因组的至少一部分缺失或失活，来对细胞进行遗传学修饰。可以利用多种方法使细胞基因组的至少一部分缺失或失活，包括但不限于例如利用反义技术(其可包括使用肽核酸或者PNA)或核酶技术进行遗传重组。可以通过同源重组或使病毒整合至宿主细胞基因组中来实现一个或多个预先选择的DNA序列的***。非同源重组方法也是已知的，例如美国专利6,623,958、6,602,686、6,541,221、6,524,824、6,524,818、6,410,266和6,361,972中描述的方法。

还可以将所期望的基因序列引入细胞中，特别是通过质粒表达载体和核定位序列引入细胞核中。本领域已经描述了指导多聚核苷酸进入细胞核的方法。例如，可以将信号肽连接到质粒DNA上，以指导DNA进入细胞核进行更高效的表达。

可以利用启动子引入遗传学材料，所述启动子允许目的基因在特定细胞隔室(包括但不限于细胞膜)中被给定的药物/化合物正向或者反向诱导、施用给定的药物/化合物后被清除、或者可以加上标签使得其被化合物(包括但不限于对它莫西芬(taxmoxifen)作出应答的经突变***受体)诱导。

还可以应用任意转染或转导技术将转录调控序列引入本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞或其后代中，以活化所期望的内源基因。这可以通过同源(例如美国专利5,641,670)或非同源(例如美国专利6,602,686)重组来进行。

可以利用遗传学标记物显示靶细胞的成功转染或转导。例如，已表明维多利亚多管水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白是鉴定和跟踪经遗传学修饰之造血细胞的有效标记物。替代性的可选择标记物包括β-Gal基因、截短的神经生长因子受体和药物可选择的标记物(包括但不限于NEO、MTX、潮霉素)。

实施例

提供了下列实验例，以描述和进一步阐明本发明的某些实施方案和方面，并且不认为其是对本发明范围的限制。

实施例1

来源于人羊水之祖细胞的表征

材料和方法

人羊水总细胞群的扩增

从15至20周孕龄的体内利用羊膜穿刺术获得了28个样品。从来自Genzyme(Pasadena，CA)的废弃培养板中收集具有正常男性核型和正常超声的样品。使用3种不同的培养基使细胞在组织培养盘(BD Falcon，Franklin Lakes，NJ)中增殖：1.Chang’s培养基(αMEM、20％Chang B和2％Chang C)(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)、L-谷氨酰胺20％的ES-FBS(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)和1％的抗生素(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)；2.按照供应(Gibco)加入AmniomaxII；3.向DMEM中添加10％的FBS(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)和1％的抗生素(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用胰蛋白酶-EDTA(0.25％)(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)对细胞进行胰蛋白酶消化。将细胞在培养箱中于37℃和5％CO₂中传代培养50次。

通过3个胚层和祖细胞之标志物的表达对羊水进行表征

根据孕龄对28个人AF样品进行分类，随后指定利用RT-PCR或实时PCR对其进行测试。

利用RT-PCR和Western印迹法对16个羊水样品进行多个标志物的分析，所述标志物来源于所有3个胚层、间充质细胞和造血细胞前体以及不同器官的早期祖细胞(图1、2和3)。

利用实时PCR对12个AF样品进行了分析，以确定不同标志物表达量的变化。

利用RT-PCR进行分析和表征

在第4次和第5次传代之间以及在进行胰蛋白酶消化后，收集细胞以进行RT-PCR和Western印迹分析。利用Rneasy Mini Kit试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照数据表所述分离总RNA。简而言之，在对样品进行裂解和匀浆后，使用硅胶柱通过旋转方法使RNA与DNA分离。在旋转步骤前加入乙醇，以使RNA与硅胶结合。随后将获得的RNA溶液利用DNA酶(DNA酶I，Invitrogen，Carlsbad，CA)进行处理，以避免任何可能的基因组污染。利用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)对1微克的总RNA进行逆转录。在基因特异性引物(Operon，Huntsville，AL)存在下用Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)使cDNA扩增。扩增条件如下：94℃，3分钟；94℃，45秒；每个引物特异性的退火温度(55℃和62℃之间)，30秒；72℃，1:30分钟，总共进行36个循环，随后在72℃，10分钟。在1.0％琼脂糖-溴化乙锭凝胶中分离RT-PCR产物，并且利用Blue/Orange Loading Dye(Promega，SanLuis Obispo，CA)观察。

利用实时PCR对12个AF细胞样品进行分析，以定量先前所提及之特异性标志物的表达。利用Roche Light Cycler 480和Light CyclerTagMan MasterMix进行实时PCR。每个实验在标准的实时PCR条件下进行35个循环。

通过Western印迹法进行分析和表征

使用Nuclear Extract Kit(Active Motif)按照厂商的说明制备全细胞裂解液。在用磷酸酶抑制剂清洗盘后，将细胞溶液从盘上刮下、收集并在4℃以500rmp离心5分钟。于4℃在裂解缓冲液中孵育20分钟后，振荡细胞并随后于4℃以14000rmp离心20分钟。收集上清液并用UV-VIS分光光度计测定浓度。用含有250mM Tris HCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，pH 6.8)、10％SDS(USBio，Cleveland，OH)、30％甘油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、5％β-疏基乙醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、0.02％溴苯酚蓝(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO-Aldrich)的点样缓冲液制备每个样品。从每个样品中分出等量(20ml，1ng/μl)的各蛋白质溶液，在煮沸1分钟的步骤后，用4％-20％的Glycin凝胶进行SDS-PAGE。然后将各溶液转移至0.45μm的PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上，并用多种抗体以1∶1000的浓度进行探查(图4)。用下列浓度进行第二抗体过氧化物缀合：抗小鼠，1∶10000；抗兔，1∶15000；抗鸡，1∶8000；和抗山羊，1∶120000。用TBS中的10％Dry Fat Milk(Santa CruzBiotech.，Santa Cruz，CA)进行封闭步骤。用TBS-T(1％Triton)作为清洗溶液。利用ECL Western印迹检测试剂(Amersham Biosciences/GEHealthcare，Buckinghamshire，UK)进行抗原检测，并在Biomax LightFilm(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)上压片，曝光1分钟。

利用实时PCR进行分析和表征

分离总RNA，按先前所述以800ng/微升的RNA浓度开始进行逆转录。利用Roche Light Cycler 480和Light Cycler TaqMan Master Mix进行实时定量PCR。实时PCR条件如下：90℃，10分钟；60℃，10秒；72℃，1秒，并于72℃分析荧光发射。每个实验进行35个循环。所有的引物和探针均由Roche生产。

来源于羊水之肾脏祖细胞群的筛选和表征

来自全羊水的肾脏祖细胞群和亚群的免疫分离

通过下述方法选择CD24和OB-钙粘蛋白阳性细胞群：将羊水总细胞与特异性抗体(以1∶100稀释的小鼠单克隆OB-钙粘蛋白抗体ABCAMAB52891和小鼠单克隆CD24抗体ABCAMAB31622-100)在摇床上于4℃孵育30分钟，接着与免疫磁性微珠于25℃孵育5分钟并随后于4℃孵育15分钟，其后用MS柱(Miltenyi Biotech，Germany)进行免疫分离。将选择出的阳性和阴性(用作阴性对照)细胞群重新置于含有Chang’s培养基的组织培养盘中进行扩增。

进行先前描述的免疫分离技术后，利用肾病蛋白、TrKa、PDGFRα、足糖萼蛋白和E-钙粘蛋白的抗人抗体如上所述进行进一步免疫筛选，以鉴定肾脏祖细胞的4个亚群。传代18次后，从原始样品中获得最终的亚群。将细胞在与培养羊水总细胞群和主要选择Cd24⁺OB-钙粘蛋白⁺细胞时使用的相同条件下重新接种。

