CN104450610B - 一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其包括以下步骤：(1)待原代培养分离后的人羊膜间充质干细胞融合度达到80～90％后，吸去培养皿中的培养液，加入PBS清洗，然后吸去PBS；(2)往培养皿中加入tryplE,转移至CO₂培养箱孵育1‑2min后，加入完全培养基，反复吹打，至80‑90％的细胞不再贴壁；(3)离心；(4)弃去上清液，用完全培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，得到的细胞悬液用细胞计数仪计数；(5)细胞悬液接种培养皿中，调整细胞密度为1.3×10⁴/cm²,然后加入含有10ng/ml EGF的完全培养基，将培养基转至CO₂细胞培养箱中进行培养。本发明能获得大量的活力高的干细胞。

Description

一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法

技术领域

本发明干细胞技术领域，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，在适宜的体内或体外环境下，可以诱导分化成多种不同的细胞，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞、肝细胞、肌细胞、神经细胞等。间充质干细胞首先在骨髓中发现，随后分别在脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在脐带、脐带血、胎盘组织中分离和制备间充质干细胞。间充质干细胞不仅能作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，还支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫，治疗多种疾病。

目前用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞，其不足之处在于受到年龄老化的限制，细胞增殖、分化能力降低，其次骨髓间充质干细胞在异体移植时引起免疫反应，影响间充质干细胞的研究与应用。最新研究显示，从胎盘组织中可以分离、培养得到间充质干细胞，通过鉴定其生物特征，可知其具有很强的增殖分化能力，免疫原性低。

现有培养羊膜间充质干细胞采用酶方法，具体方法是：观察培养细胞贴壁生长至80～90％汇合时，吸弃培养皿原有培养基，吸取PBS缓冲液加入培养皿洗涤，弃去洗液；加入(0.5～0.125％)胰酶-0.01％EDTA消化液，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察；加入FBS(或含FBS的DMEM/F12完全培养基)终止胰酶消化；反复吹打冲洗，在室温下1000rpm左右离心5～10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1∶(3～5)接种比例传代培养；置37℃，5％CO2，95％湿度的细胞培养箱中培养；待细胞生长至80-90％汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增。

上述胎盘羊膜间充质干细胞的分离与传代大规模培养中，在细胞传代过程中使用胰酶进行细胞消化，传代过程中使用0.5％～0.125％胰酶消化细胞，通常不能准确根据细胞生长活力状态来选择胰酶浓度及作用时间(1min-5min)，常会超过一定程度而导致细胞传代后不能贴壁或者死亡，对细胞损伤过大，细胞增殖力下降。当细胞连续传代多次，则会出现细胞老化死亡现象。而接种密度按照1：(3～5)来接种细胞，在大规模培养及传代中，这会增加工作量，无法一次收集大量均一的细胞。另外，羊膜干细胞的应用代数限制在6代以内，大大的限制了羊膜干细胞的应用。

因此急需建立一套有效的胎盘羊膜间充质干细胞大规模培养技术，满足间充质干细胞在科学研究与应用上的需要。该技术属于方法类技术。

发明内容

本发明的目前在于建立一套有效的胎盘羊膜间充质干细胞大规模培养技术，提供了一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法，该方法采用非酶消化(TrypLE)技术，克服了酶解对细胞的损伤，同时寻找最适合的传代接种密度，设计适合的培养基，进而将羊膜间充质干细胞的传代次数提高至15代以上仍然能保持原来的干性，从而满足间充质干细胞在科学研究与应用上的需求。

本发明的技术方案如下：

一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)原料清洗：待原代培养分离后的人羊膜间充质干细胞融合度达到80～90％后，吸去培养皿中的培养液，加入PBS清洗，然后吸去培养皿中的PBS；

(2)消化：往培养皿中加入tryplE,转移至CO₂培养箱孵育1-2min后，加入完全培养基，用巴氏吸管反复吹打，至待80-90％的细胞不再贴壁，终止消化；

(3)离心：将步骤(2)得到细胞悬液离心管中，1000rpm/min离心5min；

(4)计数：离心结束后，弃去上清液，用完全培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，得到的细胞悬液用细胞计数仪计数；

