CN103667349B - 一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法，该方法将脂肪干细胞（ADSCs）诱导重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。具体包括如下步骤：（1）将多能性因子的cDNA导入ADSCs；（2）在无饲养层体系中，使用无血清培养基培养步骤（1）得到的ADSCs；（3）出现胚胎干细胞（ESCs）样细胞克隆后，更换成添加有MEK与GSK3信号通路抑制剂的培养基继续培养，挑取细胞克隆并扩大培养；（4）鉴定细胞克隆的多能性。本发明中，ADSCs成本低且易于大量获取，重编程的速度与效率很高；无饲养层体系可以提高阳性iPSCs克隆的纯度；无血清培养基避免了血清中未明确组分与批次差异带来不稳定因素；信号通路抑制剂能够促进细胞达到充分重编程的状态，提高阳性iPSCs克隆的质量。

Description

一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞领域，特别涉及一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法。

背景技术

干细胞是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞（Adult stem cells）和胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞等，在成体组织中存在的。

1981年，ESCs的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。而人的干细胞的代始于1998年，美国科学家James A.Thomson带领研究团队首次从人类胚胎组织中提取培养出ESCs株，并且证实此株细胞具有全能干细胞特征，此项研究论文发表在顶级学术期刊“Science”上面。人ESCs细胞研究的应用前景主要是再生医学领域，在组织工程学领域中以人ESCs作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制人ESCs分化培养环境、转染能够促进人ESCs定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。

然而，一直以来，人ESCs研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：（1）供体***的来源困难，人ESCs建系效率低。此外，体细胞核移植（Somatic cellnuclear transfer,SCNT）技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类***，故而其来源难以得到保证；（2）免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对人ESCs分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应；（3）人ESCs具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置***基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题。

为避开人ESCs和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，英国剑桥大学Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入非洲爪蟾***后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4基因则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物***核泡所重构从而表达Oct4基因。

2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因等4个多能性因子，通过逆转录病毒将上述4个多能性因子导入小鼠胎儿成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ESCs的培养条件下获得了多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、基因表达谱、表面抗原标记物、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性、形成畸胎瘤等方面与小鼠ESCs非常相似，故将其命名为诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）。

接着，Yamanaka研究小组利用相同的技术，将上述同样的4个多能性因子导入到人皮肤成纤维细胞中，成功获得了人iPSCs。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为人iPSCs。这类iPSCs的各方面特性与人ESCs非常相似，并且在体外培养形成的拟胚体时和在小鼠体内形成的畸胎瘤中均可分化为三个胚层的不同细胞类型。与此同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞重编程为具有人ESCs基本特征的iPSCs，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转染。这一被学界称为生物科学“里程碑”的重大突破有望帮助科学家绕过克隆技术的伦理、道德纷争，为医学应用打开大门。

尽管科学家们在人ESCs方面做出了显著的成绩，但从ESCs，或者说iPSCs到可以移植用的组织和器官，路途仍然艰辛而遥远。从另一个角度来讲，部分科学家已经开始寻找可以直接移植的器官。但由于人体器官来源的局限性，其它物种，尤其是有蹄类哺乳动物的器官开始进入研究者的视野中，而猪就是其中一个典型的例子。由于猪在器官形态、体积及生理功能方面与人的相似性，且寿命较长，和目前使用广泛的小鼠相比，更利于人类进行透彻深入且有针对性的科学实验。小鼠ESCs广泛的运用实例告诉我们，在ESCs上，能够很高效地实现遗传修饰与生殖嵌合，进而生产出具有特定性状动物后代。同样，运用基因工程手段对猪的ESCs进行基因操作，可以培育出有医用前景的猪如抗超急性免疫排斥反应的群体，有望实现人类的器官移植治疗。在过去的几十年中，对于猪的科学研究已经取得了可喜进步。然而，尽管许多科学家曾尝试分离猪的ESCs，但都以失败而告终，包括牛、羊等在内，得到的也仅仅是类ESCs，这些细胞无法在体外长期维持多能性与自我更新的状态。因此，目前对于猪细胞的遗传操作大多基于体细胞核移植技术。不过，由于***对于体细胞核的重编程不彻底，产生的后代常有畸形，且核移植生产周期长，从而效率上偏低、费时费力。由此，猪iPSCs成为当下极具应用前景的选择。

