CN108472379B - 减少聚山梨酯降解的制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供制备这种制剂的方法和使用这种制剂的方法。本发明还提供减少聚山梨酯降解的方法，减少含水制剂中可见和亚可见颗粒的量的方法，以及解聚聚山梨酯降解产物的方法，所述方法包括将环糊精添加至包含聚山梨酯和多肽的制剂中。本发明还提供含水制剂，其包含多肽、聚山梨酯和具有减少的聚山梨酯降解的环糊精。

Description

减少聚山梨酯降解的制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年12月30日提交的第62/272,965号美国临时申请的权益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及包含环糊精和聚山梨酯的含水药物制剂以及用于减少聚山梨酯降解和用于解聚和增溶聚山梨酯降解产物的方法。
背景技术
药物制剂通常含有聚山梨酯20和80(PS20和PS80)，其是由亲水性聚氧乙烯头部基团和疏水性脂肪酸尾部组成的非离子表面活性剂。向制剂中添加表面活性剂可保护蛋白免受表面诱导的变性和聚集(Geisen,Diabetologia 27:212-218(1984)；Wang,Int.J.Pharm.289:1-30(2005))。在药物物质(DS)和药物产品(DP)加工、长期储存、运输和给药期间可发生蛋白质聚集(Cromwell等,AAPS J.8:E572-E579(2006))。已经表明，添加表面活性剂(例如PS20)可使过滤(Maa等,J.Pharm.Sci.87:808-812(1998)；Maa等,Biotechnol.Bioeng.50:319-328(1996))、搅动(Liu等,J.Pharm.Sci.102:2460-2470(2013))、冻-融(Kreilgaard等,J.Pharm.Sci.87:1597-1603(1998)；Hillgren等,Int.J.Pharm.237:57-69(2002))、冻干(Carpenter,Protein Sci.13:54-54(2004)；Carpenter等,Pharm.Res.14:969-975(1997))、重构(Webb等,J.Pharm.Sci.91:543-558(2002))、给药(Kumru等,J.Pharm.Sci.101:3636-3650(2012))和储存期间可向蛋白质施加应力的界面相互作用最小化。
为了确保活性药物成分(API)在加工、长期储存和给药期间的稳定性，防止聚山梨酯降解是重要的。然而，PS20易于通过水解和氧化途径降解(Kumru,等,J.Pharm.Sci.101:3636-3650(2012)；Mahler等,Abstr Pap Am Chem S.239:(2010))。
聚山梨酯的氧化降解已被充分表征，并且已被广泛研究(Kerwin,J.Pharm.Sci.97:2924-2935(2008)；Kishore等,J.Pharm.Sci.100:721-731(2011))。氧化通常发生在两种机理的情况下(1)环氧乙烷基团的自氧化和(2)不饱和位点处的自由基氧化(Kishore等,J.Pharm.Sci.100:721-731(2011))。尽管已经观察到聚山梨酯的氧化降解，但已经显示通过与抗氧化剂(例如甲硫氨酸)共配制可减轻蛋白质制剂中的PS20氧化。含有色氨酸的制剂也已经开发出来以防止氨基酸残基的氧化(US2014/0322203；US2014/0314)。氧化性和水解性聚山梨酯降解途径可通过独特的降解产物分布进行区分。水解性聚山梨酯降解主要产生脂肪酸并且氧化性聚山梨酯降解产生更多不同的降解产物，包括过氧化物、醛、酸、酮(keytone)、正构烷烃、脂肪酸酯及其它降解产物(Ravuri等,Pharm.Res.28:1194-1210(2011))。
之前已经描述了使用降解PS20的2,2'-偶氮二异丁酰脒(AAPH)进行氧化性聚山梨酯降解的应力模型(Borisov等,J.Pharm.Sci.104:1005-1018(2015))。使用类似的方法，可使用代表性应力模型来开发在相关条件下减少氧化性聚山梨酯降解的制剂。
之前已经描述了使用纯化的酯酶(例如猪肝酯酶等)和脂肪酶(例如tweenase等)进行水解的应力模型(Labrenz,J.Pharm..Sci.103L2268-2277(2014))。使用类似的方法，可使用代表性应力模型来开发在相关条件下减少催化性聚山梨酯降解的制剂。
最近，已经报道单克隆抗体(mAb)制剂中聚山梨酯的酶促降解。例如，Labrenz将在CHO衍生的mAb制剂中观察到的聚山梨酯80(PS80)降解归因于特定的酶促机制，而不是基于PS20降解分布的普通生物水解机理(Labrenz等,J.Pharm.Sci.103:2268-2277(2014))。CHO细胞基因组的测序鉴定了能够降解聚山梨酯的各种宿主细胞蛋白(HCP)(例如脂肪酶)(S.Hammond等,Biotech.Bioeng.109:1353-1356(2012))。随后，Lee等人已经表明，相对于对照样品，减少特定HCP的表达显著降低了PS80的水解。这些最近的发现证实，与生物制剂生产相关的脂肪酶在上游过程中表达。下游纯化过程(例如蛋白A)能够去除HCP；然而，已经表明，一些HCP可与具有相似性质的API分子共纯化，并因此在药物物质和药物产品中保留痕量(K.Lee,等,A Chinese Hamster Ovary Cell Host Cell Protein That Impacts PS-80Degradation.AccBio Conference(2015)。据推测，具有高活性的脂肪酶甚至可在检测不到的水平导致显著的聚山梨酯降解。目前有许多努力通过工程化改造脂肪酶表达减少的细胞并通过下游加工步骤(例如色谱法)从蛋白质药物中鉴定和去除脂肪酶。然而，PS20和PS80的酶促降解仍然是生物制药开发中的重大挑战，并且还没有报道鉴定用于减少水解或催化PS20降解的最佳制剂的重大努力。
聚山梨酯降解具有许多可能影响蛋白质药物制剂的稳定性和保质期的后果。聚山梨酯降解物包括难以溶解的脂肪酸，其可能导致在溶液中形成可见和亚可见的颗粒。PS20的损失也可能降低PS20对蛋白质制剂的保护作用。此外，一项尖峰研究(spiking study)表明，一些PS20相关降解物可影响蛋白质药物的稳定性；然而，在药学相关条件下没有观察到影响(Kishore等,Pharm.Res.28:1194-1210(2011)。
所需要的是一种减少聚山梨酯降解的方法，以便聚山梨酯对制剂(例如多肽)的保护作用随着时间而保持。这将得到在加工、长期储存和给药期间更稳定的多肽制剂，这又会延长多肽制剂的保质期并减少由降解和过期制剂引起的浪费。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入。
发明内容
本发明提供一种减少包含聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯降解的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1。在一些方面，本发明提供一种减少包含聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯降解的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1，其中所述制剂包含约0.005％-0.4％聚山梨酯。在一些方面，本发明提供一种减少包含聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯降解的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精至约0.01％-30％的浓度，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1，其中所述制剂包含约0.005％-0.4％聚山梨酯。在一些方面，本发明提供一种减少包含聚山梨酯的含水制剂中的亚可见颗粒(sub-visible particle)和可见颗粒(visible particle)的量的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1，其中所述制剂包含聚山梨酯和多肽。在一些方面，本发明提供了一种在含水制剂中解聚和增溶聚山梨酯降解产物的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1，其中所述制剂包含聚山梨酯和多肽。
在上述方面的一些实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯20或聚山梨酯80。在一些实施方案中，所述环糊精是HP-β环糊精、HP-γ环糊精或磺丁基醚β-环糊精。在一些实施方案中，所述制剂中聚山梨酯的浓度在约0.01％至0.4％的范围内。在一些实施方案中，所述制剂中聚山梨酯的浓度在约0.01％至0.1％的范围内。在一些实施方案中，所述制剂中聚山梨酯的浓度是约0.02％。在一些实施方案中，所述制剂中环糊精的浓度在约0.5-30％的范围内。在一些实施方案中，所述制剂中环糊精的浓度是约15％。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，聚山梨酯降解被减少约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，每mL形成小于约1,000、约750、约500、约250、约150、约100、约50或约25个直径大于约2微米的聚山梨酯颗粒。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述制剂包含多肽。在一些实施方案中，所述多肽是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述制剂中的多肽浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述制剂在约2℃至约8℃稳定至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月或至少约24个月。在一些实施方案中，所述制剂在约1℃至约10℃稳定至少约48个月。在一些实施方案中，所述制剂在约2℃至约8℃稳定至少约48个月。
在一些实施方案中，所述制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，所述制剂具有约4.5至约6.0的pH。在一些实施方案中，所述制剂具有约6.0的pH。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述制剂还包含一种或多种选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，所述制剂是适于给予受试者的药物制剂。在一些实施方案中，所述制剂是适于静脉内、皮下、肌肉内或玻璃体内给予受试者的药物制剂。
在一些方面，本发明提供一种包含多肽、聚山梨酯和环糊精的含水制剂，其中所述制剂已经在约1℃至约10℃储存至少约6个月，其中环糊精与聚山梨酯的初始w/w比是至少约37.5:1，并且其中所述制剂中聚山梨酯的量是所述制剂中聚山梨酯的初始量的至少约80％。在一些方面，本发明提供一种包含多肽、聚山梨酯和环糊精的含水制剂，其中所述制剂已经在约1℃至约10℃储存至少约6个月，其中制剂中的环糊精与聚山梨酯的w/w比是至少约37.5:1，并且其中小于约1％的聚山梨酯已降解。
在以上方面的一些实施方案中，所述环糊精是HP-β环糊精、HP-γ环糊精或磺丁基醚β-环糊精。在一些实施方案中，所述制剂中聚山梨酯的浓度在约0.01％至0.4％的范围内。在一些实施方案中，所述制剂中聚山梨酯的浓度在约0.01％至0.1％的范围内。在一些实施方案中，所述制剂中聚山梨酯的浓度是约0.02％。在一些实施方案中，所述制剂中环糊精的浓度在约0.5-30％的范围内。在一些实施方案中，所述制剂中环糊精的浓度是约15％。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，聚山梨酯降解被减少约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，每mL形成小于约1,000、约750、约500、约250、约150、约100、约50或约25个直径大于约2微米的聚山梨酯颗粒。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述制剂在约2℃至约8℃稳定至少约6个月。在一些实施方案中，所述制剂在约1℃至约10℃稳定至少约48个月。在一些实施方案中，所述制剂在约2℃至约8℃稳定至少约48个月。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述制剂还包含多肽。在一些实施方案中，所述多肽是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述制剂中的多肽浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述制剂具有约4.5至约7.0的pH。在一些实施方案中，所述制剂具有约4.5至约6.0的pH。在一些实施方案中，所述制剂具有约6.0的pH。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述制剂还包含一种或多种选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和张度剂的赋形剂。在一些实施方案中，所述制剂是适于给予受试者的药物制剂。在一些实施方案中，所述制剂是适于静脉内、皮下、肌肉内或玻璃体内给予受试者的药物制剂。
附图说明
图1示出在40℃用不含赋形剂(对照)、含有15％(w/v)蔗糖和15％(w/v)HP-β-CD的5mM AAPH氧化24小时的样品通过RP-ELSD确定的平均(n＝3)相对百分数。
图2示出在含有0.02％(w/v)PS20与0和15％(w/v)HP-β-CD的无蛋白质样品中使用南极假丝酵母脂肪酶B(黑色)、脂蛋白脂肪酶(灰色)和兔肝酯酶(白色)消化的样品通过RP-ELSD确定的PS20的平均(n＝3)相对百分数。
图3A-3D示出对于在含有0.02％(w/v)PS20与0和15％(w/v)HP-β-CD的无蛋白质样品中使用南极假丝酵母脂肪酶B(黑色)、脂蛋白脂肪酶(灰色)和兔肝酯酶(白色)消化的样品，通过HIAC确定的平均(n＝3)≥2μM(图3A)、≥5μM(图3B)、≥10μM(图3C)和≥25μM(图3D)颗粒计数/毫升。
图4示出在室温使用含有0和15％(w/v)HP-β-CD的15μg/mL PPL消化5小时的含有0.02％(w/v)PS80的无蛋白样品通过RP-ELSD确定的PS80的平均(n＝3)相对百分数。
图5A-5F示出对于在室温使用含有0.02％(w/v)PS80与0和15％(w/v)HP-β-CD的15μg/mL PPL消化5小时的样品，平均(n＝3)(图5A)≥1.4μM、(图5B)≥2μM、(图5C)≥5μM、(图5D)≥10μM、(图5E)≥15μM和(图5F)≥25μM亚可见颗粒计数/毫升。
图6示出对于在室温在含有15％(w/v)蔗糖(圆圈)、HP-α-CD(菱形)和HP-β-CD(三角形)的无蛋白样品中用15μg/mL PPL酶消化的样品，通过RP-ELSD确定的PS20的平均(n＝3)相对百分数(作为时间的函数)。
图7示出对于在室温在含有0.02％(w/v)PS20及不含有赋形剂(对照)、含有15％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甲硫氨酸、15％(w/v)PEG 1500、15％(w/v)PVP、15％(w/v)HP-α-CD、15％(w/v)HP-β-CD、15％(w/v)SBE-β-CD和15％(w/v)HP-γ-CD的无蛋白质样品中使用15μg/mL PPL酶消化4.5小时的样品，通过RP-ELSD确定的PS20的平均(n＝3)相对百分数。
图8A-8D示出对于在室温在含有0.02％(w/v)PS20及不含有赋形剂(对照)、含有15％(w/v)蔗糖、1％(w/v)甲硫氨酸、15％(w/v)PEG 1500、15％(w/v)PVP、15％(w/v)HP-α-CD、15％(w/v)HP-β-CD、15％(w/v)SBE-β-CD和15％(w/v)HP-γ-CD的无蛋白质样品中使用15μg/mL PPL酶消化4.5小时的样品，通过RP-ELSD确定的平均(n＝3)≥2μM(图8A)、≥5μM(图8B)、≥10μM(图8C)和≥25μM(图8D)颗粒计数/毫升。
图9示出对于在含有0.02(w/v)PS20及不含有赋形剂(对照)、含有15％(w/v)SBE-β-CD、15％(w/v)HP-α-CD、15％(w/v)HP-β-CD、15％(w/v)HP-γ-CD和15％(w/v)蔗糖的无蛋白质样品中使用南极假丝酵母脂肪酶B消化的样品，通过RP-ELSD确定的PS20的平均(n＝3)相对百分数。
图10A和10B示出对于添加各种赋形剂(HP-α-CD、HP-β-CD、HP-γ-CD、SBE-β-CD、PVP、PEG 1500、蔗糖和甲硫氨酸)后样品，通过HIAC确定的平均(n＝3)(图10A)≥2μM和(图10B)≥5μM颗粒计数/毫升，以评价作为酶促PS-20降解的结果产生的现有颗粒的再增溶。
图11A和11B示出含有在室温在添加15％(w/v)HP-β-CD之前(图11A)和之后(图11B)使用15μg/mL PPL酶进行酶消化产生的PS20-相关颗粒的小瓶。添加15％(w/v)HP-β-CD之后，没有可见的颗粒。
图12A-12F示出在含有0.02％(w/v)PS20在5℃储存27个月的无蛋白样品中，通过HIAC确定平均(n＝3)(图12A)≥1.4μM、(图12B)≥2μM、(图12C)≥5μM、(图12D)≥10μM、(图12E)≥15μM和(图12F)≥25μM亚可见颗粒计数/毫升。
图13示出对于在室温在含有0.02％(w/v)PS20和不同量的HP-β-CD的无蛋白质样品中使用15μg/mL PPL酶消化4.5小时的样品，通过RP-ELSD确定的PS20平均(n＝3)相对百分数。数据使用S形模型拟合。
图14A-14D示出对于在室温在不含赋形剂(对照)、含有0、0.5、5和15％(w/v)HP-β-CD的无蛋白质样品中使用15μg/mL PPL酶消化4.5小时的含有(图14A)0.005％、(图14B)0.02％、(图14C)0.1％和(图14D)0.4％PS20的样品，通过RP-ELSD确定的PS20平均(n＝3)相对百分数。
图15A-15C示出板条形图(panel bar plot)，其显示对于在室温在含有0.02％PS20及0、0.1、0.5、5和15％(w/v)HP-β-CD的无蛋白质样品中使用15μg/mL PPL酶消化4.5小时的样品，通过HIAC确定的平均(n＝3)(图15A)≥2μM、(图15B)≥5μM、(图15C)≥10μM颗粒计数/毫升。
图16示出对于在室温在含有不同HP-β-CD:PS20比的无蛋白质样品中使用15μg/mLPPL酶消化4.5小时的样品，，通过RP-ELSD确定的PS20的平均(n＝3)相对百分数。数据使用S形模型拟合。
图17A-17D示出对于在室温使用含有0、5和15％(w/v)HP-β-CD的15μg/mL PPL酶消化4.5小时的(图17A)对照、(图17B)单克隆抗体(mAb)、(图17C)双特异性抗体(BsAb)和(图17D)单Fab抗体(sFAb)样品，通过RP-ELSD确定的PS20的相对百分数。
具体实施方式
本发明涉及通过向制剂中添加环糊精减少包含聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯降解的方法，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1。本发明还提供在水溶液中减少亚可见颗粒和可见颗粒的量的方法以及解聚和增溶包含聚山梨酯的聚山梨酯降解产物的方法，所述方法包括向溶液中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的比大于约37.5:1。本发明还提供包含聚山梨酯和环糊精的稳定的含水制剂，其中所述制剂中环糊精与聚山梨酯的w/w比是至少约37.5:1。在一些实施方案中，所述制剂还包含多肽。
I.定义
术语“药物制剂”是指这样一种制剂，其形式使得活性成分的生物活性是有效的，并且不含对制剂将要给予的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。这种制剂是无菌的。
“无菌”制剂是经消毒的或不含或基本上不含所有活微生物及其孢子。
“稳定的”制剂是其中的蛋白质经储存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。优选地，制剂经储存后基本上保持其物理和化学稳定性以及其生物学活性。稳定的制剂经储存后也可保持其聚山梨酯的含量。储存期通常基于制剂的预期保质期选择。各种用于测量蛋白质稳定性的分析技术可本领域中获得并且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)and Jones,Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。稳定性可在选定的曝光量和/或温度在选定的时间段内测量。可以各种不同方式定性和/或定量评价稳定性，包括聚集体形成的评价(例如使用尺寸排阻色谱法，通过测量浊度和/或通过目视检查)；ROS形成的评价(例如通过使用轻度应力测定或2,2'-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)应力测定)；蛋白质的特定氨基酸残基的氧化(例如单克隆抗体的Trp残基和/或Met残基)；通过使用阳离子交换色谱，图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原和完整抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评价蛋白质的生物学活性或靶结合功能(例如抗体的抗原结合功能)；等等。不稳定性可涉及以下任意一种或多种：聚集、脱酰胺(例如Asn脱酰胺)、氧化(例如Met氧化和/或Trp氧化)、异构化(例如Asp异构化)、剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、未配对的半胱氨酸、N-末端延伸、C-末端加工、糖基化差异等。
如果蛋白质经目视检查颜色和/或澄清度，或者通过UV光散射或通过尺寸排阻色谱测量，显示没有或非常少的聚集、沉淀和/或变性的迹象，则蛋白质在药物制剂中“保持其物理稳定性”。
如果在给定时间的化学稳定性使蛋白质被认为仍然保留其如下定义的生物学活性，则蛋白质在药物制剂中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可通过检测和定量蛋白质的化学变化形式来评估。化学变化可能涉及蛋白质氧化，例如可使用胰蛋白酶肽作图、反相高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC/MS)来评价。例如，其他类型的化学变化包括可通过离子交换色谱或icIEF评价的蛋白质的电荷改变。
如果蛋白质在给定时间的生物活性在制备药物制剂时表现出的生物活性的约10％以内(在测定的误差内)，则蛋白质在药物制剂中“保持其生物活性”，如例如在单克隆抗体的抗原结合测定中所确定的。
本文使用的蛋白质的“生物活性”是指蛋白质结合其靶标的能力，例如单克隆抗体结合抗原的能力。它可进一步包括可在体外或体内测量的生物响应。这种活性可以是拮抗性或激动性的。