(5)铺板及培养：将步骤(4)的细胞悬液接种培养皿中，调整细胞密度为1.3×10⁴/cm²,然后加入含有10ng/ml EGF的完全培养基，将培养基转至CO₂细胞培养箱中进行培养。

优选地，步骤(1)PBS液是沿培养皿壁加入，不直接冲洗培养皿底部。

优选地，步骤(1)PBS液加入培养皿后要前后左右晃动。

优选地，步骤(2)中tryplE的最低用量以刚好覆盖培养皿底部为准。

优选地，步骤(2)直径为10cm的培养皿加入的2～3ml的tryplE。

优选地，所述完全培养基为含10％牛血清的DMEM/F12培养基。

优选地，步骤(2)直径为10cm的培养皿加入3～5ml完全培养基。

优选地，步骤(4)的细胞悬液先与台盼蓝按照1:1的比例混合染色后，在一小时内计数。

优选地，步骤(5)加入含有EGF的完全培养基后，要前后左右晃动培养皿混匀。

优选地，步骤(5)使用直接为15cm的培养皿，培养基的用量为10～15ml。使用规格大的培养皿可大规模扩增细胞，满足应用需要。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明在羊膜间充质干细胞传代培养过程中，细胞传代培养中，发明了非酶消化技术(TrypLE消化)收集贴壁的脂肪间充质干细胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度减少细胞消化过程中对细胞的损伤，寻找到1.3×10⁴/cm²最佳接种密度培养细胞，使用含10％的DMEM/F12培养基，并在培养基中加入合适浓度的EGF(10ng/ml),在φ15cm的培养皿中进行大规模的培养,能够获得大量的干细胞，且干细胞的活力高，15代培养后仍然保持完整的干性不出现衰老现象。

2、本发明采用非酶法收集贴壁的羊膜间充质干细胞，且用量低，大大减小了细胞的损伤，获得的细胞形态良好，呈现梭形，簇团性生长趋势，而且经细胞计数仪鉴定，细胞活力达到90％以上，符合细胞传代及储存条件。

3、本发明探索出最适合大规模培养的条件，选择1.3×10⁴/cm²最佳接种密度培养细胞，并使用含10％的DMEM/F12培养基，一在培养基中加入合适浓度的EGF(10ng/ml),在φ15cm的培养皿中进行大规模的培养,培养的细胞增殖快，收获细胞数量大，2.5～3.5天即可长至80～90％。φ10cm细胞培养皿收获的细胞总数可达3～4×10⁶,φ15cm细胞培养皿收获细胞可达6～8×10⁶。羊膜干细胞能够长期进行传代，15代之后仍然保持完整的干性，不出现衰老迹象。

附图说明

图1为本发明的非酶法与现有酶法传代培养的细胞形态对比图；

其中，A为现有酶法第1代MSCs细胞(×100)；B为现有酶法第6代MSCs细胞(×100)；C为非酶法第1代MSCs细胞(×100)；D为非酶法第6代MSCs细胞(×100)，E为非酶法第15代细胞(×100)。

图2为本发明的非酶法与现有酶法传代培养的细胞增殖曲线对比图。

图3为本发明的非酶法获得的第1代细胞的表面标记物流式检测结果。

图4为本发明的非酶法获得的第6代细胞的表面标记物流式检测结果。

图5为本发明的非酶法获得的第15代细胞的表面标记物流式检测结果。

图6为本发明非酶法传代培养第P15代细胞成脂分化状态图。

图7为本发明非酶法传代培养的羊膜间充质干细胞成骨诱导后细胞形态变化(×100)图。

具体实施方式

下面通过具体实施例子对本发明的技术方案做进一步详细介绍，以便清楚本发明所要保护的技术方案及能够达到的技术效果。

在介绍具体实施例子之前，先对实施例涉及到的术语进行解释：

胰酶：0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA(是质量/体积百分数)

