WO2005065717A2 - Flüssigformulierungen von antikörperkonjugaten - Google Patents

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WO2005065717A2
WO2005065717A2 PCT/EP2004/014589 EP2004014589W WO2005065717A2 WO 2005065717 A2 WO2005065717 A2 WO 2005065717A2 EP 2004014589 W EP2004014589 W EP 2004014589W WO 2005065717 A2 WO2005065717 A2 WO 2005065717A2
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cyclodextrin
antibodies
conjugate
cancer
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Karoline Bechtold-Peters
Christian Berger
Stefan Bassarab
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Boehringer Ingelheim International Gmbh
Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg
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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutical compositions of antibodies, preferably of antibodies, which are conjugated to an effector molecule.
  • the present invention relates to stable liquid formulations of Antikö ⁇ er-DM1 complexes.
  • Recombinant antibody molecules have been known for a long time in the prior art, for example humanized mouse antibodies (Shin et al, 1989; Güssow et Seemann, 1991), bispecific antibodies (Weiner et al, 1993; Goodwin, 1989), (scFv, Johnson et Bird, 1991), complete or fragmentary immunoglobulins (Coloma et al, 1992; Nesbit et al, 1992; Barbas et al, 1992) or antibodies generated by chain shuffling (Winter et al, 1994).
  • Fully human antibodies can be produced by, for example, "phage display” methods (Aujame et al., 1997; US 5,885,793; US
  • conjugates from antibodies with effector molecules are known, such as, for example, s77 ⁇ g / ec / «antibodies / toxin fusion proteins (Chaudhary et al, 1990; Friedman et al, 1993); Conjugates from antibodies with radioactive isotopes such as 131 I, n ⁇ In, 99m Tc or radioactive compounds (Larson et al, 1991; Thomas et al, 1989; Srivastava, 1988), enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase (Catty et Raykundalia, 1989) , with fluorescent dyes (Johnson, 1989) or biotin molecules (Guesdon et al, 1979); Toxins (Vitetta et ⁇ /., 1991; Vitetta et Tho ⁇ e, 1991; Kreitman et ⁇ /., 1993; Theuer et al, 1993), cytostatics (Schrappe et al, 1992), prod
  • CD44 is a protein that is expressed in various isoforms on a variety of cells (see e.g. for further information WO02 / 094879A1; WO02 / 094325 A2). However, the expression of the splice variants that contain the domain v6 (CD44v6) in the extracellular region is restricted to a part of epithelial tissue.
  • CD44v6 like other variant exons (CD44v3, CD44v5, CD44v7 / v8, CD44vlO), is a tumor-associated antigen with a favorable expression pattern in human tumors and normal tissue (Heider et al., 1995; Heider et al., 1996; Dali et al., 1996; Beham-Schmid et al., 1998; Tempfer et al, 1998; Wagner et al., 1998).
  • Antibodies are known in the prior art which are specific for certain splice variants of CD44 (CD44v, CD44var) which are only expressed on a subset of epithelial cells. Examples include the CD44v6-specific antibodies (WO02 / 094879A1), in particular also as conjugates with radioactive or cytotoxic substances, and in particular as conjugates with mantansinoids (WO02 / 094325A2).
  • the present invention encompasses pharmaceutical preparations of antibodies.
  • the stability of the product, preferably of antibodies which are conjugated to an effector molecule, can be increased by adding cyclodextrins and / or by lowering them increase the pH value.
  • the present invention relates to stable liquid
  • Figure 1 Influence of the pH value on the formation of free DM1 and its derivatives in liquid formulated antibody DMl complexes. Stress stability study over 8 weeks at 40 ° C. The difference between the content of the DM1 derivatives of the 4-week value at zero is shown, as well as the difference between the content of the DM1 derivatives of the 8-week value at zero.
  • Figure 2 Influence of the addition of various cyclodextrins in the weight ratios 1, 5 and 15% by weight on the formation of free DM1 and its derivatives in liquid-formulated antibody DMl complexes. Stress stability study over 8 weeks at 40 ° C. The difference between the content of the DM1 derivatives of the 4-week value and the zero value is shown, as well as the difference between the content of the DM1 derivatives of the 8-week value and the zero value.
  • the present invention relates to pharmaceutical compositions containing stable formulations of antibody-effector molecule conjugates and methods for producing stable antibody-effector molecule conjugates.
  • the effects according to the invention were surprisingly achieved by lowering the pH of the active ingredient solution to pH 5-6, preferably pH 5.5 ⁇ 0.2.
  • these advantages can be achieved by adding at least one cyclodextrin.
  • the. Invention a pharmaceutical composition containing a conjugate of an antibody and a maytansinoid in aqueous solution, which is characterized in that the solution has a pH of 5-6.
  • a pharmaceutical composition containing a conjugate of an antibody and a maytansinoid in aqueous solution, which is characterized in that it contains a cyclodextrin.
  • a composition comprising a mixture of an antibody conjugate, at least one cyclodextrin, and water.
  • a detergent is also advantageous.
  • an amphiphile can also be used, as described in more detail below.
  • the invention relates to formulations of antibody conjugates.
  • antibody and “antibody molecule” are synonymous.
  • Antibodies can be complete immunoglobulins containing two heavy and two light chains, fragments of such immunoglobulins such as Fab, Fab ', or F (ab) 2 fragments, recombinantly produced antibody molecules such as chimeric, humanized or completely human antibodies.
  • Antibody conjugate means a complex of antibodies and effector molecules. The effector molecule is preferably linked to the antibody by a covalent bond.
  • HER2 Antikö ⁇ er such as Herceptin ® (trastuzumab, Genentech, Inc.), VEGF specific antibodies such as bevacizumab (Genentech, Inc.); Rituxan (rituximab), anti
  • An antibody conjugate according to the invention can be obtained from one of the inventive
  • Antibodies and an effector molecule are produced, optionally in combination with a connecting molecule, a so-called linker.
  • effector molecules are: toxins, such as the maytansinoids preferred below, or the DM1 mentioned by way of example, radioactive isotopes such as 131 I, 1 "in, 99m Tc, enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase, fluorescent dyes or biotin molecules, cytostatics (doxorubicin , taxanes such as Taxotere ®, (EP 0253 738, US 4,814,470) docetaxel, daunorubicin, dactinomycin, plicamycin ,.
  • toxins such as the maytansinoids preferred below, or the DM1 mentioned by way of example, radioactive isotopes such as 131 I, 1 "in, 99m Tc
  • enzymes such as peroxidase or alkaline phosphatase
  • fluorescent dyes or biotin molecules fluorescent dyes or biotin molecules
  • cytostatics doxorubicin , taxanes such as Taxotere ®,
  • antibody conjugates according to the invention are the antibody conjugates AS 1406 (Antisoma); the humanized antibody HMFG1, which is bound to the enzyme RNase; Zevalin (ibritumomab tiuxetan); Bexxar (Corixa, iodine 1-131 tositumomab); or the maytansinoid or DM1 conjugates mentioned below.
  • conjugates of antibodies with maytansinoids in particular DM1.
  • C242 / CanAg-specific humanized monoclonal antibody-DMl conjugate canru-zumab-DMl (Liu et al., 1996; Lambert et al., 1998); the humanized monoclonal Antibody-DMl conjugate "huN901-DMl” specific for the CD56 antigen (Chari et al., 2000); the humanized monoclonal antibody-DMl conjugate My9-6-DMl specific for the CD33 antigen (Aventis); humanized monoclonal antibody-DMl conjugates specific for the IGF-1 receptor "anti-IGFl hu MAbs" (Mo ⁇ ho-Sys / IrnmunoGen); humanized monoclonal antibody-DMl conjugate anti-EGFRvIII-DMl with target molecule EGFR (Abgenix).
  • compositions of antibody conjugates as described in WO 02/094325 are particularly preferred. These are conjugates of the formula A (LB) “wherein
  • A is an antibody molecule
  • L is a linker substance
  • Antibody molecule A has a binding specificity for CD44, preferably variant CD44. “Specific for CD44” in this context means that the antibody binds specifically to an epitope in the CD44 region.
  • the antibody according to the invention preferably binds to an amino acid sequence which is encoded by the variant exon v6 of the human CD44 gene.
  • a preferred antibody molecule binds specifically to peptides containing or consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 of the attached sequence listing, or an allelic variant of said sequence
  • the antibody molecule according to the invention specifically binds to the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • Such antibodies can be prepared using methods from the prior art (WO 95/33771, WO 97/21104), for example by immunizing laboratory animals with chemically synthesized peptides of the abovementioned sequences.
  • the antibody is preferably the murine monoclonal antibody VFF-18, which is deposited by the hybridoma cell line (deposited according to the Budapest Treaty on June 7, 1994, accession number DSM ACC2174 at the DSM-Deutsche Sammlung für Mikro- Organismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig,
  • CDR's complementarity determining regions
  • Regions have been introduced into human light and heavy chains of respiratory globulin genes. "Complementarity determining regions” are defined analogously to Kabat et al, 1991, in connection with Chothia and Lesk, 1987.
  • Antibody A is particularly preferably an antibody comprising the light chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4 and the heavy chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6. Likewise particularly preferred is the antibody A comprising the light chains with the Amino acid sequence SEQ ID NO: 8 and the heavy chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • the production of the antibodies according to the invention can be carried out analogously to WO02 / 094879A1 and WO02 / 094325A2, in which the nucleotide sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 7, respectively, are introduced into an expression vector and expressed in a suitable host cell.
  • the coupling to toxins according to the invention is also described in detail in WO02 / 094325A2.
  • the linker group L advantageously contains a chemical bond which can be split off within a cell, preferably a disulfide bond.