“易于氧化”的蛋白质是包含一个或多个已发现易于氧化的残基的蛋白质，例如但不限于甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)。例如，单克隆抗体的Fab部分中的色氨酸氨基酸或单克隆抗体的Fc部分中的甲硫氨酸氨基酸可能易于氧化。
“等渗”是指感兴趣的制剂具有与人血基本相同的渗透压。等渗制剂通常具有约250至350mOsm的渗透压。例如，可使用蒸气压或冰冻式渗压计来测量等张性。
本文使用的“缓冲液”是指通过其酸-碱缀合物组分的作用抵抗pH变化的缓冲溶液。本发明的缓冲液优选具有约4.5至约8.0的pH。例如，组氨酸乙酸盐是将控制此范围内的pH的缓冲剂的实例。
“防腐剂”是可任选地包含在制剂中以基本上减少其中的细菌作用，因此例如便于制备多用途制剂的化合物。潜在的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵(其中烷基为长链化合物的烷基苄基二甲基氯化铵的混合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇(诸如苯酚)、丁醇和苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。在一个实施方案中，本文中的防腐剂是苯甲醇。
本文使用的“表面活性剂”是指表面活性试剂，优选非离子表面活性剂。本文中的表面活性剂的实例包括聚山梨酯(例如，聚山梨酯20和聚山梨酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)；聚乙二醇、聚丙二醇，以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)；等等
本文使用的“药学上可接受的”赋形剂或载体包括本领域公知的药学上可接受的载体、稳定剂、缓冲剂、酸、碱、糖、防腐剂、表面活性剂、张度剂等等(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,22nd Ed.,Pharmaceutical Press,2012)。药学上可接受的赋形剂的实例包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸、L-色氨酸和甲硫氨酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；金属络合物，诸如Zn-蛋白质络合物；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨酯、泊洛沙姆、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。“药学上可接受的”赋形剂或载体是可合理给予受试者以提供有效剂量的所用活性成分并且在所用剂量和浓度对受试者无毒的那些赋形剂或载体。
本文使用的术语“聚山梨酯”(也缩写为PS)是指用脂肪酸酯化的PEG化的脱水山梨糖醇，包括聚山梨酯20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)，聚山梨酯40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)，聚山梨酯60(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)和聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。
术语“环糊精”是指包含与α-(1,4)糖苷键连接的d-吡喃葡萄糖单元以环样结构结合的葡萄糖分子的化合物家族。示例性的环糊精包括2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD或HP-β-环糊精)、2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD或HP-α-环糊精)、2-羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD或HP-γ-环糊精)、β-环糊精(β-CD或β-环糊精)，磺丁基醚β-环糊精(SBE-β-CD或SBE-β-环糊精)，α-环糊精(α-CD或α-环糊精)和γ-环糊精(γ-CD或γ-环糊精)。环糊精的同义词包括Cavitron、环状低聚糖、cycloamulose和环葡聚糖。
术语“张度剂”是指用于调整或维持溶液相对浓度的试剂。优选的张度剂包括多元糖醇，优选三元或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、***糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
术语“稳定剂”是指稳定大量带电生物分子诸如蛋白质和抗体的试剂。当与大量带电生物分子一起使用时，张度剂也可用作稳定剂。
“减少的聚山梨酯降解”是指在相似的储存条件下，与对照相比，在一段时间之后更多的聚山梨酯保留在样品中的条件。例如，与在相同时间段之后剩余50％聚山梨酯的对照样品相比，在一段时间后具有95％聚山梨酯的样品显示减少的聚山梨酯降解。
本文使用的术语“解聚”是指由聚山梨酯降解引起的可见和/或亚可见颗粒的减少。例如，如果可见和/或亚可见颗粒的量在添加含有聚山梨酯的溶液中时降低，则试剂在解聚聚山梨酯降解产物时是有效的。
术语“增溶/溶解”是指将固体溶解在液体中。例如，如果在该试剂存在下化合物更容易溶解，则该试剂有效地溶解化合物。
术语“w/w比”是指一种溶质以质量计的量除以另一种溶质以质量计的量。例如，含有100mg环糊精和1mg聚山梨酯的溶液具有100:1的环糊精与聚山梨酯的w/w比。根据一个实施方案，环糊精与聚山梨酯的w/w比大于约37.5:1。
“含水制剂”是指适于给药的水基液体制剂。所述制剂可含有治疗剂，诸如抗体或小分子，并且优选是无菌的。含水制剂还可含有缓冲剂、稳定剂、张度剂和赋形剂。
配制的蛋白质优选是基本上纯并且理想地是基本上均质(例如不含污染蛋白质等)。“基本上纯的”蛋白质是指包含基于组合物总重量的至少约90重量％的蛋白质(例如单克隆抗体)，优选至少约95重量％。“基本上均质的”蛋白质是指包含基于组合物总重量的至少约99重量％的蛋白质(例如单克隆抗体)的组合物。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，它可包含修饰的氨基酸，并且它可被非氨基酸中断。这些术语还包括已被天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它程序或修饰，诸如与标记组分缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的蛋白质。包含在本文定义内的蛋白质的实例包括哺乳动物蛋白质，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；***；胰高血糖素；瘦素；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrand因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；肿瘤坏死因子受体，诸如死亡受体5和CD120；TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)；B细胞成熟抗原(BCMA)；B淋巴细胞刺激因子(BLyS)；增殖诱导配体(APRIL)；脑啡肽；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted))；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；缪勒管(Muellerian)抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠***相关肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血管内皮生长因子家族蛋白(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和P1GF)；血小板衍生的生长因子(PDGF)家族蛋白(例如，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其二聚体)；成纤维细胞生长因子(FGF)家族，诸如aFGF、bFGF、FGF4和FGF9；表皮生长因子(EGF)；激素或生长因子的受体，诸如VEGF受体(例如VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)、表皮生长因子(EGF)受体(例如ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4受体)、血小板衍生的生长因子(PDGF)受体(例如PDGFR-α和PDGFR-β)和成纤维细胞生长因子受体；TIE配体(血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受体，诸如TIE1和TIE2；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，诸如NGF-b；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，***结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；***；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；趋化因子，诸如CXCL12和CXCR4；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；细胞因子，诸如白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；中期因子；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰减加速因子；病毒抗原，诸如艾滋病包膜的部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肝配蛋白；Bv8；Delta样配体4(DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；卵泡抑素；肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)；ALK1；Robo4；ESM1；串珠素(Perlecan)；EGF样结构域，多个7(EGFL7)；CTGF及其家族成员；血小板反应蛋白，诸如血小板反应蛋白1和血小板反应蛋白2；胶原，诸如胶原IV和胶原XVIII；神经纤维蛋白，诸如NRP1和NRP2；多效蛋白(Pleiotrophin,PTN)；颗粒蛋白前体(Progranulin)；增殖蛋白(Proliferin)；Notch蛋白，诸如Notch1和Notch4；信号素，诸如Sema3A、Sema3C和Sema3F；肿瘤相关抗原，诸如CA125(卵巢癌抗原)；免疫粘附素；以及任何以上列出的蛋白质的片段和/或变体以及与一种或多种蛋白质(包括例如任何上述蛋白质)结合的抗体(包括抗体片段)。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性即可。
“分离的”蛋白质(例如分离的抗体)是已经从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的蛋白质。其天然环境中的污染物组分是会干扰蛋白质的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质溶质。由于蛋白质天然环境的至少一种组分不会存在，分离的蛋白质在重组细胞内包含原位蛋白质。然而，通常，分离的蛋白质将通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量不同。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链的一端有一个可变结构域(VL)，并且在另一端具有一个恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
术语“恒定结构域”是指相对于免疫球蛋白的其他部分(包含抗原结合位点的可变结构域)具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可称为“VH”。轻链的可变结构域可称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变部分并且含有抗原结合位点。
术语“可变”是指这样的事实，即可变结构域的某些部分在抗体间的序列中广泛不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性不是均匀分布在整个抗体的可变结构域中。它集中在三个称为高变区(HVR)的区段或轻链和重链可变结构域两者中。在一些实施方案中，HVR是互补决定区(CDR)。
可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大部分采用β-折叠构型，由三个HVR连接，其形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的HVR通过FR区紧靠在一起，并与来自另一条链的HVR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应器功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以归入两种明显不同的类型中的一种，称为卡帕(“κ”)和兰布达(“λ”)。
本文使用的术语IgG“同种型”或“亚类”是指由其恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何亚类。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类别。有五种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、β、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的，并且通常描述于例如Abbas等Cellular and Mol.Immunology,4th ed.,W.B.Saunders,Co.(2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，是指其基本上完整形式的抗体，而不是如下定义的抗体片段。这些术语特别指具有包含Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点和残余的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。Fab片段含有重链和轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对Fab'的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。其他抗体片段的化学偶联也是已知的。
“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv物种由紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物种中，一个重链和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可在“二聚体”结构中缔合，类似于双链Fv物种中的那些。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个HVR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个HVR共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个HVR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述，参见例如Pluckthün,in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含在相同多肽链(VH-VL)中连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以致不能在同一链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一个链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体更全面地述于例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体还述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，例如，除了可能以少量存在的突变(例如天然存在的突变)之外，包含所述群的单个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，此类单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的过程获得。例如，选择过程可以是从多个克隆(诸如杂交瘤克隆库、噬菌体克隆库或重组DNA克隆库)中选择独特克隆。应该理解，可进一步改变选定的靶结合序列，例如以改善对靶的亲和力，使靶标结合序列人源化，改善其在细胞培养物中的产生，降低其体内免疫原性，产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常未被其他免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如Kohler and Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling等,in:MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas pp.563-681 Elsevier,N.Y.(1981))，重组DNA方法(参见例如第4,816,567号美国专利)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)，以及在具有部分或全部动物人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生产人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immunol.7:33(1993)；第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016号美国专利；Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；和Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
本文中的单克隆抗体具体包括其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的“嵌合”抗体，以及此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(参见例如，第4,816,567号美国专利；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括
Figure BDA0001711997490000181
抗体，其中抗体的抗原结合区源自通过例如用感兴趣的抗原免疫猕猴产生的抗体。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体HVR的残基被来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有所需特异性、亲和力和/或能力的HVR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个，通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及第6,982,321和7,087,409号美国专利。
“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或使用本文公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的该定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是述于Cole等,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991).See also van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)中的方法。通过将抗原施用于转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已经被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源性基因座已经失效，例如免疫的异种小鼠(参见例如关于XENOMOUSETM技术的第6,075,181和6,150,584号美国专利)。另见例如关于通过人B细胞杂交瘤技术产生人抗体的Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指序列高变和/或形成结构上限定的环的抗体可变结构域的区域。通常，抗体包含六个HVR；VH(H1、H2、H3)中的三个，VL(L1、L2、L3)中的三个。在天然抗体中，H3和L3表现出6种HVR中最多样化，并且据信H3特别是在赋予针对抗体的良好特异性方面发挥独特作用。参见，例如，Xu等,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson and Wu,in Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,N.J.,2003)。实际上，由重链组成的天然存在的骆驼科动物(camelid)抗体仅在没有轻链的情况下是功能性和稳定的。参见例如Hamers-Casterman等,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
许多HVR描述正在使用中，并包含在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性并且是最常用的(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbMHVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触式(contact)”HVR基于对可用复杂晶体结构的分析。这些HVR中的每一个的残基如下所述。
Figure BDA0001711997490000191
HVR可包含如下的“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基根据Kabat等(同上)编号。
“框架”或“FR”残基是除了本文所定义的HVR残基以外的那些可变结构域残基。
