CN110079501A - 小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法 - Google Patents

小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1‑CTC，于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201930。本发明还提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。本发明分离并培养获得的循环肿瘤细胞质量均一，经过免疫荧光、增殖、侵袭迁移及致瘤能力实验鉴定符合循环肿瘤细胞的特性，是实验室研究肿瘤转移较好的实验对象，也为临床预测乳腺癌转移、检测化疗药物敏感性提供了良好的研究模型。本发明的循环肿瘤细胞分离及培养方法简单，成本低，易于操作，分离的细胞可传代，为实验室研究循环肿瘤细胞特性、肿瘤转移机制提供了很好的研究工具。本发明在肿瘤转移研究方面将会有广泛的应用。

Description

小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。
背景技术
乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，并且是女性肿瘤相关死亡的主要原因，据2015年统计，在中国有大约27万乳腺癌新增病例，大约7万患者死亡，肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，而循环肿瘤细胞在肿瘤血道转移过程中起到了关键作用。国内外大量研究证实乳腺癌患者血液中循环肿瘤细胞与患者临床分期、预后及肿瘤转移复发密切相关。2018年美国AJCC指南中将循环肿瘤细胞列为乳腺癌预后评估的一项生物学指标。故循环肿瘤细胞的早期捕获对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都具有重要的指导作用。
循环肿瘤细胞的检测有创伤小易重复的优点，故循环肿瘤细胞的捕获、分离及培养技术是关键环节。目前为止，尚未见到小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系建立的报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。
本发明提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC，于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201930。
本发明提供小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：
(1)取乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的外周血至枸橼酸钠抗凝剂中，得到抗凝血，将抗凝血轻轻移至含有小鼠外周血淋巴细胞分离液的离心管中，离心，吸取血浆及白细胞层至无菌离心管中，用无菌PBS液漂洗后离心，获得细胞沉淀；
(2)将步骤(1)得到的细胞转移至含有10％FBS的DMEM1640培养基的培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；培养24h-48h后，更换培养液，之后每48h更换一次培养液，通过更换培养液将悬浮的白细胞清除，得到贴壁生长的细胞，即为小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞。
作为优选，步骤(1)中，所述乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的建立方法包括以下步骤：用无菌PBS重悬处于对数生长期的乳腺癌细胞系4T1单细胞，接种至小鼠模型,注射至小鼠模型乳腺脂肪垫，饲养35天到40天，至小鼠模型出现消瘦、衰竭状态。
作为优选，步骤(1)中，所述小鼠模型为SPF级BALB/c小鼠。
作为优选，步骤(2)中，所述DMEM1640培养基中还加入1％青链霉素。
作为优选，步骤(2)中，待贴壁生长的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系细胞密度达到70-80％时开始传代培养。
作为优选，所述传代培养的具体方法为：弃掉培养液，用无菌PBS液漂洗后，以0.25％胰蛋白酶溶液于室温消化，当细胞变圆后，加入含有10％FBS的DMEM1640培养液将细胞吹散制备为单细胞悬液，然后将细胞悬液移至培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
作为优选，所述小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的冻存方法为：将处于对数生长期的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞用0.25％的胰蛋白酶溶液于室温消化为单细胞，离心获得细胞沉淀，缓慢加入细胞冻存液，于4℃放置1h，-20℃放置2h，-80℃放置过夜，次日在液氮中保存。
