CN115298541A - 检测聚山梨醇酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供用于检测药物产品中的聚山梨醇酯的方法。

Description

检测聚山梨醇酯的方法
发明领域
本发明涉及提供用于检测药物产品中的聚山梨醇酯的方法。
发明背景
聚山梨醇酯是食品和生物药物产品中常用的非离子表面活性剂。在生物药物产品中，它们可用于防止蛋白质吸附到表面、聚集和颗粒形成。然而，存在对于此类聚山梨醇酯的降解产物在用于肠胃外时可能会引起问题的担心，例如注射部位刺激。由于这种用途，对于开发监测聚山梨醇酯完整性的分析方法非常感兴趣，特别是聚山梨醇酯80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。可商购的PS80是异质的，最常见的加工相关的亚种是聚氧乙烯(POE)基团、POE异山梨醇单酯和POE山梨糖醇/异山梨醇二、三、四酯；因此，分析方法的开发一直具有挑战性。已经报道了几种方法。
这些方法都没有提供：(1)特异性—PS80单酯峰的抗扰度使得能够在降解样品中定量；(2)灵敏度，≤20ppm；(3)准确度，95-105％；(4)精度，≤5％；(5)可转移性，包括质量控制(QC)；(6)以与传统UV可见高效液相色谱(HPLC)方法相似地时间和大致相同的成本进行验证的能力；(7)检测完整的和降解的PS80及相关的亚种的能力；(8)作为含蛋白质的生物药物制剂的平台方法的能力；(9)线性度，R2>0.99；(10)脂肪酸的分解；(11)质谱可翻译；(12)不采用衍生化；和/或(13)不使用依赖于胶束封装的定量。
因此，需要提供用于聚山梨醇酯检测的改进的方法，该方法解决上述缺陷和/或可以检测完整的聚山梨醇酯和/或降解的聚山梨醇酯产物。
发明概述
因此，本发明提供了用于检测样品中聚山梨醇酯(例如完整的聚山梨醇酯和/或降解的聚山梨醇酯产物)的方法，该样品为例如含有蛋白质，例如药物蛋白质产品诸如抗原结合多肽(例如，单克隆抗体(mAb))的样品。
因此，在本发明的第一方面，提供了鉴定含有蛋白质的样品中的聚山梨醇酯，例如完整的聚山梨醇酯和/或降解的聚山梨醇酯产物的方法，包括使所述样品经受下列步骤：(i)通过将所述样品暴露于有机质子极性溶剂或有机非质子极性来沉淀所述蛋白质，
(ii)通过离心沉淀的样品使蛋白质形成团粒(pellete)从沉淀的样品中分离蛋白质，并获得液体上清液，
(iii)通过使上清液经受层析法分离聚山梨醇酯，其中层析法包括将上清液施加到包含固定化氰基基团的固定相柱上，并使用流动相组合物梯度洗脱结合的聚山梨醇酯，和
(iv)使用无发色团检测器检测分离的聚山梨醇酯以鉴定聚山梨醇酯。
在本发明的第二方面，提供了用于鉴定蛋白质样品的方法，例如从多个蛋白质中，其中所述鉴定的蛋白质样品含有约10ppm至约5000ppm的完整的聚山梨醇酯，并且该方法包括下列步骤：
(a)测量所述蛋白质样品中的聚山梨醇酯，包括下列步骤：
(i)通过将所述样品暴露于有机质子极性溶剂或有机非质子极性溶剂来沉淀蛋白质，
(ii)通过离心沉淀的样品使蛋白质或肽形成团粒从沉淀的样品中分离蛋白质，并获得液体上清液，
(iii)通过使上清液经受层析法分离聚山梨醇酯，其中层析法包括将上清液施加到包含固定化氰基基团的固定相柱上，并使用流动相组合物梯度洗脱结合的聚山梨醇酯，和
(iv)使用无发色团检测器检测分离的聚山梨醇酯以鉴定聚山梨醇酯；
(b)鉴定来自(a)的蛋白质样品，其具有完整的聚山梨醇酯诸如PS80的水平为约10ppm至约5000ppm，
(c)分离并回收步骤(b)中鉴定的所述蛋白质。
还提供了通过本发明第二方面的方法获得的或可获得的蛋白质，以及所述蛋白质在医药中，例如在制备用于向人受试者施用的药物制剂中的用途。
在本发明第一方面和第二方面的一个实施方案中，提供的方法是在含有蛋白质的样品例如抗体样品诸如mAb中鉴定聚山梨醇酯80(例如完整的和/或降解的PS80聚山梨醇酯)的方法。
沉淀和分离与洗脱步骤组合允许分离样品中的聚山梨醇酯产物，并且检测步骤允许检测和分析所述完整的和/或降解的聚山梨醇酯产物，诸如PS80和/或PS60和/或PS40和/或PS20。
在本发明第一方面和第二方面的一个实施方案中，本文所提供的鉴定含有蛋白质或肽，例如抗体诸如mAb的样品中的聚山梨醇酯的方法是定量的方法，其可用于测量存在于所述样品中的聚山梨醇酯诸如PS80和/或PS60和/或PS40和/或PS20的量，包括测量例如完整的PS80和/或PS60和/或PS40和/或PS20和/或降解的产物。
附图简述
图1：显示了PS80合成路径的最后两步。
图2：显示了聚山梨醇酯中两种最常见的降解类型的降解产物。
图3：显示了使用HPLC-CAD方法获得的层析图，其定量PS80单酯和定性/半定量地监测其他四组亚种。
图4：显示了多种来源的PS80(实线)和空白(虚线)的层析图。
图5：显示了多种聚山梨醇酯(实线)和空白(虚线)的层析图。
图6：显示了使用HPLC-CAD方法获得的PS80单酯的层析谱。
图7：显示了样品在5、25、40或-70℃至21天的PS80降解动力学。
图8：显示了PS80单酯降解的速率常数(在5、25和40℃)的阿仑尼乌斯(Arrhenius)图。
图9：显示了层析图叠加(200ppm标准溶液(多药典J.T.Baker PS80)、具有降解的PS80的mAb样品和空白溶液。
发明详述
在本说明书中，已经参照实施方案以能够撰写清晰简洁的说明书的方式描述了本发明。意在并且应该理解，实施方案可以在不脱离本发明的情况下以进行各种组合或分离。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)普通技术人员的通常理解相同的含义。标准技术用于定量分析方法。
本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，以如同全部阐明那样以引用的方式并入本文。
“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。多肽可以是天然的(组织衍生的)来源、从原核或真核细胞制备物重组或天然表达、或经由合成方法化学产生。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的化合物。非天然残基在科学和专利文献中有详细描述；下文描述了一些可用作天然氨基酸残基模拟物的示例性非天然组合物和指引。芳香族氨基酸模拟物可以通过下列替换产生：例如D-或L-萘丙氨酸、D-或L-苯基甘氨酸、D-或L-2噻吩丙氨酸、D-或L-1、-2、3-或4-芘丙氨酸(pyreneylalanine)、D-或L-3噻吩丙氨酸、D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸、D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸、D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸、D-(三氟甲基)-苯丙氨酸、D-对氟苯丙氨酸、D-或L-对联苯苯丙氨酸、K-或L-对甲氧基-联苯苯丙氨酸、D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸、和D-或L-烷基亚胺(alkylainines)，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲异丁基、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括，例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。
