CN108486039A - 小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法 - Google Patents

小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种完全利用小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞(LCs)的方法。该方法步骤如下，首先分离提取人脂肪干细胞并完成鉴定；然后采用特定培养基诱导人脂肪干细胞分化，同时在不同时间点向培养基中外加一定量小分子包括：SAG、22OHC、Li、PDGF‑AA、FGF2、Androgen、LH促进分化；最后采用手工剔除非***细胞(ALCs)样细胞富集分化靶细胞(ADSC‑ALCs)，并完成鉴定。按照本发明方法诱导，可以成功将人脂肪干细胞分化为***细胞，从而为采用细胞移植治疗睾酮缺乏症提供细胞来源。

Description

小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法
技术领域
本发明属于生物科技技术领域，尤其是一种完全利用小分子诱导人源脂肪干细胞分化为***细胞的方法。
背景技术
男性生殖健康离不开生殖***的功能健全。目前，雄激素缺乏症的治疗方法仅停留在雄激素替代治疗。然而，长期的雄激素治疗会引起肝肾功能损伤、免疫力降低、水钠潴留等并发症，而且不受自身昼夜节律的调控。目前，医学研究一大热点是细胞替代疗法。虽然***细胞(Leydig cell,LCs)移植可以避免外源性雄激素替代治疗带来的某些并发症，但是***细胞(Leydig cell,LCs)来源不足和异体移植可能导致宿主免疫排斥反应限制了***细胞(Leydig cell,LCs)在临床上的应用。目前，诱导干细胞(全能干细胞和成体干细胞)分化为***细胞，作为供体移植有望成为解决问题的突破口。
近年来，生物学家对脂肪间质干细胞的研究有了较大的突破和发展。如中国专利授权公告号为：CN104357387B所公开的《一种从脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法》所公开的“2001年，细胞生物学家通过脂肪抽吸术，在吸出的人体脂肪悬液中第一次分离得到了多向分化的干细胞，并发现它能分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、胰、神经等细胞；这种从人脂肪组织中发现的具有分化潜能的成体干细胞，被称为人脂肪干细胞”。如中国专利公开号为：CN104611290A的文件《诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞的方法》、中国专利公开号： CN104805051A的文件《诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞的方法》、中国专利公开号：CN106350483A的文件《诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的培养方法》、如中国专利公开号：CN 103805566B的文件《人脂肪干细胞经三维培养后分化成神经样干细胞的方法》等内容可知，脂肪干细胞(ADSCs)本身具有多向分化潜能，在一定的条件下，能够被诱导分化为多种细胞，包括成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，神经细胞和肝细胞等。而且脂肪干细胞(ADSCs)不受时间限制，可以从任意年龄段患者自体抽脂分离获取，避免了免疫排斥，取材也相对容易且不会形成肿瘤。脂肪干细胞(ADSCs)经过多年研究，已经可以被诱导分化为多种细胞，但通过小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的技术却未见公开；因此，本专利将立足采用人源脂肪干细胞(hADSCs)，采用小分子而非基因导入方法诱导脂肪干细胞(ADSCs)分化为功能的成熟***细胞LCs(ALCs)，为将来患者采用自体脂肪干细胞(ADSCs)分化的***细胞(ALC)移植治疗雄性激素缺乏症提供科学依据。