此外，将人iPSCs应用到临床之前，其所发挥的医疗效果有待于动物试验评估，安全问题即成瘤性问题也需要被严格检测。由于小鼠的寿命较短，而灵长类动物猴的饲养又较为困难、成本很高，还涉及伦理道德问题。因而，除了用于器官移植，猪作为另一个可候选的生物模型，也开始受到很多科学家和临床医生的推崇，如通过建立人类多种遗传性疾病性状的猪模型来监测分析iPSCs在组织再生医学研究上的临床疗效、安全性，为加速人类iPSCs的临床应用提供科学数据。另外，在制药领域，长期是以小鼠为实验动物进行药理、药效研究，基于猪iPSCs生产得到的疾病模型的推广，无疑也将大大加强药物临床前试验的可靠性，提高医学试验的质量。

当前，已经有多个国家的研究小组获得了猪iPSCs，尽管经证明转染一系列外源因子可以使得猪成纤维细胞的表观遗传修饰和基因转录重置成接近ESCs的状态，但猪iPSCs的诱导效率仍然十分低下，效率值约为0.1-0.2％，且阳性iPSCs克隆形成所需的周期较长，一般约在2周以上。同时，受制于对猪ESCs培养缺乏足够的认识与经验，体细胞重编程条件设置上的不完善，所建立细胞系的多能性水平也并不充分，这些都将有碍于其在产业上的后续应用。不同的细胞类型在重编程效率上不同，相同的细胞类型在不同的诱导条件下重编程效率也不同，因而寻找更为高效的猪iPSCs重编程技术体系，在今后的研究中是亟需克服的问题。

发明内容

为克服上述诱导猪iPSCs效率低、周期长的问题，本发明的目的在于提供一种高效获取猪iPSCs的技术方法，该方法为在无饲养层、无血清培养条件下，将ADSCs诱导重编程为多能干细胞，并且在重编程过程中的特定阶段，使用MEK信号通路抑制剂PD0325901与GSK3信号通路抑制剂CHIR99021处理细胞。

本发明所述的一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法，所用于将来源于猪的脂肪干细胞（ADSCs）诱导重编程为诱导性多能干细胞，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将多能性因子的cDNA导入ADSCs，其中所述的多能性因子为Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因；

（2）在无饲养层体系中，使用无血清培养基或者加入代血清添加剂的培养基培养步骤（1）得到的ADSCs；

（3）出现胚胎干细胞样细胞克隆后，在所述培养基中添加MEK信号通路抑制剂PD0325901与GSK3信号通路抑制剂CHIR99021，继续培养3天，再挑取细胞克隆并扩大培养；

（4）鉴定细胞克隆的多能性，包括检测细胞的碱性磷酸酶活性、内源多能性基因的表达、胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）标记物的表达、体内分化形成畸胎瘤的能力。

根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤（1）中多能性因子的cDNA通过病毒载体导入所述ADSCs。优选地，所述病毒载体为慢病毒载体。更优选地，所述慢病毒载体为药物可诱导的RevTet-On型表达载体。RevTet-On型慢病毒表达载体使得重编程获得的iPSCs中外源多能性因子的表达具有随时的可调控性，如在对iPSCs进行基因修饰等遗传操作后，即能够选择保持原有状态，又能够分化为正常的体细胞，便于根据需要进行相应的运用处理。

根据本发明所述的方法，在步骤（2）中，采用无饲养层体系，可以提高阳性iPSCs克隆的纯度。优选地，对于所述的无饲养层体系，需要在培养皿上预先包被基质胶。基质胶可自动聚集形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养。

根据本发明所述的方法，在步骤（2）中，优选采用无血清的培养基，它是由为化学限定性的各组分配制而成，成分清晰、明确，便于进行进一步优化改良、改造。优选地，

根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤（2）中的无血清培养基可加入代血清添加剂，优选是15%（体积百分比）血清替代物（例如KnockOut^TMSR）或5mg/mL高脂牛血清白蛋白（例如Ⅱ）。代血清添加剂可避免血清中的未明确组分以及批次差异给iPSCs培养状态带来不稳定因素。

根据本发明所述的方法的进一步特征，所述无血清培养基还包含：40%DMEM/F-12培养基、40%培养基、1%N-2添加剂、1%B-27添加剂、1%添加剂、0.1mMβ-巯基乙醇、1000U/mL白血病抑制因子、2μg/mL强力霉素。