术语“抗原结合多肽”在本文中用于指抗体、抗体片段或能够结合抗原的其它蛋白构建体。
术语“抗体”在本文以最广泛的含义使用，是指具有免疫球蛋白样结构域(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的分子，并包括单克隆的、重组的、多克隆的、嵌合的、人的、人源化的、多特异性的抗体，包括双特异性抗体，和异源偶联抗体；单个可变结构域(例如结构域抗体(DAB))、抗原结合抗体片段、Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv、二硫键连接的scFv、双抗体、TANDABS等以及前述任何的修饰形式(可选的“抗体”形式的总结参见Holliger和Hudson，Nature Biotechnology，2005，Vol 23，No.9，1126-1136)。还考虑了可选的抗体形式并且包括可选的支架，其中抗原结合蛋白的一个或多个CDR可以排列在合适的非免疫球蛋白支架或骨架上，诸如亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类结构域、avimer或EGF结构域。
在本文中可互换使用的术语完全的、全部的或完整的抗体是指具有大约150,000道尔顿的分子量的异四聚体糖蛋白。完整的抗体由通过共价二硫键连接的两条相同的重链(HC)和两条相同的轻链(LC)组成。这种H2L2结构折叠以形成三个功能结构域，包括两个抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及一个“Fc”可结晶片段。Fab片段由氨基末端的可变结构域、可变重链(VH)或可变轻链(VL)和羧基末端的恒定结构域、CH1(重)和CL(轻)组成。Fc片段由成对的CH2和CH3区域二聚化形成的两个结构域组成。Fc可以通过与免疫细胞上的受体结合或通过结合经典补体途径的第一个成分C1q来引发效应子功能。五类抗体IgM、IgA、IgG、IgE和IgD由不同的重链氨基酸序列定义，分别称为μ、α、γ、ε和δ，每条重链可以与K或λ轻链配对。血清中大部分抗体属于IgG类，人IgG有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四种同种型，其序列差异主要在铰链区。
如本文所用，“片段”在用于提及蛋白质或多肽时，是具有与完整天然存在的蛋白质/多肽的部分但不是全部氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质或多肽。片段可以是“独立的”或包含在较大的蛋白质或多肽中，它们在单个较大的蛋白质/多肽中形成作为单个连续区域的一部分或区域。
术语“单个可变结构域”是指包含抗体可变结构域序列特征的折叠多肽结构域。因此，它包括完整的抗体可变结构域，诸如VH、VHH和VL以及修饰的抗体可变结构域，例如，其中一个或多个环已被非抗体可变结构域特征的序列取代，或抗体可变结构域已被截短或包含N-或C-末端延伸，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。如本文所定义的单个可变结构域能够独立于不同的可变区或结构域结合抗原或表位。可认为“结构域抗体”或“DAB”与人“单个可变结构域”相同。单个可变结构域可以是人单个可变结构域，但也包括来自其他物种的单个可变结构域，诸如啮齿类(例如，如WO 00/29004中所公开的)、护士鲨和骆驼科VHHs。骆驼科VHHs是免疫球蛋白单个可变结构域多肽，其来源于包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼在内的物种，它们产生天然缺乏轻链的仅有重链的抗体。此类VHH结构域可以根据本领域可获得的标准技术进行人源化，并且此类结构域被认为是“单个可变结构域”。
如本文所用，术语“聚山梨醇酯”是指选自以下项的任何一种(或全部)常见的完整的聚山梨醇酯：聚山梨醇酯80(PS80)、聚山梨醇酯60(PS60)、聚山梨醇酯40(PS40)和聚山梨醇酯20(PS20)和它们的降解产物。完整的聚山梨醇酯是指以单酯存在时的聚山梨醇酯。可以通过本发明的方法检测的聚山梨醇酯的降解产物包括：长链脂肪酸(例如棕榈酸、亚油酸、油酸)、聚氧乙烯(POE)基团包括脂肪酸的POE酯和短链脂肪酸。图2：显示了聚山梨醇酯中两种最常见的降解类型的降解产物。
聚山梨醇酯通常用作食品和生物药物产品中的非离子表面活性剂。在生物药物产品中，它们用于防止蛋白质吸附到表面、聚集和颗粒形成。然而，已知当完整的聚山梨醇酯降解时会出现问题，例如，降解的聚山梨醇酯产物会引起药物产品注射剂的刺激，并且还会导致样品例如药品样品过度混浊。通常认为在药物产品中约10ppm至约5000ppm的完整的聚山梨醇酯是理想的量。
因此，极大的兴趣在于开发用于监测此类聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯的完整性的分析方法，并且特别是聚山梨醇酯80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯或TweenTM 80)，其是最常用的聚山梨醇酯。可商购的PS80是异质的，最常见的加工相关的亚种是聚氧乙烯(POE)基团、POE异山梨醇单酯和POE山梨糖醇/异山梨醇二、三、四酯。图1：显示了聚山梨醇酯(PS80)合成路径的最后两步。
然而，开发不仅检测完整的聚山梨醇酯诸如PS80以及PS60、PS40和PS20，还检测它们的降解产物的分析方法一直具有挑战性，并且需要此类方法，特别是需要能够应用于含有蛋白质的生物药物制剂的方法。此外，FDA等机构对药学上可接受的蛋白质材料的放行取决于蛋白质材料含有确定水平的聚山梨醇酯，包括某些聚山梨醇酯产物。
因此，本发明提供了能够鉴定此类聚山梨醇酯的方法，例如鉴定在药物制剂诸如含有蛋白质的生物药物制剂中的完整的聚山梨醇酯和/或降解的聚山梨醇酯产物。
本发明还提供了能够测量含有蛋白质或肽的生物药物制剂中的聚山梨醇酯的方法。如本文所用，术语聚山梨醇酯的“测量”是指所述聚山梨醇酯的鉴定和定量。所测量的聚山梨醇酯可以是完整的和/或降解的聚山梨醇酯产物。本文提供的方法是有利的，因为它们是准确的，可以在与传统HPLC相似的时间框内实施，并且不依赖于可能有问题的衍生化或胶束封装的使用。衍生化或胶束封装可能会增加样品制备的复杂性，取决于可能对精度产生负面影响的平衡动力学，并且可能会在基质中使用将对信噪比产生负面影响的另外的成分。