作为优选，所述细胞冻存液由DMEM1640培养基、胎牛血清和二甲基亚砜组成，DMEM-1640：胎牛血清：二甲基亚砜的体积比＝6:3:1。
作为优选，所述小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的复苏方法为：将冻存的细胞放置于37℃水浴锅中水浴融化，离心，获得细胞沉淀，加入含有10％FBS的DMEM-1640培养基置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每48h更换一次培养液。
本发明的有益效果体现在：
本发明分离并培养获得的循环肿瘤细胞质量均一，经过免疫荧光、增殖、侵袭迁移及致瘤能力实验鉴定符合循环肿瘤细胞的特性，是实验室研究肿瘤转移较好的实验对象，也为临床预测乳腺癌转移、检测化疗药物敏感性提供了良好的研究模型。本发明的循环肿瘤细胞分离及培养方法简单，成本低，易于操作，分离的细胞可传代，为实验室研究循环肿瘤细胞特性、肿瘤转移机制提供了很好的研究工具。本发明在肿瘤转移研究方面将会有广泛的应用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1和图2为捕获的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞4T1-CTC。
图3和图4为鉴定获得的循环肿瘤细胞是否是上皮来源。
图5为获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本细胞、原位肿瘤细胞的增殖能力比较。
图6为获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本细胞、原位肿瘤细胞的克隆球形成能力比较。
图7为获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本细胞、原位肿瘤细胞的克隆球形成能力统计学分析。
图8为通过Transwell迁移实验将获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本和原位肿瘤细胞迁移能力比较。
图9为通过Transwell侵袭实验将获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本和原位肿瘤细胞侵袭能力比较。
图10和图11为通过体内皮下成瘤实验比较循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本和原位肿瘤细胞皮下致瘤能力。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
(一)本实施涉及的相关实验试剂和实验用品
(1)200mL小鼠外周血淋巴细胞分离液。
(2)枸橼酸钠抗凝剂。
(3)DMEM1640培养基(Hyclone)。
(4)FBS(胎牛血清)(BI)，含有10％FBS的DMEM1640培养液：DMEM1640培养基于FBS按照体积比9:1混合。
(5)PBS液(0.01M)。
(6)0.25％胰蛋白溶液(Hyclone)。
(7)细胞冻存液：6mLDMEM1640培养基、3mLFBS与1mLDMSO(Sigma)混匀，4℃保存，现配现用。
(二)乳腺癌原位转移瘤动物模型建立
1.1实验鼠和细胞系准备
(1)扩增乳腺癌细胞系4T1，具体扩增方法为：从中国科学院上海细胞库购买鼠源性乳腺癌细胞4T1，用含10％FBS的DMEM1640培养基培养，并加入1％的青链霉素，于37℃，5％CO2细胞培养箱培养，待细胞密度达到80％即可进行传代扩增，弃去培养基上清，无菌PBS漂洗两遍，加入胰蛋白酶消化约3min，用含10％FBS的DMEM1640培养基重悬，按照1:3进行细胞传代扩增。
(2)购买SPF级BALB/C小鼠，10只一组，在兰州大学动物中心SPF环境中按照SPF级动物饲养标准进行饲养，自由饮水。
1.2乳腺原位肿瘤接种
1.2.1材料准备：医用手套、口罩、高压灭菌的手术器械，手术架，酒精。
1.2.2具体步骤
(1)细胞计数，保证细胞数量足够每只2×106个细胞，将扩增的处于对数生长期的4T1细胞用无菌PBS液按照每只150μL进行稀释，混匀得到单细胞悬液。
(2)将小鼠固定，找到第四对乳腺，酒精棉球消毒右侧第四对乳腺，用镊子轻轻提起右侧第四对乳腺，注射器平行进针至乳腺脂肪垫，进针后用镊子固定针头，缓慢注射细胞悬液，注射结束后，用酒精棉球轻轻按压注射部位防止出血感染。
(3)继续饲养35天到40天后，BALB/C小鼠出现消瘦状态，准备取血。
(三)乳腺癌原位肿瘤细胞分离培养过程