根据本发明所述的方法的进一步特征，所述白血病抑制因子为小鼠来源的。本发明也可采用其它物种来源的白血病抑制因子，但是小鼠源的白血病抑制因子在成本上相对地更为低廉。

根据本发明所述的方法，所述步骤（2）中培养的ADSCs的接种密度是本发明的关键因素之一。如果细胞接种密度过低，重编程的细胞基数很小，会降低阳性iPSCs克隆的得率，同时不利于细胞间有益因子的分泌互作行为；反之，如果细胞接种密度过高而间距过小，则在重编程期间不同单细胞增殖而来的细胞克隆会发生接触以至于汇合到一起，从而造成不同重编程水平的细胞间产生交叉污染，无法得到完全重编程的阳性iPSCs克隆。优选地，所述步骤（2）中培养的ADSCs是以2,500个细胞/cm²的密度接种到培养皿上。实验表明，该接种密度下的ADSCs则能够保证顺利地完成重编程进程，得到单纯的阳性iPSCs克隆。

根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤（3）中所添加的MEK信号通路抑制剂可以是Selleckchem公司的PD0325901产品（商品号为S1036）；所添加的GSK3信号通路抑制剂可以是Selleckchem公司的CHIR99021产品（商品号为S2924）。实验表明，0.5μM的MEK与3μM的GSK3信号通路抑制剂，不仅可以促进细胞重编程的发生，在诱导重编程的后期阶段，MEK抑制剂还能够促使未被重编程的以及部分重编程转而又走向分化的细胞发生凋亡。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

与现有技术公开的其它用于获取猪iPSCs的策略不同，本发明所述的方法较之以往进行了全面的优化，在源头细胞材料上选取了易于高效重编程的成体干细胞ADSCs，在重编程环境中使用了更为安全的无饲养层、无血清体系，在重编程进程的后期阶段应用了屏蔽细胞分化信号的通路抑制剂。因此，所用的ADSCs不仅可以诱导形成猪iPSCs，而且诱导重编程的效率显著大于常用的成纤维细胞，猪ADSCs转录多能性因子后，在无饲养层、无血清条件下，可以高效、高纯地诱导为iPSCs，效率约为1.53%左右，与成纤维细胞相比，诱导重编程的效率提高超过6倍，且细胞完成重编程进程所需的周期缩短至少4天以上；产生的这些iPSCs多能性标记物的表达情况与ESCs（参考小鼠、人）相近，同时外源因子的表达可以被完全沉默；在ADSCs重编的特定阶段使用特定的信号通路抑制剂进行处理，明显提高了猪iPSCs的质量，与重编程水平关联的若干基因、表观遗传修饰位点的表达情况显示出细胞已达到充分重编程状态，为该猪多能干细胞领域的研究提供了良好平台。此外，相对于目前难以直接从猪的胚胎提取出ESCs，及其提取过程中所需较高的人力、物力、时间成本，该方法将通过高效获取猪的iPSCs，为遗传操作提供了很大的便利，促进基于猪iPSCs建立的器官移植用猪、人类遗传性疾病模型猪的生产与推广，服务于人类医学的临床实践。

附图说明

图1是ADSCs及其诱导重编程得到的猪iPSCs形态图。

图2是猪iPSCs诱导重编程过程的示意图。

图3是猪iPSCs的碱性磷酸酶染色结果及其重编程效率分析图。

图4是猪iPSCs的多能性基因与ESCs标记物表达鉴定图。

图5是猪iPSCs的畸胎瘤分化鉴定图。

具体实施方式

1.定义和技术：

除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、细胞生物学的传统技术，其属于本领域技术范围。参见《分子克隆实验指南》，J.Sambrook等人编著（2008）；《精编分子生物学实验指南》，F.M.Ausubel等人编著（2008）；《动物细胞培养——基本技术指南》，R.I.Freshney等人编著（2008）；《干细胞手册》，R.Lanza等人编著（2013）。

本发明中使用的一些术语具有下列定义的含义：所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述，所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本发明中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。

本发明所述的“诱导性多能干细胞（iPSCs）”是这样的细胞，其在胚胎干细胞（ESCs）培养条件下，与ESCs在细胞形态、生长特性、表面标记物表达、体内外可分化形成包含三个胚层细胞的组织结构等方面非常相似，而且在基因组DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态等方面也也十分相似。