  • Toxic is a substance that inhibits or completely prevents the function of cells and / or causes cell destruction. Toxic substances as ligands can either act cytostatically or cytotoxically and lead to cell cycle arrest or cell death. These substances can enter the cell cycle at various points intervene, for example by interaction with nucleic acid synthesis, inactivation of nucleic acids or by tubulin binding.
  • the toxic compound B is preferably a maytansinoid, ie a derivative of maytansine (CAS 35846538). B is preferably a C-3 ester of maytansinol. Maytansinoids can be coupled to antibodies have been previously described (Chari et al., 1992; Liu et al., 1996; US Patent No. 5,208,020). These maytansinoids can be used in the present invention.
  • Preferred is the toxic compound BN -deacetyl- N - (3-mercapto-l-oxopropyl) - Maytansin
  • Said maytansinoid is preferably a maytansinol derivative that is coupled to the antibody with a disulfide bridge at the C-3 position of maytansinol.
  • the antibody / maytansinoid conjugate according to the invention is particularly preferably produced from a maytansinoid of the following formula
  • Ri represents H or SP, where ⁇ represents methyl, ethyl, linear alkyl, branched alkyl, cycloalkyl, simple or substituted aryl, or heterocyclic;
  • R 2 represents Cl or H
  • R 3 represents H or CH 3 ; and m represents 1, 2, or 3.
  • the compound of formula (I) is less toxic than the compounds B, B-X or B-L "-X, which are released after intracellular cleavage.
  • Antibodies / maytansinoid conjugates linked by means of disulfide bonds are preferred which can release maytansinoid molecules.
  • Such cell-binding conjugates are produced according to methods in the prior art (US 5,208,020; WO02 / 094325A2).
  • the conjugate consists of a CD44v6-specific antibody molecule and a maytansinoid.
  • CD44v6 specific means that the antibody has a specific binding affinity for an epitope which is preferably human CD44 in a peptide having the amino acid sequence encoded by the variant exon v6 of CD44.
  • a preferred antibody molecule of the invention specifically binds to peptides or Polypeptides comprising or precisely with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 or an allelic variant of said sequence.
  • Said antibody molecule preferably binds specifically to an epitope in this sequence.
  • the antibody molecule according to the invention specifically binds to the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO : 3.
  • the antibody molecule according to the invention in said conjugate is preferably the monoclonal antibody VFF-18 (DSM ACC2174) or a recombinant antibody with the complement binding regions (CDRs) of VFF-18.
  • the antibody molecule according to the invention particularly preferably contains the light chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4 and the heavy chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • the antibody molecule according to the invention particularly preferably contains the light chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 8 and heavy chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • the maytansinoid is preferably coupled to the antibody via a disulfide bond and has the formula
  • the antibody molecule can be modified by a suitable linker, as shown in WO02 / 094325A2.
  • the maytansinoid to the antibody molecule is preferably by an S-CH 2 CH 2 -CO-, an -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -CO-, or an -S-CH (CH 3 ) CH 2 CH 2 -CO- bound.
  • the sulfur atom in such a linker group forms the disulfide bond with the maytansinoid, whereas the carbonyl function can bind to an amine function, which can be present in an amino acid side chain.
  • a particularly preferred embodiment is a conjugate of a CD44v6-specific antibody molecule and a maytansinoid, in which the antibody molecule contains the light chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4 and the heavy chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6, and in which Maytansinoid the formula IV at and is coupled to the Antikö ⁇ er via a disulfide bond.
  • the linker group is preferably -S-CH 2 CH CH 2 CH 2 -CO- or -S- CH (CH 3 ) CH CH 2 -CO-, and the number of bound maytansinoid residues per antibody molecule is 3 to 4.
  • the concentration of the antibody conjugate complex according to the invention in solution is between 0.01 and 40 mg / ml, preferably between 0.1-20 mg / ml, in particular between 0.1-10 mg / ml. A concentration of 2-5 mg / ml is particularly suitable.
  • the cyclodextrins (CD) to be used according to the invention are cyclic oligosaccharides or cyclic polymers, the ring systems of which consist of six, seven or eight ⁇ -1,4-linked glucose units, and corresponding to their number of monomers as ⁇ -, ⁇ - or ⁇ -cyclodextrins.
  • Cyclodextrins are known to form inclusion complexes with various biomolecules, such as fatty acids or amino acids, or to incorporate them until they are saturated. can close.
  • the various available cyclodextrins differ primarily in their different ring sizes ( ⁇ -cyclodextrins, ⁇ -cyclodextrins, ⁇ -cyclodextrins).
  • Suitable cyclodextrins include, for example, substituted ⁇ -cyclodextrins (consisting of 7 glucopyranose units), hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP-ß-CD), sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin (SBE-ß-CD), ⁇ -cyclodextrin (consisting of 8 Glucopyranose units) and hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CD).
  • SAE-CD sulfoalkyl ether cyclodextrins
  • n 4, 5 or 6 - the radicals R 1, R 2 , R 3 , P, R 5 , R ⁇ , R 7 , R 8 and R each, independently, -O- or a -O- (C 2 - C 6 alkylene) -SO 3 group, in which at least one of the radicals Rj and R is independently a -O- (C 2 -C 6 alkylene) -SO 3 - group, preferably an -O- (CH 2 ) m SO Group in which m is 4 (for example -OCH 2 CH 2 CH 2 SO 3 - or -OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 SO 3 -); and
  • Si, S 2 , S 3 , S 4 , S 5 , S 6 , S 7 , S 8 and S are each independently a pharmaceutically acceptable cation comprising, for example, H +, alkali metals (for example Li + , Na + , K + ), Alkaline earth metals (eg, approx. "1 ⁇ , Mg " “ “ ), ammonium ions and amine cations such as the cations of (C1-C6) alkylamines, piperidine, pyrazine, (C1-C6) alkanolamine and (C4-C8) -
  • cyclodextrins are in particular gamma-cyclodextrin ( ⁇ -CD), hydroxypropyl-gamma-cyclodextrin (HP- ⁇ -CD), hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-ß-CD) or sulfobutyl ether-beta-cyclodextrin (SBE-ß- CD).
  • ⁇ -CD gamma-cyclodextrin
  • HP- ⁇ -CD hydroxypropyl-gamma-cyclodextrin
  • HP-ß-CD hydroxypropyl-beta-cyclodextrin
  • SBE-ß- CD sulfobutyl ether-beta-cyclodextrin
  • the cyclodextrin according to the invention is particularly preferably a cyclodextrin selected from the following table.
  • Table 1 Cyclodextrin abbreviation rest n cc-cyclodextrin ⁇ -CD H 4 ß-cyclodextrin ß-CD H 5 ⁇ -cyclodextrin ⁇ -CD H 6 carboxymethyl-ß-cyclodextrin CM-ß-CD CH 2 CO 2 H or H 5 carboxymethyl -ethyl-ß- CME-ß-CD CH 2 CO 2 H, CH 2 CH 3 5 cyclodextrin or H diethyl-ß-cyclodextrin DE-ß-CD CH 2 CH 3 or H 5 dimethyl-ß-cyclodextrin DM-ß- CD CH 3 or H 5 methyl-ß-cyclodextrin M-ß-CD CH 3 or H 5 random methyl-ß-RM-ß-CD CH 3 or H 5 cyclodextrin glucosyl-
  • a hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin which can advantageously be used for the present invention and has a molar degree of substitution of 0.5 to 0.7 is commercially available, for example, from Wacker-Chemie GmbH, D-Burghausen, under the name "CAVASOL® W8 HP Pharma” Sulfobutyl ether beta-cyclodextrin (SBE-ß-CD), also commercially available under the name Captisol (company CyDex, USA), can also be used very well.
  • Cyclodextrin can be used in the formulations according to the invention in percentages by weight per volume (w%) from 0.001 to about 40 w%, preferably 0.1-20 w%, particularly preferably 0.1-10 w% or 1-5 w%.
  • the cyclodextrin according to the invention is very particularly preferably present in an amount of about 1, 5 or 15% by weight.
  • SBE-ß-CD is particularly preferably present in an amount of approximately 1, 5 or 15% by weight.
  • Another embodiment of the invention relates to the complexation of the antibody conjugate with cyclodextrins and hydroxy acids.
  • cyclodextrin can be reduced by the formation of a ternary complex consisting of the anti-body conjugate, the respective cyclodextrin and a hydroxy acid.
  • Suitable cyclodextrins include, for example, HP-ß-CD, SBE-ß-CD, ⁇ -CD and HP- ⁇ -CD.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention intended for parenteral use can therefore contain hydroxy acids such as malic acid, lactic acid, tartaric acid, succinic acid or citric acid.
  • the molar ratio of active ingredient to cyclodextrin is between 1: 1 and 1: 3300.
  • the molar ratio of active ingredient to cyclodextrin is according to the invention as mentioned above.
  • Suitable amphiphiles that can be used instead of the cyclodextrins are, for example, choline derivatives (C6-C20), naturally occurring cholines (egg and soy lecithin), for example such as dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOP) Ethanolamine derivatives (C6 to C20) naturally occurring ethanolamines (egg and soy
  • DMPC dimyristoylphosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • DOP dioleoylphosphatidylcholine
  • Ethanolamines for example, such as dimyristoylphosphatidylethanolamine (DMPE), dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), DOPE being particularly preferred.
  • DMPE dimyristoylphosphatidylethanolamine
  • DPPE dipalmitoylphosphatidylethanolamine
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • the corresponding glycerol derivatives (C6-C20) or phosphatidic acids (C6-C20) with saturated and unsaturated fatty acids can be used as further phospholipids.