术语“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化形式是指用于Kabat等(同上)编辑抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号***。使用该编号***，实际的线性氨基酸序列可含有更少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或***至可变结构域的FR或HVR。例如，重链可变结构域可包含H2的残基52之后的单个氨基酸***物(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82之后***的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域处比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号
当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号***(例如，Kabat等,Sequences of Immunological Interest.5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时(例如Kabat等(同上)报道的EU索引)，通常使用“EU编号***”或“EU索引”。“Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
表述“线性抗体”是指Zapata等(Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995))中所描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fc区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
多克隆抗体优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而在动物中产生。将相关抗原(特别是当使用合成肽时)缀合至在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质可能是有用的。例如，使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐，SOCl2或R1N═C═NR，其中R和R1是不同的烷基，可将抗原与匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂缀合。
术语“多特异性抗体”以最广泛的含义使用并且具体涵盖包含具有多表位特异性的抗原结合结构域的抗体(即，能够特异性结合一个生物分子上的两个或更多个不同表位，或者能够特异性结合两种或更多种不同生物分子上的表位)。在一些实施方案中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原结合结构域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元特异性结合第一表位并且第二VH/VL单元特异性结合第二表位，其中每个VH/VL单元包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。这样的多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体、抗体片段(诸如Fab、Fv、dsFv、scFv)、双抗体、双特异性双抗体和三抗体、已经共价或非共价连接的抗体片段。还包含重链恒定区的至少一部分和/或轻链恒定区的至少一部分的VH/VL单元也可以被称为“半聚体(hemimer)”或“半抗体”。在一些实施方案中，半抗体包含单个重链可变区的至少一部分和单个轻链可变区的至少一部分。在一些这样的实施方案中，包含两种半抗体并结合两种抗原的双特异性抗体包含结合第一抗原或第一表位但不结合第二抗原或第二表位的第一半抗体和结合第二抗原或第二表位但不结合第一抗原或第一表位的第二半抗体。根据一些实施方案，多特异性抗体是以5M至0.001pM，3M至0.001pM，1M至0.001pM，0.5M至0.001pM或0.1M至0.001pM的亲和力与每种抗原或表位结合的IgG抗体。在一些实施方案中，半聚体包含重链可变区的足够部分，以允许与第二半聚体形成分子内二硫键。在一些实施方案中，半聚体包含杵突变(knobmutation)或臼突变(hole mutation)，例如以允许与包含互补臼突变或杵突变的第二半聚体或半抗体异源二聚化。下面将进一步讨论杵突变和臼突变。
“双特异性抗体”是包含抗原结合结构域的多特异性抗体，所述抗原结合结构域能够特异性结合一个生物分子上的两个不同表位，或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特异性抗体在本文中也可被称为具有“双重特异性”或是“双重特异性的”。除非另有说明，否则双特异性抗体名称中列出的双特异性抗体所结合的抗原的顺序是任意的。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两种半抗体，其中每种半抗体包含单一重链可变区和任选至少一部分重链恒定区，以及单一轻链可变区和任选至少一部分轻链恒定区。在某些实施方案中，双特异性抗体包含两种半抗体，其中每种半抗体包含单一重链可变区和单一轻链可变区，并且不包含多于一个单一重链可变区并且不包含多于一个单一轻链可变区。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两种半抗体，其中每种半抗体包含单一重链可变区和单一轻链可变区，并且其中第一半抗体结合第一抗原而不结合第二抗原，并且第二半抗体结合第二抗原而不结合第一抗原。
本文使用的术语“杵臼结构(knob-into-hole)”或“KnH”技术是指体外或体内通过在它们相互作用的界面上将突起(杵)引入一个多肽中并且将空腔(臼)引入另一多肽中将两种多肽配对在一起的技术。例如，KnH已被引入抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或抗体的VH/VL界面(参见例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431，和Zhu等,1997,Protein Science 6:781-788)。在一些实施方案中，在制造多特异性抗体期间，KnH驱动两种不同重链的配对。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体还可包含与每个Fc区连接的单个可变结构域，或者还包含与相似或不同的轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。KnH技术也可用于将两个不同的受体细胞外结构域或任何其他包含不同靶标识别序列(例如，包括亲和体、肽体和其他Fc融合体)的多肽序列配对。
本文使用的术语“杵突变”是指在其中多肽与另一多肽相互作用的界面处将突起(杵)引入所述多肽中的突变。在一些实施方案中，另一多肽具有臼突变(参见例如US 5,731,168、US 5,807,706、US 5,821,333、US 7,695,936、US 8,216,805，各自通过引用整体并入本文)。
本文使用的术语“臼突变”是指在其中多肽与另一多肽相互作用的界面处将空腔(臼)引入所述多肽中的突变。在一些实施方案中，其他多肽具有杵突变(参见例如US 5,731,168、US 5,807,706、US 5,821,333、US 7,695,936、US 8,216,805，各自通过引用整体并入本文)。
本文使用的术语“约”是指由本领域普通技术人员确定的相应值的可接受误差范围，其将部分取决于如何测量或确定该值，即测量***的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可表示在1个标准偏差内或多于1个标准偏差。本文提及“约”值或参数包括并描述针对该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代物，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“一种化合物”任选包括两种或更多种这样的化合物的组合等。
II.制剂和制备
本发明涉及减少包含聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯降解的方法，所述方法包括向制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1。在一些实施方案中，本发明提供一种在包含聚山梨酯的水溶液中减少亚可见颗粒和可见颗粒的量的方法，所述方法包括将向溶液中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1。在一些实施方案中，本发明提供一种在含水制剂中解聚和增溶聚山梨酯降解产物的方法，所述方法包括向制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1。在一些实施方案中，所述环糊精是HP-β环糊精、HP-γ环糊精或磺丁基醚β-环糊精。在一些实施方案中，所述环糊精是HP-α环糊精。在一些实施方案中，所述制剂还包含多肽。
在一些实施方案中，所述方法包括向制剂中添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其中所得的PVP与聚山梨酯的w/w比大于约37.5:1。在一些实施方案中，本发明提供一种在包含聚山梨酯的水溶液中减少亚可见颗粒和可见颗粒的量的方法，所述方法包括向溶液中添加PVP，其中所得的PVP与聚山梨酯的w/w比大于约37.5:1。在一些实施方案中，本发明提供一种在含水制剂中解聚和增溶聚山梨酯降解产物的方法，所述方法包括向制剂中添加PVP，其中所得的PVP与聚山梨酯的w/w比大于约37.5:1。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含聚山梨酯和环糊精的含水制剂，其中在约1℃至约10℃储存至少约6个月至至少约48个月后，少于1％的聚山梨酯被降解，其中制剂中环糊精与聚山梨酯的w/w比是至少约37.5:1。在一些实施方案中，本发明提供包含聚山梨酯和PVP的含水制剂，其中在约1℃至约10℃储存至少约6个月至至少约48个月后，少于1％的聚山梨酯被降解，其中制剂中PVP与聚山梨酯的w/w比是至少约37.5:1。在一些实施方案中，所述制剂在约2℃至约8℃稳定至少约6个月至至少约48个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，或至少约48个月。在一些实施方案中，所述制剂包含约0.005％-0.4％聚山梨酯。在一些实施方案中，所述制剂包含约0.005％-0.4％聚山梨酯，并且所述环糊精被添加至所述制剂中至约0.01％-30％的浓度。在一些实施方案中，所述环糊精是HP-β环糊精、HP-γ环糊精或磺丁基醚β-环糊精。在一些实施方案中，所述环糊精是HP-α环糊精。在一些实施方案中，聚山梨酯降解被减少约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在进一步的实施方案中，每mL形成小于约1,000、约750、约500、约250、约150、约100、约50或约25个直径大于约2微米的聚山梨酯颗粒。在一些实施方案中，所述制剂还包含多肽。在一些实施方案中，蛋白质浓度是约1mg/mL至约250mg/mL。在一些实施方案中，蛋白质浓度大于约250mg/mL。在一些实施方案中，所述制剂具有约4.5至约7.0或约4.5至约6.0，或约6.0的pH。在一些实施方案中，所述制剂还包含一种或多种稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和张度剂。在进一步的实施方案中，所述制剂适合于静脉内、皮下、肌肉内或玻璃体内给予受试者。在一些实施方案中，所述多肽是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述制剂还包含小分子、核酸、脂质和/或碳水化合物。
制剂中的蛋白质和抗体可使用本领域已知的方法制备。本文提供了用于制备抗体(例如，全长抗体、抗体片段和多特异性抗体)的非限制性示例性方法。使用本领域可获得的用于产生抗体的技术制备含水制剂中的抗体，其示例性方法在以下部分中更详细地描述。本领域技术人员可调整本文的方法用于制备包含其他蛋白质诸如基于肽的抑制剂的制剂。对于通常用于生产治疗性蛋白质的公认和常用技术和程序，参见Sam Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)；Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,等eds.(2003)；Short Protocols in Molecular Biology,Ausubel等,eds.,J.Wiley and Sons(2002)；Horswill等,Current Protocols in Protein Science,(2006)；Antibodies,A Laboratory Manual,Harlow and Lane,eds.(1988)；R.I.Freshney,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique andSpecialized Application,6th ed.,J.Wiley and Sons(2010)，其通过引用整体并入本文。
A.抗体制备
本文提供的含水制剂中的抗体针对感兴趣的抗原。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且向患有病症的哺乳动物给予抗体可导致所述哺乳动物的治疗益处。然而，也考虑针对非多肽抗原的抗体。
当抗原是多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体诸如生长因子。示例性抗原包括分子诸如血管内皮生长因子(VEGF)；CD20；ox-LDL；ox-ApoB100；肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；***；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX，组织因子和von Willebrand因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠***相关肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神经生长因子诸如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)，***结合蛋白；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；***；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰减加速因子；病毒抗原，诸如AIDS包膜的部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如HER2、HER3或HER4受体；以及任何以上列出的多肽的片段。
(i)抗原制备
任选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段可用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，诸如受体，可使用这些的片段(例如受体的胞外域)作为免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。这样的细胞可源自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是已通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其他抗原及其形式对于本领域技术人员来说是显而易见的。
(ii)某些基于抗体的方法
多克隆抗体优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而在动物中产生。使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐，SOCl2或R1N═C═NR，其中R和R1是不同的烷基，可用于将相关抗原与待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂缀合。
通过将例如100μg或5μg的蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合并且在多个部位皮内注射该溶液来针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物使动物免疫。一个月后，通过在多个部位皮下注射，用1/5至1/10初始量的弗氏完全佐剂中的肽或缀合物对动物进行加强。7至14天后，将动物放血并测定血清的抗体滴度。动物被加强直到滴度稳定状态(titer plateau)。优选地，动物用相同抗原的缀合物但缀合至不同的蛋白质和/或通过不同的交联剂加强。缀合物也可作为蛋白质融合物在重组细胞培养物中制备。而且，聚合剂诸如明矾适合用于增强免疫应答。
本发明的单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备，其由Kohler等,Nature,256:495(1975)首次描述，并进一步述于例如Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nded.1988)；Hammerling等,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981),and Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(关于人-人杂交瘤)。另外的方法包括例如关于从杂交瘤细胞系产生单克隆人天然IgM抗体的第7,189,826号美国专利。人类杂交瘤技术(Trioma技术)述于Vollmers and Brandlein,Histologyand Histopathology,20(3):927-937(2005)and Vollmers and Brandlein,Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
对于各种其他杂交瘤技术，参见例如US 2006/258841；US 2006/183887(完全人抗体)，US 2006/059575；US 2005/287149；US 2005/100546；US 2005/026229；及第7,078,492和7,153,507号美国专利。如下描述使用杂交瘤方法产生单克隆抗体的示例性方案。在一个实施方案中，使小鼠或其他适当的宿主动物诸如仓鼠免疫，以引发产生或能够产生将与用于免疫接种的蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射本发明多肽或其片段以及佐剂诸如单磷酰脂质A(MPL)/海藻糖二霉菌酸酯(TDM)(RibiImmunochem.Research,Inc.,Hamilton,Mont.)在动物中产生抗体。本发明的多肽(例如抗原)或其片段可使用本领域公知的方法制备，诸如重组方法，其中一些在本文中进一步描述。测定来自免疫动物的血清用于抗-抗原抗体，并任选给予加强免疫。分离产生抗-抗原抗体的来自动物的淋巴细胞。或者，可在体外使淋巴细胞免疫。
然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。参见例如Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103Academic Press,(1986)。可使用有效融合的骨髓瘤细胞，支持所选抗体产生细胞稳定的高水平抗体生产，并对诸如HAT培养基等培养基敏感。示例性骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤细胞系，诸如得自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤以及得自American Type Culture Collection,Rockville,Md.USA的SP-2或X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于生产人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63MarcelDekker,Inc.,New York(1987)。
将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，例如含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的培养基。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，该物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。优选地，使用无血清杂交瘤细胞培养方法来减少动物源性血清诸如胎牛血清的使用，例如述于Even等,Trends inBiotechnology,24(3),105-108(2006)。
作为用于改善杂交瘤细胞培养物生产力的工具的寡肽述于Franek,Trends inMonoclonal Antibody Research,111-122(2005)。具体而言，标准培养基富含某些氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)或蛋白质水解产物部分，并且细胞凋亡可通过由3-6个氨基酸残基构成的合成寡肽显著抑制。肽以毫摩尔浓度或更高的浓度存在。
可测定其中杂交瘤细胞生长的培养基以产生结合本发明抗体的单克隆抗体。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来确定。例如，通过斯Scatchard分析可确定单克隆抗体的结合亲和力。参见例如Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)。
在鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序将克隆物亚克隆并通过标准方法生长。参见例如Goding(同上)。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物体内以腹水肿瘤的形式生长。通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱将亚克隆物分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水或血清中分离。一种从杂交瘤细胞中分离蛋白质的程序描述于US 2005/176122和第6,919,436号美国专利中。所述方法包括在结合过程中使用最小量的盐诸如感胶离子盐，并且优选在洗脱过程中也使用少量的有机溶剂。
(iii)某些文库筛选方法