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，该方法突破了现有技术中诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的技术空白；且诱导完全采用小分子，不依赖外源基因的导入，提高了未来用于临床应用的安全性。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：①将获得的人源脂肪组织通过I型胶原酶分离出脂肪干细胞，该I型胶原酶按照质量体积比0.1％加入到 DMEM低糖(DMEM-LG)培养基中，然后用含质量体积比为0.25％EDTA的胰酶消化获取传代培养的脂肪干细胞；②对获取的传代培养的脂肪干细胞进行流式细胞分析鉴定；③采用成脂诱导培养基诱导脂肪干细胞完成成脂分化鉴定；④采用成骨诱导培养基诱导脂肪干细胞完成成骨分化鉴定；⑤待脂肪干细胞完成步骤②-③的鉴定处理后，对脂肪干细胞进行免疫荧光处理：于室温进行膜通透化处理后直接加入一抗4℃孵育过夜，然后加入二抗室温孵育，接着染色室温孵育；⑥将脂肪干细胞接种培养5天后，进行分化培养，在分化培养过程中加入小分子促进脂肪干细胞分化成***细胞，小分子成分包括SAG、22OHC、Li、PDGF-AA、 FGF2、Androgen、LH，然后手工剔除非***细胞(ALCs)样细胞，并富集分化得到的靶细胞(ADSC-ALCs)，并完成对靶细胞的免疫荧光鉴定和逆转录 PCR检测鉴定分析。
进一步的，所述步骤⑥中对脂肪干细胞进行分化培养的过程中，将接种培养基换成分化培养基时，此时间点定义为分化第0天，然后在分化第0至7天，每隔2 天向分化培养基中外加0.5μM SAG、2μM 22OHC、10mM Li促进分化，在分化第7至14天，每隔2天向分化培养基中外加促增殖因子10ng/mL PDGF-AA和10 ng/mL FGF2，以及加入促分化因子20μMAndrogen，在分化第14至18天，每隔 2天向分化培养基中外加促成熟因子50ng/mL LH和0.5μM SAG；脂肪干细胞在分化培养基ADSC-DIM中共诱导18天，每2天换1次分化培养基。
再进一步的，在诱导分化18天后，采用自制玻璃细胞刮在显微镜下手动剔除非***样细胞，剩余贴壁细胞采用质量体积比为0.25％EDTA消化后1000转/ 分钟离心5分钟富集，采用富集培养基Enrichment Medium重悬后转移至预先用体积百分比1％MatrigelCoating处理即37℃孵育1小时以上的6孔板中富集培养7 天，即第25天，所述富集培养基Enrichment Medium包括DMEM-F12、体积百分比1％FBS、Sodiumpyruvate、Glutamax。
进一步的，所述步骤⑥中分化培养时采用的分化培养基包括DMEM-F12、 ITS、10ng/mL LH、0.2μM SAG、2μM 22OHC和5mM Li。
再进一步的，所述步骤③中的成脂诱导培养基包括含100U/mL P/S和体积百分比10％FBS的DMEM/LG、10μM的胰岛素、0.5mM的异丁基甲基黄嘌呤、 1μM的***、200μM的吲哚美辛。
进一步的，所述步骤③中的成脂诱导培养基包括含100U/mL P/S和10％FBS 的DMEM/LG、10μM的胰岛素、0.5mM的异丁基甲基黄嘌呤、1μM的***、200μM的吲哚美辛。
进一步的，所述步骤④中成骨诱导培养基包括含100U/mL双抗(P/S)和体积百分比10％胎牛血清(FBS)的DMEM/LG、50μM抗坏血酸磷酸盐、1μM***、100μM甘油磷酸盐。进一步的，所述步骤⑤中一抗包括兔单克隆 CYP11A1抗体、兔多克隆CYP17A1抗体、兔多克隆HSD3B1抗体、鼠单克隆 CD29抗体，兔单克隆CYP11A1抗体与稀释液按体积比1:350稀释，兔多克隆 CYP17A1抗体与稀释液按体积比1:100稀释，兔多克隆HSD3B1抗体与稀释液按体积比1:500稀释，鼠单克隆CD29抗体与稀释液按体积比1:500稀释；二抗包括 Cy3标记羊抗兔IgG抗体、Cy3标记羊抗鼠IgG抗体、FITC标记羊抗兔IgG抗体，Cy3标记羊抗兔IgG抗体与稀释液按体积比1:500稀释，Cy3标记羊抗鼠IgG 抗体与稀释液按体积比1:500稀释，FITC标记羊抗兔IgG抗体与稀释液按体积比 1:500稀释。