因此，本发明在第一方面提供了鉴定含有蛋白质例如抗体诸如mAb样品的样品中聚山梨醇酯，例如完整的聚山梨醇酯和/或降解的聚山梨醇酯产物的方法，包括使所述样品经受下列步骤：(i)通过将所述样品暴露于有机质子极性溶剂或有机非质子极性来沉淀所述蛋白质，
(ii)通过离心沉淀的样品使蛋白质或肽形成团粒从沉淀的样品中分离蛋白质，并获得液体上清液，
(iii)通过使上清液经受层析法分离聚山梨醇酯，其中层析法包括将上清液施加到包含固定化氰基基团的固定相柱上，并使用流动相组合物梯度洗脱结合的聚山梨醇酯，和
(iv)使用无发色团检测器检测分离的聚山梨醇酯以鉴定聚山梨醇酯。
沉淀和分离与洗脱步骤组合允许分离样品中的聚山梨醇酯产物，例如完整的和降解的聚山梨醇酯产物，并且检测步骤允许检测、鉴定和定量聚山梨醇酯产物，例如完整的和降解的聚山梨醇酯产物诸如PS80和/或PS60和/或PS40和/或PS20和它们的降解产物。在一个实施方案中，本文所提供的测量含有蛋白质的样品，例如抗体诸如mAb样品中完整的聚山梨醇酯的方法是定量的方法，其允许测量存在于所述样品中的完整的和/或降解的聚山梨醇酯诸如PS80和/或PS60和/或PS40和/或PS20的量。
在一个实施方案中，本发明的方法可以用于监测样品中完整聚山梨醇酯的降解，样品诸如含有蛋白质的样品，例如抗体诸如mAb样品，或表达异源治疗性基因的细胞或含蛋白质的载体，例如随时间推移评估此类含有蛋白质的样品的稳定性。
本发明还提供了测量含有蛋白质的样品中完整聚山梨醇酯的量的方法的用途，例如测量存在于此类样品中的完整PS80和/或完整PS60和/或完整PS40和/或完整PS20的量。
在本发明的第二方面，提供了用于鉴定蛋白质样品的方法，例如从多个蛋白质中，其中所述鉴定的蛋白质样品含有约10ppm至约5000ppm的完整的聚山梨醇酯，并且该方法包括下列步骤：
(a)测量所述蛋白质样品中的聚山梨醇酯，包括下列步骤：
(i)通过将所述样品暴露于有机质子极性溶剂或有机非质子极性溶剂来沉淀蛋白质，
(ii)通过离心沉淀的样品使蛋白质或肽形成团粒从沉淀的样品中分离蛋白质，并获得液体上清液，
(iii)通过使上清液经受层析法分离聚山梨醇酯，其中层析法包括将上清液施加到包含固定化氰基基团的固定相柱上，并使用流动相组合物梯度洗脱结合的聚山梨醇酯，和
(iv)使用无发色团检测器检测分离的聚山梨醇酯以鉴定聚山梨醇酯；
(b)鉴定来自(a)的蛋白质样品，其具有完整的聚山梨醇酯的水平为约10ppm至约5000ppm；
(c)分离并回收步骤(b)中鉴定的所述蛋白质。
在本发明第二方面的一个实施方案中，完整的聚山梨醇酯是PS80和/或PS60和/或PS40和/或PS20。
还提供了通过本发明第二方面的方法获得的或可获得的蛋白质，以及所述蛋白质在医药中，例如在制备用于向人受试者施用的药物制剂中的用途。
本发明还提供了从本发明第二方面的方法可获得或获得的蛋白质(例如抗体)，并且该蛋白质含有约10ppm至约4000ppm或至约3000ppm或至约2000ppm或至约800ppm或至约700ppm的完整存在的聚山梨醇酯，以及所述蛋白质在医药中，例如在制备用于向人受试者施用的药物制剂中的用途。
在一个实施方案中，当蛋白质是抗体或用于细胞疗法的细胞或表达异源治疗性基因的含有蛋白质的载体时，存在于蛋白质中的完整聚山梨醇酯的量为约10ppm至约700ppm。样品中存在的并且可以应用本发明的方法的蛋白质浓度可以为约5mg/mL至约300mg/mL、约5至约200mg/mL、约5至约50mg/mL、约5至约20mg/mL、约5至约10mg/mL、约10至约20mg/mL、约15或约20mg/mL至约50mg/mL。
本发明的方法可以应用于任何天然或重组蛋白质。蛋白质样品可以例如包含治疗性蛋白质、预防性蛋白质或诊断性蛋白质。例如，该方法可以应用于包含抗原结合构建体的样品，诸如抗体或抗体片段，例如抗体的生物学功能性片段，该方法也可以应用于疫苗组合物、细胞或含有表达异源治疗性基因的载体的蛋白质。
当蛋白质样品是抗体时，它可以是例如单克隆抗体(mAb)或双特异性或多特异性抗体或其片段。抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。在蛋白质是抗体片段的情况下，其可以是例如Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv、二硫键连接的scFv、双抗体、TANDABSTM、抗体的CDRs和前述任何的修饰形式。
抗体片段也可以是单个可变结构域(或dAb)，诸如人VH或VL单个可变结构域或衍生自非人来源诸如美洲驼或骆驼科的单个可变结构域，例如骆驼科VHH包括NanobodyTM(例如在WO 94/04678和WO 95/04079等中描述)。例如，也考虑使用任何这些抗体或单个可变结构域的CDR作为蛋白质支架的一部分。
用于本发明方法的蛋白质样品可以是在水性介质中的液体或悬浮液形式，或者它们可以例如冷冻干燥然后在水性介质中重构。蛋白质样品可以进一步包含另外的稀释剂，例如除了所述蛋白质和水之外的药学上可接受的稀释剂。此类药学上可接受的稀释剂的示例包括溶剂诸如水、氯化钠溶液、糖、缓冲液诸如乙酸盐、盐诸如氯化钠和/或其他赋形剂。在一个实施方案中，缓冲液是乙酸盐和柠檬酸盐。
本发明的方法特别适用于检测含有蛋白质的液体样品诸如液体生物药物制剂例如mAb制剂中的聚山梨醇酯，例如完整的聚山梨醇酯和聚山梨醇酯的降解种类，例如PS80和/或PS60和/或PS40和/或PS20。
本发明的方法还可以应用于包含寡核苷酸的样品、用于细胞疗法的工程化细胞以及基因疗法产品，诸如含有治疗性基因的工程化载体(例如病毒载体)，用于向人受试者施用。
本发明的方法还可以用于测量包含小分子的样品中的聚山梨醇酯，这些小分子是化学实体(NCE)，并且在此类NCE样品不包含蛋白质的情况下，可以省略蛋白质沉淀并且调整有机质子极性溶剂或有机非质子极性的量。
本发明的方法可以在宽的pH范围内实施，因为pH值对于本方法的性能不重要，例如从约pH 5至约pH 10、或约pH 6至约pH 8。根据本发明的方法分析的蛋白质样品pH可以是约pH 6.0至约pH 8.0，例如约7.4至约6.8的pH。
用于蛋白质沉淀步骤的有机质子极性溶剂是本领域中公知的，并且如本文所用的术语是指含有不稳定质子并且可电离的有机溶剂。可用于本发明方法的此类溶剂的示例是本领域技术人员公知的，包括例如甲醇、乙醇和异丙醇(IPA)。例如，当蛋白质是抗体时，甲醇、IPA或丙酮可用于蛋白质沉淀步骤。
用于蛋白质沉淀步骤的有机非质子极性溶剂也是本领域中公知的，并且如本文所用的术语是指不含有不稳定质子的有机溶剂。可用于本发明方法的此类溶剂的示例是本领域技术人员公知的，包括例如丙酮、四氢呋喃(THF)和乙腈。
该方法可以在宽的溶剂浓度范围内实施，并且当该方法在包含抗体的样品上实施时，体积/体积稀释可以是从约1份样品至约5、9或约19份溶剂。