本发明的抗体可通过使用组合文库来筛选具有所需活性的抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选具有所需结合特征的抗体的文库。这种方法通常述于Hoogenboom等in Methods in Molecular Biology 178:1-37,O’Brien等,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,(2001)。例如，一种产生感兴趣抗体的方法是通过使用如Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-93(2004)中所描述的噬菌体展示文库。
原则上，通过筛选含有展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体克隆。通过针对所需抗原的亲和色谱来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附到抗原上，从而与文库中的非结合克隆分离。然后从抗原上洗脱结合克隆，并且可通过另外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗体可如下获得：设计合适的抗原筛选程序来选择感兴趣的噬菌体克隆，随后使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗体克隆，述于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIHPublication 1-3:91-3242,Bethesda Md.(1991)。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合结构域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，每个来自轻链(VL)和重链(VH)，两者都存在三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变结构域可功能性地展示在噬菌体上，作为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短的柔性肽，或者作为Fab片段共价连接，其中它们各自与恒定结构域融合并且非共价地相互作用，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。本文使用的编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
可通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的组库(repertoire)，并在噬菌体文库中随机重组，然后其可如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述针对抗原结合克隆进行搜索。来自免疫源的文库提供对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述，可克隆未受攻击的组库以向广泛的非自身和自身抗原提供单一来源的人抗体而无需任何免疫。最后，还可如下合成制备未受攻击的文库：克隆来自干细胞的未重排V基因片段并使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，如Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。
在某些实施方案中，丝状噬菌体用于通过与次要外壳蛋白pIII融合来展示抗体片段。抗体片段可展示为单链Fv片段，其中VH和VL结构域通过柔性多肽间隔物连接在相同的多肽链上，例如，如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者作为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，在那里组装Fab-外壳蛋白结构，所述Fab-外壳蛋白结构通过置换一些野生型外壳蛋白展示在噬菌体表面上，如Hoogenboom等,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)。
通常，编码抗体基因片段的核酸获自从人或动物收获的免疫细胞。如果需要倾向于抗-抗原克隆的文库，则将受试者用抗原免疫以产生抗体应答，并且回收脾细胞和/或循环B细胞其他外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个实施方案中，通过在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(并且缺乏功能性内源性抗体生产***)的转基因小鼠中产生抗-抗原抗体应答来获得偏向于抗-抗原克隆的人抗体基因片段文库，使得抗原免疫产生B细胞产生针对抗原的人抗体。下面描述产生人抗体的转基因小鼠。
抗-抗原反应性细胞群的额外富集可如下获得：使用合适的筛选程序来分离表达抗原特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用抗原亲和色谱的细胞分离或将细胞吸附到荧光染料标记的抗原，然后进行流式活化细胞分选(FACS)。
或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其他PBL的使用提供可能的抗体组库的更好的代表性，并且还允许使用任何动物(人或非人)物种构建抗体文库，其中所述抗原不是抗原性的。对于掺入体外抗体基因构建的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。感兴趣的免疫细胞可获自多种动物物种，诸如人、小鼠、大鼠、兔形目(lagomorpha)、狼(luprine)、犬科动物(canine)、猫科动物(feline)、猪(porcine)、牛科动物(bovine)、马科动物(equine)和鸟类(avian)物种等。
从感兴趣的细胞中回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并进行扩增。在重排的VH和VL基因文库的情况下，所需DNA可如下获得：从淋巴细胞中分离基因组DNA或mRNA，然后通过聚合酶链式反应(PCR)，使用与重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物，如Orlandi等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)所述，由此制备用于表达的不同V基因组库。可从cDNA和基因组DNA扩增V基因，其中具有在编码成熟V结构域的外显子的5'末端处的回引物，以及基于J区段内的正向引物，如Orlandi等(1989)和Ward等,Nature,341:544-546(1989)中所述。然而，为了从cDNA扩增，反向引物也可基于前导外显子，如Jones等,Biotechnol.,9:88-89(1991)中所述，以及在恒定区内的正向引物，如Sastry等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)中所述。为了最大化互补性，可将简并性引入引物中，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)中所述。在某些实施方案中，文库多样性通过以下方式最大化：使用靶向每个V基因家族的PCR引物以扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可用的VH和VL排列，例如，如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的方法中所述或如Orum等,Nucleic Acids Res.,21:4491-4498(1993)的方法中所述。为了将扩增的DNA克隆到表达载体中，可在PCR引物内在一端引入稀有限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)中所述，或通过用带标签引物的进一步PCR扩增，如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)中所述。
合成重排的V基因的组库可从V基因区段体外获得。已经克隆和测序了大多数人VH-基因区段(在Tomlinson等,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)中报道)，并绘图(在Matsuda等,Nature Genet.,3:88-94(1993)中报道)；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构象)可用于产生不同的VH基因组库，其中PCR引物编码不同序列和长度的H3环，如在Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。VH组库也可用集中在单一长度的长H3环中的全部序列多样性制备，如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)中所述。已经克隆并测序了人Vκ和Vλ区段(在Williams and Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993)中报道)并且可用于制备合成性轻链组库。基于一系列VH和VL折叠以及L3和H3长度，合成性V基因组库将编码具有相当结构多样性的抗体。在扩增编码V基因的DNA之后，可根据Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法体外重排种系V基因区段。
抗体片段的组库可通过以若干方式将VH和VL基因组库组合在一起构建。可在不同的载体中产生各种组库，并且载体在体外重组，例如如Hogrefe等,Gene,128:119-126(1993)中所述，或通过组合感染体内重组，例如Waterhouse等,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中所述的loxP***。体内重组方法利用Fab片段的双链特性来克服由大肠杆菌转化效率强加的文库大小的限制。未受攻击的VH和VL库分开克隆，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过噬菌体感染含噬菌粒的细菌将这两个文库组合起来，使得每个细胞含有不同的组合，并且文库大小仅由存在的细胞数量限制(约1012个克隆)。两种载体均含有体内重组信号，使得VH和VL基因重组到单个复制子上并共包装入噬菌体病毒体。这些巨大的文库提供大量不同亲和力的抗体(Kd -1约为10-8M)。
或者，可将所有组库依序克隆到相同的载体中，例如，如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)中所述，或者通过PCR装配在一起，然后克隆，例如，如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)中所述。PCR装配也可用于将VH和VLDNA与编码柔性肽间隔基的DNA连接以形成单链Fv(scFv)组库。在另一种技术中，“细胞PCR装配”用于通过PCR将淋巴细胞内的VH和VL基因组合，然后克隆所连接基因的组库，如Embleton等,Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)中所述。
未受攻击的文库(天然或合成的)产生的抗体可具有中等亲和力(Kd -1是约106至107M-1)，但亲和力成熟也可通过从第二文库构建和重新选择进行体外模拟，如Winter等(1994)(同上)中所述。例如，通过使用Hawkins等,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法或Gram等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:3576-3580(1992)的方法中的易错聚合酶(在Leung等,Technique 1:11-15(1989)中报道)，可体外随机引入突变。此外，亲和力成熟可如下进行：随机突变一个或多个CDR，例如，在选定的个体Fv克隆中使用具有携带感兴趣的CDR的随机序列生成的引物的PCR，并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754(1996年3月14日公开)描述了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区诱导诱变以产生轻链基因文库的方法。另一种有效的方法是将通过噬菌体展示选择的VH或VL结构域与获自未免疫供体的天然存在的V结构域变体的组库重组，并在几轮链式转换(chain reshuffling)中筛选更高的亲和力，如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述。该技术允许产生亲和力是约10-9M或更低的抗体和抗体片段。
文库的筛选可通过本领域已知的各种技术来完成。例如，可使用抗原包覆吸附板的孔，在附着于吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选，或者与生物素结合以用链霉亲和素包覆的珠粒捕获，或者用于淘选噬菌体展示文库的任何其他方法。
使噬菌体文库样品在适合于用吸附剂结合至少一部分噬菌体颗粒的条件下与固定的抗原接触。通常，选择包括pH、离子强度、温度等在内的条件以模拟生理条件。洗涤结合于固相的噬菌体，然后用酸(例如，如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,88:7978-7982(1991)中所述)，或用碱(例如，如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所述)洗脱，或通过抗原竞争(例如，以类似于Clackson等,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争方法的程序)进行。噬菌体在单轮选择中可富集20-1,000倍。而且，富集的噬菌体可在细菌培养物中生长并进行更多轮选择。
选择效率取决于许多因素，包括洗涤过程中解离的动力学，以及单个噬菌体上的多个抗体片段是否可同时与抗原结合。具有快速解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可通过使用短洗涤、多价噬菌体展示和固相中高抗原包覆密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用来稳定噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体重新结合。通过使用长洗涤和单价噬菌体展示(如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690中所述)和低包覆密度的抗原(如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述)可促进具有慢解离动力学(和良好结合亲和力)的抗体的选择。
有可能在不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，即使亲和力略有不同，对于抗原也是如此。然而，选择的抗体的随机突变(例如，如在一些亲和力成熟技术中进行的)可能会产生许多突变体，大多数与抗原结合，并且少数具有较高的亲和力。在限制性抗原的情况下，稀有的高亲和力噬菌体可能会被淘汰出局。为了保留所有更高亲和力的突变体，可将噬菌体与过量的生物素化抗原温育，但与生物素化抗原一起以比抗原的目标摩尔浓度亲和力常数更低的摩尔浓度的浓度温育。然后可通过链霉亲和素包覆的顺磁珠粒捕获高亲和力结合噬菌体。这种“平衡捕获”允许根据它们的结合亲和力来选择抗体，其灵敏度允许从具有尽可能少至两倍高亲和力的大量过量噬菌体中分离突变克隆。用于洗涤结合到固相的噬菌体的条件也可***纵以基于解离动力学进行区分。
可根据活性选择抗原克隆。在某些实施方案中，本发明提供抗-抗原抗体，其结合天然表达抗原或与自由浮动抗原或与其他细胞结构连接的抗原结合的活细胞。对应于这种抗-抗原抗体的Fv克隆可如下选择：(1)如上所述从噬菌体文库中分离抗-抗原克隆，并且任选地通过在合适的细菌宿主中培养群体来扩增分离的噬菌体克隆群体；(2)需要针对阻断和非阻断活性分别选择抗原和第二蛋白；(3)将抗-抗原噬菌体克隆吸附至固定化抗原；(4)使用过量的第二蛋白洗脱任何不需要的克隆，所述克隆识别与第二蛋白的结合决定簇重叠或共享的抗原结合决定簇；和(5)洗脱步骤(4)后仍保持吸附的克隆。任选地，通过一次或多次重复本文所述的选择程序，可进一步富集具有期望的阻断/非阻断性质的克隆。
使用常规程序(例如通过使用设计为特异性扩增来自杂交瘤或噬菌体DNA模板的感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)，可容易地分离和测序编码本发明的杂交瘤衍生的单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，获得重组宿主细胞中所需单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256(1993)and Pluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。
编码本发明Fv克隆的DNA可与编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如，合适的DNA序列可获自Kabat等(同上))组合以形成编码全长或部分长度重链和/或轻链的克隆。应该理解，任何同种型的恒定区可用于该目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这样的恒定区可从任何人或动物物种获得。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变结构域DNA，然后与另一种动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合(hybrid)”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用的“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，源自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长度人重链和/或轻链的编码序列。
编码衍生自本发明杂交瘤的抗-抗原抗体的DNA也可被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如，如在Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)的方法中)。编码源自杂交瘤或Fv克隆的抗体或片段的DNA可通过共价连接至免疫球蛋白编码序列、全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列进一步修饰。以此方式，制备具有本发明的源自Fv克隆或杂交瘤克隆的抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
(iv)人源化抗体和人抗体
用于人源化非人抗体的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体具有从非人源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可基本上按照Winter及其同事的方法(Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988))进行，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(第4,816,567号美国专利)，其中基本上少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的轻链和重链人可变结构域的选择对降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合(best-fit)”方法，针对已知人可变结构域序列的完整文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受与啮齿动物最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一种方法使用衍生自轻或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等,J.Immunol.,151:2623(1993))。
进一步重要的是，将抗体人源化并保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现该目标，根据该方法的一个实施方案，人源化抗体通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备。三维免疫球蛋白模型通常可用并且对于本领域技术人员来说是熟悉的。计算机程序可用于说明和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可从接受体和输入序列中选择并组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，诸如对(一种或多种)靶标抗原增加的亲和力。通常，高变区残基直接且最实质地涉及影响抗原结合。
如上所述，可通过将选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列与已知的人恒定结构域序列组合来构建本发明的人抗体。或者，可通过杂交瘤方法制备本发明的人单克隆抗体。用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已由例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,pp.51-63(1987)；andBoerner等,J.Immunol.,147:86(1991)描述。
有可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫时能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生完整的人抗体组库。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。人种系免疫球蛋白基因阵列在这种种系突变小鼠中的转移将导致抗原攻击时产生人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等,Year in Immuno.,7:33(1993)；和Duchosal等Nature 355:258(1992)。
基因改组(Gene shuffling)也可用于从非人(例如啮齿动物)抗体衍生人抗体，其中人抗体对起始非人抗体具有相似的亲和力和特异性。根据也被称为“表位印记”的这种方法，通过本文所述的噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链或轻链可变区被人V结构域基因的组库替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合体的群体。用抗原选择导致分离非人链/人链嵌合scFv或Fab，其中人链恢复了在原代噬菌体展示克隆中去除相应的非人链后被破坏的抗原结合位点，即表位支配(印记)人链配对物的选择。当重复该过程以取代剩余的非人链时，获得人抗体(参见1993年4月1日公开的PCT WO 93/06213)。与通过CDR植入的传统非人抗体的人源化不同，该技术提供完全人抗体，其不具有非人来源的FR或CDR残基。