本发明所述的脂肪干细胞（ADSCs）是来自哺乳动物的ADSCs，它是从背、腹部皮下脂肪组织中分离提取获得，具有可塑性。脂肪组织位于皮肤下方，属于一种松散的***结构，在动物体内大量分布，根据脂肪细胞结构和功能的不同，将脂肪组织分为白色（黄色）脂肪组织、棕色脂肪组织，实验取材所用的属于前者。脂肪组织除了由大量群集的脂肪细胞构成，还富含具有自我更新能力的ADSCs，能够参与皮肤等组织的损伤修复。

培养的ADSCs呈成纤维细胞样的短梭形贴壁、涡旋状生长，形态饱满且折光性很强；分泌一些粘附分子、细胞外基质蛋白质、干细胞因子和生长因子，表达间充质干细胞特异性标记物CD44、CD90、CD29；在一定的诱导条件下能够实现可塑性，表现为横向或纵向的分化能力，如向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化。

各种动物来源的ADSCs均可以从动物中容易地分离，便于处理，对其研究也不会涉及伦理道德问题。例如从人类医学美容相关手术术后的脂肪组织废弃物中分离得到，或者从育肥家畜的脂肪组织中提取。

本发明所述的术语“诱导重编程”是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞即所述的ADSCs，可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞。其中，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2、Klf4，以及c-Myc基因。最优选地，所述多能性因子为人源Oct4、Sox2、Klf4，以及c-Myc基因。具体地，所述多能性因子为Oct4，NCBI登录号为NM_002701；Sox2，NCBI登录号为NP_003097；Klf4，NCBI登录号为NP_004226；c-Myc，NCBI登录号为NP_002458。

将所述多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地慢病毒载体（例如可以受到特定药物随时调控表达的RevTet-On型载体），如实施例中所述的。

本发明所述的“无饲养层、无血清培养条件”是在本领域常规干细胞培养条件基础上的优化处理，并且包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰。培养方法以及培养条件参见《干细胞手册》，R.Lanza等人编著（2013）。

本发明的高效获取猪诱导性多能干细胞的技术方法优选实施例的过程如下，图1是ADSCs及其诱导重编程得到的猪iPSCs形态图；图2是猪iPSCs诱导重编程过程的示意图；图3是猪iPSCs的碱性磷酸酶染色结果及其重编程效率分析图；图4是猪iPSCs的多能性基因与ESCs标记物表达鉴定图；图5是猪iPSCs的畸胎瘤分化鉴定图。

2.实施例

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

下列实施列举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例，根据本发明公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学等方面的常规技术。

实施例1.细胞的制备和培养

1.1猪脂肪干细胞（ADSCs）的培养

从猪背、腹部皮下分离出脂肪组织，清除血管、肌肉残留物，DPBS缓冲液（Gibco公司）洗涤充分洗涤，然后用外科手术剪将脂肪组织充分剪碎至几乎无剪切阻力，转移至离心管内，加入相当于脂肪组织总体积2～3倍的0.09%的I型胶原酶消化液（Sigma公司），置于37℃水浴上振荡、消化处理；组织悬液糊化后，用巴斯德吸管反复吹打以分散组织碎屑，1,200rpm室温离心5min，弃掉离心管上层的成熟脂肪组织、中层的消化液，再用含10%胎牛血清的DMEM/F-12基础培养基（HyClone公司）充分地重悬离心管底层的细胞；依次用孔径为250μm、80μm、25μm的尼龙网筛过滤细胞悬液，离心后弃掉基础培养基，用新鲜的基础培养基反复洗涤离心管底层的细胞沉淀物；再次离心并弃掉基础培养基后，用猪ADSCs完全培养基充分重悬细胞沉淀物，并接种到细胞培养瓶内，放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱内培养。所述猪ADSCs完全培养基中包含DMEM/F-12培养基（HyClone公司）、10％胎牛血清（Gibco公司）、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（Peprotech公司）、50μg/mL L-抗坏血酸（Sigma公司）、2mM L-谷氨酰胺（Gibco公司）。

1.2猪诱导性多能干细胞（iPSCs）的培养

猪iPSCs无血清完全培养基中包含40%DMEM/F-12培养基（Gibco公司）、40%培养基（Gibco公司）、15%血清替代物（KnockOut^TM SR）或5mg/mL高脂牛血清白蛋白（Ⅱ）（Gibco公司）、1%N-2添加剂（Gibco公司）、1%B-27添加剂（Gibco公司）、1%添加剂（Gibco公司）、0.1mMβ-巯基乙醇（Gibco公司）、1000U/mL白血病抑制因子（Millipore公司）、2μg/mL强力霉素（Clontech公司）。此外，处理细胞克隆用的小分子抑制剂PD0325901的工作浓度为0.5μM，CHIR99021的工作浓度为3μM。