用***麻醉荷瘤小鼠，用无菌手术剪和镊子将荷瘤小鼠肿瘤组织剥离一块，置于培养皿中，手术刀切除表面脂肪及坏死组织，无菌PBS漂洗2次，手术刀交叉切成3mm的小块，手术镊将组织块移入离心管中，加入无菌PBS，漂洗2次将组织转移至无菌锥形瓶中，加入100mL酶解液37℃消化，每隔20min摇动一次，待消化液混浊时，立即终止消化，40μm的细胞滤网过滤，1000rpm，5min离心，培养基漂洗2次，离心获得细胞沉淀，用含有10％FBS的DMEM1640培养基重悬细胞，37℃，5％CO2细胞培养箱培养。
(四)循环肿瘤细胞分离培养过程
(1)取血之前，用1mL无菌注射器吸入100μL枸橼酸钠抗凝剂。
(2)心脏取血，血样和枸橼酸钠抗凝剂的体积比为9:1。
(3)将抗凝血轻轻移至含有3mL小鼠外周血淋巴细胞分离液的离心管中，离心800g20min，轻轻吸取血浆及白细胞层至无菌离心管中，用无菌PBS液漂洗两次，250g 5min，获得细胞沉淀。
(4)再次用无菌PBS液漂洗，室温下250g 5min离心，得细胞沉淀。
(5)将洗涤后的细胞转移至含有10％FBS的DMEM1640培养基的培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，为防止细菌污染，培养基中加入1％双抗(青链霉素)。
(6)培养24小时后更换一次含有10％FBS的DMEM1640培养液，之后每隔48小时换液，自第一次更换培养液起7～10天，细胞培养瓶中悬浮的白细胞通过换液会逐步被清除，肿瘤细胞会增殖，形成克隆，待克隆(第一代细胞)达到70％-80％时，进行第一次传代。此时得到贴壁生长的细胞，即为乳腺癌原位转移瘤模型BALB/c小鼠的循环肿瘤细胞，将其命名为小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC。
传代培养具体方法为：弃掉培养液，用无菌PBS液轻轻漂洗两遍后，以0.25％胰蛋白酶溶液于室温消化约1分钟，当细胞变圆后，加入含有10％FBS的DMEM1640培养液将细胞吹散制备为单细胞悬液，然后将细胞悬液移至培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，培养24小时后换液一次，以后48h换液一次。
将培养得到的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称CCTCC，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201930。
(7)关于冻存和复苏
冻存：将处于对数生长期的乳腺癌循环肿瘤细胞用0.25％的胰蛋白酶溶液于室温消化为单细胞，1000rpm离心5min获得细胞沉淀，逐滴缓慢加入配制好的细胞冻存液，于4℃放置1h，-20℃放置2h，-80℃放置过夜，次日在液氮中保存。
复苏：将冻存的细胞放置于37℃水浴锅中水浴融化，离心1000rpm，5min，获得细胞沉淀，加入含有10％FBS的DMEM-1640培养基置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每48h更换一次培养液。
实验结果表明：细胞可以正常传代、冻存。
(五)循环肿瘤细胞的鉴定
4T1乳腺癌细胞是上皮来源细胞，通过细胞免疫组化、细胞免疫荧光鉴定循环肿瘤细胞是否表达上皮角蛋白。
细胞免疫组化：准备无菌的圆形载玻片放至24孔板，将生长状态良好的捕获的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC CCTCC NO：C201930以细胞密度为3×103密度接种至每孔，次日细胞密度达到60％后取出，弃去细胞培养上清，PBS洗3次，每孔加入1ml预冷的4％多聚甲醛固定20min，弃去，PBS洗3次，0.05％Triton 100透膜15min，弃去，PBS洗3次，3％H202去离子水孵育5-10min，PBS洗三次，每次3min，滴加正常山羊血清工作液室温孵育15min，甩去玻片表面的血清。滴加广谱角蛋白抗体(1:100)4℃孵育过夜。次日，PBS漂洗3次，每次3min，滴加生物素化二抗工作液37℃孵育15min，PBS漂洗3次，每次3min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育15min，预冷PBS漂洗3次，每次3min。滴加DAB显色剂显微镜下观察至细胞变黄色后终止显色，滴加自来水充分漂洗，苏木素套核10s，自来水漂洗三次，分化液分化1s，自来水漂洗3遍，每次3min，氨水返蓝2s，自来水漂洗3次，每次3min。依次经过浓度梯度乙醇(80％一次，95％两次，100％三次，每次1min)脱水。二甲苯透明3次，每次3min，中性树胶封片，显微镜观察拍照。