(v)抗体片段
可通过传统手段诸如酶消化或通过重组技术产生抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而不是整个抗体具有优势。片段的较小尺寸允许快速清除，并且可能导致改善对实体肿瘤的访问。有关某些抗体片段的综述，请参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。
已经开发了多种用于生产抗体片段的技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化而得到(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；和Brennan等,Science,229:81(1985))。然而，这些片段现在可直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和从大肠杆菌中分泌，从而可容易地产生大量这些片段。可从上面讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段述于第5,869,046号美国专利。产生抗体片段的其它技术对于熟练技术人员将显而易见。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；第5,571,894和5,587,458号美国专利。Fv和scFv是仅有的具有完整结合位点而没有恒定区的物种；因此，它们可能适合在体内使用期间降低的非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以在scFv的氨基或羧基末端产生效应物蛋白的融合。参见Antibody Engineering,ed.Borrebaeck(同上)。该抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如第5,641,870号美国专利中所述。这种线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体对至少两种不同的表位具有结合特异性，其中表位通常来自不同的抗原。尽管此类分子通常仅结合两个不同的表位(即双特异性抗体，BsAbs)，但当在本文中使用时，具有额外特异性的抗体诸如三特异性抗体被包括在此表达中。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤进行的正确分子的纯化非常麻烦，并且产物收率低。类似的程序述于WO 93/08829和Traunecker等,EMBO J.,10:3655-3659(1991)。
根据不同的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。该融合优选与免疫球蛋白重链恒定结构域一起，其包含至少部分铰链区、CH2和CH3区。典型地，第一重链恒定区(CH1)含有存在于至少一种融合物中的轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物以及必要时的免疫球蛋白轻链的DNA***分开的表达载体中，并共转染至合适的宿主有机体中。当在构建中使用的三条多肽链的不等比率提供最佳产量时，这在实施方案中为调节三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相同比率表达产生高产量时或者当比率没有特别意义时，可将两条或全部三条多肽链的编码序列***一个表达载体中。
在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构有助于将所需双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白链组合中分离，因为在双特异性分子的仅一半中存在免疫球蛋白轻链提供了便利的分离方式。该方法在WO 94/04690中公开。关于产生双特异性抗体的更多细节，参见例如Suresh等,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
根据WO96/27011中描述的另一种方法，可工程化改造一对抗体分子之间的界面以最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。一个界面包含抗体恒定结构域的CH 3结构域的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似尺寸的互补“空腔”。这提供增加异二聚体相对于其他不需要的终产物诸如同二聚体的产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可与亲和素偶联，另一种与生物素偶联。例如，已经提出这样的抗体，其使免疫***细胞靶向不需要的细胞(第4,676,980号美国专利)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂在本领域中是公知的，并且公开于第4,676,980号美国专利，以及一些交联技术。
文献中也描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，双特异性抗体可使用化学连接来制备。Brennan等,Science,229:81(1985)描述了一种操作，其中完整抗体被蛋白水解切割以产生F(ab’)2片段。这些片段在二硫醇络合剂***存在下被还原以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物之一再转化为Fab'-硫醇，并与等摩尔量的其他Fab'-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定剂。
最近的进展促进了从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，其可化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每个Fab'片段分别从大肠杆菌中分泌出来并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。
还描述了直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区被还原形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。该方法也可用于生产抗体同二聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术已提供了制备双特异性抗体片段的可选机制。片段包含通过接头连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)，所述接头太短以致于不能在相同链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al,J.Immunol,152:5368(1994)。
预期具有多于两种价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tuft等,J.Immunol.147:60(1991)。
(vii)单结构域抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体是单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的单一多肽链。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；参见例如第6,248,516号美国专利)。在一个实施方案中，单结构域抗体由抗体的全部或部分重链可变结构域组成。
(viii)抗体变体
在一些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当的变化引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这样的修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或***和/或取代。任何缺失、***和取代的组合都可以达到最终构建物，只要最终构建物具有所需的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入主题抗体氨基酸序列中。
(ix)抗体衍生物
本发明的抗体可进一步修饰以含有本领域已知且容易获得的其他非蛋白质性质部分。在某些实施方案中，适合衍生抗体的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以是分支或不分支的。连接到抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果连接多于一种聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑来确定，所述考虑包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否将用于限定条件下的治疗等。
(x)载体、宿主细胞、重组方法
抗体也可使用重组方法产生。为了重组产生抗-抗原抗体，分离编码抗体的核酸并将其***可复制载体中用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，可容易地分离和测序编码抗体的DNA。许多载体都可用。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(a)信号序列组分
本发明的抗体不仅可直接重组产生，而且可与具有异源多肽的融合多肽重组产生，所述异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特异性切割位点的其他多肽。优选选择的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(例如被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核生物信号序列取代。对于酵母分泌，天然信号序列可被例如酵母转化酶前导序列、因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)α-因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列，白色假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列或WO 90/13646中所述的信号序列取代。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号序列。
(b)复制起点
表达载体和克隆载体均含有使载体能够在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，该序列是使载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。这样的序列对于各种细菌、酵母和病毒是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适用于酵母，各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(SV40起点通常可使用仅因为它含有早期启动子)。
(c)选择基因组分
表达和克隆载体可含有选择基因，也称为选择标志物。典型的选择基因编码这样的蛋白质：(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物阻止宿主细胞的生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生赋予耐药性的蛋白质，从而在选择方案中存活。这种显性选择的实例使用药物新霉素、麦考酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适选择标志物的另一实例是能够鉴定有能力摄取编码抗体的核酸的细胞，诸如DHFR、谷氨酰胺合成酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂氨甲喋呤(Mtx)的培养基中培养转化体来鉴定用DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因与任何其他共转化的核酸一起被扩增。可使用内源性DHFR活性缺陷的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，通过在含有GS抑制剂L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)的培养基中培养转化体来鉴定用GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其他共转化的核酸一起被扩增。GS选择/扩增***可与上述DHFR选择/扩增***组合使用。
或者，用编码感兴趣抗体、野生型DHFR基因和另一选择标志物诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)可通过在含有用于选择标志物的选择剂(诸如氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中进行细胞生长来选择。参见第4,965,199号美国专利。
适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等,Nature,282:39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母的突变株提供选择标志物，例如ATCC No.44076或PEP4-1。Jones,Genetics,85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中trp1病变的存在则为检测在色氨酸不存在下的生长检测转化提供了有效的环境。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)由携带Leu2基因的已知质粒补充。
另外，来源于1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于克鲁维酵母(Kluyveromycesyeast)的转化。或者，报道了乳酸克鲁维酵母(K.lactis)的大规模生产重组小牛凝乳酶的表达***。Van den Berg,Bio/Technology,8:135(1990)。也公开了用克鲁维酵母的工业菌株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等,Bio/Technology,9:968-975(1991)。
(d)启动子组分
表达和克隆载体通常含有被宿主有机体识别并与编码抗体的核酸可操作连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子***、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子***和杂交启动子诸如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子是合适的。用于细菌***的启动子也将包含与编码抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
启动子序列对于真核生物是已知的。实际上，所有真核基因都具有位于转录起始位点上游大约25至30个碱基处的富含AT的区域。在许多基因的转录开始的上游70至80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'末端是AATAAA序列，其可以是用于在编码序列的3'末端添加polyA尾部的信号。所有这些序列适合***真核表达载体中。
适用于酵母宿主的启动子序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶)的启动子。
其他酵母启动子(其为具有由生长条件控制的转录的额外优点的诱导型启动子)是以下酶的启动子区域：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。EP 73,657中进一步描述了用于酵母表达的合适载体和启动子。酵母增强子也有利地与酵母启动子一起使用。
例如，可通过获自病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒，乙型肝炎病毒，猿猴病毒40(SV40))的基因组或获自异源哺乳动物启动子(例如来自热休克启动子的肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，条件是这种启动子与宿主细胞***相容)的启动子来控制哺乳动物宿主细胞中载体的抗体转录。
SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为也含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子可方便地作为HindIII E限制性片段获得。在第4,419,446号美国专利中公开了使用牛***瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的***。该***的一种改进述于第4,601,978号美国专利。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人β-干扰素cDNA，还参见Reyes等,Nature297:598-601(1982)。或者，Rous肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。
(e)增强子元件组分
高等真核生物对编码本发明抗体的DNA的转录常常通过将增强子序列***载体而增加。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点晚期侧的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。关于促进真核生物启动子活化的元件，参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可在抗体编码序列的5'或3'位置剪接到载体中，但优选位于启动子的5'位点。
(f)转录终止子组分
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞有机体的有核细胞)中使用的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的未翻译部分转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
(g)宿主细胞的选择和转化
用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是上述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于该目的的合适原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺菌属(Shigella)，以及杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例是说明性的而非限制性的。
可在细菌中产生全长抗体、抗体融合蛋白和抗体片段，特别是当不需要糖基化和Fc效应物功能时，诸如当治疗性抗体与细胞毒剂(例如毒素)缀合时，其本身显示肿瘤细胞破坏的有效性。全长抗体在循环中具有更大的半衰期。大肠杆菌的生产速度更快，成本效益更高。为了在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如，第5,648,237号美国专利(Carter等)、第5,789,199号美国专利(Joly等)、第5,840,523号美国专利(Simmons等)，描述翻译起始区(TIR)和用于优化表达和分泌的信号序列。还参见Charlton,Methods in MolecularBiology,Vol.248,B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,pp.245-254(2003)，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，抗体可以从可溶级分的大肠杆菌细胞糊(cellpaste)中分离，并且可根据同种型通过例如蛋白A或G柱纯化。最终纯化可类似于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法进行。
除原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和***克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论使用酵母和丝状真菌来生产治疗性蛋白质的综述，参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。
可选择某些真菌和酵母菌株，其中糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见，例如，Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)(描述了巴斯德毕赤酵母中糖基化途径的人源化)；和Gerngross等(同上)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞还衍生自多细胞有机体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
还可利用棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、浮萍(Leninaceae)，苜蓿(M.truncatula)和烟草的植物细胞培养物作为宿主。参见例如第5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429号美国专利(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞可用作宿主，并且培养物(组织培养物)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或为了在悬浮培养物中生长而亚克隆的293细胞，Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1,ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCCCCL 51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,248:255-268(2003)。
用上述用于抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在适当诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。
(h)培养宿主细胞