  • Polyoxyethylene sorbitan monolaurate preferably n approx. 20, 60 or 80; polysorbate 20, 60 or 80, Tween 20 ® , Tween 60 ® , Tween 80 ® ) or also poloxamers (Pluronic ® ) in the concentration range of 0.01-5 percent by weight, preferably 0.01-0.1 percent by weight, particularly preferably 0.01-0.05 percent by weight can be used.
  • Preferred detergent concentrations are 0.01 +/- 0.01 percent by weight per 1 mg / ml antibody conjugate, for example 0, 0.01 or 0.02 percent by weight per 1 mg / ml antibody conjugate, particularly preferably 0.01 percent by weight per 1 mg / ml
  • the concentration is 0.01-0.05 weight percent polyoxyethylene sorbitan monolaurate (0.01, 0.02, 0.03, 0.04 or 0.05 weight percent).
  • compositions according to the invention also contain customary auxiliaries and excipients such as, for example, the isotonants glucose, mannitol or sodium chloride.
  • Formulations according to the invention can also contain a buffer, for example sodium acetate or sodium acetate trihydrate in combination with acetic acid, or a citric acid / phosphate buffer consisting, for example, of citric acid and disodium hydrogen phosphate or disodium hydrogen phosphate dihydrate.
  • a buffer for example sodium acetate or sodium acetate trihydrate in combination with acetic acid
  • a citric acid / phosphate buffer consisting, for example, of citric acid and disodium hydrogen phosphate or disodium hydrogen phosphate dihydrate.
  • Other buffer systems can also be used and are described below.
  • a succinate buffer eg using Na 2 succinate x 6 H 2 O
  • a concentration of 5-20 mmol / l has proven to be particularly suitable, preferably pH 5-6, in particular 5.5 ⁇ 0.2.
  • a Na K phosphate buffer in a concentration of 5-20 mmol / 1 at pH 6.5 can be used.
  • Water for injection is usually used as the solvent for the preparation of the solution.
  • the preparations can be filled into standard ampoules and stored at 2-8 ° C.
  • the pH can be lowered with the following agents: HC1, H 3 PO 4 and other derivatives of phosphoric acid, HNO 3 , H 2 SO 4 , CH 3 COOH, or all pharmaceutically acceptable acids known for this purpose, or selected by selection of suitable buffer systems from the group of buffer systems based on monobasic acids: acetic, benzoic, gluconic, glycerol, lactate; dibasic acids: aconite, adipine, Ascorbic, carbon, glutamine, apple, amber, tartrate; polybasic acids: citrate, phosphate, or bases: ammonia, diethanolamine, glycine, triethanolamine,
  • Tromethamine and its salts can be adjusted. If the pH value needs to be increased due to the pH being too low, the relevant known substances or solutions thereof, such as NaOH, KOH, ammonia solution, etc. come into question.
  • the pharmaceutical composition can also contain salts or salt solutions, in particular pharmaceutically acceptable salts, such as, for example, inorganic salts such as chlorides, sulfates, phosphates, di-phosphates, hydrobromides and / or nitrate salts.
  • pharmaceutically acceptable salts such as, for example, inorganic salts such as chlorides, sulfates, phosphates, di-phosphates, hydrobromides and / or nitrate salts.
  • the lipid suspension can also contain organic salts, e.g.
  • composition can also contain arginine, glycine or other amino acids.
  • polymers optionally contained in the pharmaceutical composition according to the invention include polyvinylpyrrolidones, derivatized celluloses such as e.g. Hydroxymethyl, hydroxyethyl or hydroxypropyl ethyl cellulose, polymeric sugars such as e.g. Ficoll or dextran, starch such as Hydroxyethyl or hydroxypropyl starch, dextrins such as e.g.
  • Cyclodextrins (2-hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, sulfobutyl ether-ß-cyclodextrin), polyethylenes, glycols, chitosan, collagen, hyaluronic acid, polyacrylates, polyvinyl alcohols and / or pectins.
  • sugars optionally contained in the pharmaceutical composition according to the invention are mono-, di-, oligo- or polysaccharides or a combination thereof.
  • simple sugar are preferably the aldohexoses, ketohexoses and their derivatives and optical isomers, fructose, maltose, galactose, glucose, D-mannose, sorbose, D (+) - glucose, D (+) - mannose, D (+) - galactose , D (-) - fructose, D (+) - sorbose, and the like.
  • Double sugars are, for example, lactose, sucrose, sucrose, trehalose or cellobiose. Suitable as multiple sugar or polysaccharides NEN in particular raffinose, melezitose, dextrin, or starch: •
  • compositions according to the invention can be used for parenteral systemic, e.g. intravenous, intravascular, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, or intrathecal application can be used.
  • parenteral systemic e.g. intravenous, intravascular, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, or intrathecal application can be used.
  • compositions according to the invention can be administered subcutaneously, intracutaneously, intracardially, intralobal, intramedullary, intrapulmonary or directly in or near the organ to be treated (connective tissue, bone, muscle, nerve or epithelial tissue).
  • the invention relates to a treatment method for cancer, in that a pharmaceutical preparation according to the invention is administered to a patient in need in a therapeutically effective amount of the pharmaceutical preparation according to the invention.
  • the preparation contains an antibody which is specific for the antigen CD44v6 and is conjugated with a maytansinoid, in particular in the preferred embodiments described above.
  • the cancer is preferably squamous cell carcinoma (e.g.
  • SCC Head and Neck Squameous Cell Carcinoma
  • esophagus SCC esophagus SCC
  • lung SCC skin SCC
  • breast adenocarcinoma esophagus SCC
  • lung SCC skin SCC
  • breast adenocarcinoma esophagus SCC
  • lung adenocarcinoma cervix SCC
  • pancreatic adenocarcinoma pancreatic adenocarcinoma
  • colon adenocarcinoma gastric adenocarcinoma
  • the pharmaceutical preparation according to the invention is administered, for example, according to the following protocols, for example weekly for 1 to 6 weeks as an iv bolus or continuous infusion over 5 days.
  • the bolus dose can be administered in 50 to 100 ml of physiological saline, to which 5 to 10 ml of human serum albumin are added.
  • Continuous infusions can be administered in 250 to 500 ml of physiological saline per 24 hours, to which 25 to 50 ml of human serum albumin has been added.
  • the antibody conjugate dose is generally 10 mg to 400 mg / m 2 body surface area per application. The dose must be high enough on the one hand to be effective, but also below the so-called "dose limiting toxicity" (DLT).
  • DLT dose limiting toxicity
  • MTD maximum tolerated dose
  • the administration can take place in 5 daily doses followed by a break of several weeks, in which case the expected MTD is lower than 100 mg / m 2
  • the pharmaceutical preparation according to the invention can be administered as a single iv infusion at a rate of 3 mg / min every 21 days, up to 7 treatment cycles are used, and the doses used can also vary outside of the above Move areas when the clinical situation requires it.
  • a single dose can also be a higher dose than 400 mg / m, or the weekly dose higher than 200 mg / m 2 .
  • An embodiment of a parenteral composition of antibody conjugate according to the invention contains the active substance in doses of 1 mg / kg body weight to 40 mg / kg body weight daily, preferably in the range 3-15 mg / kg body weight. Dosages expressed in [mg / m 2 ] are also preferred: 10 [mg / m 2 ] to 200 [mg / m 2 ]; particularly preferably 20 to 100 [mg / m 2 ], very particularly preferably 10, 20, 40 or 50 mg / m 2 .
  • the application is carried out in a preferred embodiment via a continuous infusion over 0.5 to 24 hours or possibly over several days in order to maintain a steady-state plasma level.
  • a preferred embodiment of the invention is therefore the use of a formulation or pharmaceutical composition according to the invention for the production of a medicament for the treatment of cancer (for definitions see above).
  • the present preferred methods for producing stable Antikö ⁇ er- Maytansinoid or -DM1 complexes lead to a reduction in the formation of free Maytansinoid or DM1 and their derivatives during storage of the product. This enables the runtime of such a preparation (stored at 2-8 ° C) to be increased compared to conventional formulations.
  • a preferred formulation contains an antibody-DMl conjugate in which the antibody contains the light chains with the amino acid sequence SEQ ED NO: 4 or SEQ ID NO: 8 and the heavy chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6, a phosphate buffer, Common salt, as well as Tween 20.
  • Particularly preferred is such a formulation containing 1-5 mg / ml conjugate, a phosphate buffer made of 1-1.9 mmol / 1 NaH 2 PO 4 x H 2 O; 4-5 mmol / 1 KH 2 PO 4 ; 3.5-4.5 mmol / 1 Na 2 HPO 4 , 30-100 mmol / 1 NaCl; 0.01 w% Tween 20 per mg / ml antibody conjugate, (ie 0.02 weight percent if the conjugate is present in a concentration of 2 mg / ml, 0.04 weight percent for a conjugate concentration of 4 mg / ml), at a pH from 5-6.
  • the pH is particularly preferred 5.5.
  • Another preferred formulation contains 1-2.5 mg / ml, preferably 1.8 to 2 mg / ml of a conjugate as described above, a phosphate buffer of approx. 1.45 nmol / 1 NaH 2 PO 4 x H 2 O, approx 4.19 mmol / 1 KH 2 PO 4 , approx. 3.91 mmol / 1 Na 2 HPO 4 , and approx. 60 mmol / 1 NaCl, as well as 0.02 w% Tween 20 ® at a pH of 5.5 ,
  • the preparation contains 4 mg / ml of a conjugate as described above, a phosphate buffer of approx. 1.45 mmol / 1 NaH 2 PO 4 ⁇ H 2 O, approx. 4.19 mmol / 1 KH 2 PO 4 , approx. 3.91 mmol / 1 Na 2 HPO 4 , and 0.04 w% Tween 20 ® at a pH of 5.5.