来源于羊水之肾脏细胞群(来源于后肾间充质组织的细胞(MMDC))和4个肾脏细胞亚群的表征

通过RT-PCR和Western印迹分析，对CD24⁺OB^-钙粘蛋白⁺细胞群(MMDC)进行早期和成熟肾脏标志物的分析(图3；图6)。免疫选择后，根据相同的标志物组分析5个亚群，以研究肾病蛋白⁺、TrKa⁺、PDGFRα⁺、和E-钙粘蛋白⁺MMDC来源的细胞群之间的不同特征和共有特征(图7)。

通过实时PCR对CD24⁺OB^-钙粘蛋白⁺和AKPC进行分析和表征

利用实时PCR对CD24⁺OB^-钙粘蛋白⁺细胞群和5个细胞亚群进行了GDNF、WT-1、LIM-1、PAX-2、肾病蛋白、OCT-4、TRKA、PDGFRA、E-钙粘蛋白、ZO-1、足糖萼蛋白和紧密连接蛋白(occludin)的分析。

结果

通过3个胚层和祖细胞之标志物的表达对羊水进行表征

人羊水总细胞群的培养

总细胞群的形态是多种多样的，大部分呈现成纤维样细胞的形状。CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺阳性选择群表现出与成纤维细胞的典型形状不同的形态(图8A-D)。利用DMEM可以对羊水总细胞群进行多达10次传代使其扩增，随后细胞停止生长。培养于Amniomax II和Chang培养基的细胞扩增超过50次传代。但是，只有Chang培养基中的细胞保持初始的细胞形态。因此，选择Chang培养基进行所有的实验。

利用RT-PCR对人羊水细胞进行分析和表征

根据孕周(从15至20周)将羊水总细胞群(AFCP)分类，并利用RT-PCR和Western印迹分析进行分析。如图4所显示，分析了3个胚层、多能细胞、间充质细胞和造血细胞以及几种器官的早期器官祖细胞(图9)之标志物的表达。发现代表内胚层和中胚层之基因的表达随时间而减少，而外胚层标志物则保持恒定表达。

多能细胞标志物在所分析的所有19周以下孕龄中表达。而间充质细胞标志物CD90则在所分析的所有时间点中表达，CD34(造血细胞谱系的标志物)在早期样品中不存在，但是在18周或更大孕龄的样品中少量出现。不同器官的早期祖细胞标志物在18周和更大孕龄的样品中表达。

利用实时PCR进行进一步定量分析

对每个时间点(15-16、17-18、19-20周)的4个样品进行了分析。一些标志物，例如Brachyury、TAL-1、肾病蛋白和TRKA在一个或多个样品中没有表达。Goosecoid和PDX-1在所分析的任何样品中均没有发现。

上皮细胞标志物E-钙粘蛋白在17-18孕周时增加了15倍。相反，NCAM和FGF5虽然也存在，但并没有随时间而明显变化。

中胚层标志物Brachyury仅在15-16周的1个样品中表达。Tal-1随着时间减少，而FLK1增加了4倍。

内胚层标志物CXCR-4在15-16和19-20周之间增加了3.5倍，而SOX-17和AFP则倾向于减少。

多能细胞标志物OCT-4在所研究的范围内没有变化，而c-kit则在17-18周增加了3倍，仅在更大孕龄样品中消失。

与间充质细胞标志物CD90在17-18周增加2倍相反，造血细胞标志物CD34在17-18周后减少。

除了PDX-1未显示表达之外，祖细胞标志物通常随孕龄而增加。早期心脏标志物NKX2.5在19-20周增加了6倍，而肺/甲状腺标志物NKX2.1则在17-18周表达加倍，并在19-20周又增加了2.5倍。

与15-16周和19-20周孕龄相比，CEBPG显示其表达在17-18周增加了5倍。

通过Western印迹法对人羊水细胞进行分析和表征

在孕期中，内胚层和中胚层细胞的蛋白表达显示出减少，而根据mRNA的表达来看，外胚层蛋白在孕期中恒定存在。多能细胞、造血细胞和间充质细胞标志物遵循与RT-PCR分析中所见相同的趋势(图4)。

如图9所显示，来源于不同器官之祖细胞的早期蛋白显示孕期中其在羊水细胞中的表达增加。

全羊水中肾脏祖细胞的选择和表征

利用RT-PCR进行分析和表征

利用一组抗体对表达早期肾脏标志物GDNF的样品进行表征，以研究早期和成熟肾脏分化标志物的表达。如图6A-B所显示，通过RT-PCR和Western印迹法确认肾脏来源之细胞的存在。

在早期和较晚的AF样品中均发现了LIM-1、Aquaporin-1、Zo-1和紧密连接蛋白(occluding)的表达。至18周孕龄时CD24、OB-钙粘蛋白、PAX-2、GDNF和肾病蛋白大部分表达。

利用实时PCR进行额外的分析和定量

CD24和OB-钙粘蛋白在17-18周时其表达加倍。同时CD24的表达在17-18和19-20周之间保持不变，而在相同期间内，OB-钙粘蛋白减少到以前的表达水平。Pax-2在15-16周和19-20周之间稍有增加，而LIM-1的表达则没有变化。对于肾病蛋白，每个时间段的1个样品均为阳性，显示随时间而增加，在19-20周孕龄时加倍。Zo-1和水通道蛋白-1未随时间而显著变化，而紧密连接蛋白则在19-20周增加了8倍。

GDNF和PDGFRA的表达仅在一些样品中发现。

来自全羊水的细胞群和亚群的免疫分离

与AF总细胞群相比，经选择的CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺细胞表现出更加一致的形态。在经选择的CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺细胞群中，很长的细胞突起(体外培养之足细胞的典型特征)更加明显。CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺细胞群经过4次传代扩增后，通过免疫分离法获得了表达足糖萼蛋白、TRKA、肾病蛋白、PDGFRA和E-钙粘蛋白的亚群。

对羊水中来源于后肾间充质组织的细胞进行表征

通过RT-PCR和Western印迹法对主要细胞群(CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺)(图5)和4个衍生亚群中的早期和成熟肾脏标志物以及多能细胞标志物进行了表征(图7)，如前所述。如附图中所显示，肾脏标志物的表达在所研究的群中不同。CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺E-钙粘蛋白⁺细胞群表达E-钙粘蛋白和GDNF，并且对于肾病蛋白是轻度阳性的。CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺肾病蛋白⁺细胞对于肾病蛋白(以及水通道蛋白1和Zona Occludens 1)是阳性的。经免疫选择的CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺PDGFRα⁺细胞群对于ZO-1和PDGFRα是阳性的，而CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺TrKA⁺细胞群表达TrKA、ZO-1和低水平的PDGFRα。CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺足糖萼蛋白⁺细胞群对于GDNF是阳性的，并且对于肾病蛋白是轻度阳性的。

通过实时PCR进行分析和定量

通过实时PCR分析了CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺初始群和5个亚群中特异性肾脏标志物的表达。

E-钙粘蛋白⁺亚群中E-钙粘蛋白的表达增加了2倍，紧密连接蛋白的表达增加了7倍，LIM-1的表达增加了9倍。此外，OCT-4的表达增加了12倍。

PDGFR⁺亚群显示PDGFRA的表达增加了2倍。TrKA⁺亚群表达可比水平的LIM-1、PAX-2、OCT-4、E-钙粘蛋白、PDGFRA和TRKA，而紧密连接蛋白增加了约2倍。肾病蛋白⁺选择群显示GDNF、LIM-1和OCT-4的表达增加了11倍，PAX-2的表达增加了4倍，并且肾病蛋白的表达增加了2倍。此外，紧密连接蛋白的表达增加了4倍，ZO-1的表达增加了7倍。还表达了WT-1，而未发现足糖萼蛋白的表达。