可在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。市售培养基诸如HamF10(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)；第4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469号美国专利；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
(xi)抗体的纯化
当使用重组技术时，抗体可在细胞内、在周质空间中产生，或者直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤除去微粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简言之，在约30分钟内，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下融化细胞糊。细胞碎片可通过离心去除。在抗体分泌到培养基中的情况下，通常首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自这种表达***的上清液。蛋白酶抑制剂诸如PMSF可包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并可包含抗生素以防止外来污染物的生长。
从细胞制备的抗体组合物可使用例如羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱进行纯化，其中亲和色谱是典型的优选纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。推荐蛋白G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所连接的基质通常是琼脂糖，但其他基质也是可用的。机械稳定的基质诸如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖实现的更快的流速和更短的加工时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。用于蛋白质纯化的其他技术诸如在离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上进行肝素SEPHAROSETM色谱分析、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀还取决于待回收的抗体。
通常，制备用于研究、测试和临床的抗体的各种方法学在本领域中是公认的，与上述方法学一致和/或本领域技术人员认为对于特定感兴趣抗体合适。
B.选择生物活性抗体
如上所述产生的抗体可进行一种或多种“生物活性”测定以从治疗角度选择具有有益特性的抗体。可筛选抗体与针对其所产生的抗原结合的能力。例如，对于抗-DR5抗体(例如，drozitumab)，可在检测结合死亡受体5(DR5)的能力的测定中评价抗体的抗原结合特性。
在另一个实施方案中，抗体的亲和力可通过例如饱和结合；ELISA；和/或竞争测定(例如RIA)来确定。
此外，可对抗体进行其他生物学活性测定，例如为了评价其作为治疗剂的有效性。这种测定是本领域已知的并取决于苯并抗原和抗体的预期用途。
为了筛选与感兴趣抗原上的特定表位结合的抗体，可进行例如Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的常规交叉阻断测定。或者，表位作图，例如，如Champe等,J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)，以确定抗体是否结合感兴趣的表位。
C.制剂的制备
本文提供包含聚山梨酯和具有减少聚山梨酯降解的环糊精的制剂。在一些实施方案中，所述环糊精是2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD)，2-羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是β-环糊精(β-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是磺丁基醚β-环糊精(SBE-β-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是α-环糊精(α-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是γ-环糊精(γ-CD)。在一些实施方案中，所述制剂包含聚山梨酯和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)并具有减少的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，所述制剂还包含多肽。在一些实施方案中，所述聚山梨酯在约0.001％至约15％的范围内或这些值之间的任何范围内。在某些实施方案中，聚山梨酯的范围是约0.001％至约0.4％、0.01％至约0.4％、约0.01％至约0.3％、约0.01％至约0.2％、约0.01％至约0.1％。在一些实施方案中，所述制剂包含约0.001％、约0.005％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.4％、约1％、约5％或约15％的聚山梨酯。在一些实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯20。在一些实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯40。在一些实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯60。在一些实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯80。
在一些实施方案中，聚烷基吡咯烷酮是由单体N-乙烯基吡咯烷酮制成的一类聚合物分子。在一些实施方案中，所述聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是聚维酮(可溶性PVP)。在一些实施方案中，所述PVP是聚维酮K12(近似MW：2.5kDa)。在一些实施方案中，所述PVP是聚维酮K15(近似MW：8kDa)。在一些实施方案中，所述PVP是聚维酮K17(近似MW：10kDa)。在一些实施方案中，所述PVP是聚维酮K25(近似MW：30kDa)。在一些实施方案中，所述PVP是聚维酮K30(近似MW：50kDa)。在一些实施方案中，所述PVP是聚维酮K60(近似MW：400kDa)。在一些实施方案中，所述PVP是聚维酮K90(近似MW：1,000kDa)。在一些实施方案中，所述PVP是聚维酮K120(3,000kDa)。在一些实施方案中，所述PVP是交聚维酮(不溶性PVP)。在一些实施方案中，所述PVP是共聚维酮。
在一些实施方案中，所述环糊精在约0.5％至约30％的范围内。在一些实施方案中，所述环糊精在约1％至约25％，或约5％至约20％，或约10％至约15％的范围内。在进一步的实施方案中，所述环糊精的浓度是约0.5％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％或约30％。在一些实施方案中，所述PVP在约0.5％至约30％的范围内。
在一些实施方案中，制剂中环糊精与聚山梨酯的w/w比大于约37.5:1。在一些实施方案中，制剂中环糊精与聚山梨酯的w/w比大于约50:1，大于约100:1，大于约150:1，大于约250:1，大于约750:1，大于约1000:1或大于约3000:1。在一些实施方案中，环糊精与聚山梨酯的w/w比不在67:1和1000:1之间。在一些实施方案中，制剂中PVP与聚山梨酯的w/w比大于约37.5:1。
在一些实施方案中，所述含水制剂包含浓度范围是约10mg/mL至约250mg/mL或这些值之间的任何范围的多肽。在一些实施方案中，所述多肽的浓度大于约250mg/mL。在一些实施方案中，所述多肽的浓度范围是约10mg/mL至250mg/mL，50mg/mL至250mg/mL，100mg/mL至250mg/mL，150mg/mL至250mg/mL，200mg/mL至250mg/mL，10mg/mL至200mg/mL，50mg/mL至200mg/mL，100mg/mL至200mg/mL，150mg/mL至200mg/mL，10mg/mL至150mg/mL，50mg/mL至150mg/mL，100mg/mL至150mg/mL，10mg/mL至100mg/mL，50mg/mL至100mg/mL，10mg/mL至50mg/mL或这些范围之间的任何范围。
在一些实施方案中，所述含水制剂包含抗体。在一些实施方案中，所述抗体针对血管内皮生长因子(VEGF)；CD20；ox-LDL；ox-ApoB100；肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；***；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX，组织因子和von Willebrand因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠***相关肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神经生长因子诸如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)，***结合蛋白；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；***；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰减加速因子；病毒抗原，诸如AIDS包膜的部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如HER2、HER3或HER4受体；以及任何以上列出的多肽的片段。在一些实施方案中，所述抗体不是抗-CD20抗体。在一些实施方案中，所述制剂不包含抗-CD20抗体和0.2％聚山梨酯(例如聚山梨酯80)。在一些实施方案中，所述制剂不包含10％HP-γ环糊精和0.03％聚山梨酯20。在一些实施方案中，所述制剂不包含抗-CD20抗体、10％HP-γ环糊精和0.03％聚山梨酯20。
在一些实施方案中，所述含水制剂还包含一种或多种选自稳定剂、缓冲剂，表面活性剂和张度剂的赋形剂。本发明的含水制剂可在pH缓冲溶液中制备。本发明的缓冲液具有在约pH 4.5至约9.0范围内的pH。在某些实施方案中，pH在约4.5至约7.0范围内，在约4.5至约6.5范围内，在约4.5至约6.0范围内，在约pH 4.5至约5.5范围内，在约pH 4.5至约5.0范围内，在约pH 5.0至约7.0的范围内，在约pH 5.5至约7.0范围内，在约pH 5.7至约6.8范围内，在约pH 5.8至约6.5的范围内，在约pH 5.9至约6.5的范围内，在约pH 6.0至约6.5的范围内或在约pH 6.2至约6.5的范围内。在某些实施方案中，所述液体制剂的pH在约4.7至约5.2范围内，在约5.0至6.0范围内或在约5.2至约5.8范围内。在本发明的某些实施方案中，所述液体制剂具有6.2或约6.2的pH。在本发明的某些实施方案中，所述液体制剂具有6.0或约6.0的pH。
控制pH在此范围内的缓冲剂的实例包括有机酸和无机酸及其盐。例如，乙酸盐(例如乙酸组氨酸、乙酸精氨酸、乙酸钠)，琥珀酸盐(例如组氨酸琥珀酸盐、精氨酸琥珀酸盐、琥珀酸钠)，葡糖酸盐，磷酸盐，富马酸盐，草酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐及其组合。缓冲剂浓度可从约1mM至约600mM，这取决于例如缓冲剂和制剂所需的等张性。
额外的表面活性剂可任选添加至含水制剂中。示例性表面活性剂包括非离子表面活性剂，诸如泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188等)。添加的表面活性剂的量使得其减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。例如，所述表面活性剂可以约0.001％至约0.5％、约0.005％至约0.2％、约0.01％至约0.1％、或约0.02％至约0.06％、或约0.03％至约0.05％的量存在于制剂中。在某些实施方案中，所述表面活性剂以0.04％或约0.04％的量存在于制剂中。在某些实施方案中，所述表面活性剂以0.02％或约0.02％的量存在于制剂中。在一个实施方案中，所述制剂不包含表面活性剂。
存在张度剂，有时称为“稳定剂”，以调节或维持组合物中液体的张力。当与大的带电生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因为它们可与带电荷的氨基酸侧链基团相互作用，从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其他成分的相对量，张度剂可以0.1重量％至25％，或更优选1重量％至5重量％的任何量存在。优选的张度剂包括多元糖醇，优选三元或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、***糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
在一些实施方案中，所述制剂用于体内给药。在一些实施方案中，配方是无菌的。所述制剂可通过无菌过滤膜过滤而变得无菌。本文的治疗制剂通常置于具有无菌入口的容器中，例如具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。给药途径根据已知和可接受的方法，诸如通过以合适的方式单次或多次推注或长时间输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注，局部给药，吸入或通过持续释放或缓释方式。
本发明提供的含水制剂包含多肽、聚山梨酯和环糊精并且在储存一段时间后表现出增强的聚山梨酯稳定性。在一个实施方案中，聚山梨酯稳定性表示为储存一段时间后制剂中残留的聚山梨酯的相对百分比。例如，如果最初含有0.1％聚山梨酯且在储存一段时间后含有0.09％聚山梨酯的制剂，则10％的聚山梨酯已被降解。在另一个实施方案中，通过使用蒸发光散射检测(RP-ELSD)的反相超高效液相色谱法(Kim,J&Qiu,J.2014,AnalyticaChimica Acta 806:144-151)确定溶液中聚山梨酯的量。在一些实施方案中，通过将样品结果与使用不同聚山梨酯浓度产生的标准曲线进行比较来确定样品中聚山梨酯的浓度。
在一些实施方案中，在制剂在约1℃至约10℃储存约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，少于5％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约2℃至约8℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，少于5％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约4℃至约6℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，少于5％的聚山梨酯已降解。
在一些实施方案中，在制剂在约1℃至约10℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，少于1％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约2℃至约8℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，少于1％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约4℃至约6℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，少于1％的聚山梨酯已降解。
在一些实施方案中，在制剂在约1℃至约10℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，少于0.1％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约2℃至约8℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，少于0.1％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约4℃至约6℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，少于0.1％的聚山梨酯已降解。
在一些实施方案中，在制剂在约22℃至约28℃储存至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约4个月，至少约5个月，至少约6个月，至少约7个月，至少约8个月，至少约9个月，至少约10个月，至少约11个月或至少约12个月后，少于5％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约22℃至约28℃储存至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约4个月，至少约5个月，至少约6个月，至少约7个月，至少约8个月，至少约9个月，至少约10个月，至少约11个月或至少约12个月后，少于1％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约22℃至约28℃储存至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约4个月，至少约5个月，至少约6个月，至少约7个月，至少约8个月，至少约9个月，至少约10个月，至少约11个月或至少约12个月后，少于0.1％的聚山梨酯已降解。
在一些实施方案中，在制剂在约-15℃至约-25℃储存至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月，至少约48个月，至少约54个月，至少约60个月，至少约66个月或至少约72个月后，少于5％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约-15℃至约-25℃储存至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月，至少约48个月，至少约54个月，至少约60个月，至少约66个月或至少约72个月后，少于1％的聚山梨酯已降解。在一些实施方案中，在制剂在约-15℃至约-25℃储存至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月，至少约48个月，至少约54个月，至少约60个月，至少约66个月或至少约72个月后，少于0.1％的聚山梨酯已降解。
在一些实施方案中，所述制剂储存在约-8℃至约-80℃。在一些实施方案中，所述制剂储存在约-20℃、-40℃、-70℃或-80℃。
本发明提供的制剂对于减少聚山梨酯降解产物诸如可见和亚可见颗粒是有效的。在一个实施方案中，通过将样品置于玻璃小瓶中并在丁达尔光存在下旋转样品来观察可见颗粒。在一个实施方案中，使用高精度(HIAC)粒子计数器分析亚可见颗粒。在一些实施方案中，可使用配备有HRDL-150检测器和1mL注射器的HIAC 9703颗粒计数器。在一些实施方案中，可在每次测量会话控制(session)前使用NIST可追踪的2μm聚苯乙烯珠粒标准品以3000计数/mL验证仪器的性能。在一些实施方案中，HIAC仪器可配置为10mL/min流速、0.1mL皮重体积和0.4mL样品体积。在特定实施方案中，可使用0.4mL小量(sip)的4次运行来分析样品，并且丢弃每个样品的第一轮运行以防止由于样品携带(carryover)引起的测量误差。2、5、10、15和25μm的过滤器尺寸可用于分析。
在一些实施方案中，所述制剂具有每mL小于约10,000、约5,000、约1,000、约500、约250、约150、约100、约50或约25个直径大于1.4μ的颗粒。在一些实施方案中，所述制剂具有每mL小于约10,000、约5,000、约1,000、约500、约250、约150、约100、约50或约25个直径大于2μ的颗粒。在一些实施方案中，所述制剂具有每mL小于约1250、约150、约100、约50、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个直径大于5μ的颗粒。在一些实施方案中，所述制剂具有每mL小于约250、约150、约100、约50、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个直径大于10μ的颗粒。在一些实施方案中，所述制剂具有每mL小于约250、约150、约100、约50、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个直径大于15μ的颗粒。在一些实施方案中，所述制剂具有每mL小于约250、约150、约100、约50、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个直径大于25μ的颗粒。
III.制剂的给药
根据已知的方法，诸如作为推注或通过在一段时间内连续输注的静脉内给药，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、玻璃体内、关节内、滑膜内、鞘内、眼部、口服、局部或吸入途径，将含水制剂给予需要用蛋白质(例如抗体)治疗的哺乳动物，优选人。在一个实施方案中，所述含水制剂通过静脉内给药给予哺乳动物。为了这种目的，例如可使用注射器或通过IV线来注射制剂。在一个实施方案中，通过皮下给药将液体制剂给予哺乳动物。
例如，蛋白质的合适剂量(“治疗有效量”)将取决于例如待治疗的病症，病症的严重程度和过程，为预防或治疗目的是否给予蛋白质，先前的疗法，患者的临床病史和对蛋白质的响应，所用蛋白质的类型以及主治医师的判断。蛋白质适当地一次或通过一系列治疗施用于患者，并且可在从诊断开始的任何时间给予患者。蛋白质可作为唯一的治疗或与用于治疗所述病症的其它药物或疗法联合给药。本文使用的术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施两者。需要治疗的患者包括已经患有该病症的患者以及需要预防该病症的患者。本文使用的“病症”是将从治疗受益的任何病症，包括但不限于慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患有所述病症的那些病理状况。
在药理学意义上，在本发明的上下文中，蛋白质(例如抗体)的“治疗有效量”是指有效预防或治疗病症(所述抗体对于病症的治疗有效)的量。作为一般建议，无论通过一次或多次给药，所给予的蛋白质的治疗有效量将在约0.1至约50mg/kg患者体重的范围内，其中所用蛋白质的典型范围为例如每日给药约0.3至约20mg/kg，优选约0.3至约15mg/kg。然而，其他剂量方案可能是有用的。例如，蛋白质可以每1、2、3或4周约100或400mg的剂量给药，或者以每1、2、3或4周约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、15.0或20.0mg/kg的剂量给药。剂量可以作为单剂量或作为多个剂量(例如2个或3个剂量)给药，诸如输注。该疗法的进展很容易通过常规技术进行监测。
IV.减少聚山梨酯降解的方法