采用上述方案，本发明的反应机理如下：1)分离获取高纯度人源脂肪干细胞；2)按照本专利公开配比方案进行最佳诱导分化。本发明采用小分子诱导分化的有益效果如下：1)选用脂肪间充质干细胞作为诱导种子细胞，较其他干细胞来源广泛大量，且可以从自体组织中获取，规避了免疫排斥反应；2)分化过程未引入外源基因，完全采用小分子诱导，提高了未来临床应用的安全性；3)小分子诱导过程灵活可控，避免了过度诱导，提高了诱导效率；4)诱导方法可操作性强，重复性好，可稳定诱导出大量能分泌睾酮的***细胞，从而更适用于未来临床应用。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
附图1为分离和培养的脂肪干细胞(ADSCs)；其中，(A)为原代培养的 ADSCs(P0)；(B)为一代培养的ADSCs(P1)；(C)为二代培养的ADSCs (P2)；(D)为三代培养的ADSCs(P3)；
附图2为脂肪干细胞(ADSCs)的流式鉴定；其中，(A)为流式分析脂肪干细胞(ADSCs)表面抗原的表达情况；(B)为柱状图统计流式分析数据图；
附图3为脂肪干细胞(ADSCs)的成脂成骨诱导鉴定；其中，(A)为未经过成脂诱导培养基处理的脂肪干细胞(ADSCs)阴性对照组；(B)为油红O染色经过成脂诱导培养基分化处理的ADSCs成阳性(黑色箭头)；(C)为未经过成骨诱导培养基处理的ADSCs阴性对照组；(D)为碱性磷酸酶染色经过成骨诱导培养基分化处理的ADSCs成阳性(黑色箭头)；
附图4为脂肪干细胞(ADSCs)在分化培养基(ADSC-DIM)中被诱导分化为***细胞(ALCs)；其中，(A)为诱导分化示意图；(B)为不同时间点诱导分化靶向细胞明场形态；(C)为放射免疫法测定在LH刺激3小时后ADSCs(阴性对照)，ADSC-ALCs(分化组)和ALCs(阳性对照)培养基上清中睾酮水平；
附图5为免疫荧光鉴定诱导分化的靶细胞(ADSC-ALCs)；其中，免疫荧光检测ADSCs(阴性对照)，LCs(阳性对照)和ADSC-ALCs(实验组)标记蛋白 CYP11A1，CYP17A1，HSD17B3和CD29表达。
具体实施方式
本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。
本发明的具体实施例如图1-4所示是小分子诱导脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其包括如下步骤，
①获得人脂肪干细胞：严格按照无菌操作要求，在超净工作台里将来自六位女性腹部抽提得到的脂肪(或者从现有脂肪库中提取)依次转入50mL离心管中，静止10分钟待组织液与脂肪分层后，使用巴氏管将处于离心管底层的组织液去除。然后脂肪组织按照体积比1:1的比例加入用DMEM低糖(DMEM-LG)稀释为质量体积比0.1％的I型胶原酶，在恒温37℃，100转/分钟摇床孵育45分钟。离心力300g离心15分钟分层后，小心去除掉上层消化液，为进一步去除混合在脂肪细胞中的大量血细胞，加入10mL体积百分比为0.3％的生理盐水，在恒温 37℃，100转/分钟摇床孵育15分钟，重复2-3次直至离心后看不见红色沉淀物为止。然后加入5mL PBS缓冲液，重悬细胞后用100目钢网过滤，取滤液300g离心5分钟，细胞由于离心力沉积于离心管底部，接着加入提前配置的ADSC培养液即ADSC Medium重悬细胞，该ADSC培养液包括DMEM-LG、体积百分比 10％胎牛血清(FBS)、体积百分比1％双抗(P/S)，经细胞计数后，以5×104个 /mL密度接种于培养瓶中。将培养瓶转移至恒温为37℃，体积百分比5％CO2的培养箱中进行培养，3天后细胞换液，进一步去除不能贴壁的杂质、死细胞以及血细胞。之后每间隔3天更换培养基1次，待细胞增殖融合至80％～90％时，使用含质量体积比0.25％EDTA胰酶消化后进行传代培养，获得脂肪干细胞。
实验结果显示，ADSCs可以顺利的通过I型胶原酶消化法从抽脂的脂肪组织中提取出来。一般来说，在培养后的第5天，通过每隔2天连续换液去除悬浮的血细胞，大部分贴壁生长的原代ADSCs(P0)能呈现出良好的长梭型细胞形态(图1A)。细胞继续培养，很快能增殖达到80-90％融合状态。采用质量体积比0.25％ EDTA胰蛋白酶消化获取传代培养的第一代ADSCs(P1)(图1B)，第二代 ADSCs(P2)(图1C)和第三代ADSCs(P3)(图1D)。