离心步骤可以以足以获得蛋白质团粒的速度和时间实施，例如可以以至少约10,000rpm实施至少约10分钟。
分离步骤可以使用柱层析法实施，例如使用反相介质或混合模式保留层析法。此类混合模式层析法涉及两种或多种保留机制的组合使用，例如正常相、阳离子交换和阴离子交换。
在一个实施方案中，本发明的方法的分离步骤可以用本领域技术人员已知的方法在反相层析柱上实施，其中所述柱包含具有C3或更长的碳链的基团，例如C4直至约C18。
在一个实施方案中，柱包含固定化氰基基团，例如使用在固定相上包含固定化氰基基团的反相层析柱。氰基基团是本领域中公知的并且是包含基团-CN的任何化合物。在本发明的方法中可以使用任何氰基基团。可以根据本发明的方法有用地使用的包含CN基团的柱是Agilent Zorbax SB300-CN并且包括Agilent Zorbax SB300-CN、Phenomenex Luna CN或Agilent InfinityLab Poroshell 120EC-CN。
柱可以是具有例如约80埃或更大孔径大小的二氧化硅珠柱。在一个实施方案中，孔径大小为约120至约300埃。例如可以使用约300埃的孔径大小。合适的二氧化硅柱的示例包括：Agilent Zorbax SB300-CN、Phenomenex CN或Agilent InfinityLab Poroshell120EC-CN。在一个实施方案中，使用的柱是Agilent Zorbax SB300-CN，3.5um，150x 4.6mm(可从Agilent Co.，Santa Clara，CA，USA获得)。可以加热柱，例如柱的温度可以为约20℃至约80℃、或约40℃至约60℃或约50℃。
在一个实施方案中，使用梯度分离流动相实施洗脱步骤，其可以是例如A和B的梯度分离流动相。在一个实施方案中，采用A和B的梯度分离流动相，其中A为0.1％至约10％的酸或乙酸铵在H2O中的混合物，酸可以选自三氟乙酸(TFA)、甲酸、乙酸、二氟乙酸，并且B可以是甲醇、异丙醇或乙腈。在一个实施方案中，采用A和B的梯度分离流动相，其是0.1％三氟乙酸(TFA)在H2O中的混合物，并且B是甲醇或乙腈。可按照下文表1中的详细描述的实施A和B的梯度分离流动相。
表1
Figure BDA0003853443370000111
本发明的方法中使用的检测器是无发色团的检测器，并且此类检测器是在用于检测的样品无发色团时发挥功能的检测器。
在一个实施方案中，本发明的方法中使用的检测器可以是蒸发光散射检测器或质谱分析法可以用于检测。
在另一个实施方式中，荷电气溶胶检测器(CAD)用作本发明方法中的检测器，这是与例如高效液相色谱法(HPLC)结合使用，并通过对具有已经经过高压电晕线充电的氮气的非挥发性和半挥发性分析物进行充电来工作的检测器。荷电分析物粒子随后通过离子阱，去除高迁移率种类(即溶剂)并继续移动到收集器，在那里它们由灵敏的静电计测量。可以使用的CAD的示例包括Corona Veo(可从Thermo Waltham获得，MA，USA)、Corona Veo RS(可可从Thermo Waltham获得，MA，USA)和Vanquish(可从Waltham获得，MA，USA)、Corona Ultra和Ultra RS(可从Thermo Waltham获得，MA，USA)、Corona Plus(可从Thermo Waltham获得，MA，USA)。
CAD提供的特征之一是通过对分析物表面充电来测量完整种类的能力，与产生荷电片段的质谱分析法不同。另外，对于具有相似表面积和密度的分析物，其响应是相似的。最后，如果使用非常易挥发的洗脱液，CAD方法也可以非常灵敏(亚纳克)。
虽然CAD易于操作，但在开发标准HPLC-UV/Vis分析方法时还有另外的考虑。其中包括：(1)选择不脱落的柱；(2)在流动相中使用高纯度溶剂以获得低、可重现的基线；(3)清洁玻璃仪器和塑料，因为污染物干扰的可能性更大。使用CAD时实现特异性是重要的，因为无法像使用二极管阵列或质谱仪(MS)检测那样辨别峰纯度。还应当指出，如果没有实现特异性，观察到的信号不仅仅是UV-Vis分光光度法中响应的总和，并且响应的差异通常因分析物的电荷、表面积、密度和挥发性参照流动相的成分的差异而复杂化。由于这些原因，CAD非常适合作为分析PS80的检测器。
在一个实施方案中，在本文所述的方法中使用的荷电气溶胶检测器(CAD)是Corona Veo RS(可从Thermo，Waltham获得，MA，USA)。
使用CAD实施的检测步骤导致获得层析图，该层析图中的基线是使用选定的空白溶液获得的，并且其中包含样品中完整聚山梨醇酯、降解产物以及蛋白质和赋形剂的峰面积。使用曲线下面积计算的峰面积的评估允许对聚山梨醇酯诸如PS80、和/或PS60、和/或PS40和/或PS20及其降解产物进行定量。在一个实施方案中，该方法允许鉴定PS80，例如完整和降解的PS80。
当我们提及使用本发明的方法进行分离时，其意思是必须从油酸峰中分离出完整的聚山梨醇酯峰(即单酯)。油酸峰和完整的聚山梨醇酯单酯峰之间的分离度为1.5或更高。其他峰仅需要简单地相互区分。另外，在一个实施方案中有特异性要求，即在完整聚山梨醇酯(即单酯)的保留时间不存在按面积计大于约3％的干扰峰。在一个实施方案中，本发明提供了鉴定含有蛋白质(例如抗体样品)的样品中的聚山梨醇酯的方法，其包括：
(i)通过将所述样品暴露于甲醇或IPA沉淀蛋白质，
(ii)通过离心沉淀的样品使蛋白质或肽形成团粒从沉淀的样品中分离蛋白质，并且获得液体上清液，
(iii)通过以下方法分离所述聚山梨醇酯：使上清液在二氧化硅柱上经受反相HPLC，该二氧化硅柱具有约300埃的孔径大小并且其包含固定化氰基基团，并且使用由A和B组成的流动相组合物梯度洗脱，其中A是0.1％三氟乙酸(TFA)在H2O中的混合物且B是甲醇或乙腈，
(iv)使用荷电气溶胶检测器(CAD)检测分离的聚山梨醇酯以鉴定聚山梨醇酯产物。
实施例
参照下列实施例进一步描述本发明。这些实施例仅为了示出本发明的各种方面并且不旨在作为本发明的限制。
实施例1：经由以下任一种方法测量存在于mAb药物产品中的PS80及其亚种的比较：(i)根据本发明的方法的新型HPLC-CAD分析，具有定量PS80单酯的能力，和(ii)使用蒸发光散射检测的改进的HPLC方法—HPLC-ELSD方法。
使用的试剂和方法如下：