PBS:磷酸缓冲液

EGF:上皮生长因子

IBMX：3-异丁基-1-甲基化黄嘌呤

实施例1

一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法,具体方法如下：

(1)观察选材：取出人羊膜间充质干细胞分离培养皿，培养皿的规格为φ10cm，置于倒置相差显微镜下进行观察，拍照。当细胞汇合度至80-90％，即可进行细胞传代操作。

(2)清洗：用巴氏吸管吸去培养皿中培养液；用移液管向每个培养皿内加适量的PBS进行清洗2次后，用移液管吸去培养皿中的PBS。所述巴氏吸管量程为3ml,移液管量程为10ml。每次清洗PBS的用量为10ml，PBS沿着培养皿壁加入，不得直接冲洗培养皿底部，加入PBS清洗的培养皿要前后、左右晃动,10次左右。

(3)消化：往培养皿加入tryplE，加入2～3ml的tryplE覆盖培养皿底部，转移培养皿至CO2培养箱孵育1-2min后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，随后加入完全培养基，轻轻吹打混匀，终止消化。所述培养基为人羊膜间充质干细胞培养基(DMEM/F12按照1：1混和，10％胎牛血清)，培养基的加入量为3ml～5ml。待80-90％细胞不再贴壁，可以进行终止消化。

(4)离心：将步骤3得到细胞悬液10ml移液管转移至15ml离心管中，1000rpm/min离心5min。

(5)计数：离心结束后，弃去上清液，细胞沉淀先用0.4％台盼蓝按照1：1混合染色，再用5ml完全培养基重悬细胞沉淀。在1h内吹打混匀，取20μl细胞悬液用细胞计数仪计数，测定细胞总数与细胞活力。所述细胞计数仪采用为Countstar自动细胞计数仪。

(6)铺板及培养：将细胞悬液接种到细胞培养皿中，调整细胞密度为1.3×104/cm²,加入10ml完全培养基(φ10cm培养皿)或者15ml完全培养基(φ15cm培养皿)，加入EGF至终浓度10ng/ml，前后、左右晃动培养皿混匀5-10次。转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中进行培养。

(7)观察：传代后每隔24h在光学显微镜下观察细胞形态及生长汇合度，根据细胞生长状态，进行下一步的细胞传代或冻存以及其他用途。

实施例2

将羊膜间充质干细胞进行分离后，获得P0代细胞，按照本发明无酶法进行传代，与传统酶解消化细胞的方法作为对照。连续传代，在光学显微镜下观察第1代、第6代、第15代细胞生长形态。镜下观察结果见附图2。

结果显示：培养过程中，发现通过无酶法，细胞形态相对均一，增殖速度快，贴壁速度快，传代至15代以上，其形态及生长特点亦无明显改变。而传统酶解消化细胞传代方法，在第6代后细胞形态发生改变，增殖速率降低。并且无法传代至15代。

实施例3

本发明的非酶法与现有酶法传代培养的细胞增殖速度的比较。

分别取通过非酶法传代的第3代羊膜间充质干细胞，及用现有酶法得到的第3代羊膜间充质干细胞，按照2×10⁴细胞/孔接种于24孔板中，分别每隔48h消化收集3孔细胞，用0.4％的台盼蓝染色计数活细胞数量，算出平均值，绘制两者细胞生长曲线，结果见附图2。

结果显示：非酶法得到的细胞倍增时间为明显优于酶法传代的细胞。

实施例4

本发明的非酶法传代培养的细胞表面标记物检测(P1、P2、P3)

(1)分别取第1、6、15代细胞，用流式细胞仪检测不同代数之间的细胞表面标志。分别消化收集细胞，计数后每个批次取4×106个细胞，分装4管；染色缓冲液洗1次，200g离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD45、CD59、CD90及HLA-DRA抗体各10μl，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1500rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500ul的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。

流式细胞仪检测细胞的表面标志，观察到第1、6、15代的细胞的表面标记物没有明显改变。造血细胞表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)为均呈现阴性，同时CD59、CD90均呈现阳性。第三代以后的羊膜间充质干细胞，细胞形态均一，纯度在90％以上。