②流式细胞分析脂肪干细胞(ADSCs)：将脂肪干细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔培养板上，待细胞长满后。用含质量体积比0.25％EDTA胰蛋白酶消化细胞，1500转/分钟离心5分钟收集ADSCs。PBS清洗1次，然后加入500μL体积百分比4％多聚甲醛4℃固定过夜，弃固定液，2mL毫升PBS震荡重悬，离心弃上清。用2mL体积百分比5％的FBS-PBS室温封闭10分钟，离心弃上清，同时设置同型对照组。按体积比1：50加入荧光抗体FITC-CD29，FITC-CD44， FITC-CD59，PE-CD105，PE-CD34，PE-CD45和PE-HLA-DR工作液100微升(5 μL抗体每100μL细胞体积)，室温避光孵育20分钟，离心去上清，加入500μL PBS清洗3次，最后用200μLPBS重悬，过滤并上机检测。
结果显示，P1代ADSCs流式表面抗原检测结果显示，分离的ADSCs能阳性的表达CD44，CD59和CD29，低水平表达CD105和CD34，阴性表达CD45和 HLA-DR(图2A)，并对数据进行定量分析后作图(图2B)。
③脂肪干细胞成脂分化：将脂肪干细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔培养板上，待细胞贴壁后，加入成脂诱导培养基进行诱导2周，成脂诱导培养基主要成分包括：100U/mL双抗(P/S)、体积百分比10％胎牛血清(FBS)的 DMEM/LG、10μM胰岛素、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、1μM***和200 μM吲哚美辛。然后用PBS洗涤脂肪干细胞3遍，加入10％的甲醛室温固定30分钟。接着再用PBS洗涤脂肪干细胞3遍，加入2％的油红O溶液室温染色10分钟。最后用体积百分比70％的乙醇洗涤染色液并倒置显微镜下观察拍照。
结果显示，经过2周的成脂诱导，诱导后形成的脂肪颗粒能被油红O染成红色(图3B)，说明ADSCs被成功诱导分化为脂肪细胞。
④脂肪干细胞成骨分化：将脂肪干细胞以1×106个/孔的密度接种到6孔培养板上，待细胞贴壁后，加入成骨诱导培养基进行诱导2周，成骨诱导培养基主要成分包括：含100U/mL双抗(P/S)和体积百分比10％胎牛血清(FBS)的 DMEM/LG、50μM抗坏血酸磷酸盐、1μM***、100μM甘油磷酸盐。然后用PBS洗涤脂肪干细胞3遍，加入体积百分比4％的多聚甲醛室温固定10分钟。接着脂肪干细胞再用PBS洗3遍，加入碱性磷酸酶溶液37℃染色15分钟。最后用去离子水洗涤染色液并倒置显微镜下观察拍照。
结果显示，经过2周的成骨诱导，诱导后细胞分泌产生钙化的富含胶原的 ECM，通过碱性磷酸酶染色成阳性显蓝色(图3C)，说明ADSCs被成功诱导分化为骨细胞。
上述成脂成骨诱导分化的这些数据说明，成上述过程已经成功地从脂肪组织中提取出ADSCs。
⑤小分子诱导脂肪干细胞(ADSCs)分化为***细胞(ADSC-ALC) 将脂肪干细胞以1×105个/孔的密度接种到12孔培养板上，待培养5天细胞长满。培养基采用分化培养基ADSC-DIM：DMEM-F12，ITS，10ng/mL LH，0.2M SAG，2M 22OHC和5mM Li，此时间点定义为分化第0天。然后在分化第0至7 天，每隔2天向分化培养基中外加0.5M SAG，2M 22OHC，10mMLi促进分化。在分化第7至14天，每隔2天向分化培养基中外加促增殖因子10ng/mL PDGF-AA和10ng/mL FGF2，以及促分化因子20M Androgen。在分化第14至18 天，每隔2天向分化培养基中外加促成熟因子50ng/mL LH和0.5M SAG。 ADSCs在分化培养基ADSC-DIM中共诱导18天，每2天换1次分化培养基。诱导分化18天后，采用自制玻璃细胞刮在显微镜下手动剔除非ALC样细胞，剩余贴壁细胞采用质量体积比0.25％EDTA消化后1000转/分钟离心5分钟富集，采用富集培养基(Enrichment Medium)：DMEM-F12、质量体积比1％FBS、 Sodiumpyruvate、Glutamax重悬后转移至预先体积百分比1％Matrigel Coating处理 (37℃孵育1小时以上)的6孔板中富集培养7天，即第25天。然后分化得到的靶细胞进行后续鉴定分析。