多药典J.T.Baker PS80购自Fisher Scientific(Atlanta，GA，USA，02-003-654)。两种来源的PS80购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)：(1)储存在天然着色塑料容器的PS80(Part#P1754-25ML)，和(2)储存在琥珀、玻璃容器中的PS80(Part#59925-100G)。超精制PS80购自Croda Health Care(Edison，NJ，USA，SR48833)。符合ChP的全油酸酯PS80购自NOF(White Plains，NY，USA)、非GMP PS80、POLO80(HX2)19B803364)。聚山梨醇酯60购自USPReference Standard(Rockville，MD，USA，154794)。聚山梨醇酯40购自Fisher Scientific(Atlanta，GA，USA，AC334142500)。油酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA，75090-5ML)。亚油酸购自Fisher Scientific(Atlanta，GA，USA，AC215040250)。棕榈酸购自MPBiomedicals(Santa Ana，CA，USA，100905-10G)。棕榈油酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA，76169)。层析(LC-MS或GC)级甲醇购自Fisher Scientific(Atlanta，GA，USA，A456-4)或VWR(Honeywell/Burdick和Jackson，GC级，纯度≥99.9％，BJGC 230-4)。Milli-Q水净化***(Millipore Corporation，Burlington，MA，USA)用于产生超纯水(MilliQ水)。三氟乙酸(TFA)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA，91707-10x1 mL)。其他沉淀溶剂(异丙醇、丙酮、四氢呋喃(THF))为层析级，购自Sigma-Aldrich。对于HPLC-ELSD方法，HPLC级甲醇(646377-4L)和乙腈(439134-4L)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。HoneywellFluka甲酸(94318-250ML)购自Fisher Scientific(Atlanta,GA,USA,AC334142500)。
使用的仪器和分析条件如下：
蛋白质沉淀和PS80提取：
对于新型HPLC-CAD分析方法，其以下列方法实施：
为了在注射前去除蛋白质[即mAb药物产品]，经由沉淀溶剂(甲醇、异丙醇和/或丙酮)沉淀蛋白质。另外，采用沉淀来破坏任何潜在的蛋白质-PS80相互作用并抑制任何脂肪酶或酯酶发生的降解。由于去除一些聚山梨醇酯种类，过滤不是一个可行的选择。因此，在预先冲洗(使用甲醇或沉淀溶剂)的1.5mL Eppendorf安全锁管(Hauppauge,NY,USA,022363204)中将900μL沉淀溶剂添加到100μL样品中。然后通过涡旋将样品制备物简单混合(约5秒)，并以14,000rpm离心10min。PS80种类和脂肪酸仍然可溶于上清液中。将至少60μL上清液转移到配备300μL内插管的HPLC样品瓶中。
通过将100±10mg多药典J.T.Baker PS80称量至100mL A级容量瓶并用甲醇稀释至容量来制备1,000ppm PS80储备标准溶液。将100μL MilliQ水、20μL 1,000ppm PS80储备标准溶液和880μL甲醇在预冲洗(带有沉淀溶剂)的1.5mL Eppendorf管中通过涡旋混合制备20ppm PS80工作标准溶液。因此，标准品的最终稀释组合物(90％沉淀溶剂：10％MilliQH2O/水)与样品的相同。PS60、PS40和PS20溶液以相同的方式制备。
制备分离度检查溶液，其包含20ppm PS80和5ppm油酸储备标准溶液。通过将898μL有机溶剂、100μL水和2μL 1,000ppm PS80储备标准溶液混合制备灵敏度溶液。批量制备mAb制剂缓冲液，等分并储存在-70℃直至分析当天。通过用LC-MS或GC级甲醇稀释制备20ppmPS80制剂缓冲液制备物。无蛋白质的样品制备物不需要离心步骤。
对于热应激样品，将多个含有mAb/蛋白质的制剂的样品瓶在-70、5、25和40℃孵育3周，并在每个时间点(初始、1、2、3、4、7、14和21天)从温箱中移除一个小瓶并在-70℃冷冻直至分析的时间。
对于改进的HPLC-ELSD分析方法，其实施方法如下：
由于怀疑的PS80-蛋白质相互作用并且为了阻止任何酶促降解，蛋白质用甲醇沉淀，而不是用水稀释。为了沉淀蛋白质并提取PS80，在1.5mL微量离心管中将800μL有机溶剂添加到的200μL样品中并涡旋混合。混合后，将样品在5℃下以10,000rpm离心30分钟。离心后，将200μL上清液转移到配备300μL内插管的HPLC样品瓶中。
样品中PS80含量的定量是通过制作校准曲线来实现的。由于HPLC-ELSD检测器的性质，标准曲线的基质必须是样品的代表。为了获得具有代表性的基质，将500mg多药典J.T.baker PS80称量至50.0-mL低光化A级容量瓶中，并用HPLC级甲醇稀释至容量以制备10,000ppm PS80储备溶液。然后，将0.5mL 10,000ppm PS80储备溶液添加到10.0-mL容量瓶中，并用HPLC级甲醇定容以制备500ppm储备溶液。500ppm储备溶液用于制备甲醇/水溶液(80:20v/v)中的校准标准品，预期PS80浓度为10、25、50、100、150、200和250ppm。通过用HPLC级甲醇稀释制备20ppm PS80制备物。对于无蛋白质的制备物不实施离心步骤。图9中提供了样品层析图。概括来说，图9显示了使用改进的HPLC-ELSD方法收集的层析图叠加(200ppm标准溶液(多药典J.T.Baker PS80)、具有降解的PS80的mAb样品和空白溶液)。在图9中，200ppm标准品具有最大峰，-20样品具有中间较小的峰。
新型HPLC-CAD方法：
Agilent HPLC 1260***(Santa Clara，CA，USA)包括二元溶剂管理器、设置为23℃的样品管理器、设置为50℃的柱温箱和荷电气溶胶检测器(CAD)Veo RS(Thermo，Waltham，MA，USA)。CAD经由80cm的管道(Agilent，01078-87305)直接连接到分析柱，该管道通过180mm的管道(Agilent，G1313-87305)直接连接到3μL帕尔贴(peltier)。HPLC柱加热器经由标准管道连接到HPLC自动进样器，并且UV-VIS和柱转换阀均被绕过。
分析柱是来自Agilent Technologies(Wilmington,DE,USA)的Zorbax SB300-CN(150mm x 4.6mm,3.5μm
Figure BDA0003853443370000151
863973-905)。采用包含溶于MilliQ水中的0.1％v/v TFA(MP A)和100％LC-MS或GC级甲醇(MP B)的挥发性流动相(MP)。另外，通过对35％MP A:65％MP B以1.2mL/min流动，并确保CAD的基线水平在10mV以下并使用上文列出的参数，对流动相的洁净度进行预筛选。通过在1.2mL/min流速下梯度洗脱(溶于MilliQ水中的0.1％TFA为：0min-100％；1min-100％；3min-50％；8min-50％；27min-5％；30min-5％；和30.1min-100％)实现PS80亚种的分离。该方法的总运行时间为40min。进样体积为30.0μL。ThermoVeo RS CAD在以下设置下运行：蒸发温度，60℃；幂函数，1.00；输出偏移，0％；过滤器，5.0sec；范围100pA。使用内部氮气供应。通过使用e-SAT/IN模块(Waters，Milford，MA，USA，668000230)将CAD模拟信号转换为数字信号。