本文提供减少含有聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯降解的方法，所述方法包括向制剂中添加环糊精。本文还提供减少含有聚山梨酯的水溶液中可见和亚可见颗粒的量的方法，所述方法包括向制剂中添加环糊精。本发明还包括在水溶液中解聚和增溶聚山梨酯降解产物的方法，所述方法包括向制剂中添加环糊精。在一些实施方案中，所述制剂还包含多肽、核酸、脂质和/或碳水化合物。
本文提供减少包含聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯的方法。本文还提供减少含有聚山梨酯的水溶液中的可见和亚可见颗粒的量的方法，所述方法包括向制剂中添加PVP。本发明还包括在水溶液中解聚和增溶聚山梨酯降解产物的方法，所述方法包括向制剂中添加PVP。在一些实施方案中，所述制剂还包含多肽、核酸、脂质和/或碳水化合物。
在一些实施方案中，所述聚山梨酯在约0.001％至约0.4％的范围内或这些值之间的任何范围内。在某些实施方案中，所述聚山梨酯在约0.001％至约0.4％，约0.01％至约0.4％，约0.01％至约0.3％，约0.01％至约0.2％的范围内或约0.01％至约0.1％的范围内。在一些实施方案中，所述制剂包含约0.001％、约0.005％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％或约0.4％的聚山梨酯。在一些实施方案中，是聚山梨酯是聚山梨酯20。在一些实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯40。在一些实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯60。在一些实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯80。
在一些实施方案中，将环糊精添加至约0.5％至约30％的浓度。在一些实施方案中，环糊精在约1％至约25％，约5％至约20％或约10％至约15％的范围内。在进一步的实施方案中，将环糊精添加至约0.5％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％或约30％的浓度。在一些实施方案中，将PVP添加至约0.5％至约30％的浓度。
在一些实施方案中，所述制剂不包含10％HP-γ环糊精和0.03％聚山梨酯20。在一些实施方案中，所述制剂不包含抗-CD20抗体、10％HP-γ环糊精和0.03％聚山梨酯20。
在一些实施方案中，制剂中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约37.5:1。在一些实施方案中，制剂中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于约50:1，大于约100:1，大于约150:1，大于约250:1，大于约750:1，大于约1000:1或大于约3000:1。在一些实施方案中，制剂中环糊精与聚山梨酯的w/w比不在67:1和1000:1之间。在一些实施方案中，制剂中所得的PVP与聚山梨酯的w/w比大于约37.5:1。在一些实施方案中，制剂中所得的PVP与聚山梨酯的比为250:1。
在一些实施方案中，所述环糊精是2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD)、2-羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是磺丁基醚β-环糊精(SBE-β-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是β-环糊精(β-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是α-环糊精(α-CD)。在一些实施方案中，所述环糊精是γ-环糊精(γ-CD)。
在一些实施方案中，所述含水制剂包含浓度在10mg/mL至250mg/mL范围内的多肽。在一些实施方案中，所述多肽的浓度高于250mg/mL。在一些实施方案中，所述多肽的浓度范围为30mg/mL至150mg/mL，50mg/mL至150mg/mL，或100至150mg/mL。
在一些实施方案中，所述含水制剂包含抗体。在一些实施方案中，所述抗体针对血管内皮生长因子(VEGF)；CD20；ox-LDL；ox-ApoB100；肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；***；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX，组织因子和von Willebrand因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠***相关肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神经生长因子诸如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)，***结合蛋白；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；***；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰减加速因子；病毒抗原，诸如AIDS包膜的部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如HER2、HER3或HER4受体；以及任何以上列出的多肽的片段。在一些实施方案中，所述抗体不是抗-CD20抗体。
在一些实施方案中，所述含水制剂还包含一种或多种选自稳定剂、缓冲剂，表面活性剂和张度剂的赋形剂。本发明的方法可在pH缓冲溶液中进行。本发明的缓冲液具有在约pH 4.5至约9.0范围内的pH。在某些实施方案中，pH在约4.5至约7.0范围内，在约4.5至约6.6范围内，在约4.5至约6.0范围内，在约pH 4.5至约5.5范围内，在约pH 4.5至约5.0范围内，在约pH 5.0至约7.0的范围内，在约pH 5.5至约7.0范围内，在约pH 5.7至约6.8范围内，在约pH 5.8至约6.5的范围内，在约pH 5.9至约6.5的范围内，在约pH 6.0至约6.5的范围内或在约pH 6.2至约6.5的范围内。在某些实施方案中，所述液体制剂的pH在约4.7至约5.2范围内，在约5.0至6.0范围内或在约5.2至约5.8范围内。在本发明的某些实施方案中，所述液体制剂具有6.2或约6.2的pH。在本发明的某些实施方案中，所述液体制剂具有6.0或约6.0的pH。
控制pH在此范围内的缓冲剂的实例包括有机酸和无机酸及其盐。例如，乙酸盐(例如乙酸组氨酸、乙酸精氨酸、乙酸钠)，琥珀酸盐(例如组氨酸琥珀酸盐、精氨酸琥珀酸盐、琥珀酸钠)，葡糖酸盐，磷酸盐，富马酸盐，草酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐及其组合。缓冲剂浓度可从约1mM至约600mM，这取决于例如缓冲剂和制剂所需的等张性。
额外的表面活性剂可任选添加至含水制剂中。示例性表面活性剂包括非离子表面活性剂，诸如泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188等)。添加的表面活性剂的量使得其减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。例如，所述表面活性剂可以约0.001％至约0.5％、约0.005％至约0.2％、约0.01％至约0.1％、或约0.02％至约0.06％、或约0.03％至约0.05％的量存在于制剂中。在某些实施方案中，所述表面活性剂以0.04％或约0.04％的量存在于制剂中。在某些实施方案中，所述表面活性剂以0.02％或约0.02％的量存在于制剂中。在一个实施方案中，所述制剂不包含表面活性剂。
所述方法可涉及使用张度剂，有时称为“稳定剂”，以调节或维持含水制剂的张力。当与大的带电生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因为它们可与带电荷的氨基酸侧链基团相互作用，从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其他成分的相对量，张度剂可以0.1重量％至25％，或更优选1重量％至5重量％的任何量存在。优选的张度剂包括多元糖醇，优选三元或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、***糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
在一些实施方案中，在制剂在约1℃至约10℃储存约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，所述方法导致少于5％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约2℃至约8℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，所述方法导致少于5％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约4℃至约6℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，所述方法导致少于5％的聚山梨酯降解。
在一些实施方案中，在制剂在约1℃至约10℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，所述方法导致少于1％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约2℃至约8℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，所述方法导致少于1％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约4℃至约6℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，所述方法导致少于1％的聚山梨酯降解。
在一些实施方案中，在制剂在约1℃至约10℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，所述方法导致少于0.1％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约2℃至约8℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，所述方法导致少于0.1％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约4℃至约6℃储存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月或至少约48个月后，所述方法导致少于0.1％的聚山梨酯降解。
在一些实施方案中，在制剂在约22℃至约28℃储存至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约4个月，至少约5个月，至少约6个月，至少约7个月，至少约8个月，至少约9个月，至少约10个月，至少约11个月或至少约12个月后，所述方法导致少于5％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约22℃至约28℃储存至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约4个月，至少约5个月，至少约6个月，至少约7个月，至少约8个月，至少约9个月，至少约10个月，至少约11个月或至少约12个月后，所述方法导致少于1％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约22℃至约28℃储存至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约4个月，至少约5个月，至少约6个月，至少约7个月，至少约8个月，至少约9个月，至少约10个月，至少约11个月或至少约12个月后，所述方法导致少于0.1％的聚山梨酯降解。
在一些实施方案中，在制剂在约-15℃至约-25℃储存至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月，至少约48个月，至少约54个月，至少约60个月，至少约66个月或至少约72个月后，所述方法导致少于5％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约-15℃至约-25℃储存至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月，至少约48个月，至少约54个月，至少约60个月，至少约66个月或至少约72个月后，所述方法导致少于1％的聚山梨酯降解。在一些实施方案中，在制剂在约-15℃至约-25℃储存至少约12个月，至少约18个月，至少约24个月，至少约30个月，至少约36个月，至少约42个月，至少约48个月，至少约54个月，至少约60个月，至少约66个月或至少约72个月后，所述方法导致少于0.1％的聚山梨酯降解。
本发明提供的方法在减少如可见和亚可见颗粒的数量上是有效的。在一些实施方案中，每mL形成小于约10,000、约5,000、约1,000、约500、约250、约150、约100、约50或约25个直径大于1.4μ的颗粒。在一些实施方案中，每mL形成小于约10,000、约5,000、约1,000、约500、约250、约150、约100、约50或约25个直径大于2μ的颗粒。在一些实施方案中，每mL形成小于约1250、约150、约100、约50、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个直径大于5μ的颗粒。在一些实施方案中，每mL形成小于约250、约150、约100、约50、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个直径大于10μ的颗粒。在一些实施方案中，每mL形成小于约250、约150、约100、约50、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个直径大于15μ的颗粒。在一些实施方案中，每mL形成小于约250、约150、约100、约50、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个直径大于25μ的颗粒。
本文还提供了在制剂中再溶解聚山梨酯降解产物的方法。在一些实施方案中，在添加聚山梨酯后，制剂中存在的大于1.4μ的颗粒的数量减少了100、1000、2000、5000或10000倍。在一些实施方案中，在添加聚山梨酯后，制剂中存在的直径大于2μ的颗粒的数量减少了100、1000、2000、5000或10000倍。在一些实施方案中，在添加聚山梨酯后，制剂中存在的直径大于5μ的颗粒的数量减少了100、1000、2000、5000或10000倍。在一些实施方案中，在添加聚山梨酯后，制剂中存在的直径大于10μ的颗粒的数量减少100、1000、2000、5000或10000倍。在一些实施方案中，在添加聚山梨酯后，制剂中存在的直径大于15μ的颗粒的数量减少了100、1000、2000、5000或10000倍。在一些实施方案中，在添加聚山梨酯后，制剂中直径大于25μ的颗粒的数量减少了100、1000、2000、5000或10000倍。
V.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供一种制品，其包括容纳本发明液体制剂的容器并且任选地提供其使用说明。合适的容器包括例如瓶子、小瓶和注射器。容器可以由多种材料形成，诸如玻璃或塑料。示例性容器是3-20cc一次性使用的玻璃小瓶。或者，对于多剂量制剂，容器可以是3-100cc玻璃小瓶。容器容纳制剂，并且容器上或与容器相关联的标签可指示使用说明。所述制品还可包含从商业和用户角度期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装插页。
VI.试剂盒
在本发明的另一个实施方案中，提供用于减少聚山梨酯降解的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供通过本文所述的方法用于减少聚山梨酯降解的试剂盒。在一些实施方案中，提供了包含本文提供的任何制剂的试剂盒。在一个实施方案中，此类试剂盒包含治疗性肽或抗体的含水制剂的容器和可添加到含水制剂中的环糊精溶液，其中环糊精与聚山梨酯的比大于37.5:1。在一个实施方案中，此类试剂盒包含治疗性肽或抗体的含水制剂的容器和可添加至含水制剂中的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液，其中PVP与聚山梨酯的比大于37.5:1。
所述说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文所示和所述的那些以外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言从前面的描述中变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。
实施例
通过参考以下实施例将更全面地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。应该理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且对于本领域技术人员将暗示对其进行各种修改或改变，并且将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范畴内。
材料和方法
材料
羟基丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为Cavitron W7HP5Pharma获自Ashland Inc.(Ashland,Kentucky)。磺丁基醚-β-环糊精(SBE-β-CD)作为Captisol获自LigandPharmaceuticals(La Jolla,California)。羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD)、羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD)、聚乙二醇(PEG 1500)和甲硫氨酸获自Sigma Aldrich(St.Louis,Missouri)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为KollidonPovidone K-157获自Spectrum Chemical(Gardena,California)。聚山梨酯20(PS20)获自Croda Inc.(New Castle,Delaware)。猪胰脂肪酶(PPL)、来自伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)(LPL)的脂蛋白脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶B(candida antarctica lipase B)(CALB)、兔肝酯酶(RLE)和2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(AAPH)获自Sigma Aldrich Inc.(St.Louis,Missouri)。
通过HIAC确定亚可见颗粒计数
使用配备有HRDL-150检测器和1mL注射器的HIAC 9703颗粒计数器测量亚可见颗粒。在每次测量会话控制(session)前使用NIST可追踪的2μm聚苯乙烯珠粒标准品以3000计数/mL验证仪器的性能。HIAC仪器配置为10mL/min流速、0.1mL皮重体积和0.4mL样品体积。使用0.4mL小量(sip)的4次运行分析样品，并丢弃每个样品的第一轮运行以防止由于样品携带(carryover)引起的测量误差。结果报告为1.4、2、5、10、15、25和50μm分析过滤器尺寸的平均值。
聚山梨酯浓度的确定
通过使用蒸发光散射检测(RP-ELSD)的反相超高效液相色谱法确定聚山梨酯浓度。使用安装有Waters Oasis MAX管柱(20x 2.1mm,30μm粒度)的Agilent 1100系列高效液相色谱***(HPLC)分析样品。HPLC***设置了一个开关阀，将柱流通至废液或设置为100℃的Varian 380-LC蒸发光散射检测器。流动相由2％甲酸水溶液(泵A)和2％甲酸/异丙醇(泵B)组成。在平衡过程中泵梯度为10％泵B，线性至20％泵B持续1分钟，在20％泵B等梯度持续2.4分钟，线性至100％泵B持续0.1分钟，在100％泵B等梯度持续1.1分钟，线性至10％泵B持续0.1分钟，最后在10％泵B等梯度持续1.9分钟。开关阀在每次注射开始时将柱流通引导至废物，然后在2.4分钟后将流体引导至检测器直至梯度结束。为了定量PS20浓度，通过注入20μL包含0％w/v至0.4％w/v PS20之间的溶液产生标准曲线。对于影响PS20通过柱的迁移时间的赋形剂，分析中包括含有相关赋形剂的PS20标准曲线溶液以促进准确定量。
通过Seidenader的可见颗粒成像
使用Seidenader V90-T目视检查装置(Markt Schwaben,Germany)将样品瓶架倾斜至60度，检查小瓶中的可见颗粒。样品的可见颗粒检查通过将玻璃小瓶置于支架中并且在丁达尔光通过小瓶底部的情况下旋转而进行。首先进行预旋转(即快速旋转)以搅动液体，使颗粒悬浮并循环。在旋转和照射之后，颗粒运动并且光引起使颗粒可见的颗粒的反射(即，丁达尔效应)。然后使用放大镜观察可见颗粒。可见颗粒的视频和照片是使用Samsung(Seoul,South Korea)Galaxy设备获得的。
浊度的确定
使用UV光谱法确定浊度。通过在Agilent 8453分光光度计上使用Chemstation软件(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)在具有1cm路径长度的石英比色池中记录279nm和320nm处的吸光度来测量每个样品的UV吸光度。
蛋白质浓度的确定
蛋白质浓度如下测量。通过在Agilent 8453分光光度计上使用Chemstation软件(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)在具有1cm路径长度的石英比色池中记录340nm和360nm之间的平均吸光度来测量每个样品的UV吸光度。通过使用每种蛋白质的实验确定的吸光度来计算UV浓度确定。测量结果与适当的缓冲液一起消隐。
实施例1：聚山梨酯的氧化降解
使用先前已经显示降解PS20的2,2'-偶氮二异丁酰脒(AAPH)(Borisov等,J.Pharm.Sci.104:1005-1018(2015))评价环糊精抑制氧化性PS20降解的能力。为了评价环糊精抑制PS20的氧化的能力，将含有15％(w/v)HP-β-CD或15％(w/v)蔗糖的样品与对照样品(不含任何额外的赋形剂)进行比较。对于不含赋形剂(对照)、含有15％(w/v)蔗糖和15％(w/v)HP-β-环糊精的样品在40℃用5mM AAPH氧化24小时，通过RP-ELSD确定聚山梨酯20降解。
如图1所示，数据表明HP-β-CD和蔗糖两者均降低了PS20降解的量。在与AAPH温育后，在对照样品中观察到PS20降解相对下降17.9％。相反，对于分别含有15％(w/v)蔗糖和HP-β-CD的样品，观察到PS20降解分别降低9.8％和3.6％。