足糖萼蛋白⁺细胞群显示LIM-1、PAX-2、GDNF和OCT-4的表达减少，而足糖萼蛋白的表达增加。此外，还显示了WT-1的表达。

讨论

自从发现干细胞以来，其已经成为再生医学的有前景的工具。其自我更新和多能性特性已经表明，干细胞可以用于修复受损组织和重建受损器官，例如作为受损组织修复和器官离体重建的有用工具。广泛研究了胚胎干细胞(ES细胞)产生胚胎全部细胞类型和胚外组织的能力，但是伦理学争议妨碍了其在治疗中的应用。已经提出将间充质干细胞作为有用的治疗工具，其不存在针对ES细胞提出的伦理和临床方面的问题，因而成为可靠的替代品。MSC是多能性非造血细胞，能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和心肌细胞。

骨髓和脐带血是众所周知的间充质细胞以及造血细胞、血流细胞(例如红细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)祖细胞的来源。造血细胞用于治疗白血病和血液病症，正在对间充质干细胞进行大量的研究，以研究其再生潜力。

脐带血表现出一些优点，例如易于得到新样品，细胞处于未成熟状态以及不存在细胞修复的风险。骨髓可以成为理想的适合物，因为患者自身可以是供体。自体同源细胞在体外扩增后可以重新移植进入骨髓，以避免任何免疫反应。

已经研究将成体干细胞用作不同器官再生的可能工具，但是组织中存在的细胞数量较少，难于对这些细胞驻留的位置(niches)进行定位，并且其分化潜能有限，这些已明确地限制了其吸引力。

羊水(amniotic fluid，AF)，由于其来源以及与发育中的胎儿接触，因而包含大量多种悬浮细胞，所述细胞已经广泛用于诊断目的。最近，已经从AF中分离出同时表现出胚胎干细胞和间充质干细胞特性的干细胞。其易于获得，避免了伦理学纠纷，并且能够在培养基中繁殖而同时保持其多能性(Prusa和Hengstschlager，2002)。除了干细胞之外，还假定羊水中存在其他细胞类型，例如定型祖细胞和成体细胞。

羊水中的干细胞构成总细胞群的不超过1％，关于其他细胞类型的特性几乎是未知的。虽然来源于3个胚层的细胞因产生不同细胞谱系(其具有多种且有时是完全不同的功能)的能力而吸引了科学家的兴趣，但是还没有对羊水中存在之定型谱系祖细胞进行重要研究。因此，本实施例的主要重点是AF中已经丧失多能性并因此定向分化为确切谱系(该谱系可产生有限数目的不同细胞)的那些细胞。

对15-20周之间孕龄范围的人男性羊水样品进行处理。由于羊水组分随孕期胎儿发育而变化，因此通过根据孕龄将样品分组而确定可以获得关于细胞组成的更多信息。

胚胎的发育包括3个胚层中细胞的分化，所述3个胚层是内胚层、外胚层和中胚层。细胞分化的这3个途径涉及通过由多能性状态(pluripotentstate)变为复能性状态(multipotent state)而导致潜能丧失。内胚层产生肺、肝、膀胱、消化道；外胚层产生脑、脊索、皮肤、毛发和眼；而中胚层产生脂肪组织、骨、骨骼肌和内皮。

如本文中所显示，发明人成功地鉴定了表达所有3个胚层的细胞、间充质细胞和造血细胞、不同器官的祖细胞，以及特别是显示肾脏特性的细胞，包括足细胞前体、肾小管上皮细胞和系膜细胞。

在孕期中，人胚胎发育遵循精确的时间表。AF中的细胞在不同孕期时间点定向分化成为多种器官。在所研究的时间范围中，较早样品更频繁并且以较高水平表达与中胚层和内胚层有关的标志物，而在较晚样品中，由于AF细胞随时间分化并且从胎儿分离之细胞的成熟程度不同，这些标志物表达的频率和数量减少。此外，可能由于器官发生过程的成熟，器官特异性标志物的表达随孕期而增加。

大部分AF体积来源于胎儿尿液，因此，假定肾脏祖细胞构成AF的主要成分是合理的。肾脏标志物(例如PAX-2、LIM-1、肾病蛋白、PDGFRA、TRKA、E-钙粘蛋白、CD24和OB-钙粘蛋白)的表达量显示在第17周孕龄末期明显增加。

已经表明肾脏祖细胞存在于AF的总细胞群中，基于报道CD24和OB-钙粘蛋白共表达于发育中的肾脏中并且特别地共表达于后肾间充质组织(MM，其与输尿管芽一起产生成熟肾脏)中的体内研究，从AF中筛选特异性细胞群。该细胞群称为后肾间充质细胞样细胞(CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺)，如图22所显示。当UB诱导MM时，GDNF1、LIM-1、PAX-2、BMP-2和其他基因开始明显表达，这些基因还表达于CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺细胞群中。随后，随着肾脏成熟的进程，基因表达发生改变，并且开始局限于特定的细胞谱系。每种细胞谱系获得通过特异性基因表达引起并通过表面标志物显示的特性，所述标志物例如E-钙粘蛋白(MET，间充质-上皮转化细胞)、肾病蛋白(足细胞)、足糖萼蛋白(成熟足细胞)、TRKA(基质源性皮层间充质细胞)和PDGFRA(系膜细胞)。因此，用这些表面标志物对最初分离的CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺细胞群进行额外的免疫筛选。

五种CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺亚群中基因和蛋白(例如GDNF、WT-1、LIM-1和PAX-2)的存在决定着肾脏细胞类型的命运。还研究了OCT-4的表达，以确定经亚选择的细胞是否仍然具有多向分化的潜能。在肾脏发育过程中，器官特异性前体经历不同的分化阶段，以达到成熟状态。在该成熟过程中，多能基因不会突然关闭，而且所有的成熟期特异性基因也不会突然开启。在中间状态时会发生两种类型之基因的共表达。如图21中的总结所显示，RT-PCR分析证实，来源于CD24⁺OB-钙粘蛋白⁺细胞群的5个亚群均具有肾脏标志物表达的特定暂时性模式。

最令人感兴趣的结果之一是由WT-1的表达(体内表达于后肾S形体邻近部分中的后肾细胞中并随后专门表达于成熟足细胞中)所揭示的。在所有分离出的亚群中，仅肾病蛋白⁺和足糖萼蛋白⁺的细胞表达WT-1，表明这些确实是足细胞的前体细胞。特别需要强调的是，例如PAX-2或者LIM-1基因在经筛选的足糖萼蛋白⁺细胞中没有表达，但是在肾病蛋白⁺细胞中明显表达，表明与表达足糖萼蛋白的细胞相比，肾病蛋白⁺细胞可能代表较为不成熟的足细胞谱系。足糖萼蛋白⁺细胞不表达OCT-4而肾病蛋白⁺细胞高水平表达OCT-4的发现也支持了这一观点。此外，培养的足糖萼蛋白⁺细胞显示所培养的人足细胞的典型形态，呈现出与Vogelmann等所描述相似的主要突起。在其他细胞群中，WT-1没有表达，表明这些细胞不会定向分化为足细胞。特别地，PDGFRA⁺细胞的表达模式，即表达PAX-2而不表达LIM-1，表明其定向分化为肾源性谱系而不是目前认为的MET。此外，OCT-4高度表达，这是与TRKA⁺细胞群共有的特性。TRKA⁺细胞群对于PAX-2、LIM-1和TRKA是显著阳性的。特别地，仅在发育中之肾脏的基质源性皮层间充质细胞中表达的TRKA表明TRKA⁺细胞的定向。E-钙粘蛋白⁺细胞不表达PAX-2，相反，其显示LIM-1和E-钙粘蛋白的表达，这表明其未完成肾原性模式的定向分化。