改进的HPLC-ELSD方法：
该方法是对Hewitt和Koppolu方法的改进。Agilent HPLC 1100***(SantaClara，CA，USA)包括二元溶剂管理器、设置为25℃的样品管理器、设置为30℃的柱温箱和1260Infinity G4260B蒸发光散射检测器(ELSD，Agilent Technologies，Wilmington，DE，USA)。ELSD直接连接到分析柱，分析柱直接连接到3μL帕尔贴(peltier)。HPLC柱加热器经由标准管道连接到HPLC自动进样器，并且UV-VIS和柱转换阀均被绕过。
分析柱是来自Waters Corporation(Milford,MA,USA)的
Figure BDA0003853443370000161
MAX(20mm x2.1mm,30μm
Figure BDA0003853443370000162
Part#186002052)。采用包含溶于MilliQ的2％v/v甲酸和溶于异丙醇的2％v/v甲酸的挥发性流动相。在1.0mL/min流速下通过梯度洗脱(溶于MilliQ水的2％甲酸为：0min-90％；1min-80％；3.4min-80％；3.5min-0％；4.5min-0％；4.6min-90％；和10min-90％)实现分离，在运行的前4min将流量从ELSD中转移。进样体积为50.0μL。Agilent1260Infinity G4260B ELSD在以下设置下运行：LED，10；增益(PMT)，2；平滑(Smth)，1；数据输出，80Hz；蒸发温度，80℃；雾化器温度，50℃；气流(SLM)，1。使用内部氮气供应。通过使用e-SAT/IN模块(Waters，Milford，MA，USA，668000230)将CAD模拟信号转换为数字信号。
对于新型HPLC-CAD分析方法数据分析、积分和计算，以下列方法实施：
报告了一式三份制备物的PS80单酯浓度的平均值。为了定量总酯(单酯和多酯)以与改进的HPLC-ELSD方法进行比较，通过将线性制备物中PS80单酯和多酯的面积分组，制作了总酯的校准曲线。因此，HPLC-CAD方法中的总酯面积类似于改进的HPLC-ELSD方法中的单峰；POE基团不包含在单峰中，因为在每次进样的前4min，当阀门开关转向废液时它们会被洗脱。
采用阿仑尼乌斯(Arrhenius)动力学模型评估PS80降解速率并估计稳定性或活化能(Ea)。假设PS80单酯的水解降解是伪一级的，如先前所述。速率常数由浓度比时间的自然对数曲线的斜率确定，假设动态粘度的变化没有显著影响。对于所有线性图，如先前所实施斜率的相对误差分析：
Figure BDA0003853443370000163
其中n是数据点的数量，a是斜率，b是y-截距。
对于改进的HPLC-ELSD分析方法，使用Empower 3实施数据分析、积分和计算，从而允许批量数据处理以获得保留时间、峰面积和其他层析图的品质因数。类似地，对于新型HPLC-CAD方法，使用Empower 3实施数据分析、积分和计算，从而允许批量数据处理以获得保留时间、峰面积、分离度、S/N和其他层析图的品质因数。
结果：
发现上述新型HPLC-CAD方法可以准确和精确地定量PS80单酯，并且定性/半定量地监测其他四组亚种。为简单起见，我们选择了一个线性的浓度范围，即使CAD响应是非线性的。校准曲线也可以通过应用幂函数算法进行线性化；然而，如果没有基线再现性，此类算法可能并不总是正确的。
通过评估以下各项中加标的PS80的回收率来评估基质干扰：(1)不含PS80的IgG药物产品；和(2)具有完全降解的(<定量限(LOQ))PS80单酯的mAb样品(参见表2和下文的讨论)。含有蛋白质的降解的样品在含有海藻糖、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、mM EDTA和PS80的水性缓冲液中。含有蛋白质的其他样品在含有海藻糖、柠檬酸盐、EDTA和PS80的水性缓冲液中。为了评估降解样品的特异性，还将脂肪酸(亚油酸、棕榈酸、油酸和棕榈油酸)以5ppm的浓度加标到20ppm PS80工作标准溶液中(参见图3)。概括来说，图3显示了使用HPLC-CAD方法获得的层析图，详细说明了定量PS80单酯和定性/半定量地监测其他四组亚种。它显示了空白(虚线)和用10ppm脂肪酸加标的20ppm PS80(多药典J.T.Baker)标准溶液(实线)的叠加。峰：1＝未保留的制剂缓冲液成分(海藻糖、氨基酸、EDTA、溶剂中的盐杂质和/或样品残留物)；2＝POE组；3＝棕榈油酸；4＝亚油酸；5＝棕榈酸；6＝油酸；7＝PS80单酯(山梨聚糖和异山梨醇)；8＝二酯；9＝三酯；10＝四酯；*如果存在，来自Eppendorf管的污染物。假设PS80峰的鉴定与先前报道的LC-MS结果[17,30]一致，并且与基于分析物相对疏水性的预期洗脱顺序一致。
完成了mAb药物产品的方法资格验证。
它由精度、线性度、准确度、特异性和LOQ组成(表2)。每次进样使用CAD响应，计算平均浓度、标准偏差和相对标准偏差。通过对两到三次机会的一式三份制备物的平均值的分析来评估精度。还使用制剂缓冲液(或测定对照)通过对两名分析人员在五次测定机会中重复进样的重复性分析来评估精度。中间精度由一名分析员在一个***上实施两次独立的测定机会，而第二位分析员在第二个***上实施三个独立的测定机会来确定。
表2.PS80单酯在制剂缓冲液和mAb制剂中的准确度、可重复性、中间精度和线性度。
Figure BDA0003853443370000181
mAb药物产品一式三份进行测试，并对结果进行统计分析以确定平均浓度、标准偏差和相对标准偏差。
经由两名分析员重复五次独立的测定机会来评估线性度。每条曲线的决定系数(R2)通过线性回归确定。使用加标回收方法确定准确性。两名分析员在五次分析机会中一式三份将20ppm PS80引入制剂中不含PS80的样品中。该制备物也用于确认特异性。特异性还通过分离度检查溶液中PS80单酯和油酸峰的分离度以及确保在90％有机溶剂/10％水空白进样中PS80单酯的洗脱窗口(±0.5min)内没有干扰峰来评估。由于CAD是通用检测器并且有时会检测到少量污染物，峰特异性显示为没有观察到相对于标准面积大于2％面积的峰。对于2ppm PS80溶液，信噪比(S/N)估计为≥10。
表3.PS80单酯的重量调整峰面积。
Figure BDA0003853443370000182
*对20ppm PS80溶液的峰面积进行重量调整(重量调整后的峰面积＝测量峰面积*(实际重量(mg))/100mg)至100.0mg的精确质量，以便直接比较。