细胞免疫荧光：准备无菌的圆形载玻片放至24孔板，将生长状态良好的捕获的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC CCTCC NO：C201930以3×103细胞密度，每孔500μl接种，次日细胞密度达到60％后取出，弃去细胞培养上清，无菌PBS清洗三遍，每孔加入1mL4％多聚甲醛固定20min，弃去，PBS洗3次，0.05％Triton 100透膜15min，弃去，PBS洗3次，3％H202去离子水孵育5-10min，PBS洗三次，每次3min，滴加正常山羊血清工作液室温孵育15min，甩去玻片表面的血清。滴加广谱角蛋白抗体(1:100)4℃孵育过夜。次日PBS洗3遍，每遍3min，每孔加入200μl FITC标记的荧光二抗(1:500)室温避光孵育1h，PBS洗3次，用防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察拍照。
鉴定结果描述：捕获的循环肿瘤细胞形态与4T1亲本和原位形态相似，(如图1，2)，细胞免疫组化和细胞免疫荧光进行广谱角蛋白标记结果提示捕获的细胞角蛋白阳性，(如图3，4)，说明该循环肿瘤细胞属于上皮来源。
图1、图2为捕获的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞4T1-CTC。
图3和图4为鉴定获得的循环肿瘤细胞是否是上皮来源。
(六)循环肿瘤细胞增殖、克隆球形成能力、迁移和侵袭能力及皮下致瘤能力研究(3次重复)。
1.比较循环肿瘤细胞与其亲本和原位4T1细胞的增殖能力。
将处于生长对数期的细胞，0.25％胰蛋白酶溶液消化，用含有10％FBS的1640培养液制备成单细胞悬液，调整细胞密度为5×103个/mL，每孔200μl(每孔含1000个细胞)，将小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC CCTCC NO：C201930与其亲代和原位4T1细胞细胞分别种于96孔板中，时间梯度1/2/3/4天，每组8个负孔，每孔加入20μl 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h，弃去上清，每孔加入150μl DMSO终止10min，酶标仪490nm波长滤光片检测各孔OD值，以各孔OD值的平均值为纵轴，以时间为横轴，绘制生长曲线，重复三次。
结果分析：4T1-CTC细胞增殖能力较4T1亲本细胞和4T1原位细胞低(如图5)。
图5为获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本细胞、原位肿瘤细胞的增殖能力比较。
2.比较循环肿瘤细胞与其亲本和原位4T1细胞的克隆球形成能力。
克隆球形成实验，分别将4T1亲本、原位及小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTCCCTCC NO：C201930以每孔700个细胞接种至六孔板中，至第八天终止，PBS漂洗两遍，4％多聚甲醛固定10min，0.5％结晶紫染色10min，PBS漂洗两遍，拍照。
结果分析：4T1-CTC细胞克隆球形成能力较4T1亲本细胞和4T1原位细胞低(如图6，7)。
图6为获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本细胞、原位肿瘤细胞的克隆球形成能力比较。
图7为获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本细胞、原位肿瘤细胞的克隆球形成能力统计学分析。
3.Transwell迁移方法比较循环肿瘤细胞与4T1亲本和4T1原位细胞的迁移能力。
Transwell迁移实验：用无血清培养基重悬的1×105个处于对数期的细胞接种至Transwell小室上室，下室加入500μl含10％血清的培养基，于36h后终止，用棉签轻轻擦拭Transwell小室上室未穿出的细胞，4％多聚甲醛固定10min，0.5％结晶紫染色15min，PBS漂洗两遍，显微镜下拍照并统计穿出的细胞数。
结果分析：4T1-CTC细胞迁移能力较4T1亲本细胞和4T1原位细胞低(如图8)。
图8为通过Transwell迁移实验将获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本和原位肿瘤细胞迁移能力比较。
4.Transwell侵袭方法比较循环肿瘤细胞与亲本和原位4T1细胞的侵袭能力。
Transwell侵袭实验：将40μl基质胶(1:8稀释)加入至Transwell小室上室，于37℃孵箱中凝固1h，用无血清培养基重悬的1×105个处于对数期的细胞接种至Transwell小室上室，下室加入500μl含10％血清的培养基，于48h后终止，用棉签轻轻擦拭Transwell小室上室未穿出的细胞，4％多聚甲醛固定10min，0.5％结晶紫染色15min，PBS漂洗两遍，显微镜下拍照并统计穿出的细胞数。
结果分析：4T1-CTC细胞迁移能力较4T1亲本细胞和4T1原位细胞低(如图9)。
图9为通过Transwell侵袭实验将获得的循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本和原位肿瘤细胞侵袭能力比较。
5.比较循环肿瘤细胞与其亲本、原位4T1细胞的皮下致瘤能力。
循环肿瘤细胞与其亲本和原位4T1细胞按照2×106个/只分别接种于BALB/C雌鼠的第四对脂肪垫，待形成肿瘤后，每隔两天测量肿瘤体积一次，绘制肿瘤的生长曲线。