实施例2：HP-β-CD对聚山梨酯20的酶促降解的抑制作用
测量15％HP-β-CD对PS20的酶促降解的作用。在室温用猪胰脂肪酶(PPL)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶(CALB)和兔肝酯酶(RLE)中每种酶消化在pH 5.5缓冲液中不含额外赋形剂、含有15％蔗糖或15％HP-β-环糊精的0.02％PS20样品。PPL样品用15μg/mL酶消化4.5小时。LPL样品用70μg/mL酶消化5小时。CALB样品用0.1mg/mL固定化酶消化1小时。RLE样品用15μg/mL酶消化5小时。所有消化均在室温进行。
通过在85℃水浴中热灭活30分钟来终止PPL消化。LPL和RLE消化不会通过热灭活停止，因此立即分析样品的PS20含量。通过过滤出固定化酶珠粒来停止CALB消化。为了使颗粒形成，将CALB样品置于5℃过夜。将RLE和LPL样品在-20℃冷冻过夜以阻止酶活性，然后立即在颗粒分析之前立即在冰上解冻。
如上所述，通过具有在线蒸发光散射检测器(Varian 380-LC系列)的高效液相色谱(Agilent 1100系列)分析所有样品的PS20含量。在Seidenader目视检查仪上进行可见颗粒检查。在HIAC 9703颗粒计数器上进行亚可见颗粒分析。
用CALB、RLE和LPL处理的样品显示PS20的减少59.2％-68.3％(图2)。相反，含有15％HP-β-CD的样品显示出对PS20降解的显著抑制。具体而言，对于这些样品，PS20浓度降低了14.3％-37.4％(图2和表1)。
表1-通过CALB、LPL和RLE对聚山梨酯20的酶促降解
Figure BDA0001711997490000651
另外，HIAC数据显示15％(w/v)HP-β-CD减少了亚可见颗粒(SVP)的形成。使用多种酶(CALB、LPL和RLE)进行酶促降解后，当样品中包含15％(w/v)HP-β-CD时，对于所有粒度分类(≥2、≥5、≥10和≥25微米颗粒)观察到极少SVP/mL。LPL和RLE获得类似的结果；然而，极少量的≥10和>≥25微米颗粒排除了≥10和≥25微米颗粒计数测量的解释(图3A-3D)。
这些发现表明，HP-β-CD是一种代表性环糊精复合物，能够抑制多种酶对PS20的酶促降解。不受理论束缚，这可能表明环糊精分子保护PS20的主要机制涉及环糊精与聚山梨酯分子之间的直接相互作用。
实施例3：HP-β-CD对聚山梨酯80的酶促降解的抑制作用
测量15％(w/v)HP-β-CD对PS80酶促降解的作用。在室温用15μg/mL猪胰脂肪酶(PPL)在pH 5.5缓冲液中消化含有0％和15％(w/v)HP-β-CD的0.02％(w/v)PS80的样品5小时。通过在85℃水浴中热灭活30分钟停止PPL消化。
PPL消化后，RP-ELSD显示出PS80中相对降低约19％(图4)。相反，在含有15％(w/v)HP-β-CD的样品中观察到PS80降解降低约4％。
另外，HIAC数据表明15％(w/v)HP-β-CD降低了亚可见颗粒(SVP)的平均(n＝3)量。使用PPL进行酶促降解后，当样品中包含15％(w/v)HP-β-CD时，对于所有粒度分类(≥1.4、≥2、≥5、≥10和≥25微米颗粒)观察到极少SVP/mL(图5A-5F)。
这些发现表明，HP-β-CD是一种代表性环糊精复合物，能够抑制PS80的酶促降解。这些结果表明，环糊精减少聚山梨酯降解、减少颗粒形成和增溶现有颗粒的能力通常适用于各类聚山梨酯分子(例如PS20、PS40、PS60、PS80等)。不受理论束缚，这可能表明环糊精分子保护聚山梨酯的主要机制涉及环糊精与包含所有聚山梨酯分子的保守化学结构亚基(例如脂肪酸)之间的直接相互作用。
实施例4：聚山梨酯20的酶促降解动力学
为了评价酶促PS20降解的动力学，在室温用15μg/mL PPL消耗样品，含有0.02％(w/v)PS20和15％蔗糖、15％HP-β-CD或15％HP-α-CD的无蛋白样品使用在约25℃温育180小时的PPL消耗。如上所述，通过具有在线蒸发光散射检测器(Varian 380-LC系列)的高效液相色谱(Agilent 1100系列)分析所有样品的PS20含量。在HIAC 9703颗粒计数器上进行亚可见颗粒分析。
图6中的15％蔗糖曲线显示PS20降解可通过单相指数衰减来描述。半衰期为32.91小时，平稳度为44％(图6)。这些降解动力学支持使用4.5小时消化模型(使用PPL在25℃4.5小时)用于后续研究。
实施例5：环糊精和其他赋形剂对聚山梨酯的酶促降解的抑制作用
测试了几种赋形剂保护PS20免于酶水解的能力，包括HP-α-CD、HP-β-CD、HP-γ-CD、SBE-β-CD、PVP、PEG 1500、蔗糖和甲硫氨酸。添加酶后，在pH 5.5缓冲液中制备含有终浓度为0.02％PS20的每种赋形剂的溶液。赋形剂溶液中HP-α-CD、HP-β-CD、HP-γ-CD和SBE-β-CD的浓度为106mM。由于溶解度限制，甲硫氨酸样品含有10mg/mL甲硫氨酸。将剩余的赋形剂(PVP、PEG 1500、蔗糖)添加至15％w/v以匹配HP-β-CD的％w/v。样品在室温用15μg/mL PPL酶消化4.5小时，接着在85℃热灭活30分钟。使用具有在线蒸发光散射检测器的高效液相色谱分析每个样品的PS20浓度。然后将样品置于5℃过夜以允许形成颗粒，并如前所述分析可见和亚可见颗粒。
RP-ELSD结果表明，赋形剂类别对于确定酶促PS20降解的程度是重要的(图7)。酶消化后，对照样品(即无赋形剂)的PS20降解下降58％。对于含有15％(w/v)蔗糖的样品观察到PS20的等效降低58％。这些发现表明，蔗糖作为无环二糖(即蔗糖)对酶促PS20降解没有抑制作用。环糊精的抑制作用不能仅仅归因于质量稀释效应(mass dilution effect)，因为结果表明等量的其他赋形剂(例如蔗糖)不会减轻催化性聚山梨酯降解。
类似地，含有甲硫氨酸的样品对酶促PS20降解或SVP形成没有抑制作用(图7和8A-8D)。据推测，甲硫氨酸会阻止氧化性PS20降解，但不会阻止酶促PS20降解。不受理论束缚，在该实验中再现的PS20降解机制可能是水解的并且不依赖于氧化性PS20降解。
结果表明，PEG相对于对照样品对PS20降解具有小的抑制作用。对于含有5％(w/v)PEG 1500的样品观察到PS20降低51％。
评价的环糊精分子(HP-α-CD、HP-β-CD和SBE-β-CD)对酶促PS20降解和SVP形成都具有显著的抑制作用(图7和8A-8D)。有趣的是，糖亚基的数量在确定环糊精抑制程度方面可能是重要的。例如，对于HP-α-CD和HP-β-CD分别观察到1％和7％的PS20下降。
进行进一步研究以评价HP-α-CD、HP-β-CD和HP-γ-CD的重要性，以进一步理解环糊精环大小的重要性。图9所示的数据表明，对于含有HP-α-CD和HP-β-CD的样品没有观察到显著的PS20降解；相反，在含有15％HP-γ-CD的样品中观察到约82％的PS20降解。类似地，在对照样品(即无赋形剂和15％蔗糖)中观察到PS20浓度的显著降低(图9)。这些发现表明，较小的环糊精HP-α-CD(空腔直径：
Figure BDA0001711997490000671
空腔体积：
Figure BDA0001711997490000672
)和HP-β-CD(空腔直径：
Figure BDA0001711997490000677
空腔体积：
Figure BDA0001711997490000674
)是比比HP-γ-CD(空腔直径：
Figure BDA0001711997490000675
空腔体积：
Figure BDA0001711997490000676
)更有效的聚山梨酯20降解抑制剂。
每种环糊精的空腔的尺寸和体积可确定它们作为酶促PS20降解的分子抑制剂的有效性，而不是每种环糊精的物理化学性质。不受理论束缚，该发现表明，保护机制可能涉及环糊精与聚山梨酯20反应位点之间的主客体络合(host-guest complexation)。
实施例6：与通过环糊精和其他赋形剂的酶促聚山梨酯20降解相关的可见和亚可见颗粒的增溶
测试了几种赋形剂增溶作为酶促PS20降解的结果而产生的颗粒的能力。在pH 5.5缓冲液中一式三份制备浓缩的HP-α-CD、HP-β-CD、HP-γ-CD、SBE-β-CD、PVP、PEG 1500、蔗糖和甲硫氨酸的溶液。制备来自酶促PS20降解的颗粒。在pH 5.5缓冲液中0.05％PS20的三种溶液在室温用37.5μg/mL PPL酶促降解4.5小时，接着在85℃热灭活30分钟。将降解的PS20溶液置于5℃以允许颗粒结晶。
在降解的PS20溶液中形成颗粒后，剩余的样品制备在5℃的冷室中进行以防止PS20衍生的颗粒溶解。将每种降解的PS20溶液分成11份，并将浓缩的赋形剂掺入每份等分试样中。各样品中赋形剂的最终浓度如下：5％蔗糖、10mg/mL甲硫氨酸、5％PVP、5％PEG1500、15％HP-β-CD、5％HP-β-CD、0.5％HP-β-CD，35.5mM HP-α-CD、35.5mM HP-γ-CD和35.5mM SBE-β-CD。添加各种赋形剂后，将样品在5℃放置过夜。次日，在Seidenader目视检测仪下检查小瓶中的可见颗粒。使用HIAC 9703颗粒计数器测量亚可见颗粒计数。
结果表明，环糊精(HP-α-CD、HP-β-CD和HP-γ-CD)相对于对照和其它赋形剂样品能够显著降低SVP的量(图10A和10B)。这些结果证实，除了防止酶促聚山梨酯降解外，环糊精还可增溶由聚山梨酯20的酶促消化产生的PS20降解物。
另外，在添加15％(w/v)HP-β-CD之前和之后立即拍摄照片。照片描绘了在添加15％(w/v)HP-β-CD之前(图11A)和之后(图11B)PS20-相关可见颗粒的增溶。照片中表示的可见颗粒的立即增溶提供了令人信服的证据，表明环糊精可增加与PS20降解相关的可见和亚可见颗粒的溶解度。
实施例7：与环糊精氧化性聚山梨酯20降解相关的可见和亚可见颗粒的增溶
对不同浓度的HP-β-CD测试其增溶由氧化性PS20降解产生的颗粒的能力。在pH5.5的缓冲液中一式三份制备浓缩的HP-β-CD溶液。含有0.02％(w/v)PS20的无蛋白样品在5℃储存27个月，导致氧化性PS20降解并形成与PS20降解产物相关的可见和不可见颗粒。将每种降解的PS20溶液分成3份，并将浓缩的赋形剂掺入每份等分试样中。各样品中赋形剂的最终浓度如下：0％(w/v)HP-β-CD(对照)、5％(w/v)HP-β-CD和15％(w/v)HP-β-CD。HP-β-CD浓度调整后，将样品在5℃放置过夜。次日，使用HIAC 9703颗粒计数器测量亚可见颗粒计数。
测试0％、5％和15％(w/v)浓度的HP-β-CD对SVP再增溶的作用。结果证明，相对于对照样品(0％HP-β-CD)，含有HP-β-CD的样品中SVP显著降低。如图12A-12F所示，15％HP-β-CD有效地再增溶大于或等于1.4微米的颗粒，而5％HP-β-CD有效再增溶大于或等于2微米的颗粒。
这些结果证实，除了防止酶促聚山梨酯降解和增溶由聚山梨酯20的酶促消化产生的PS20降解物之外，环糊精还可增溶由聚山梨酯20的氧化消化产生的PS20降解产物。
实施例8：HP-β-CD浓度和HP-β-CD:PS20比对PS20降解的作用
为了确定HP-β-CD浓度对PS20降解的作用，使用15μg/mL的PPL将含有0.001、0.01、0.1、1、5或15％PS20的样品消化4.5小时。如图13所示，增加HP-β-CD的量降低了PS20降解。
评估HP-β-CD浓度在不同PS20浓度对PS20酶促降解的作用，以鉴定抑制酶促PS20降解的最佳浓度。为了评价PS20降解对HP-β-CD浓度的依赖性，使用RP-ELSD确定在各种PS20浓度含有不同HP-β-CD浓度的一式三份样品的PS20含量。在室温使用15μg/mL PPL酶将含有0.005％(图14A)、0.02％(图14B)、0.1％(图14C)和0.4％PS20(图14D)的样品在不含赋形剂(对照)、含有0、0.5、5和15％(w/v)HP-β-CD的无蛋白样品中消化4.5小时。将PPL以75mgPPL/mg PS20的比添加至每种处理溶液中，将等体积的缓冲液添加至对照溶液中以确定HP-β-CD:聚山梨酯比对酶促降解的作用。通过在85℃水浴中热灭活30分钟来停止消化。如上所述使用具有在线蒸发光散射检测器的高效液相色谱分析每个样品的PS20浓度。然后将样品置于5℃过夜，以便在如上所述分析可见和亚可见颗粒的过程中形成颗粒并置于冰上。
表2-HP-β-CD与PS20比
Figure BDA0001711997490000691
Figure BDA0001711997490000701
完全抑制酶促PS20降解所需的环糊精的量取决于PS20的浓度(图13和14A-D)。在较低的PS20浓度(例如，0.005％PS20(图14A))，仅需0.5％的HP-β-CD来完全抑制PS20降解，而对于含有0.1％PS20的样品则需要15％HP-β-CD(图14C)。类似地，直径大于2、5或10微米的亚可见颗粒的形成取决于环糊精与聚山梨酯的比。含有0.02％PS20的样品需要0.5％的HP-β-CD以部分抑制亚可见颗粒的形成以及15％的HP-β-CD以完全抑制亚可见颗粒的形成(图15A-15C)。
这些结果可在HP-β-CD与PS20比(w/w)的背景下解释(图16和表2)。PS20数据表明，需要足够的HP-β-CD:PS20(≥37.5w/w)来抑制酶促PS20降解(表2)。结果表明，在确定跨越PS20和HP-β-CD的宽浓度范围的PS20降解时，HP-β-CD与PS20的比是重要的。
结果还阐明了通过HP-β-CD抑制PS20降解的可能机制。在这种情况下，随着在固定底物(即PS20)浓度抑制剂(即HP-β-CD)浓度增加(图13)，PS20降解的量呈S形变化。因此，不受理论束缚，增加环糊精浓度可有效降低溶液中游离底物浓度，其降低PS20降解的速率。或者，PS20降解速率可能被底物-抑制剂复合物抑制。
实施例9：抗体储存条件下的聚山梨酯降解
评估各种蛋白质分子类别(例如，单克隆抗体(mAb)、单Fab抗体(sFAb)和双特异性抗体(BsAb))对环糊精降低酶促PS20降解的能力的作用。mAb、sFAb和BsAb药物样品以其天然制剂形式提供。将样品透析并在pH 5.5用0.02％PS20调理至20mM组氨酸乙酸盐的目标制剂中，使最终蛋白质浓度为20mg/mL。制备对照样品以含有20mM组氨酸乙酸盐,pH 5.5,0.02％PS20。将每种mAb、sFAb、BsAb和对照样品再分份并用调理缓冲液调节以含有不同量(0％、5％和15％)的HPβCD。样品在室温用15μg/mL PPL酶消化4.5小时，随后在85℃热灭活30分钟。使用具有在线蒸发光散射检测器的高效液相色谱分析每个样品的PS20浓度。然后将样品置于5℃过夜以允许形成颗粒，并如上所述分析可见和亚可见颗粒。
结果证明，每个含有0％HPβCD的样品具有不同量的PS20降解。结果显示，含有蛋白质的0％HPβCD样品(图17B-D)相对于对照样品(图17A)具有更高量的PS20降解。因为蛋白质在中华仓鼠卵巢(CHO)或大肠杆菌细胞中表达，所以蛋白质样品可能含有有助于PS20降解总量的其他杂质(即脂肪酶等)。
尽管观察到含0％HPβCD蛋白质的样品具有更高量的PS20降解，但结果表明，在含有5％和15％HPβCD的样品中观察到可比数量的PS20降解。这些结果表明，尽管HPβCD可能具有不同量的催化降解PS20的杂质(图17A-D)，但它在减轻所评价的所有分子形式的催化性PS20降解方面同样有效。这表明，蛋白质分子及其天然杂质谱的存在不显著影响减轻PS20降解所必需的环糊精与蛋白质的比。不受理论束缚，该发现表明，催化抑制的机制涉及直接与PS20相互作用的环糊精分子，而不是降解聚山梨酯的酶。否则，与对照相比，含有降解聚山梨酯的额外酶的含蛋白质样品需要更多HPβCD来减轻PS20降解。因此，本文所述的环糊精与PS20的比应广泛适用于包含不同蛋白质分子和杂质谱的各种制剂。
结论
所进行的研究显示环糊精抑制聚山梨酯(PS20和PS80)的酶促和氧化降解的能力。结果表明，PVP和环糊精(即HP-α-CD、HP-β-CD、HP-γ-CD、SBE-β-CD)能够防止PS20的酶促降解。进一步的实验证明，HP-β-CD在多种酶(即CALB、RLE、LPL和PLL)存在下对聚山梨酯具有保护作用。不受理论束缚，抑制机理可能涉及抑制剂(即环糊精)与底物(即聚山梨酯)之间的相互作用。包合复合物的形成既可降低游离底物的浓度，也可直接在空间上抑制与活性位点和底物的相互作用。此外，浓度研究确定了提供完全抑制酶促PS20降解所必需的HP-β-CD与PS20比(≥37.5w/w)的最佳范围。
除了防止酶促PS20降解，结果表明，环糊精可有效减少亚可见颗粒和可见颗粒的量。以这种方式，环糊精解聚并增溶溶液中的亚可见和可见的颗粒。除了有效防止颗粒形成之外，结果表明，环糊精还可有效增溶与聚山梨酯降解相关的现有颗粒。据推测，环糊精还增加作为聚山梨酯降解产物的游离脂肪酸的溶解度。
这项研究的发现具有广泛的实际意义。结果提供了全面的证据表明含有环糊精的制剂可用于防止酶促聚山梨酯降解。此外，环糊精可用于增溶与来自氧化降解和酶促降解两者的聚山梨酯降解相关的游离脂肪酸。因此，环糊精也可用作药物产品的稀释剂或重构缓冲剂以增溶与聚山梨酯降解相关的降解物和颗粒。

Claims (36)

1.一种使用环糊精减少包含聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯降解的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于37.5:1，其中所述制剂还包含多肽。
2.一种使用环糊精减少包含聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯降解的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于37.5:1，其中所述制剂包含0.005％-0.4％聚山梨酯，其中所述制剂还包含多肽。
3.一种使用环糊精减少包含聚山梨酯的含水制剂中的聚山梨酯降解的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精至0.01％-30％的浓度，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于37.5:1，其中所述制剂包含0.005％至0.4％的聚山梨酯，其中所述制剂还包含多肽。
4.一种使用环糊精减少包含聚山梨酯的含水制剂中的亚可见颗粒和可见颗粒的量的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于37.5:1，其中所述制剂还包含多肽。
5.一种使用环糊精在包含聚山梨酯的含水制剂中解聚和增溶聚山梨酯降解产物的方法，所述方法包括向所述制剂中添加环糊精，其中环糊精与聚山梨酯的所得的w/w比大于37.5:1，其中所述制剂还包含多肽。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯20或聚山梨酯80。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述环糊精是HP-β环糊精、HP-γ环糊精或磺丁基醚β-环糊精。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂中聚山梨酯的浓度在0.01％至0.4％的范围内。
9.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂中聚山梨酯的浓度在0.01％至0.1％的范围内。
10.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂中聚山梨酯的浓度是0.02％。
11.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂中环糊精的浓度在0.5至30％的范围内。
12.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂中环糊精的浓度是15％。
13.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述聚山梨酯降解被被减少50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
14.权利要求1-4中任一项的方法，其中每mL形成小于1,000个直径大于2微米的聚山梨酯颗粒。
15.权利要求1-4中任一项的方法，其中每mL形成小于750个直径大于2微米的聚山梨酯颗粒。
16.权利要求1-4中任一项的方法，其中每mL形成小于500个直径大于2微米的聚山梨酯颗粒。
17.权利要求1-4中任一项的方法，其中每mL形成小于250个直径大于2微米的聚山梨酯颗粒。
18.权利要求1-4中任一项的方法，其中每mL形成小于150个直径大于2微米的聚山梨酯颗粒。
19.权利要求1-4中任一项的方法，其中每mL形成小于100个直径大于2微米的聚山梨酯颗粒。
20.权利要求1-4中任一项的方法，其中每mL形成小于50个直径大于2微米的聚山梨酯颗粒。
21.权利要求1-4中任一项的方法，其中每mL形成小于25个直径大于2微米的聚山梨酯颗粒。
22.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂在2℃至8℃稳定至少6个月。
23.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂在2℃至8℃稳定至少12个月。
24.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂在2℃至8℃稳定至少18个月。
25.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂在2℃至8℃稳定至少24个月。
26.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂在1℃至10℃稳定至少48个月。
27.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂在2℃至8℃稳定至少48个月。
28.权利要求1的方法，其中所述多肽是抗体。
29.权利要求28的方法，其中所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或抗体片段。
30.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂中的多肽浓度是1mg/mL至250mg/mL。
31.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂具有4.5至7.0的pH。
32.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂具有4.5至6.0的pH。
33.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂具有6.0的pH。
34.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂还包含一种或多种选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和张度剂的赋形剂。
35.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂是适合于给予受试者的药物制剂。
36.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述制剂是适合于静脉内、皮下、肌肉内或玻璃体内给予受试者的药物制剂。
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