1.3其它细胞的培养

293T细胞用作慢病毒的包装细胞系，使用与成纤维细胞相同的培养基，所有细胞一直放在37℃、5％CO₂的细胞培养箱内培养。

实施例2.病毒载体感染猪ADSCs

根据实施例1所述的方法，在细胞培养瓶中接种低代次的猪ADSCs，37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养至汇合度达80～90%时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco公司）于37℃消化为单细胞悬液后，用收集的病毒上清液感染1×10⁵个ADSCs，感染复数（MOI）为3（所用病毒的滴度为5～10×10⁶IU/mL，携带多能性因子cDNA的四种病毒按1:1:1:1混合），然后接种到6孔培养板中，继续在37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养。所述病毒上清液是通过用包含人Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的药物可诱导（RevTet-On）型慢病毒表达载体（SiDanSai公司）按常规方法转染293T细胞（Fugene HD，Roche公司）获得的（参见《分子克隆实验指南》，J.Sambrook等人编著（2008））。

实施例3.感染细胞的继续培养和克隆筛选

在感染后的第2天，使用DPBS缓冲液清洗培养孔两次，再将感染后的ADSCs用0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco公司）于37℃消化为单细胞悬液后，按2,500个细胞/cm²的密度接种到新的6孔培养板中，共接种4个培养孔，培养板皿面预先包被基质胶（BDPharmingen公司），继续使用ADSCs完全培养基。这里4个板孔的平行样中，1个板孔用于碱性磷酸酶（AP）染色（SiDanSai公司），统计阳性克隆数，另3个板孔用于克隆挑选，实验重复了三次。在感染后的第3天，将ADSCs完全培养基更换为实施例1中所述的猪iPSCs无血清完全培养基，继续在37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养。培养至第5天左右，会有典型的细胞集落出现，约第6～8天出现ESCs样细胞克隆后，在猪iPSCs无血清完全培养基中添加0.5μM的MEK信号通路抑制剂PD0325901与3μM的GSK3信号通路抑制剂CHIR99021，处理重编程过程中的细胞。

需要特别指出的是，感染后的ADSCs以过高或者过低的密度接种到细胞培养板中，以及过早或者过晚添加PD0325901和CHIR99021，还包括仅仅使用其中的一个小分子抑制剂，猪iPSCs阳性克隆的形成率均会大大降低。

培养至第10天左右，将用于克隆挑选的3个板孔，使用玻璃针分割边缘光滑、细胞核清晰、形态紧致的典型ESCs样的单个克隆，然后用玻璃管吸取这些分割开的克隆按一式两样接种到两块96孔培养板对应的孔中，每个孔接种一个克隆，培养板皿面预先用小鼠胎儿成纤维细胞制备的饲养层细胞包被，37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养。在96孔培养板培养约一周后，选取其中的一块培养板进行AP染色。将AP阳性的克隆使用TryPLE Express（Gibco公司）于37℃消化为单细胞悬液后，按1:6-12的比例传代，依次从96孔、24孔、12孔培养板，向6孔培养板扩增。在这些iPSCs候选克隆中，我们选择了2个做进一步的鉴定。

未进行克隆挑取的那1个6孔培养板板孔，直接进行AP染色，依据克隆形态及AP染色结果对典型ESCs的克隆计数（使用单镜头反光照相机在微距下拍照，然后用“ImageJ”软件统计），计算诱导效率公式：诱导效率=AP阳性克隆数量÷被感染细胞数量×100%。经试验重复统计分析后发现，接种2.5×10⁴个感染后的猪ADSCs，能够形成382个AP阳性克隆，即我们这种方法总体的效率为大约1.53%，与同期设置的对照组成纤维细胞约0.25%的效率相比超过6倍。

实施例4.Real-Time PCR鉴定猪iPSCs克隆中多能性基因的表达水平

使用RNeasy Mini（QIAGEN公司）试剂盒，按照制造商说明提取猪iPSCs总RNA；用QuantiTect Reverse Transcription（QIAGEN公司）试剂盒进行逆转录，并使用FastStartSYBR Green Master（Rox）试剂盒（Roche公司），StepOnePlus荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems公司）进行Real-Time PCR。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件，按照制造商说明进行。