  • a phosphate buffer of approx. 1.45 mmol / 1 NaH 2 PO 4 ⁇ H 2 O, approx. 4.19 mmol / 1 KH 2 PO 4 , approx. 3.91 mmol / 1 Na 2 HPO 4 , and 0.04 w% Tween 20 ® at a pH of 5.5.
  • Another preferred formulation contains 1 mmol / 1 succinate buffer, for example
  • Further optional components of this particularly preferred pharmaceutical preparation are NaCl in the range from 30-100 mmol of 1 NaCl, preferably 60 mmol / 1 NaCl, and / or Tween 20 in the range of 0.01-0.05 w% Tween 20, preferably Tween 20 at 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 or 0.05 percent by weight or 0.01 +/- 0.01 percent by weight of Tween 20 per 1 mg / ml antibody conjugate, i.e. 0, 0.01 or 0 , 02 percent by weight per mg / ml antibody conjugate, particularly preferably 0.01 percent by weight per 1 mg / ml antibody conjugate.
  • the pH is adjusted to 5-6, particularly preferably 5.5.
  • Another preferred formulation contains 5-20 mrnol / 1 succinate, examples play Natriumsuccinatpuffer, 2-5 mg / ml Antikö ⁇ erkonjugat, and 0.02 to 0.05 percent by weight Tween ® 20, an embodiment containing 4 mg / ml of conjugate, 10 mmol / 1 succinate (preferably the disodium salt), 0.4 g / 1 Tween ® (0.04% w) 20.
  • the Antikö ⁇ erkonjugat is preferably a conjugate of an CD44v6-specific antibody as described above and the maytansinoid DM1.
  • the pH is adjusted to 5-6 before, particularly preferably 5.5.
  • the excipients used meet the requirements for pharmaceutically approved excipients.
  • the auxiliaries used are summarized in Table 2.
  • WFI is water for injections.
  • HP hydroxypropyl SBE: sulfobutyl ether
  • CD cyclodextrin
  • the antibody-DMl complex used is a conjugate of a CD44v6-specific antibody molecule and the maytansinoid DM1, in which the antibody molecule contains the light chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 4 and the heavy chains with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6, and in which the maytansinoid has the formula IV and is coupled to the antibody via a disulfide bond.
  • the starting solution is buffered in the new solutions to be tested (according to standard methods) or the appropriate auxiliary substances are added together.
  • the protein concentration can be increased to 4-5 mg / ml. The exact composition of these formulations is described in the examples.
  • the pH value, osmolality, appearance, color and clarity (AFK) are determined in accordance with the applicable PharmEu and USP regulations.
  • RP-HPLC reversed phase high performance liquid chromatography
  • Crimp cap Kombika / Alu-KU (West company, DE)
  • Crimp cap Kombika / Alu-KU (West company, DE)
  • the various formulations to be tested are sterile filtered through a sterile filter (0.22 micrometer, Millipore) and filled into the vials.
  • the filling volume is 20 ml for the liquid formulations, 10 ml for the lyophilization formulation.
  • the filled 10 ml lyophilization formulation is then freeze-dried.
  • the vials are closed with a stopper and crimp cap and stored overhead.
  • the storage temperature for the stress stability studies is 40 ° C.
  • the sampling times are: 0, 4 and 8 weeks.
  • Example 1 Influence of pH and lyophilization on the stability of antibody-DMl complexes
  • the protein concentration (antibody-DMl complex) is 1.8 mg / ml for all liquid formulations and 4.65 mg / ml for the lyophilization formulations.
  • the comparison formulation (Table 3) consists of the following auxiliaries:
  • the pH of the various formulations to be investigated was adjusted to pH 6.0 and 5.5 using 1 N phosphoric acid based on the comparison formulation (Table 3). 20 ml of the respective formulation were filled into a 20 R vial and the vials were stored upside down at 40 ° C.
  • the lyophilization formulation consists of (Table 4): Table 4:
  • Figure 1 shows the difference between free DM1 content. The difference of free DM1 between the zero value and the 4-week value is shown, and the difference between the zero value and the 8-week value.
  • the monomer content is 2-6% higher for pH 5.5 than for formulations at pH 6.5.
  • the pH reduction also has an advantageous influence on the AFK (appearance, color clarity) parameter (see Table 4). Over a period of 8 weeks (stored at 40 ° C) the monomer content decreases by 12% (formulation at pH 6.5).
  • Example 2 Influence of cyclodextrins on the stability of antibody-DMl complexes
  • the Gnmd formulation consists of the following auxiliaries (Table 6):
  • Figure 2 shows that the free DM1 content is lowest for Formulations D (Captisol).
  • the monomer contents of the various cyclodextrin formulations are comparable to the comparison formulation at pH 6.5 (Table 3).
  • the formulations with cyclodextrins, in particular captisol stabilize the antibody-DMl complex.
  • the term of the product can thus be extended compared to the comparison formulation.
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern, bevorzugt von Antikörpern, die an ein Maytansinoid konjugiert sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung stabile Formulierungen von Antikörper-DM1 Komplexen.

Description

FLÜSSIGFORMULIERUNGEN VON A TIKÖRPERKONJUGATEN
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern, bevorzugt von Antiköφern, die an ein Effektormolekül konjugiert sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung stabile flüssige Formulierungen von Antiköφer- DM1 Komplexen.
2. STAND DER TECHNIK
Im Stand der Technik sind rekombinante Antiköφermoleküle seit längerer Zeit bekannt z.B. humanisierte Mausantiköφer (Shin et al, 1989; Güssow et Seemann, 1991), bispezifische Antiköφer (Weiner et al, 1993; Goodwin, 1989),
Figure imgf000003_0001
(scFv, Johnson et Bird, 1991), komplette oder fragmentarische Immunglobuline (Colo- ma et al, 1992; Nesbit et al, 1992; Barbas et al, 1992) oder durch chain shuffling erzeugte Antiköφer (Winter et al, 1994). Heutzutage können vollhumane Antiköφer durch z.B. "phage display" Verfahren (Aujame et al., 1997; US 5,885,793; US
5,969,108; US 6,300,064; US 6,248,516, US 6,291,158) oder mittels transgener Mäuse, die transgen für funktioneile humane Ig Gene sind, hergestellt werden (EP 0 438 474 ; EP 0 463 151; EP 0 546 073).
Weiterhin sind Konjugate aus Antiköφern mit Effektormolekülen bekannt, wie z.B. s77τg/e-c/ «-Antiköφer/Toxin-Fusionsproteine (Chaudhary et al, 1990; Friedman et al, 1993); Konjugate aus Antiköφern mit radioaktiven Isotopen wie 131I, n ιIn, 99mTc oder radioaktiven Verbindungen (Larson et al, 1991; Thomas et al, 1989; Srivastava, 1988), Enzymen wie Peroxidase oder alkalischer Phosphatase (Catty et Raykundalia, 1989), mit Fluoreszenzfarbstoffen (Johnson, 1989) oder Biotinmolekülen (Guesdon et al, 1979); Toxinen (Vitetta et α/., 1991 ; Vitetta et Thoφe, 1991; Kreitman et α/., 1993; Theuer et al, 1993), Zytostatika (Schrappe et al, 1992), Prodrugs (Wang et al, 1992; Senter et al, 1989), radioaktiven Substanzen, mit einem Zytokin oder einem anderen immunmodulatorischen Polypeptid verknüpft sein, z.B. mit Tumomekrosefaktor oder
Interleukin-2.
CD44 ist ein Protein, das in verschiedenen Isoformen auf einer Vielzahl von Zellen exprimiert wird (siehe z.B. für weitere Information WO02/094879A1; WO02/094325 A2). Die Expression der Spleißvarianten jedoch, die die Domäne v6 (CD44v6) in der extrazellulären Region enthalten, ist auf einen Teil von Epithelienge- webe beschränkt. CD44v6, ebenso wie andere Variante Exons (CD44v3, CD44v5, CD44v7/v8, CD44vlO) ist ein Tumor-assoziiertes Antigen mit einem günstigen Expressionsmuster bei humanen Tumoren und normalem Gewebe (Heider et al., 1995; Heider et al., 1996; Dali et al., 1996; Beham-Schmid et al., 1998; Tempfer et al, 1998; Wagner et al., 1998). Es sind im Stand der Technik Antiköφer bekannt, die für bestimmte Spleißvarianten von CD44 (CD44v, CD44var), welche nur auf einer Untergruppe von Epithelzellen exprimiert werden, spezifisch sind. Beispielsweise seien die CD44v6- spezifischen Antiköφer genannt (WO02/094879A1), insbesondere auch als Konjugate mit radioaktiven oder cytotoxischen Substanzen, und besonders als Konjugate mit May- tansinoiden (WO02/094325A2).
Zur Verabreichung besagter Antiköφerkonjugate an Patienten ist es notwendig, stabile Formulierungen zu entwickeln. Ein Nachteil im Stand der Technik stellt die Abspaltung dieses funktioneilen, chemischen Molekülteils vom Antiköφer während der Lagerung des Produktes. Daher ist die Aufgabe der Erfindung, neue Formulierungen für Antikör- perkonjugate bereitzustellen.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe wurde im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und Ansprüche gelöst.