上述采用特定的分化培养基ADSC-DIM：DMEM-F12，ITS，10ng/mL LH， 0.2μM SAG，2μM 22OHC和5mM Li，诱导ADSCs向ALCs分化。同时在不同时间点向分化培养基中外加一定量小分子包括：SAG,22OHC,Li,PDGF-AA,FGF2, Androgen,LH促进细胞增殖和分化，最后采用手工剔除非ALCs样细胞富集分化的靶细胞(ADSC-ALCs)，具体分化流程见图4A。当ADSCs培养基ADSC Medium 更换为分化培养基ADSC-DIM时定义为分化第0天，此时细胞呈致密梭形结构，生长状态良好。在诱导分化第7天，细胞形态发生显著变化，呈卵泡状，折光性强。诱导分化第14天，细胞形态呈圆形及椭圆形混合状态，折光性下降。在诱导分化第18天，细胞形态呈多种形态混合状态(图4B)。诱导分化后经过手工富集的ADSC-ALCs，在培养基中加入100ng/ml LH(最大刺激浓度)培养3小时，收集培养基，测量培养基上清睾酮，结果显示ADSC-ALCs可以分泌睾酮，且高于阴性对照ADSCs，但是低于阳性对照ALCs(图4C)。
⑥对分化靶细胞(ADSC-ALCs)进行免疫荧光鉴定：待脂肪干细胞处理好后，吸弃上清，PBS洗1遍，加入体积百分比4％多聚甲醛室温下孵育15分钟，然后PBS洗3遍，每遍5分钟，再加入含有质量体积比0.1％Triton-X 100和质量体积比3％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS，室温进行膜通透化处理1小时。然后不洗涤直接加入一抗：兔单克隆CYP11A1抗体(体积比1:350)，兔多克隆CYP17A1 抗体(体积比1:100)，兔多克隆HSD3B1抗体(体积比1:500)，和鼠单克隆CD29 抗体(体积比1:500)4℃孵育过夜。然后PBS洗3次，每次5分钟，接着加入二抗：Cy3标记羊抗兔IgG抗体(体积比1:500)，Cy3标记羊抗鼠IgG抗体(体积比 1:500)和FITC标记羊抗兔IgG抗体(体积比1:500)室温孵育2小时。之后PBS洗3 次，每次5分钟，接着加入DAPI染色液室温避光孵育15分钟。最后PBS洗3 次，每次5分钟，直接倒置荧光显微镜下观察拍照。
上述对分化靶细胞(ADSC-ALCs)进行免疫荧光鉴定，检测***细胞相关标志蛋白CYP11A1，CYP17A1，HSD17B3，以及脂肪干细胞表面特异性标记蛋白CD29的表达情况。结果显示阴性对照组脂肪干细胞ADSCs可阳性表达 CD29，但阴性表达CYP11A1，CYP17A1，HSD17B3。阳性对照组Leydig细胞 LCs可阳性表达CYP11A1，CYP17A1，HSD17B3，阴性表达CD29。实验组诱导分化靶细胞ADSC-ALCs部分细胞能阳性表达***细胞相关标记蛋白CYP11A1，CYP17A1，HSD17B3，阴性表达脂肪干细胞相关标记蛋白CD29(图 5)。
⑦逆转录PCR(RT-PCR)检测
利用Trizol(英潍捷基，美国)提取各组细胞总的RNA，并测定OD，保证提取各组的RNA OD 260/OD280值在1.8和2.1之间，以保证其纯度。然后总RNA利用逆转录试剂盒(东洋纺，日本)进行反转录成cDNA，反应体系和反应程序参照产品说明书。cDNA用来做RT-PCR，引物序列采用：
Cyp11a1-F:GCAGTGTCTCGGGACTTCG
Cyp11a1-R:GGCAAAGCGGAACAGGTCA
Hsd3b1-F:CACATGGCCCGCTCCATAC
Hsd3b1-R:GTGCCGCCGTTTTTCAGATTC
Cyp17a1-F:TATGGCCCCATCTATTCGGTT
Cyp17a1-R:GCGATACCCTTACGGTTGTTG
Hsd17b3-F:GTCAACAATGTCGGAATGCTTC
Hsd17b3-R:TGATGTTACAATGGATGAGGCTC
Sf-1-F:GGAGGCTTGCGAAGGAGAAG
Sf-1-R:AGCTTACCCAACGGCGTG