总的来说，除了存在具有多能性特性的少数细胞(1％)之外，AF细胞中其他99％的组分是多样性的，其中含有大量的细胞亚群，这些细胞亚群表现为定向分化成为特定种系或组织终点，从非特异性祖细胞到器官特异性祖细胞以及经分化的成熟细胞类型。本文中对AF中的MM样细胞群进行了鉴定，从中成功地分离出特异性细胞亚群并使其在培养基中经过几次传代生长。人AF中特异性肾脏祖细胞(特别是足细胞前体)的存在和成功鉴定表明其是用于再生性治疗(可应用于多种肾脏疾病)的有价值的细胞来源。

实施例2

羊水干细胞用于肾脏再生-人羊水干细胞在急性肾小管坏死中的保护性作用

材料和方法

来源于羊水之c-kit阳性干细胞的分离和标记

经洛杉矶儿童医院临床研究委员会(Childrens Hospital Los AngelesCommittee 0n Clinical Investigation)(IRB)批准，由废弃的羊膜穿刺术(amniocentesis)获得了人羊水样品。由于所获得的样品信息仅限于核型和胎儿健康状况，因此不需要书面或者口头同意。利用如De Coppi等(2007)所述的以细胞表面标志物c-kit为对象的标准磁珠分选(MACS)技术(Miltenyi Biotech)，从人羊水细胞总体环境中分离干细胞群。根据Atala等概述的方案测试克隆群和亚克隆群的多能性。然后将克隆培养于培养皿中，培养基含有添加了20％Chang B、2％Chang C溶液、20％胎牛血清、1％谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素抗生素(Gibco/BRL)的α-MEM。利用标准方法确定了用于体内注射之hAFSC的核型。

注射前，在0.05M胰蛋白酶/EDTA溶液中对hAFSC克隆群进行胰蛋白酶消化，并以1500rpm离心5min，然后按照厂商的说明进行细胞表面标志物CM-Dil(Molecular Probes)的标记，以便在注射期间和注射后跟踪细胞。简而言之，将细胞与1mg/ml的CM-Dil于37℃孵育5分钟，随后于4℃孵育15分钟并用PBS清洗3次。

急性肾小管坏死的诱导和注射

禁水22小时后，通过肌内注射50％的高渗性甘油溶液(10ml/kg体重)(Sigma-Aldrich)，在雌性nu/nu小鼠(Jackson Laboratories，BarHarbor，ME Harlan)中诱导横纹肌溶解诱导的ATN(Acute TubularNecrosis，急性肾小管坏死)。递送细胞之前，在麻醉状态下通过外科手术方法暴露大腿根部肌肉并缓慢注射甘油溶液，进行受控的肌内甘油注射。经洛杉矶儿童医院动物关爱与利用委员会批准，遵守实验室动物关爱与利用国家研究机构健康指南(National Institutes of Health Guide for theCare and Use of Laboratory Animals)，进行动物实验。

利用异氟醚吸入将小鼠小心地麻醉。一旦达到令人满意的麻醉效果，利用氯己定(clorxidine)准备小鼠外科手术。在背部切开约1cm的小切口，通过切口小心地取出两个肾脏，利用微注射器EppendorfTransferMan NK2 Injector(Eppendorf)，使用30-33号针小心地将hAFSC(在PBS缓冲液中稀释1×106倍)注射到两个肾脏的皮层中。接着将肾脏放回到腹膜后腔，用聚丙烯缝线(Taper C-1，5-0号，90cm)缝合切口，并使小鼠从麻醉中恢复。在整个麻醉期间，使小鼠保持在加热垫上。缝合伤口前，皮下施用0.1mg/kg的丁丙诺啡，并沿切口边缘施用1mg/kg的丁哌卡因(局部麻醉剂)，以缓解术后疼痛。将动物遮盖，以防止肾脏与动物皮肤接触，以减少腹膜炎的风险。对照动物用PBS进行注射。

组织处理

在不同的时间点(从24小时至3周)处死经注射的小鼠和对照小鼠。将肾脏切碎，并根据所要进行的分析用以下方法之一进行处理。

RNA/DNA提取

将肾脏切成小片，并利用Qiagen Rneasy试剂盒根据厂商的说明提取RNA。简而言之，提取总mRNA并进行逆转录。利用不编码小鼠序列的人特异性引物对所得到的cDNA进行扩增。在初始变性步骤(95℃，10分钟)后，利用PCR热循环仪(Eppendorf)。变性步骤在95℃进行30s；随后是退火步骤，在每个引物特异性温度(范围从54℃至60℃)下进行45秒；以及延伸步骤，在72℃进行45s，总共进行35个循环。为了排除扩增基因组DNA的可能性，用无DNA的试剂盒(Ambion Inc.)处理RNA样品。通过利用1％琼脂糖凝胶电泳进行大小分级，对PCR扩增产物进行检测。对人β-肌动蛋白的RNA片段(作为看家基因)进行扩增。引物序列和扩增子的预期大小显示于图14中。

为了对基因组DNA进行PCR，以评估萤光素酶基因的存在，依照下列Qiagen DNeasy试剂盒的标准方案进行DNA提取。

组织学

将肾脏在4％经缓冲的多聚甲醛(Sigma-Aldrich)中于4℃固定8小时，经常规处理，包埋于石蜡中，做成5μm切片。简而言之，将肾脏在70％酒精中清洗2小时，随后在酒精中清洗2次2小时，并置于甲苯中2次40分钟，接着置于甲苯/石蜡溶液中1小时并于石蜡中过夜。第二天早晨，肾脏完全包埋于石蜡中，准备进行切片。依照标准的组织学方法，用苏木精和伊红(H&E；Sigma-Aldrich)、甲苯胺蓝(Sigma-Aldrich)以及过碘酸希夫(Periodic acid Schiff)(PAS；Sigma-Aldrich)对切片进行染色。

此外，将一些肾脏用液氮冷冻并储存于-20℃。当需要时，将其制成5μm的冷冻切片，然后用于免疫组化分析。

用萤光素酶-生物发光检测法对AFSC进行标记

依照标准方案，用洛杉矶儿童医院Vector Facility制备的慢病毒载体(SMPU-R-MNCU3-LUC，基于转导了萤火虫萤光素酶基因的HIV-1)对hAFSC进行了转导。通过去除旧培养基并添加新的病毒上清和培养基进行2轮转导。初次转导后24小时，在移植或体外分析之前，用磷酸盐缓冲液(PBS)充分清洗细胞3次。体内注射之前，进行简单的体外测试，以确定通过生物发光可检出的hAFSC最小量。评估了范围从5×10⁴至2×10⁶的不同细胞浓度。此外，通过PCR证实了细胞经20次传代培养后仍然表达萤光素酶基因。将经萤光素酶转导的hAFSC(稀释于PBS中，1×10⁶细胞/小鼠)直接注射到从Jackson Laboratories获得之10周龄nu/nu小鼠的肾脏中。利用原型IVIS三维生物发光/荧光光学成像***(Xenogen，Alameda，CA)在不同的时间点进行光学成像。