使用这种方法测试了多种来源和类型的PS80(表3)。如图4所示，每个PS80来源的层析图在视觉上具有可比性。概括来说，图4显示了多种来源的PS80(实线)和空白(虚线)的层析图：(A)符合ChP的全油酸酯PS80；(B)储存在琥珀、玻璃容器中的Sigma-Aldrich PS80；(C)Croda超精制PS80；(D)储存在天然着色塑料容器中的Sigma-Aldrich PS80；(E)多药典J.T.Baker PS80。
假设全油酸酯PS80和多药典J.T.Baker PS80中的PS80单酯相同，由于分子量稍大，全油酸酯PS80的峰面积会更高。聚山梨醇酯合成路线的不一致导致观察到批次之间亚种的一些变化性。已证明物理化学性质在批次之间不同。如Sigma-Aldrich PS80的备用储存容器所证明的，推荐使用与生物药物制剂中使用的PS80相同来源和批次的材料制备PS80标准溶液。
还评估了聚山梨醇酯40(PS40，聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)和聚山梨醇酯60(PS60，聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单硬脂酸酯)(图5)，每个层析谱从多酯中分离出单酯。概括来说，图5显示了多种聚山梨醇酯(实线)和空白(虚线)的层析图：(A)聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)；(B)聚山梨醇酯40(PS40，聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)；(C)聚山梨醇酯60(PS60，聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单硬脂酸酯)；(D)聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)。每个层析谱从多酯中分离出单酯。PS60似乎含有两种主要的单酯形式或大量的POE异山梨醇单酯；可能需要经由质谱法进一步研究来辨别这些峰的身份。多药典聚山梨醇酯20(PS20，聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)也包括在内，但产生了复杂的层析图(SM图7)。先前已经报道了使用PS20的复杂层析图，而使用全月桂酸酯PS20实现了较为简单的层析图。PS60似乎含有两种主要的单酯形式或大量的POE异山梨醇单酯；可能需要经由质谱法进一步研究来辨别这些峰的身份。
因此，该方法对PS20、PS40和PS60具有有用的应用。
为了评估PS80单酯方面的方法的准确性和特异性，使用mAb对单酯完全降解的样品进行加标和分析。PS80单酯降解是经由将样品在5℃下孵育36个月实现的(图6)。概括来说，图6显示了使用HPLC-CAD方法获得的PS80单酯的层析谱，该样品单酯完全降解，使用mAb进行加标并分析。PS80单酯降解是经由将样品在5℃下孵育36个月实现的。该图显示了通过新型CAD方法收集的层析图的叠加，表明多酯的峰展宽是由于mAb产品在5和-20℃下储存36个月时的氧化降解。另外，单酯几乎完全降解与POE基团的增加一致。标准品是J.T.Baker，多药典PS80。17.5min的峰是来自未预冲洗的Eppendorf管的可变污染物。分析降解的样品，确认不存在可量化的量的PS80单酯(<LOQ)。正如预期的那样，PS80单酯的降解产生了显著增加的POE基团。为了确定随后的降解是否会干扰单酯定量，采用了加标回收方法。降解的样品制备物用20ppm PS80加标，这与200ppm PS80样品浓度相关。PS80单酯的回收值为93％，证实了降解产物的显著增加不会对单酯的检测产生不利影响。另外，多酯峰略有下降并表现出峰展宽。这很可能归因于在参与自由基诱导的降解后，疏水性和/或大小略有不同的氧化降解物的降解和重整。
ELSD和CAD方法的比较：
使用这两种方法制备和测试了一系列样品。样品是在5℃和-20℃下储存36个月的制剂缓冲液和mAb产品，有或没有一个冻融(FT)循环。由于改进的ELSD方法在前4min内包含转移，因此据称POE基团和蛋白质不会通过检测器，如从先前报道的方法中推断的那样。两种方法中总酯的直接比较总结在表4中，并表现出良好的一致性。
表4.用36M，5℃mAb样品对改进的HPLC-ELSD方法和新型CAD方法的比较。一致性百分比计算为，％一致性＝[C2/C1]*100％，其中C1和C2分别是通过HPLC-HPLC-ELSD和HPLC-CAD方法测定的PS80总酯浓度。
Figure BDA0003853443370000201
1改进的HPLC-ELSD方法；2新型HPLC-CAD方法。
该方法已用IgG1、IgG2和IgG4 mAbs进行了验证(表5)。在本次调查中发现，一些沉淀溶剂(例如丙酮、THF)在制剂缓冲液中对PS80单酯或亚种的回收率很低或很差(数据未显示)。
表5.新型CAD方法已验证的多种mAb制剂。
Figure BDA0003853443370000211
实施例2：PS80动力学研究：通过用新型HPLC-CAD方法定量每个时间点(初始、1、2、4、7、14和21天)的PS80单酯和亚种的量，获得浓度-时间数据(图7)。概括说，图7显示了样品在5、25、40或-70℃下最长21天的PS80降解动力学。定量了(A)单酯、(B)多酯(二酯、三酯和四酯)、(C)POE基团和(D)总质量平衡。在这里，PS80单酯峰是真正定量的，而亚种是半定量的。通过用新型HPLC-CAD方法定量每个时间点(初始、1、2、4、7、14和21天)的PS80单酯和亚种的量，获得浓度-时间数据。对于真正可定量的PS80单酯，用5、25和40℃数据的速率常数为PS80单酯的降解编制了阿仑尼乌斯(Arrhenius)图，结果是PS80单酯的活化能35.8±7.2kJ/mol；线性最小二乘拟合结果是y＝4311.5x-0.1696，R2＝0.961(图8)。观察到的活化能与先前公布的PS80水解观察结果相似，Kishore报告了约35kJ/mol的活化能用于降解前～30％的PS80。然而，所采用的分析方法不具有区分单酯和多酯形式的特异性。在我们的研究中，由于降解很可能是由于脂肪酶的存在而导致的水解降解，本研究中多酯的峰展宽非常小，因此，也定量了POE基团和多酯(图7)。通过将POE基团、PS80单酯和多酯的浓度(ppm)相加来计算质量平衡；所有质量平衡数据的精度<10％。在40℃下观察到的油酸量可忽略不计。
多药典J.T.Baker中的PS80单酯的稳定性明显低于多酯。这与先前公布的数据一致。虽然单酯非常易降解，但仍有可能通过大量多酯的保留来使其免受蛋白质聚集或实现胶体稳定性。
在过去，怀疑的蛋白质-PS80相互作用被认为会降低含蛋白质药物产品中测定的初始PS80的含量。有趣的是，该方法还可以测定是否发生快速降解，因为PS80单酯浓度会降低并且POE基团会相应增加。如果POE基团没有增加，则很可能是与蛋白质或容器的相互作用。