CD29-F:GGAGTCGCGGAACAGCA
CD29-R:AGCAAACACACAGCAAACTGAA
CD44-F:CTGCCGCTTTGCAGGTGTA
CD44-R:CATTGTGGGCAAGGTGCTATT
Gadph-F:ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
Gadph-R:GCCATCACGCCACAGTTTC
反应体系参考SYBR试剂盒(宝日，日本)说明书，瞬离后上机，95℃预变性3 分钟，反应35个循环(95℃,10秒；60℃,30秒)。反应后根据Ct值统计分析，绘制标准曲线，使用基于Ct(2-Ct)方法进行定量分析。
同时逆转录PCR(RT-PCR)检测结果显示，诱导分化靶细胞ADSC-ALCs 能阳性表达***细胞相关标记基因Cyp11a1，Hsd3b1，Cyp17a1，Hsd17b3和 Sf-1，阴性表达脂肪干细胞相关标基因CD29和CD44。
血清睾酮测定(放免法)
配制TBS-G溶液：1g gelatin，4.4g Trizma HCl，2.65g Trizma Base，5.84NaCl和1g Na Azide溶于1L双蒸水。在标记TC管(不用活性炭吸附，测完整放射值)中加500μLTBS-G。在标记NBS管(不加抗体，用于测量非特异性结合值) 中加500μL TBS-G。在标记样品管中加200μL TBS-G和100μL样品。在标记标准品管的管中加300μL不同浓度的标准品(10-2000pg/100μL，8个浓度)。除 TC管和NBS管外，每管加200μL睾酮抗体。每管加300μL Tracer(3H-睾酮- TBS-G溶液)，振荡，4℃过夜。除TC管外，每管加200μL活性碳/葡萄聚糖 (用于吸附与抗体结合的睾酮)并放置20分钟，振荡，1800g离心10分钟。将上清小心加入到含有5μL液闪液瓶中，其过程中注意不让活性碳进入液闪瓶，然后上下颠倒混匀。液闪测量。检测的内部效应和外部效应差异为15％。
综上，此部实验结果提示，在分化培养基ADSC-DIM基础上，外加SAG, 22OHC,Li,PDGF-AA,FGF2,Androgen,LH小分子能够成功诱导脂肪干细胞 (ADSCs)分化为***细胞(ALCs)。

Claims (10)

1.一种小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：①将获得的人源脂肪组织通过I型胶原酶分离出脂肪干细胞，该I型胶原酶按照质量体积比0.1％加入到DMEM低糖(DMEM-LG)培养基中，然后用含质量体积比为0.25％EDTA的胰酶消化获取传代培养的脂肪干细胞；②对获取的传代培养的脂肪干细胞进行流式细胞分析鉴定；③采用成脂诱导培养基诱导脂肪干细胞完成成脂分化鉴定；④采用成骨诱导培养基诱导脂肪干细胞完成成骨分化鉴定；⑤待脂肪干细胞完成步骤②-④的鉴定处理后，对脂肪干细胞进行免疫荧光处理：于室温进行膜通透化处理后直接加入一抗4℃孵育过夜，然后加入二抗室温孵育，接着染色室温孵育；⑥将脂肪干细胞接种培养5天后，进行分化培养，在分化培养过程中加入小分子促进脂肪干细胞分化成***细胞，小分子成分包括SAG、22OHC、Li、PDGF-AA、FGF2、Androgen、LH，然后手工剔除非***细胞(ALCs)样细胞，并富集分化得到的靶细胞(ADSC-ALCs)，并完成对靶细胞的免疫荧光鉴定和逆转录PCR检测鉴定分析。
2.根据权利要求1所述的小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于：所述步骤⑥中对脂肪干细胞进行分化培养的过程中，将接种培养基换成分化培养基时，此时间点定义为分化第0天，然后在分化第0至7天，每隔2天向分化培养基中外加0.5μM SAG、2μM 22OHC、10mM Li促进分化，在分化第7至14天，每隔2天向分化培养基中外加促增殖因子10ng/mL PDGF-AA和10ng/mL FGF2，以及加入促分化因子20μM Androgen，在分化第14至18天，每隔2天向分化培养基中外加促成熟因子50ng/mL LH和0.5μM SAG；脂肪干细胞在分化培养基ADSC-DIM中共诱导18天，每2天换1次分化培养基。