Die vorliegende Erfindung umfasst pharmazeutische Zubereitungen von Antiköφem. Die Stabilität des Produktes, bevorzugt von Antiköφern, die an ein Effektormolekül konjugiert sind, kann man durch die Zugabe von Cyclodextrinen und/oder Erniedrigung des pH-Wertes erhöhen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung stabile flüssige
Formulierungen von Antiköφer-DMl Komplexen und Verfahren zu deren Herstellung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Abbildung 1: Einfluss des pH Wertes auf die Bildung von freiem DM1 und deren Derivate in flüssig formulierten Antiköφer-DMl Komplexen. Stress-Stabilitätsstudie über 8 Wochen bei 40 °C. Dargestellt ist der Unterschied zwischen dem Gehalt der DM1- Derivaten des 4 Wochen Wertes zum Nullwert, als auch der Unterschied zwischen dem Gehalt der DM1 -Derivaten des 8 Wochen Wertes zum Null wert.
Abbildung 2: Einfluss des Zusatzes verschiedener Cyclodextrine in den Gewichtsverhältnissen 1, 5 und 15 w% auf die Bildung von freiem DM1 und deren Derivate in flüs- sig formulierten Antiköφer-DMl Komplexen. Stress-Stabilitätsstudie über 8 Wochen bei 40 °C. Dargestellt ist der Unterschied zwischen dem Gehalt der DM1 -Derivaten des 4 Wochen Wertes zum Nullwert, als auch der Unterschied zwischen dem Gehalt der DM1 -Derivaten des 8 Wochen Wertes zum Nullwert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Vor der Darstellung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sei angemerkt, dass in der Beschreibung und in den Ansprüchen die Verwendung des Singulars ("ein", "das" etc.) ebenso den Plural umfasst, sofern nicht ausdrücklich anders dargestellt oder aus dem Kontext offensichtlich. Alle verwendeten Begriffe haben die in der Fachwelt bekannte Bedeutung, sofem nicht anders definiert. Alle hier zitierten Publikationen und Patentschriften werden hiermit vollinhaltlich in die Beschreibung aufgenommen, insbesondere im referierten Kontext. Die Verwendung von Komma (,) vor der Dezimalstelle und der englischen Schreibweise (.) vor der Dezimalstelle ist gleichbedeutend, daher ist beispielsweise 0,02 gleichbedeutend mit 0,02. Die Definition w% ist gleichbedeutend mit Gewichtsprozent. Erfindungsgemäße Formulierungen stellen eine vorteilhaft einfache, praktische und kostengünstige Darreichungsform dar, die die Laufzeit der momentan zur Verfügung stehenden Formulierungen von Antiköφerkonjugaten übertrifft und insbesondere die Entstehung von freiem Effektormolekül während der Lagerung des Produktes reduziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend stabile Formulierungen von Antiköφer-Effektormolekülkonjugaten sowie Methoden zur Herstellung von stabilen Antiköφer-Effektormolekülkonjugaten. Die erfindungsgemäßen Wirkungen wurden überraschenderweise durch eine Erniedrigung des pH- Wertes der Wirkstofflösung auf pH 5-6, bevorzugt pH 5,5 ± 0,2 erreicht. Alternativ, oder in Kombination mit der pH- Werterniedrigung, können diese Vorteile durch Zusatz von mindestens einem Cyclodextrin erreicht werden. In einem Aspekt betrifft die. Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Konjugat aus einem Antiköφer und einem Maytansinoid in wäßriger Lösung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Lösung einen pH- Wert von 5-6 hat. In einem anderen Aspekt betrifft sie eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Konjugat aus einem Antiköφer und einem Maytansinoid in wässriger Lösung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ein Cyclodextrin enthält. In einem weiteren Aspekt betrifft sie eine solche Zusammensetzung enthaltend ein Gemisch aus einem Antiköφerkonjugat, mindestens einem Cyclo- dextrin, und Wasser. Vorteilhaft ist femer der Zusatz eines Detergenz. Statt eines Cyc- lodextrins kann auch ein Amphiphil verwendet werden, wie im Folgenden genauer beschrieben.
Die Erfindung betrifft Formulierungen von Antiköφerkonjugaten. Die Begriffe „Anti- köφer" und „Antiköφermolekül" sind gleichbedeutend. Antiköφer können vollständige Immunglobuline sein, enthaltend zwei schwere und zwei leichte Ketten, Fragmente solcher Immunglobuline wie z.B. Fab, Fab', or F(ab)2 Fragmente, rekombinant hergestellte Antiköφermolekül e wie chimäre, humanisierte oder ganz humane Antiköφer. Unter Antiköφerkonjugat wird ein Komplex aus Antiköφer und Effektormolekül ver- standen. Vorzugsweise ist dabei das Effektormolekül durch eine kovalente Bindung mit dem Antiköφer verknüpft. Beispielsweise seien als erfindungsgemäße Antiköφer genannt: HER2 Antiköφer wie z.B. Herceptin® (trastuzumab, Genentech, Inc.), VEGF spezifische Antiköφer wie Bevacizumab (Genentech, Inc.); Rituxan (rituximab), Anti-
EFGR Antiköφer ABX-EGF; Antiköφer ABX-CBL (Abgenix); Antiköφer ICR-62
(ICR, Sutton, England Xolair (omalizumab)), C242 (cantuzimab, ImmunoGen), Erbitux
(Cetuximab, IMC-C225, ImClone Systems); monoklonaler Antiköφer 425 (Merck KGaA); Mitumomab (Imclone Systems and Merck KGaA); Antegren (natalizumab).
Ein erfindungsgemäßes Antiköφerkonjugat kann aus einem der erfindungsgemäßen
Antiköφer und einem Effektormolekül hergestellt werden, optional in Kombination mit einem verbindenden Molekül, einem sog. Linker.
Als Beispiele für Effektormoleküle seien genannt: Toxine, wie auch die weiter unten bevorzugten Maytansinoide oder das beispielhaft genannte DM1, radioaktive Isotope wie 131I, l ' 'in, 99mTc, Enzyme wie Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, Fluoreszenzfarbstoffe oder Biotinmoleküle, Zytostatika (Doxorubicin, Taxane wie Taxotere®, (EP 0253 738, US 4,814,470) Docetaxel, Daunorubicin, Dactinomycin, Plicamycin,. Mitomycin, Bleomycin, Idarubicin, Cyclophosphamid, Mechlorethamin, Melphalan, Chlorambucil, Procarbazin, Dacarbazine, altretamine, Cisplatin, Carboplatin, Oxalipla- tin, Iproplatin, Ormaplatin, Tetraplatin), Methotrexat, Mercaptopurin, Thioguanin, Flu- darabinphosphat, Cladribin, Pentostatin, Fluorouracil: 5-FU, Cytarabin, Azacytidin), Prodrugs, Zytokin, immunmodulatorisches Polypeptid wie z.B. Tumomekrosefaktor oder Interleukin-2.
Als Beispiele für erfindungsgemäße Antiköφerkonjugate seien die Antiköφerkonjugate AS 1406 (Antisoma); der humanisierte Antiköφer HMFG1, der an das Enzym RNase gebunden ist; Zevalin (Ibritumomab tiuxetan); Bexxar (Corixa, iodine 1-131 tositumo- mab); oder die unten genannten Maytansinoid- oder DM1 -Konjugate genannt.
Bevorzugt sind Konjugate von Antiköφem mit Maytansinoiden, insbesondere DM1. Beispiele für solche Konjugate sind das Antiköφerkonjugat MLN2704 bestehend aus einem monoklonalen Antiköφervehikel T-MAV, das spezifisch an Prostata- spezifisches Membranprotein bindet, konjugiert an das Maytansinoid DM1; das
C242/CanAg-spezifιsche humanisierte monoklonale Antiköφer-DMl Konjugat canru- zumab-DMl (Liu et al., 1996; Lambert et al., 1998); das humanisierte monoklonale Antiköφer-DMl Konjugat „huN901-DMl" spezifisch für das CD56 antigen (Chari et al., 2000); das humanisierte monoklonale Antiköφer-DMl Konjugat My9-6-DMl spezifisch für das CD33 antigen (Aventis); humanisierte monoklonale Antiköφer-DMl Konjugate spezifisch für den IGF-1 receptor „anti-IGFl hu MAbs" (Moφho- Sys/IrnmunoGen); humanisierte monoklonale Antiköφer-DMl Konjugat anti- EGFRvIII-DMl mit Zielmolekül EGFR (Abgenix).
Besonders bevorzugt sind pharmazeutische Zusammensetzungen von Antiköφerkonjugaten, wie sie in der WO 02/094325 beschrieben sind. Dies sind Konjugate der Formel A(LB)„ worin
A ein Antiköφermolekül ist; L eine Linkersubstanz ist;
B eine für Zellen toxische Verbindung ist; und n eine Dezimalzahl n = 1 bis 10 ist.
Das Antiköφermolekül A hat eine Bindungsspezifizität für CD44, bevorzugt variantes CD44. „Spezifisch für CD44" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Antiköφer spezifisch an ein Epitop in der CD44 Region bindet. Bevorzugt bindet der erfindungs- gemäße Antiköφer an eine Aminosäuresequenz, die von dem Varianten Exon v6 des humanen CD44 Gens kodiert ist. Ein bevorzugtes Antiköφermolekül bindet spezifisch an Peptide enhaltend oder bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO: 1 des anliegenden Sequenzprotokolls, oder einer allelen Variante besagter Sequenz. Besonders bevorzugt bindet das erfindungsgemäße Antiköφermolekül spezifisch an die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3. Derartige Antiköφer können mit Methoden aus dem Stand der Technik hergestellt werden (WO 95/33771, WO 97/21104), z.B. durch hnmunsierung von Labortieren mit chemisch synthetisierten Peptiden der o.g. Sequenzen.