结论：
使用HPLC-CAD为生物药物制剂中的PS80开发了一种新颖、灵敏且特异的平台分析方法。该方法采用蛋白质沉淀来减轻可能妨碍特异性的潜在干扰，并终止任何活性降解酶(例如脂肪酶和酯酶)。使用PS40、PS60和多种类型的PS80证明了特异性。使用多种类型的IgG mAb的方法的应用为该方法使用新鲜和严重降解的药物产品可获得的特异性提供了进一步的支持。
对该方法验证了层析法的特异性，从而监测PS80单酯、POE山梨糖醇/异山梨醇、脂肪酸和多酯亚种的降解。资格验证研究得出结论，该方法在重复性(2.2％RSD)、中间精度(6.5％RSD)、准确度(101％回收率)、线性度(平均R2≥0.999)、特异性(在基质中未观察到干扰峰并且Rs≥1.5油酸/PS80单酯)和定量限(样品～20ppm以及2ppm无蛋白质的样品)方面表现出足够的性能。对严重降解的mAb药物产品的研究表明，PS80单酯在低于LOQ的情况下降解，并且可以获得可接受的回收率(93％)。应当注意，PS80单酯的减少伴随着POE基团的增加。严重降解的研究还允许通过定量所有酯化的PS种类，将特定方法与具有低特异性的已建立的方法进行了比较。
因此，总而言之，上述分析CAD方法已被证明可提供有关生物药物产品中PS80的选择的、敏感的和特异的定量和定性信息。通过对沉淀溶剂采用改进，使用多种IgG mAbs亚型(IgG1、IgG2和IgG4)证明了其作为适用于验证的平台方法的潜力。因此，该方法是支持这些mAbs和其他生物药物产品稳定性研究的有价值的工具。

Claims (25)

1.鉴定含有蛋白质的样品中的聚山梨醇酯的方法，其包括：
(i)通过将所述样品暴露于有机质子极性溶剂或有机非质子极性溶剂来沉淀所述蛋白质，
(ii)通过离心所述沉淀的样品使所述蛋白质或肽形成团粒(pellet)从所述沉淀的样品中分离所述蛋白质，并获得液体上清液，
(iii)通过使所述上清液经受层析法分离所述聚山梨醇酯，其中所述层析法包括将所述上清液施加到包含固定化氰基基团的固定相柱上，并使用流动相组合物梯度洗脱所述结合的聚山梨醇酯，和
(iv)使用无发色团检测器检测所述分离的聚山梨醇酯以鉴定聚山梨醇酯。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法鉴定完整的聚山梨醇酯和/或降解的聚山梨醇酯产物。
3.根据权利要求1-2的方法，其进一步包括定量聚山梨醇酯。
4.根据权利要求1-3的方法，其中所述蛋白质样品包含抗体。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白质是单克隆抗体或其片段。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法检测选自以下任一种的聚山梨醇酯：PS80、PS60、PS40和PS20。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述无发色团检测器是荷电气溶胶检测器(CAD)。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白质样品包含醋酸盐或柠檬酸盐缓冲液。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品中的所述蛋白质以约5mg/mL至约300mg/mL的浓度存在。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使用选自以下的溶剂进行所述蛋白质沉淀：甲醇、异丙醇(IPA)、THF或丙酮。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使用包含固定化氰基基团的反相HPLC柱进行所述聚山梨醇酯的分离。
12.根据权利要求11的方法，其中所述柱是具有≥80埃的孔径大小的二氧化硅柱。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使用梯度分离的流动相进行所述洗脱，该流动相由缓冲液A和缓冲液B组成，其中缓冲液A是0.1％三氟乙酸(TFA)在H2O中的混合物且缓冲液B是甲醇或乙腈。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使用温度为约20℃至约80℃的加热柱进行所述聚山梨醇酯的分离。
15.根据权利要求1的方法，其包括：
(i)通过将所述样品暴露于甲醇或IPA沉淀所述蛋白质，
(ii)通过离心所述沉淀的样品使所述蛋白质形成团粒从所述沉淀的样品中分离所述蛋白质，并获得液体上清液，
(iii)通过以下方法分离所述聚山梨醇酯：使所述上清液在二氧化硅柱上经受反相HPLC，所述二氧化硅柱具有约300埃的孔径大小并且其包含固定化氰基基团，并且使用由A和B组成的流动相组合物梯度洗脱，其中A是0.1％三氟乙酸(TFA)在H2O中的混合物且B是甲醇或乙腈，
(iv)使用荷电气溶胶检测器(CAD)检测所述分离的聚山梨醇酯以鉴定聚山梨醇酯。
16.鉴定蛋白质样品的方法，其中所述鉴定的蛋白质样品含有约10ppm至约5000ppm的完整的聚山梨醇酯，并且所述方法包括以下步骤：
(a)测量所述样品中的聚山梨醇酯，包括下列步骤
(i)通过将所述样品暴露于有机质子极性溶剂或有机非质子极性溶剂来沉淀所述蛋白质，
(ii)通过离心所述沉淀的样品使所述蛋白质或肽形成团粒从所述沉淀的样品中分离所述蛋白质，并获得液体上清液，
(iii)通过使所述上清液经受层析法分离所述聚山梨醇酯，其中所述层析法包括将所述上清液施加到包含固定化氰基基团的固定相柱上，并使用流动相组合物梯度洗脱所述结合的聚山梨醇酯，和
(iv)使用无发色团检测器检测所述分离的聚山梨醇酯以鉴定聚山梨醇酯；
(b)鉴定来自(a)的所述蛋白质样品，其具有完整的聚山梨醇酯的水平为约10ppm至约5000ppm，
(c)分离并回收步骤(b)中鉴定的所述蛋白质。
17.根据权利要求16的方法，其中步骤(c)中分离的所述蛋白质样品含有约10ppm至约700ppm的完整的聚山梨醇酯。
18.根据权利要求16或17的方法，其中所述聚山梨醇酯是PS80。
19.根据权利要求16-18的方法，其中所述无发色团检测器是荷电气溶胶检测器(CAD)。
20.根据权利要求16-19所述的方法获得的或可获得的蛋白质或肽聚山梨醇酯。
21.根据权利要求20的蛋白质，其是单克隆抗体或其片段。
22.根据权利要求20-21的蛋白质用于医药。
23.根据权利要求20-21的蛋白质在治疗或诊断人受试者中的用途。
24.根据权利要求20-21的蛋白质在制备用于治疗人受试者的疾病的药物中的用途。
25.药物制剂，其包含根据权利要求20-21的蛋白质与一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合。
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