在成像之前，对每只小鼠静脉内注射如所描述(Wang等，2003)的剂量为125mg/kg的萤光素(Promega)。接着用5％异氟醚诱导全身麻醉，并将小鼠置于不透光的加热室中；在该步骤中，通过鼻锥(nose cone)将2％异氟醚引入，持续进行麻醉。所述成像***包括一个冷背照式电荷耦合器件(CCD)照相机，以捕捉用发光二极管获取的动物可见光图像和发光图像。旋转镜和可移动的动物平台使得可以获得360°的图像。

免疫染色

用荧光染料对冷冻和石蜡载玻片进行染色。将石蜡载玻片脱蜡，置于1％的Triton中5分钟(如果抗原是细胞核)并在PBS中简单清洗。接着将石蜡载玻片置于Vector Antigen Retrieval Solution(VectorLaboratories)中3次。冷冻载玻片在80％甲醇中固定5分钟。用抗生物素蛋白/生物素(Vector Laboratories)进行封闭后，利用PBS中的合适的5％正常血清进行第二次封闭。将载玻片在第一抗体(VectorLaboratories的双花扁豆凝集素和花生凝集素、Promega的萤光素酶以及Santa Cruz的胶质细胞源性神经营养因子和水通道蛋白2)溶液中于室温孵育1小时或者于4℃过夜。接着用PBS清洗载玻片3次，每次5分钟。第二抗体(Vector Laboratories)的浓度在5％正常血清中是1∶200。将切片在该溶液中于室温孵育1.5小时，随后用PBS清洗3次，每次5分钟。接着在PBS缓冲液中以1∶500的浓度使用合适的荧光标记物(VectorLaboratories的Texas Red或者Fluorescein Avidin DCS)5-10分钟，随后用PBS最后清洗3次，每次5分钟。进行TUNEL染色(Roche，Applied-Science)，以确定凋亡细胞的存在。简而言之，将细胞与TUNEL试剂于37℃孵育1小时，接着用PBS清洗。用DAPI封片剂(VectorLaboratories)将载玻片封片。在实验组中，对每300个细胞核中阳性凋亡细胞核的数量进行计数，将经hAFSC处理的动物与未处理的对照动物比较。数值为平均值±SD。Leica DM RA荧光显微镜与Open Lab 3.1.5软件组合使用，以使染色成像。

血液采集，肌酸酐和BUN的测定

经洛杉矶儿童医院Animal Core Facility和Saban研究院批准，用5mm刃口长度的动物柳叶刀将面静脉切开，并利用标准方案采集血液。将动物分成如下不同的组：1.10只动物，用于测定肌酸酐基线水平；2.10只动物，经历ATN(急性肾小管坏死)但未注射hAFSC；3.10只动物，经历ATN且经甘油注射2小时后肾内注射hAFSC；4.10只动物，经历甘油诱导的ATN且经甘油注射2小时后肾内注射PBS。

将血液样品(30μl)采集到含有肝素锂的血浆分离管中。将其以13,000-RPM离心3分钟，移去血浆(上层)并在分析前储存于-80℃。在指定的14天期间内对最多15％的循环血液进行采样(血液总体积约占总体重的0.6％)。每24小时获得损伤后测定值。血液样品用于通过分析肌酸酐的水平和BUN的水平监测肾脏功能。根据厂商说明，通过将30μl血清样品点样于96孔微滴定板中，进行肌酸酐(BioAssay Systems Cat#DUCT-500)和BUN(BioAssay System Cat#DIUR-500)的ELISA。利用非配对t检验进行组之间的比较。认为p＜0.05的数值具有统计学显著性。利用GraphPad Prism软件进行分析。数据显示为平均值±SD。

形态学研究

通过常规方法制备厚度为4μm的肾脏切片，并如上所述用PAS试剂染色。将肾脏切片分成6个主要的组：1.经历ATN但未注射hAFSC的小鼠，处死于24小时；2.经历ATN且经甘油注射2小时后肾内注射hAFSC的小鼠，处死于24小时；3.经历ATN但未注射hAFSC的小鼠，处死于48小时；4.经历ATN且经甘油注射2小时后肾内注射hAFSC的小鼠，处死于48小时；5.经历ATN但未注射hAFSC的小鼠，处死于72小时；以及6.经历ATN且经甘油注射2小时后肾内注射hAFSC的小鼠，处死于72小时。

利用PAS染色，基于3个主要参数对肾小管损伤进行了评估：1.肾小管膜的破坏；2.刷状缘的破坏；和3.管型形成。在实验组中，利用经PAS染色样品中的连续性非重叠区域，将受损肾小管计数为存在于切片中的肾小管总量的分数。在不知道实验组的情况下对受损肾小管的百分数进行评估。数值为平均值±SD。

细胞因子分析

为了检测甘油诱导ATN(注射或未注射细胞)后产生的促炎分子和抗炎分子，利用多细胞因子阵列技术(Proteome Profiler Array Kit)测定经消化的小鼠肾脏中人和小鼠细胞因子的水平。简而言之，在细胞裂解缓冲液中将肾脏组织匀浆，将匀浆物于4℃以12,000rpm离心15分钟。利用Cytokine Array Kit(对于人而言批号是ARY005，对于小鼠而言批号是ARY006)，按照方案说明(R&D Systems，Inc.)测定每个上清液中的总蛋白浓度。利用Array Vision Program(R&D Systems，Inc.)分析数据。

结果

注射前hAFSC的表型和核型

如图15A所显示，注射前HAFSC表现出成纤维细胞样形状。对注射前hAFSC中早期和晚期肾脏标志物的表达进行分析。如图15B所显示，hAFSC对于很多肾脏标志物而言(从早期肾脏发育中表达的转录因子到晚期分化标志物)是阴性的。这使得可以确定当体外培养时，hAFSC并非特异地定向分化为肾脏祖细胞。

对细胞进行测试，以证实体内应用前的正常核型，以便排除可损害其多能性的染色体异常(图15C)。

甘油诱导的肌肉损伤和急性肾小管坏死(ATN)，苏木精和伊红(H&E)，过碘酸希夫染色(PAS)，TUNEL

图16A显示任何损伤前小鼠肾脏(nu/nu)的正常形态。髓质和皮层之间的界线清晰可见，肾小管和肾小球都是完整的。图16B显示肌内注射甘油3天后的肾脏形态。ATN造成了显著的结构破坏，以致不能区分髓质和皮层。近端肾小管和远端肾小管的正常结构被破坏(有管型形成)，而大多数肾小球则保持完整。这种类型的损伤是典型的横纹肌溶解诱导之损伤，其中经历衰竭的肾脏的主要结构是肾小管而非肾小球。在该公认的模型中，主要的病理学机制是肾脏血管收缩、管腔内管型形成和血红素蛋白直接诱导的细胞毒性(并产生促进缺血性损伤的自由基)(图16C和16D)。

与对照(其未经历甘油诱导的肌肉损伤)相比，凋亡细胞(TUNEL染色)数量增加。此外，与未经处理的对照小鼠相比，经甘油处理的小鼠中存在的凋亡细胞数量的差异非常显著。

通过生物发光体内检测hAFSC

在体内注射前，用编码萤光素酶的慢病毒(在多次群体倍增内稳定表达转基因)转导hAFSC。图17A显示未经感染的细胞(作为对照)与暴露于萤光素(萤光素酶的底物)的经感染细胞之间的对比，以确定20次群体倍增后在生物发光检测下信号的存在。在图17B中，体外实验确定了生物发光检测下光学检出的最小细胞数量是1×10⁵个细胞。