Bevorzugt ist der Antiköφer der murine monoklonale Antiköφer VFF-18, der durch die hinterlegte Hybridomzelllinie (nach dem Budapester Vertrag hinterlegt am 07. Juni 1994, Zugangsnummer DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für Mikro- Organismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig,
Deutschland). Ebenso bevorzugt sind humanisierte rekombinante Antiköφer, bei denen die sog. „complementarity determining regions" (CDR's) von VFF-18 in entsprechende
Regionen in humanen leichten und schweren Ketten von hrrmunglobulingenen einge- bracht wurden. "Complementarity determining regions" sind definiert analog Kabat et al, 1991, in Zusammenhang mit Chothia and Lesk, 1987.
Besonders bevorzugt ist der Antiköφer A ein Antiköφer enthaltend die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 und die schweren Ketten mit der Aminosäu- resequenz SEQ ID NO: 6. Ebenso besonders bevorzugt ist der Antiköφer A ein Antiköφer enthaltend die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 8 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6. Die Produktion der erfindungsgemäßen Antiköφer kann analog WO02/094879A1 und WO02/094325A2 durchgeführt werden, in dem die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 7 , respektive, in einen Expressionsvektor eingebracht und in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden.
Auch die Kopplung an erfindungsgemäße Toxine, insbesondere Maytansinoide, ist in WO02/094325A2 ausführlich dargestellt. Vorteilhaft enthält die Linkergruppe L eine chemische Bindung, die innerhalb einer Zelle abgespalten werden kann, vorzugsweise eine Disulfidbindung.
„Toxisch" ist eine Substanz, die die Funktion von Zellen inhibiert oder völlig verhindert und/oder Zellzerstörung verursacht. Toxische Substanzen als Liganden können entwe- der zytostatisch oder zytotoxisch agieren und fuhren zu Zellzyklusarrest oder Zelltod. Diese Substanzen können an verschiedenen Punkten in den Zellzyklus eingreifen, beispielsweise durch Interaktion mit der Nukleinsäuresynthese, Inaktivierung von Nukleinsäuren, oder durch Tubulinbindung. Bevorzugt ist die toxische Verbindung B ein Maytansinoid, d.h. ein Derivat von Maytansin (CAS 35846538). Bevorzugt ist B ein C-3 Ester von Maytansinol. Maytansinoide, die an Antiköφer gekoppelt warden können, sind vorbeschrieben (Chari et al., 1992; Liu et al., 1996; U.S. Patent No. 5,208,020). Diese Maytansinoid können in der gegenwärtigen Erfindung benutzt werden. Bevorzugt ist die toxische Verbindung B N -deacetyl- N -(3-mercapto-l-oxopropyl)-Maytansin
(CAS Number 139504-50-0), auch als DM1 bezeichnet. Bevorzugt ist besagtes Maytansinoid ein Maytansinolderivat, dass an den Antiköφer mit einer Disulfidbrücke an der C-3 Position von Maytansinol gekoppelt ist. Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Antiköφer/Maytansinoidkonjugat aus einem Maytansinoid der folgenden Formel hergestellt
Formel II
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worin
Ri bedeutet H oder SP , worin ^ Methyl, Ethyl, linearer Alkyl, verzweigter Alkyl, Cycloalkyl, einfacher oder substituierter Aryl, oder heterocyclisch bedeutet;
R2 bedeutet Cl oder H;
R3 bedeutet H oder CH3; und m bedeutet 1, 2, or 3.
Bevorzugt ist Ri H, CH3j oder SCH3, R2 ist Cl, R3 ist CH3, und m = 2.
Die Verbindung mit Ri = H, R2 = Cl, R = CH3, und m = 2 wird in der Literatur als DM1 bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform, hat die erfindungsgemäße Verbindung die Formel III Formel III wonn A ein Antiköφermolekül ist, das spezifisch für CD44 ist, bevorzugt spezifisch für das Variante Exon v6, bevorzugt spezifisch für die Aminosäure Sequenz SEQ ID NO: 3; (L') ein optionales Linkermolekül ist p eine Dezimalnummer mit p = 1 to 10 ist. Bevorzugt ist p= 3 bis 4, besonders bevorzugt ca. 3.5.
Verfahren zur Herstellung besagter Maytansinoide sind im Stand der Technik bekannt (insbesondere US 5,208,020, Beispiel 1; WO02/094325A2). In einer bevorzugten Ausführungsform, ist die Verbindung der Formel (I) weniger toxisch als die Verbindungen B, B-X oder B-L"-X, die nach intrazellulärer Abspaltung freigesetzt werden.
Bevorzugt werden mittels Disulfidbindungen verbundene Antiköφer / Maytansinoid- konjugate, die Maytansinoidmoleküle freisetzen können. Derartige zellbindende Konjugate werden gemäß Verfahren im Stand der Technik hergestellt (US 5,208,020; WO02/094325A2). In einem weiteren Aspekt besteht das Konjugate aus einem CD44v6-spezifischen Antiköφermolekül und einem Maytansinoid. „CD44v6 spezifisch" bedeutet, dass der Antiköφer eine spezifische Bindungsaffinität für ein Epitop hat, das in einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die durch das Variante Exon v6 von CD44 kodiert wird, bevorzugt humanes CD44. Ein bevorzugtes Antiköφermolekül der Erfindung bindet spezifisch an Peptide oder Polypeptide umfassend oder genau mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine allele Variante besagter Sequenz. Bevorzugt bindet besagtes Antikörpermolekül spezifisch an ein Epitop in dieser Sequenz. Besonders bevorzugt bindet das erfindungsgemäße Antiköφermolekül spezifisch an die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3.
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Antiköφermolekül in besagtem Konjugat der monoklonale Antiköφer VFF-18 (DSM ACC2174) oder ein rekombinanter Antiköφer mit den Komplementbindungsregionen (CDRs) von VFF-18. Besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Antiköφermolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6. Ebenso besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Antiköφermolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 8 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6. Das Maytansinoid ist bevorzugt an den Antiköφer über eine Disulfidbindung gekoppelt und hat die Formel
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worin die Verknüpfung mit dem Antiköφer über das Schwefelatom in Formel IV an ein weiteres Schwefelatom im Antiköφermolekül erfolgt. Um ein solches Schwefelatom für eine Bindung im Antiköφermolekül zu erhalten, kann das Antiköφermolekül durch einen geeigneten Linker modifiziert werden, wie in WO02/094325A2 dargestellt. Vor- zugsweise ist das Maytansinoid an das Antiköφermolekül durch eine S-CH2CH2-CO-, eine -S-CH2CH2CH2CH2-CO-, oder eine -S-CH(CH3)CH2CH2-CO- Gruppe gebunden. Das Schwefelatomatom in einer derartigen Linkergruppe bildet die Disulfidbindung mit dem Maytansinoid, wohingegen die Carbonylfunktion an eine Aminfünktion, die in einer Aminosäureseitenkette vorhanden sein kann, binden kann.
Auf diese Art und Weise können mehrere Maytansinoidreste an ein Antiköφermolekül gebunden werden. Bevorzugt sind 3 bis 4 gebundene Maytansinoid-Reste pro Antikörpermolekül. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist ein Konjugat aus einem CD44v6-spezifϊschen Antiköφermolekül und einem Maytansinoid, worin das Antikör- permolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 enthält, und worin das Maytansinoid die Formel IV at und an den Antiköφer über eine Disulfidbindung gekoppelt ist. Bevorzugt ist die Linkergruppe -S-CH2CH CH2CH2-CO- oder -S- CH(CH3)CH CH2-CO-, und die Anzahl von gebundenen Maytansinoid-Resten pro An- tiköφermolekül ist 3 bis 4.
Die erfindungsgemäße Konzentration des Antiköφerkonjugat Komplexes in Lösung beträgt zwischen 0,01 und 40 mg/ml, vorzugsweise zwischen 0,1 - 20 mg/ml, insbesondere zwischen 0,1 - 10 mg/ml. Besonders geeignet ist eine Konzentration von 2-5 mg/ml.
Bei den erfindungsgemäß zu verwendenden Cyclodextrinen (CD) handelt es sich um zyklische Oligosaccharide oder zyklische Polymere, deren Ringsysteme aus sechs, sieben oder acht α-l,4-verknüpften Glucose-Einheiten bestehen, und entsprechend ihrer Anzahl an Monomeren als α-, ß- bzw. γ-Cyclodextrine bezeichnet werden. Von den Cyclodextrinen ist bekannt, daß sie mit verschiedenen Biomolekülen, wie z.B. Fettsäuren oder Aminosäuren, Inklusionskomplexe bilden, bzw. diese bis zur Sättigung ein- schließen können. Die verschiedenen zur Verfügung stehenden Cyclodextrine unterscheiden sich in erster Linie durch unterschiedliche Ringgröße (α-Cyclodextrine, ß-Cyclodextrine, γ-Cyclodextrine). Außerdem gibt es verschieden substituierte Cyclodextrine, deren Toxizität und Protein-Cyclodextrin- Wechselwirkungseigenschaften unterschiedlich sind. Zu den geeigneten Cyclodextrinen gehören beispielsweise substituierte ß-Cyclodextrine (bestehend aus 7 Glucopyranoseeinheiten), Hydroxypropyl-ß- Cyclodextrin (HP-ß-CD), Sulfobutylether-ß-Cyclodextrin (SBE-ß-CD), γ-Cyclodextrin (bestehend aus 8 Glucopyranoseeinheiten) und Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin (HP-γ- CD). Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Cyclodextrine Sulfoalkylether- Cyclodextrine (SAE-CD) der folgenden Formel verstanden:
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worin n= 4, 5 oder 6 - die Reste Ri, R2, R3, P , R5, R^, R7, R8 und R jeweils, unabhängig, -O- oder eine -O- (C2-C6 Alkylen)-SO3-Gruppe ist, worin mindestens einer der Reste Rj und R unabhängig eine -O-(C2-C6 Alkylen)-SO3- Gruppe ist, bevorzugt eine -O-(CH2)mSO -Gruppe, worin m 4 ist, (z.B. -OCH2CH2CH2SO3 - oder -OCH2CH2CH2CH2SO3-); und
Si, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8 und S sind jeweils, unabhängig, ein pharmazeutisch akzeptables Kation, umfassend, z.B. H+, Alkalimetalle (z.B. Li+, Na+, K+), Erdalkalimetalle (z.B., Ca."1^, Mg"""), Ammoniumionen und Aminkationen wie z.B. die Kationen von (C1-C6) Alkylaminen, Piperidin, Pyrazin, (C1-C6) Alkanolamin und (C4-C8)-
Cycloalkanolamin.