3.根据权利要求2所述的小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞，其特征在于：在诱导分化18天后，采用自制玻璃细胞刮在显微镜下手动剔除非***样细胞，剩余贴壁细胞采用质量体积比0.25％EDTA消化后1000转/分钟离心5分钟富集，采用富集培养基(Enrichment Medium)重悬后转移至预先用体积百分比1％Matrigel Coating处理即37℃孵育1小时以上的6孔板中富集培养7天，即第25天，所述富集培养基(Enrichment Medium)包括DMEM-F12、体积百分比1％胎牛血清(FBS)、Sodiumpyruvate、Glutamax。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于：所述步骤⑥中分化培养时采用的分化培养基包括DMEM-F12、ITS、10ng/mL LH、0.2μM SAG、2μM 22OHC和5mM Li。
5.根据权利要求4所述的小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于：所述步骤③中的成脂诱导培养基包括含100U/mL P/S和体积百分比10％FBS的DMEM/LG、10μM的胰岛素、0.5mM的异丁基甲基黄嘌呤、1μM的***、200μM的吲哚美辛。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于：所述步骤③中的成脂诱导培养基包括含100U/mL P/S和体积百分比10％FBS的DMEM/LG、10μM的胰岛素、0.5mM的异丁基甲基黄嘌呤、1μM的***、200μM的吲哚美辛。
7.根据权利要求5所述的小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于：所述步骤④中成骨诱导培养基包括含100U/mL双抗(P/S)和体积百分比10％胎牛血清(FBS)的DMEM/LG、50μM抗坏血酸磷酸盐、1μM***、100μM甘油磷酸盐。
8.根据权利要求1-3任意一项所述的小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于：所述步骤④中成骨诱导培养基包括含100U/mL双抗(P/S)和体积百分比10％胎牛血清(FBS)的DMEM/LG、50μM抗坏血酸磷酸盐、1μM***、100μM甘油磷酸盐。
9.根据权利要求7所述的小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于：所述步骤⑤中一抗包括兔单克隆CYP11A1抗体、兔多克隆CYP17A1抗体、兔多克隆HSD3B1抗体、鼠单克隆CD29抗体，兔单克隆CYP11A1抗体与稀释液按体积比1:350稀释，兔多克隆CYP17A1抗体与稀释液按体积比1:100稀释，兔多克隆HSD3B1抗体与稀释液按体积比1:500稀释，鼠单克隆CD29抗体与稀释液按体积比1:500稀释；二抗包括Cy3标记羊抗兔IgG抗体、Cy3标记羊抗鼠IgG抗体、FITC标记羊抗兔IgG抗体，Cy3标记羊抗兔IgG抗体与稀释液按体积比1:500稀释，Cy3标记羊抗鼠IgG抗体与稀释液按体积比1:500稀释，FITC标记羊抗兔IgG抗体与稀释液按体积比1:500稀释。
10.根据权利要求1-3任意一项所述的小分子诱导人脂肪干细胞分化为***细胞的方法，其特征在于：所述步骤⑤中一抗包括兔单克隆CYP11A1抗体、兔多克隆CYP17A1抗体、兔多克隆HSD3B1抗体、鼠单克隆CD29抗体，兔单克隆CYP11A1抗体与稀释液按体积比1:350稀释，兔多克隆CYP17A1抗体与稀释液按体积比1:100稀释，兔多克隆HSD3B1抗体与稀释液按体积比1:500稀释，鼠单克隆CD29抗体与稀释液按体积比1:500稀释；二抗包括Cy3标记羊抗兔IgG抗体、Cy3标记羊抗鼠IgG抗体、FITC标记羊抗兔IgG抗体，Cy3标记羊抗兔IgG抗体与稀释液按体积比1:500稀释，Cy3标记羊抗鼠IgG抗体与稀释液按体积比1:500稀释，FITC标记羊抗兔IgG抗体与稀释液按体积比1:500稀释。
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