在容易地检出损伤诱导(图17C)后，将1.2×10⁶个hAFSC直接注射到右肾中。左肾用作对照。信号非常明显，并扩散至身体的多个区域(小图1-2)，例如最初几天扩散至肺。注射后24小时可以看到肾脏区域中hAFSC的信号(小图3)。48小时和72小时时的肾脏信号最强，并持续至多达6天(小图4-5)，其后在接下来的几天中信号开始消失(小图6-7)。但是，在注射后21天，肾脏区域的信号再次明显(小图8)。

第21天时对经注射和未注射的肾脏进行DNA提取和PCR，以确定萤光素酶的存在。结果显示，如看家基因ATCB不存在时所证实的，萤光素酶和人ATCB DNA仅存在于经注射的肾脏组织中(图17D)。从整个经注射的肾脏中提取DNA。如图17E所显示，对萤光素酶的阳性免疫染色也证实了该结果。

通过免疫组化和基因表达检测受损肾脏中的hAFSC

用组织学方法对经注射之hAFSC的存在进行评估。通过表面标志物CM-Dil的红色荧光所检测的注射后1周的冷冻切片证实了hAFSC的存在(图18A)。观察到来自hAFSC的CM-Dil信号与肾脏标志物的荧光染色相重叠，几个实例如下：注射后3周，将萤光素酶阳性的hAFSC针对水通道蛋白2、花生凝集素、双花扁豆凝集素进行双重染色，表明hAFSC能够分化成为表达成体远端和近端肾小管凝集素的细胞(图18B-D)。在一些实例中，还在表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF；图18E)的肾小球结构中发现了hAFSC，表明干细胞还能够表达分化早期的肾小球标志物。

21天后，利用人特异性引物对所收集的肾脏进行RT-PCR，并鉴定出经注射之肾脏中hAFSC所表达的几种特异性人肾脏基因(分化早期和晚期的标志物)：肾病蛋白、水通道蛋白2、Pax-2和Occl(与注射前的hAFSC相比)(图18F)。

肌酸酐和血尿氮素(BUN)的测定

用10只nu/nu小鼠的对照组来确定任何处理前血清肌酸酐的基线水平，其平均为0.6mg/dl。第0天肌内注射甘油后，肌酸酐的水平增加至高达1.10mg/dl，注射后48小时和72小时之间显示出峰值。

类似地，注射甘油后UBN的水平(基线水平为27mg/dl)增加，并在约48小时和72小时检测出峰值。3周后肌酸酐和BUN的浓度回复至正常水平。进一步的分析表明，在肌内注射甘油后注射盐水介质溶液的动物与注射甘油后未注射盐水介质溶液的动物之间，肌酸酐和BUN的水平没有统计学上的显著差异，因此，将这些组合并进行统计学分析。相反，经历肌内注射甘油诱导之损伤并接受肾脏内注射hAFSC的动物显示，在预期的损伤急性期中肌酸酐和BUN的水平没有增加。

形态学研究

从24小时至72小时，观察到在经甘油处理的动物中受损肾小管的数量增加。到72小时时，由于受损肾小管内的管型形成，损伤更加严重。与未注射干细胞的动物相比，在经甘油注射且用hAFSC处理的动物中受损肾小管的数量在48小时时增加，但是到72小时时受损肾小管的数量显著减少。双因素ANOVA显示出时间的非常显著的影响(p＝0.03)以及时间和处理之间的相互作用(p＝0.01)。

免疫细胞因子谱

由于在ATN急性期中注射hAFSC产生有益作用，因此该保护性作用可能涉及肾脏细胞因子环境的急性变化。肌内注射甘油后24小时和48小时，将人以及小鼠肾脏中表达之细胞因子的细胞因子谱与未受损对照组和经甘油注射且肾内注射hAFSC的小鼠的进行比较。细胞因子水平以全面的依次性柱状图组(平均值和SD)显示于图20中。为了相对易于解释，不同的细胞因子基于其主要的免疫学功能显示为4个广义功能组：1.抗炎性；2.促炎性；3.化学吸引剂；和4.多种生物学作用。对于单个细胞因子而言，图中的柱从左至右显示：对照的细胞因子水平；24小时时的ATN肾脏；以及24小时时经hAFSC注射的ATN肾脏(显示为来源于小鼠和来源于hAFSC之人细胞因子水平的总和)。然后在48小时时重复该显示顺序。

小鼠特异性细胞因子测定与人细胞因子测定没有交叉反应。其通过将经消化的小鼠肾脏与人细胞因子特异性膜一起孵育以及相反地将hAFSC与小鼠细胞因子特异性膜一起孵育而证实。

在所显示的时间点(24小时和48小时)将小鼠组织暴露于人细胞因子和小鼠细胞因子活性中。当用这种方式考虑时，在早期细胞因子反应中，很显然所分析之组合细胞因子水平大部分趋向于显著增加。因此，肌内注射甘油后24小时和48小时，当肾脏损伤达到峰值时，未注射hAFSC的小鼠中所有4组细胞因子的表达水平均显著上升(多达5或6倍)。但是，当向经甘油处理的小鼠注射hAFSC时，细胞因子水平的增加甚至明显更多，特别是24小时时将小鼠和人细胞因子的水平相加。但是，在48小时时，组合细胞因子水平的这种趋势发生逆转，以致大部分组合细胞因子水平相对于未接受hAFSC注射的肾脏来说显著降低或者不再增加。此外，到48小时时，人与小鼠细胞因子的相对比例也发生逆转，细胞因子环境中人组分相对较小。

缩写

hAFSC：人羊水干细胞；ATN：急性肾小管坏死；H&E：苏木精和伊红；PAS：过碘酸希夫；BUN：血尿氮素；AQP1：水通道蛋白1；AQP2：水通道蛋白2；GDNF：胶质细胞源性神经营养因子；ZO-1：闭锁小环蛋白(Zona Occludens)-1：OCLN：紧密连接蛋白(Occuldin)；THP：Tamm-Horsfall蛋白；CDHOB：OB-钙粘蛋白；ACTB：β-肌动蛋白。

讨论

急性肾小管坏死(ATN)造成肾脏肾小管上皮细胞的严重损伤，其可导致终末期肾病(ESRD)。本文中证实了hAFSC的保护性作用，所述hAFSC直接注射到经甘油诱导之ATN的肾脏中。近些年来，一些研究已经证实了干细胞(主要是来源于骨髓的间充质干细胞)或肾脏特异性祖细胞(Lin，2007；Al-Awqati和Oliver，2006)改善肾脏损伤的潜在作用。发现移植骨髓干细胞可以整合到受损肾脏中(Gupta等，2002；Poulsom等，2001)。Morigi等(2004，2006)和Herrara等(2004)表明间充质干细胞(MSC)能够整合到受损的肾小管中，并推测来源于骨髓的MSC具有分化成为肾脏上皮细胞的能力。但是，尚不清楚是否这些细胞整合到受损的肾小管中具有任何生理作用。相反，其他小组已经表明，MSC具有通过不同于整合和复制的机制修复受损肾脏功能的作用(Duffield等，2005；Lin等，2005)。Bonventre等(2008)强调MSC在肾脏修复中的重要性，并且提出MSC可能通过作用于急性肾脏损伤后的炎症过程来介导修复的可能性。

已经对来源于羊水的新型干细胞群进行了表征(De Coppi等，2007)。这些c-kit⁺细胞在体外可以分化成来源于所有3个胚层的细胞，并且显示出与体内分化相似的潜能。hAFSC具有整合到胚胎肾脏中的潜能，并参与肾脏发生的关键步骤，表明当置于合适的环境中时，hAFSC可以被诱导成为肾脏(Perin等，2007)。