使用本申请的方法获得的猪iPSCs克隆中，不仅内源性的Oct4、Sox2、Nanog、Dnmt3b、Tert基因被激活，与细胞重编程程度关联的Lin28、Esrrb、Utf1、Dppa5基因也充分上调表达，而这些多能性因子在未经诱导重编程的ADSCs中均没有可检测到的表达或较低表达。

实施例5.蛋白免疫荧光染色鉴定猪iPSCs克隆中ESCs标记物的表达

DPBS缓冲液洗涤培养2～3天的猪iPSCs克隆后，使用4%多聚甲醛（Solarbio公司）固定；使用0.5%Triton X-100（Solarbio公司）通透细胞（限核内标记物检测），然后用含1%BSA（Sigma公司）的DPBS缓冲液封闭处理；期间反复洗涤后，依次加入一抗（抗Oct4和Nanog的抗体购自Abcam公司、抗Sox2的抗体购自Cell Signaling公司、抗SSEA-3和SSEA-4的抗体购自Developmental Studies Hybridoma Bank公司）、二抗（Alexa Fluor594购自Molecular Probes公司）孵育；最后用DAPI染料（Sigma公司）定位细胞核，使用常规的荧光显微镜观察。结果显示猪iPSCs克隆高表达ESCs标记物Oct4、Sox2、Nanog、SSEA3和SSEA4蛋白。

实施例6.鉴定猪iPSCs克隆在体内分化形成三个胚层组织结构的能力

为确认所检测猪iPSCs克隆是否具有长期维持细胞多向分化潜能的特性，我们基于传代10代次以上的细胞来进行的畸胎瘤形成实验。

将猪iPSCs克隆使用TryPLE Express于37℃消化为单细胞悬液后，重新接种到新的培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱静置45分钟，取上层未贴壁的细胞（饲养层细胞贴壁快，故可将饲养层细胞与猪iPSCs分离）；计数，取500万猪iPSCs单细胞悬浮于300μL含15％KnockOut^TM SR的DMEM/F-12中，对NOD/SCID先天性免疫缺陷小鼠进行后腿根部肌肉无菌注射；小鼠注射后，置于SPF级层流间中饲养，期间不停饲喂2mg/mL的强力霉素（溶解于无菌蔗糖溶液），约3～5天换次水，逐渐有米粒大小的硬块长出，待瘤块长大到可以取后将药物撤掉；撤药后正常喂养3～4周，用眼科剪、手术镊将畸胎瘤取出，固定在4%多聚甲醛中；固定后的畸胎瘤，经石蜡包埋、切片，以及苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin）染色观察畸胎瘤分化情况。结果显示，猪iPSCs成功分化出具有三个胚层的不同类型细胞的组织结构，如内胚层的肠上皮结构、中胚层的脂肪结构以及外胚层的角质上皮结构，

由上结果进一步证明使用本申请的方法能够高效获取猪iPSCs，且具有ESCs的特性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法，用于将来源于猪的脂肪干细胞（ADSCs）诱导重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），其特征在于，包括如下步骤：

（1）将多能性因子的cDNA通过药物可诱导的RevTet-On型表达载体导入ADSCs，其中所述的多能性因子为Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因；

（2）在无饲养层体系中，使用无血清培养基或者加入代血清添加剂的培养基培养步骤（1）得到的ADSCs；所述无血清培养基还包含：40% DMEM/F-12培养基、40% Neurobasal® 培养基、1% N-2添加剂、1% B-27添加剂、1% GlutaMAX®添加剂、0.1mM β-巯基乙醇、1000U/mL白血病抑制因子、2μg/mL 强力霉素；在培养皿上预先包被基质胶，将培养的ADSCs以2500个细胞/cm²的密度接种到培养皿上；

（3）出现胚胎干细胞样细胞克隆后，在所述培养基中添加工作浓度为0.5μM的MEK信号通路抑制剂与工作浓度为3μM的GSK3信号通路抑制剂，继续培养3天，再挑取细胞克隆并扩大培养；以及

（4） 鉴定细胞克隆的多能性，包括检测细胞的碱性磷酸酶活性、内源多能性基因的表达、胚胎干细胞（ESCs）标记物的表达、体内分化形成畸胎瘤的能力。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述代血清添加剂是体积百分比为15%的血清替代物或5mg/mL高脂牛血清白蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白血病抑制因子为小鼠来源的。