结果分析：4T1-CTC细胞皮下致瘤能力较4T1亲本细胞和4T1原位细胞低(如图10，11)。
图10和图11为通过体内皮下成瘤实验比较循环肿瘤细胞(4T1-CTC)与其亲本和原位肿瘤细胞皮下致瘤能力。
为保持循环肿瘤细胞特性，以上实验循环肿瘤细胞均使用前三代细胞.
综合以上本发明的实验结果，可以证实，本发明首次分离培养得到一种小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞，即小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC CCTCC NO：C201930，描述为“乳腺癌原位转移模型BALB/c小鼠的循环肿瘤细胞”，本发明的分离培养方法简单易操作，有利于实验室通过对循环肿瘤细胞特性的研究，为肿瘤转移的相关机制研究提供更好的实验对象。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系4T1-CTC，于2019年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201930。
2.小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的外周血至枸橼酸钠抗凝剂中，得到抗凝血，将抗凝血轻轻移至含有小鼠外周血淋巴细胞分离液的离心管中，离心，吸取血浆及白细胞层至无菌离心管中，用无菌PBS液漂洗后离心，获得细胞沉淀；
(2)将步骤(1)得到的细胞转移至含有10％FBS的DMEM1640培养基的培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；培养24h-48h后，更换培养液，之后每48h更换一次培养液，通过更换培养液将悬浮的白细胞清除，得到贴壁生长的细胞，即为小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：步骤(1)中，所述乳腺癌原位转移瘤小鼠模型的建立方法包括以下步骤：用无菌PBS重悬处于对数生长期的乳腺癌细胞系4T1单细胞，接种至小鼠模型,注射至小鼠模型乳腺脂肪垫，饲养35天到40天，至小鼠模型出现消瘦、衰竭状态。
4.根据权利要求2或3所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：步骤(1)中，所述小鼠模型为SPF级BALB/c小鼠。
5.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：步骤(2)中，所述DMEM1640培养基中还加入1％青链霉素。
6.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：步骤(2)中，待贴壁生长的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系细胞密度达到70-80％时开始传代培养。
7.根据权利要求6所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述传代培养的具体方法为：弃掉培养液，用无菌PBS液漂洗后，以0.25％胰蛋白酶溶液于室温消化，当细胞变圆后，加入含有10％FBS的DMEM1640培养液将细胞吹散制备为单细胞悬液，然后将细胞悬液移至培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
8.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的冻存方法为：将处于对数生长期的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞用0.25％的胰蛋白酶溶液于室温消化为单细胞，离心获得细胞沉淀，缓慢加入细胞冻存液，于4℃放置1h，-20℃放置2h，-80℃放置过夜，次日在液氮中保存。
9.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述细胞冻存液由DMEM1640培养基、胎牛血清和二甲基亚砜组成，DMEM-1640：胎牛血清：二甲基亚砜的体积比＝6:3:1。
10.根据权利要求2所述的小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，其特征在于：所述小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞的复苏方法为：将冻存的细胞放置于37℃水浴锅中水浴融化，离心，获得细胞沉淀，加入含有10％FBS的DMEM-1640培养基置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每48h更换一次培养液。
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