在针对急性肾衰竭(nu/nu小鼠)的本研究中，诱导ATN所需的甘油量比野生型小鼠所需剂量高50％(数据未显示)。这表明与野生型小鼠相比，T缺陷的小鼠(裸鼠)可得到保护而不受甘油-横纹肌溶解诱导的ATN的影响(Burne等，2001)。甘油诱导的ATN涉及复杂的一系列事件，其中受损肌肉中释放的肌红蛋白破坏远端肾小管上皮细胞，导致管型形成、血管收缩并且使得肾小球过滤压降低。凋亡细胞水平较高、肌酸酐和BUN水平增加以及组织学分析证实了本模型中存在ATN。

如萤光素酶检测所证明的，注射后存活之hAFSC的数量随时间而减少。尽管如此，注射的hAFSC可以分化为肾小管上皮细胞。如利用特异性的人抗体和人引物进行免疫组化和RT-PCR所测定的，注射后3周在受损肾脏中发现了hAFSC，其定位于受损的肾小管中，并且表达上皮细胞标志物。注射前这些标志物不存在于体外hAFSC中。

还证实了注射的hAFSC还能够表达肾脏基因，例如PAX2和NPHS1，表明其可以定向诱导分化为肾脏。此外，在某些情况下，注射的hAFSC细胞可以表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，所述GDNF在肾脏的极早发育期时表达，通常不在成体肾脏中表达。

还评估了hAFSC是否可调节损伤后的肾脏功能，其反映为血清肌酸酐和BUN。当在已确立的损伤急性期(注射甘油后48-72小时之间)中注射hAFSC时，肌酸酐和BUN的水平没有降低(数据未显示)。这意味着当损伤已经发生时再注射hAFSC已太晚，而不能改善损伤。相反，当在注射甘油的同一天将hAFSC注射到肾脏中时，没有观察到肌酸酐和BUN的峰，强调了AFSC具有潜在的保护性作用。因此，当注射得足够早(在此情形下与损伤同时)时，hAFSC可以改善急性肾脏损伤。

此外，组织学分析还证实，甘油注射后72小时，与经注射了甘油但未经hAFSC处理的肾脏相比，经hAFSC注射的肾脏显示具有较少的受损肾小管。经AFSC处理的动物中肾小管膜破坏较少并且无管型形成。因此，似乎注射hAFSC使得部分受损之肾小管上皮细胞增殖加快，并且防止额外的细胞凋亡。该保护机制导致总体上更好地维持了肾小管结构，因此避免了甘油诱导的ATN中通常观察到的BUN和肌酸酐增加。

在急性肾脏损伤过程中，免疫反应特别地在前48小时发挥作用；受损肾脏上皮细胞吸引白细胞，损伤时释放血管活性介质，肾小管上皮细胞产生促炎性细胞因子和趋化性细胞因子(Bonventre等，2003)。最近，Bonventre等(2008)和Lin等(2007)推测骨髓干细胞有助于肾脏修复的机制是通过削弱免疫反应，而不是通过干细胞整合到受损器官的细胞中或者分化成为受损器官的细胞。Togen等(2005)表明，基于测定血清肌酸酐水平，注射MSC可以早在24小时时抵御缺血性肾脏损伤。他们还推测，由于观察到的保护性反应时间非常短，这些动物中的保护作用不是通过所注射MSC的整合和分化而实现的。

本文中证实了注射hAFSC的有益作用在ATN过程的早期发生。因此，为了进一步研究hAFSC增强肾脏保护作用的潜在机制，测定了肾脏内的细胞因子，以便确定最初48小时中当免疫***在急性损伤期发挥极重要作用时，与未经处理的小鼠相比，经hAFSC处理的小鼠中炎症细胞因子的模式是否发生总体变化。

与未经处理的对照小鼠相比，仅经甘油注射的动物中显示肾脏细胞因子表达的显著增加。这表明在急性ATN中，肾脏响应于细胞因子的强烈释放。与仅用甘油处理的肾脏中测定的细胞因子水平相比，当用hAFSC注射小鼠时，细胞因子水平的增加甚至明显更多，特别是在较早(24小时)的时间点。因此，hAFSC的功能可能是在ATN早期扩大肾脏细胞因子环境。

而且到48小时时，组合细胞因子水平中的这种趋势发生逆转，以致大部分组合细胞因子水平相对于未接受hAFSC注射的肾脏来说显著减少，或者不再升高。此外，到48小时时，人与小鼠细胞因子的相对比例也发生逆转，细胞因子环境中人组分的比例相对较小。

除了几个例外，大部分人细胞因子对小鼠细胞也是具有活性的(Maliszewski等，1998；Hu-Li等，1987；Liu等，1995；Schwabe等，1996；Kennedy等，1996；De Haan等，2000)，因此人和小鼠细胞因子均很可能影响肾脏环境。这可能是有相关性的，因为很可能来源于经注射之人细胞的细胞因子以及内源性小鼠细胞因子的复杂相互作用可在任何保护性作用中发挥作用。

因此，当将hAFSC直接注射到ATN小鼠模型的肾脏中时，其可以被招募，如先前在两个肺损伤小鼠模型中所显示的(Carraro等，2008).因此，hAFSC可以驻留于损伤位点，在那里其防止受损组织进一步损伤，并通过细胞因子介导的旁分泌机制加快修复。据信，由hAFSC分泌的细胞因子与内源性小鼠细胞因子之间有协同作用，以促进并保持组织总体的内稳态，并且与有助于使损伤消退的炎症环境相互作用，因而允许防止甘油诱导的ATN中急性期的进程。

此外，与24小时时(此时人细胞因子的相对比例非常高)的组合细胞因子水平相比，将hAFSC注射到ATN肾脏后48小时时，细胞因子表达模式的大部分贡献来自于小鼠细胞因子。这表明人细胞因子在肾脏响应于损伤的最早期发挥作用。

总之，证实了hAFSC对在中毒性损伤中存活的固有肾脏细胞的营养作用，而不是通过受损结构的直接再增殖，即使其显示出随时间分化为肾小管上皮细胞的潜能。如通过肾小管结构损伤的更快消退以及正常化的肌酸酐和BUN水平所显示的，早期将hAFSC直接注射到肾脏中显著改善ATN损伤。此外，数据表明hAFSC在非常早期的时间点具有免疫调节作用，与内源性细胞因子产生的幅度相当。因此，hAFSC可以应用于治疗肾脏疾病的目的，包括用于组织再生的多能细胞来源和全器官工程的可行替代品。

以下实施方案内容对应于原申请的权利要求书：

1.经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群。

2.来源于羊水之CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞的克隆群。

3.实施方案1或2的细胞群，其中所述细胞还表达E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、PDGFR-α、足糖萼蛋白或其组合。

4.实施方案1或2的细胞群，其中所述细胞能够被诱导分化成后肾细胞、足细胞、基质源性间充质细胞或系膜细胞。

5.实施方案1或2的细胞群，其中所述细胞能够在体内或离体被诱导分化。

6.一种组合物，其包含实施方案1或2的来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群以及可药用载体和/或培养基。

7.一种制备组合物的方法，包括将实施方案1或2中任一项的细胞或者由其分化的后代细胞与载体混合。

8.实施方案7的方法，其中所述载体是细胞培养基。

9.一种产生来源于羊水之肾脏祖细胞群的方法，包括从羊水样品中选择CD24和OB-钙粘蛋白阳性细胞。

10.实施方案9的方法，其中所述选择利用抗CD24抗体和抗OB-钙粘蛋白抗体进行。

11.实施方案9或10的方法，另外针对E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、PDGFR-α或足糖萼蛋白进行选择。