Besonders bevorzugte Cyclodextrine sind insbesondere gamma-Cyclodextrin (γ-CD), Hydroxypropyl-gamma-cyclodextrin (HP-γ-CD), Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-ß-CD) oder Sulfobutylether-beta-cyclodextrin (SBE-ß-CD).
Von der sehr großen Anzahl der bisher publizierten Literatur, die sich mit der Herstellung und Verwendung von Cyclodextrinen, insbesondere der ß-Cyclodextrine, befasst, sollen nur beispielhaft die folgenden Publikationen genannt werden: Manning, M. et al. , Pharm. Res. 6, 1903-1918, 1989; Yoshida, A. et al, Int. J. Pharm. 461, 217-222, 1988; Brewster, M. et al, Int. J. Pharm. 59, 231-243, 1980; Pitha, J. et al, Int. J. Pharm. 29, 73-82, 1986; Pitha, J. & Pitha J., J Pharm. Sei. 74, 987-990, 1985; Brewster, M. et al, J. Parent. Sei. Technol 43, 231-240, 1978. Insbesondere wird von Pitha J. & Pitha, J., loc. cit. (1986) die Herstellung von Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin (HP-ß-CD) beschrieben, und es wird berichtet, dass durch Verwendung von HP-ß-CD die Wasserlöslichkeit der verschiedensten Wirkstoffe und biologischen Markromoleküle verbessert wird. Hinsichtlich der Verwendung der Cyclodextrine auf pharmazeutischem Gebiet sei auf die Übersichtsartikel von Pitha, J. et al, in: Controlled Drug Delivery [Brück, S.D., Hrsg.] Vol. I, CRC Press, Boca Raton, Florida, 125-148, 1983, verwiesen, oder auf Ue- kama, K., et al, in: CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 3 (1), 1-40, 1987; bzw. auf Uekama, K., in: Topics in Pharmaceutical Sciences 1987 [Breimer, D.D. and Speiser, P., Hrsg.] Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division), 181-194, 1987).. Die Verwendung von insbesondere 2-Hydroxypropyl-ß- cyclodextrin zur Solubilisierung und Stabilisierung von verschiedenen biologisch aktiven Proteinen wird von Brewster, M.E. et al, Pharm. Res. 8, 792-795, 1991 , näher beschrieben.
Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Cyclodextrin ein Cyclodextrin ausge- wählt aus der folgenden Tabelle. Tabelle 1: Cyclodextrin Abkürzung Rest n cc-Cyclodextrin α-CD H 4 ß-Cyclodextrin ß-CD H 5 γ-Cyclodextrin γ-CD H 6 Carboxymethyl-ß-cyclodextrin CM-ß-CD CH2CO2H oder H 5 Carboxymethyl-ethyl-ß- CME-ß-CD CH2CO2H, CH2CH3 5 cyclodextrin oder H Diethyl-ß-Cyclodextrin DE-ß-CD CH2CH3 oder H 5 Dimethyl- ß -Cyclodextrin DM-ß-CD CH3 oder H 5 Methyl-ß-Cyclodextrin M-ß-CD CH3 oder H 5 Random methyl-ß- RM-ß-CD CH3 oder H 5 Cyclodextrin Glucosyl-ß-Cyclodextrin Gi-ß-CD Glucosyl oder H 5 Maltosyl- ß -Cyclodextrin G2-ß-CD Maltosyl oder H 5 Hydroxyethyl-ß-Cyclodextrin HE-ß-CD CH2CH2OH oder H 5 Hydroxypropyl-ß- HP-ß-CD CH2CHOHCH3 oder H 5 Cyclodextrin Sufobutylether-ß-Cyclodextrin SBE-ß-CD (CH2) SO3Na oder H 5
Ein für die vorliegende Erfindung vorteilhaft verwendbares Hydroxypropyl-γ- cyclodextrin mit einem molaren Substitutionsgrad von 0,5 bis 0,7 ist beispielsweise von der Firma Wacker-Chemie GmbH, D-Burghausen, unter dem Namen „CAVASOL ® W8 HP Pharma" im Handel. Sehr gut kann auch Sulfobutylether-beta-Cyclodextrin (SBE-ß-CD), auch kommerziell unter dem Namen Captisol (Firma CyDex, USA) erhältlich, verwendet werden.
Cyclodextrin kann in den erfindungsgemäßen Formulierungen in Gewichtsprozenten pro Volumen (w%) von 0,001 bis ca. 40 w %, vorzugsweise 0,1 -20 w%, besonders bevorzugt 0,1 - 10 w% oder 1-5 w% eingesetzt werden. Ganz besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Cyclodextrin zu ca. 1, 5 oder 15 w% vorhanden. Besonders bevorzugt ist SBE-ß-CD zu ca. 1, 5 oder 15 w% vorhanden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Komplexierung des Antikör- perkonjugates mit Cyclodextrinen und Hydroxysäuren. Dabei kann die benötigte Menge an Cyclodextrin durch die Bildung eines temären Komplexes bestehend aus dem Anti- köφer-Konjugat, dem jeweiligen Cyclodextrin und einer Hydroxysäure reduziert werden. Zu den hierfür geeigneten Cyclodextrinen gehören beispielsweise HP-ß-CD, SBE- ß-CD, γ-CD und HP-γ-CD. Neben dem Wirkstoff und dem Cyclodextrin können die zur parenteralen Anwendung bestimmten erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen daher Hydroxysäuren wie beispielsweise Äpfelsäure, Milchsäure, Weinsäure, Bemsteinsäure oder Zitronensäure enthalten.
Das molare Verhältnis von Wirkstoff zu Cyclodextrin liegt erfindungsgemäß zwischen 1:1 und 1:3300. Bevorzugt ist ein molares Verhältnis von 1 : 100 bis 1 : 1500, insbesondere 1:100 bis 1:600. In Gegenwart von Hydroxysäure liegt das molare Verhältnis von Wirkstoff zu Cyclodextrin erfindungsgemäß wie vorgenannt vor.
Geeignete Amphiphile, die statt der Cyclodextrine verwendet werden können, sind beispielsweise Cholinderivate (C6- C20), natürlich vorkommende Choline (Ei- und Soja- Lecithin) beispielsweise wie Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dipalmitoyl- phosphatidylcholin (DPPC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) oder Ethanolamin- derivate (C6 bis C20) natürlich vorkommende Ethanolamine (Ei- und Soja-
Ethanolamine) beispielsweise wie Dimyristoylphosphatidylethanolamin (DMPE), Di- palmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), wobei DOPE besonders bevorzugt ist. Desweiteren können als weitere Phospholipide die entsprechenden Glycerolderivate (C6-C20) oder Phosphatid-Säuren (C6-C20) mit gesättigten und ungesättigten Fettsäuren eingesetzt werden.
Als Detergenz kann Polyoxyethylen-sorbitan-monolaureat (bevorzugt n ca. 20, 60 oder 80; Polysorbat 20, 60 oder 80, Tween 20®, Tween 60®, Tween 80®) oder auch Poloxa- mere (Pluronic®) im Konzentrationsbereich von 0,01-5 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,01-0,1 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt 0,01-0,05 Gewichtsprozent verwendet werden. Bevorzugte Detergenzkonzentrationen sind 0,01 +/- 0,01 Gewichtsprozent pro 1 mg/ml Antiköφerkonjugat, beispielsweise 0, 0,01 oder 0,02 Gewichtsprozent pro 1 mg/ml Antiköφerkonjugat, besonders bevorzugt 0,01 Gewichtsprozent pro 1 mg/ml
Antiköφerkonjugat. In anderen Ausführungsformen beträgt die Konzentration ist 0,01 - 0,05 Gewichtsprozent Polyoxyethylen-sorbitan-monolaureat (0,01, 0,02, 0,03, 0,04 oder 0,05 Gewichtsprozent).
Gegebenenfalls enthalten die erfmdungs gemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen femer übliche Hilfs- und Trägerstoffe wie beispielsweise die Isotonanzien Glucose, Mannitol oder Natriumchlorid.
Erfindungsgemäße Formulierungen können auch einen Puffer enthalten, z.B. Natrium- acetat bzw. Natriumacetat-Trihydrat in Verbindung mit Essigsäure, oder einen Zitronensäure/Phosphat-Puffer bestehend z.B. aus Zitronensäure und Dinatriumhydro- genphosphat bzw. Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat. Auch andere Puffersysteme können verwendet werden und werden weiter unten beschrieben. Als besonders geeig- net hat sich ein Succinatpuffer (z.B. unter Verwendung von Na2Succinat x 6 H2O) in einer Konzentration von 5 - 20 mmol/1 erwiesen, bevorzugter pH 5-6, insbesondere 5,5 ± 0,2. Alternativ kann ein Na K-Phosphatpuffer in einer Konzentration von 5-20 mmol/1 bei pH 6,5 eingesetzt werden.