实施例5

本发明非酶法传代培养第P15代细胞成脂分化实验

细胞培养至第14代时，按照5×10³细胞/cm₂接种于六孔板中，加入完全培养基，放置37℃、5％CO₂培养箱培养。待细胞生长汇合度至80-90％左右，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1uM***、100uM吲哚美辛、5ug/ml胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等，每三天换液。三周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况。结果见图6。

结果显示：培养三周后，镜下观察羊膜间充质干细胞经过油红O染色后，约90％的细胞富含脂肪滴，说明间充质干细胞依然可以具有诱导分化为脂肪细胞的能力。

实施例6

本发明非酶法传代培养第P15代细胞成骨试验

细胞培养至第14代进行传代时，按照5×10³细胞/cm₂接种于明胶涂层的六孔板中，加入完全培养基，放置37℃、5％CO₂培养箱培养。待细胞生长汇合度至90％左右，加入成骨诱导培养基进行培养。成骨诱导培养基包括：基础培养基DMEM/F12、10％胎牛血清、50μM抗坏血酸、10mMβ-磷酸甘油、0.1uM***。每2-3天换液，细胞在2-3周后进行固定及茜素红染色。结果见附图7。

结果显示：成骨诱导培养的第15代间充质干细胞形态由梭形变成立方形，3周后出现钙化结节(图7-C)。染色比较明显，细胞已向成骨细胞转化。说明干细胞可以在体外诱导分化为成骨细胞。

结论：通过以上实施例可以得知，在人羊膜间充质干细胞的传代培养技术中，使用传统Trypsin胰酶存在以下缺点：

1、细胞损伤大－Trypsin抑制剂需要将酶快速灭活，这会导致细胞损失或死亡。

2、冷冻保存－Trypsin必须保存在－20℃，在经过多次反复冻融或在4℃长期保存后，稳定性丧失。

3、批间差异大－Trypsin为动物源性，批次之间差异性大。

相比之下，TrypLE在人羊膜间充质干细胞的传代培养技术中在以下优点：

1、细胞损失小－TrypLE为非动物源性的消化酶，更纯，对细胞损失更小。由于TrypLE作用细胞温和，不需要Trypsin酶抑制剂。

室温保存稳定性高－TrypLE可以稳定的保存于室温，节省了冷冻空间，同时提供即时可用的便利。

应用范围广－TrypLE是在有血清或无血清环境中培养的多种不同细胞系的理想选择，可以直接替代现有步骤中所用的0.25％trypsin EDTA试剂。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (8)

1.一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)原料清洗：待原代培养分离后的人羊膜间充质干细胞融合度达到80～90％后，吸去培养皿中的培养液，加入PBS清洗，然后吸去培养皿中的PBS；

(2)消化：往培养皿中加入tryplE,转移至CO₂培养箱孵育1-2min后，加入完全培养基，用巴氏吸管反复吹打，至80-90％的细胞不再贴壁，终止消化；

(3)离心：将步骤(2)得到细胞悬液离心管中，1000rpm/min离心5min；

(4)计数：离心结束后，弃去上清液，用完全培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，得到的细胞悬液用细胞计数仪计数；

(5)铺板及培养：将步骤(4)的细胞悬液接种培养皿中，调整细胞密度为1.3×10⁴/cm²,然后加入含有10ng/ml EGF的完全培养基，将培养基转至CO₂细胞培养箱中进行培养,

其中,所述步骤(2)中tryplE的用量为10cm的培养皿加入的2～3ml的tryplE。

2.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其特征在于：步骤(1)PBS液是沿培养皿壁加入，不直接冲洗培养皿底部。

3.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其特征在于：步骤(1)PBS液加入培养皿后要前后左右晃动。

4.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其特征在于：所述完全培养基为含10％牛血清的DMEM/F12培养基。

5.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其特征在于：步骤(2)直径为10cm的培养皿加入3～5ml完全培养基。

6.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其特征在于：步骤(4)的细胞悬液先与台盼蓝按照1:1的比例混合染色后，在一小时内计数。

7.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其特征在于：步骤(5)加入含有EGF的完全培养基后，要前后左右晃动培养皿混匀。

8.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞传代培养方法，其特征在于：步骤(5)使用直接为15cm的培养皿，培养基的用量为10～15ml。