12.实施方案9或10的方法，其中所述选择通过荧光活化细胞分选或高梯度磁性选择进行。

13.由实施方案9或10的方法制备的经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群。

14.一种使富含来源于羊水肾脏祖细胞的细胞群增殖的方法，包括：

a.从羊水样品中选择至少一个CD24和OB-钙粘蛋白阳性细胞；

b.将所述至少一个细胞引入培养基中；和

c.使所述至少一个经选择的细胞在所述培养基中增殖。

15.实施方案14的方法，其中所述细胞还表达E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、PDGFR-α或足糖萼蛋白。

16.一种使经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群分化的方法，包括使所述细胞群与至少一种分化因子相接触。

17.一种储存经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群的方法，包括从人对象获得羊水样品；从所述样品中分离CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群；以及冷冻保存所述来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞。

18.实施方案16或17的方法，其中所述细胞还表达E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、PDGFR-α或足糖萼蛋白。

19.一种预防或治疗肾脏疾病或损伤的方法，包括向对象施用治疗所述疾病或损伤有效量的实施方案1或2的细胞或者由其分化的后代。

20.一种预防或治疗肾脏疾病或损伤的方法，包括向对象施用治疗所述疾病或损伤有效量的从羊水中分离和纯化的c-kit阳性细胞群或由其分化的后代。

21.实施方案19或20的方法，其中所述对象是哺乳动物。

22.实施方案21的方法，其中所述哺乳动物是人。

23.实施方案19或20的方法，其中所述细胞通过局部或全身注射施用。

24.实施方案19或20的方法，其中所述疾病包括糖尿病性肾病、膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化症、膜增生性肾小球肾炎、弥漫增生性肾小球肾炎、膜性局灶节段性肾小球硬化症、轻度肾小球病变、系膜增殖性肾小球肾炎、管内增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、高密度沉积性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、缺血性肾病、基于***性疾病的肾小球疾病、基于血管疾病的肾小球疾病、基于代谢性疾病的肾小球疾病、遗传性肾脏病变或移植肾小球病变。

25.实施方案24的方法，其中所述遗传性肾脏病变导致奥尔波特综合征。

26.实施方案19或20的方法，其中所述损伤是物理创伤的结果。

27.由实施方案1或2的方法生产的经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群，其用于医学治疗。

28.实施方案27的用途，其中所述医学治疗是治疗由于损伤或疾病所致的肾脏伤害。

29.由实施方案1或2的方法生产的经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群在制备用于治疗由于损伤或疾病导致肾脏损伤的药物中的用途。

30.从羊水中分离和纯化的c-kit阳性细胞群或由其分化的后代在制备用于治疗由于损伤或疾病所致肾脏伤害的药物中的用途。

31.实施方案29或30的用途，其中所述药物包含生理学上可接受的载体和/或细胞培养基。

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Claims

1.经分离和纯化的、来源于羊水的CD24、OB-钙粘蛋白阳性并且对肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白之一呈现阳性的肾脏祖细胞群。

2.来源于羊水的CD24、OB-钙粘蛋白阳性并且对肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白呈现阳性的肾脏祖细胞的克隆群。

3.权利要求1或2的细胞群，其中所述细胞能够在体内或离体被诱导分化。

4.一种组合物，其包含权利要求1或2的来源于羊水的肾脏祖细胞群以及可药用载体和/或培养基。

5.一种制备组合物的方法，包括将权利要求1或2中任一项的细胞或者由其分化的后代细胞与载体混合。

6.权利要求5的方法，其中所述载体是细胞培养基。

7.一种产生来源于羊水之肾脏祖细胞群的方法，包括从羊水样品中选择CD24、OB-钙粘蛋白阳性并且对肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白之一呈现阳性的细胞。

8.权利要求7的方法，其中所述选择利用抗CD24抗体、抗OB-钙粘蛋白抗体以及抗肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白之一的抗体进行。

9.权利要求7或8的方法，其中所述选择通过荧光活化细胞分选或高梯度磁性选择进行。

10.由权利要求7或8的方法制备的经分离和纯化的、来源于羊水的CD24、OB-钙粘蛋白阳性并且对肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白之一呈现阳性的肾脏祖细胞群。

11.一种使富含来源于羊水之肾脏祖细胞的细胞群增殖的方法，包括：

a.从羊水样品中选择至少一个CD24、OB-钙粘蛋白阳性并且对肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白之一呈现阳性的细胞；

b.将所述至少一个细胞引入培养基中；和

c.使所述至少一个经选择的细胞在所述培养基中增殖。

12.一种使经分离和纯化的、来源于羊水的CD24、OB-钙粘蛋白阳性并且对肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白之一呈现阳性的肾脏祖细胞群分化的方法，包括使所述细胞群与至少一种分化因子相接触。

13.一种储存经分离和纯化的、来源于羊水的CD24、OB-钙粘蛋白阳性并且对肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白之一呈现阳性的肾脏祖细胞群的方法，包括从人对象获得羊水样品；从所述样品中分离CD24、OB-钙粘蛋白阳性并且对肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白之一呈现阳性的肾脏祖细胞群；以及冷冻保存所述来源于羊水的CD24、OB-钙粘蛋白阳性并且对肾病蛋白⁺、TrKA⁺、PDGFR-α⁺或足糖萼蛋白之一呈现阳性的肾脏祖细胞。

14.权利要求1或2的细胞或者由其分化的后代在制备用于预防或治疗肾脏疾病或损伤的药物中的用途，其中所述疾病或损伤选自局灶节段性肾小球硬化症、膜增生性肾小球肾炎、弥漫增生性肾小球肾炎、膜性局灶节段性肾小球硬化症、轻度肾小球病变、系膜增殖性肾小球肾炎、管内增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、高密度沉积性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、缺血性肾病、基于***性疾病的肾小球疾病、基于血管疾病的肾小球疾病、基于代谢性疾病的肾小球疾病和移植肾小球病变。

15.权利要求14的用途，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

16.权利要求15的用途，其中所述哺乳动物细胞是人。

17.权利要求14的用途，其中所述细胞通过局部或全身注射施用。

18.权利要求1或2的细胞或者由其分化的后代在制备用于预防或治疗肾脏疾病或损伤的药物中的用途，其中所述疾病或损伤是奥尔波特综合征。

19.由权利要求7或8的方法产生的经分离和纯化的、来源于羊水的肾脏祖细胞群在制备用于医学治疗的药物中的用途，其中所述治疗选自治疗局灶节段性肾小球硬化症、膜增生性肾小球肾炎、弥漫增生性肾小球肾炎、膜性局灶节段性肾小球硬化症、轻度肾小球病变、系膜增殖性肾小球肾炎、管内增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、高密度沉积性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、缺血性肾病、基于***性疾病的肾小球疾病、基于血管疾病的肾小球疾病、基于代谢性疾病的肾小球疾病和移植肾小球病变。

20.权利要求19的用途，其中所述医学治疗是治疗由于损伤或疾病所致的肾脏伤害。

21.由权利要求7或8的方法产生的经分离和纯化的、来源于羊水的肾脏祖细胞群在制备用于治疗由于疾病导致之肾脏损伤的药物中的用途，其中所述疾病选自局灶节段性肾小球硬化症、膜增生性肾小球肾炎、弥漫增生性肾小球肾炎、膜性局灶节段性肾小球硬化症、轻度肾小球病变、系膜增殖性肾小球肾炎、管内增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、高密度沉积性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、缺血性肾病、基于***性疾病的肾小球疾病、基于血管疾病的肾小球疾病、基于代谢性疾病的肾小球疾病和移植肾小球病变。

22.权利要求14、19或21的用途，其中所述药物包含生理学上可接受的载体和/或细胞培养基。