Als Lösungsmittel zur Herstellung der Lösung dient üblicherweise Wasser für Injektionszwecke. Die Präparate können in handelsübliche Ampullen abgefüllt und bei 2-8°C gelagert werden.
Die Konzentrationen weiterer Hilfs- und Trägerstoffe sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise aus Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th ed. Mack Publ., Easton, zu entnehmen.
Der pH kann mit folgenden Agenzien erniedrigt werden: HC1, H3PO4 und andere Derivate der Phosphorsäure, HNO3, H2SO4, CH3COOH, oder alle pharmazeutisch akzeptab- len, hierfür bekannten Säuren, oder durch Auswahl geeigneter Puffersysteme ausgewählt aus der Gruppe von Puffersystemen auf der Gmndlage von monobasischen Säuren: Essig-, Benzoe-, Glucon-, Glycerin-, Lactat-; dibasische Säuren: Aconit-, Adipin-, Ascorbin-, Karbon-, Glutamin-, Apfel-, Bernstein-, Tartrat-; polybasische Säuren: Cit- rat-, Phosphat-, oder Basen: Ammoniak, Diethanolamine, Glycine, Triethanolamine,
Tromethamine und deren Salze eingestellt werden. Sollte wegen zu niedrigem pH Wert dieser erhöht werden müssen, kommen die einschlägig bekannten Substanzen bzw. Lö- sungen hiervon wie NaOH, KOH, Ammoniaklösung etc. in Frage.
Als weitere Inhaltsstoffe, als zusätzliche Stabilisatoren, kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch Salze bzw. Salzlösungen enthalten, insbesondere pharmazeutisch akzeptable Salze, wie zum Beispiel anorganische Salze wie Chloride, Sulfate, Phospha- te, di-Phosphate, Hydrobromide und/oder Nitrat-Salze. Femer kann die Lipidsuspension auch organische Salze beinhalten, wie z.B. Malate, Maleate, Fumarate, Tartrate, Succi- nate, Ethylsuccinate, Citrate, Acetate, Lactate, Methansulfonate, Benzoate, Ascorbate, Paratoluensulfonate, Palmoate, Salicylate, Stearate, Estolate, Gluceptate oder Labionat- Salze. Die Zusammensetzung kann auch Arginin, Glyzin oder andere Aminosäuren ent- halten.
Beispiele für optional in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Polymere umfassen Polyvinylpyrrolidone, derivatisierte Zellulosen, wie z.B. Hydroxymethyl-, Hydroxyethyl-, oder Hydroxypropyl-ethylzellulose, polymere Zucker wie z.B. Ficoll oder Dextran, Stärke wie z.B. Hydroxyethyl- oder Hydroxypropylstärke, Dextrine wie z.B. Cyclodextrine (2-Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, Sulfobutylether-ß- cyclodextrin), Polyethylene, Glykole, Chitosan, Collagen, Hyaluronsäure, Polyacrylate, Polyvinylalkohole und/oder Pektine.
Beispiele für optional in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Zucker sind Mono-, Di-, Oligo- oder Polysaccharide oder eine Kombination hieraus. Beispiele für Einfachzucker sind vorzugsweise die Aldohexosen, Ketohexosen und ihre Derivate und optischen Isomere, Fruktose, Maltose, Galaktose, Glucose, D- Mannose, Sorbose, D(+)-Glucose, D(+)-Mannose, D(+)-Galactose, D(-)-Fructose, D(+)-Sorbose, und dergleichen. Zweifachzucker sind beispielsweise Laktose, Saccharose, Sucrose, Trehalose, oder Cellobiose. Als Mehrfachzucker oder Polysaccharide eig- nen sich insbesondere Raffinose, Melezitose, Dextrin, oder Stärke: •
Beispiele für optional in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Zuckeralkohole sind neben Mannitol, bzw. D-Mannitol (D-Mannit), Xylitol, Maltitol, Galaktitol, Arabinitol, Adonitol, Laktitol, Sorbitol (Glucitol), Pyranosylsorbi- tol, Inositol, Myoinositol und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur parentera- len systemischen, z.B. intravenösen, intravaskulären, intramuskulären, intraarteriellen, intraperitonealen, oder intrathekalen Applikation verwendet werden. Eine lokalere
Darreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann subkutan, intrakutan, intrakardiell, intralobal, intramedullär, intrapulmonar oder direkt in oder nahe dem zu behandelnden Organ erfolgen (Bindegewebe, Knochen, Muskel, Nerven- oder epitheliales Gewebe).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung ein Behandlungsverfahren von Krebs, indem eine erfmdungsgemäße pharmazeutische Zubereitung einem bedürftigen Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung verabreicht wird. In einer bevorzugten Ausfüh- rungsform enthält die Zubereitung einen Antiköφer, der für das Antigen CD44v6 spezifisch und mit einem Maytansinoid konjugiert ist, insbesondere in den oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsaformen. Bevorzugt ist der Krebs ein Plattenepithelkarzi- nom (z.B. „Head and Neck Squameous Cell Carcinoma (SCC)", Ösophagus SCC, Lungen SCC, Haut SCC, Brustadenokarzinom, Lungenadenokarzinom, Zervix SCC, Pankreasadenokarzinom, Kolonadenokarzinom, Magenadenokarzinom).
In der klinischen Behandlung von Krebs wird die erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung z.B. nach folgenden Protokollen verabreicht, z.B. wöchentlich 1 bis 6 Wochen lang als i.v. Bolus oder kontinuierliche Infusion über 5 Tage. Die Bolusdosis kann in 50 bis 100 ml physiologischer Kochsalzlösung verabreicht werden, zu der 5 bis 10 ml von humanem Serumalbumin hinzugefügt werden. Kontinuierliche Infusionen können in 250 bis 500 ml physiologischer Kochsalzlösung pro 24 Stunden verabreicht werden, zu der 25 bis 50 ml von humanem Serumalbumin hinzugefügt wurden. Die Antikör- perkonjugatdosis ist im Allgemeinen 10 mg to 400 mg/m2 Köφeroberfläche pro Applikation. Die Dosis muss einerseits hoch genug sein, um effektiv zu sein, aber auch unterhalb der sog. „dose limiting toxicity" (DLT). Eine tolerierte, maximale Dosis unterhalb der DLT ist die "maximum tolerated dose" (MTD). Der Fachmann kennt die Bestimmung der MTD (Lambert et al., 1998). Für wöchentliche Darreichungen kann die MTD beispielsweise im Bereich von 100 bis 200 mg/m2 liegen. Alternativ können die Abstände zwischen Verabreichungen länger sein, z.B. zwei bis vier Wochen, bevorzugt drei Wochen. In diesem Fall ist die zu erwartende MTD im Bereich von 200 bis 300 mg/m2. Alternativ kann die Darreichung in 5 täglichen Dosen, gefolgt von einer Pause von mehreren Wochen stattfinden. Dann ist die erwartende MTD niedriger als 100 mg/m2. Beispielsweise kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung als einzelne i.v. Infusion mit einer Rate von 3 mg/min alle 21 Tage erfolgen. Bis zu 7 Behandlungszyklen werden angewandt. Die angewandten Dosen können sich auch außerhalb der o.g. Bereiche bewegen, wenn die klinische Situation es erfordert.
Beispielsweise, wenn die MTD als höher als dargestellt gefunden wird, so kann eine einzelne Gabe auch eine höhere Dosis als 400 mg/m sein, oder die wöchentliche Dosis höher als 200 mg/m2.
Eine erfindungsgemäße Ausführung einer parenteralen Zusammensetzung von Antikör- perkonjugat enthält den Wirkstoff in Dosierungen von 1 mg/kg Körpergewicht bis 40 mg/kg Köφergewicht täglich, vorzugsweise im Bereich 3-15 mg/kg Köφergewicht. Bevorzugt sind auch Dosierungen ausgedrückt in [mg/m2]: 10 [mg/m2] bis 200 [mg/m2]; besonders bevorzugt 20 bis 100 [mg/m2], ganz besonders bevorzugt 10, 20, 40 oder 50 mg/m2.
Die Anwendung erfolgt in einer vorzugsweisen Ausfuhrungsform über eine kontinuierliche Infusion über 0,5 bis hin zu 24 Stunden oder gegebenenfalls über mehrere Tage, um einen Steady-State Plasmaspiegel aufrechtzuerhalten. Die Applikationsvolumina liegen im Bereich von 50 bis 500 ml, vorzugsweise bei 100 bis 250 ml, d.h. die Anwendungskonzentrationen des Wirkstoffs liegen im Bereich 80 mg/500 ml = 0,16 mg/ml (0,015 %) bis 1500 mg/100 ml = 15 mg/ml (1,5 %). Bevorzugt ist eine Wirkstoffkon- zentration von 0,5 mg/ml = 0,05 % (g/v) bis 3,5 mg/ml = 0,35 % (g/v). Daher ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Formulierung bzw. pharmazeutischen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs (Definitionen siehe oben).
Die vorliegenden bevorzugten Methoden zur Herstellung von stabilen Antiköφer- Maytansinoid bzw. -DM1 Komplexen führen zu einer Reduzierung der Entstehung von freiem Maytansinoid bzw. DM1 und deren Derivate während der Lagerung des Produktes. Dadurch kann die Laufzeit einer solchen Präparation (gelagert bei 2-8°C) gegenüber einer herkömmlichen Formulierungen gesteigert werden.
Eine bevorzugte Formulierung enthält ein Antiköφer-DMl -Konjugat, bei dem der Antiköφer die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ED NO: 4 oder SEQ ID NO: 8 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 enthält., einen Phosphatpuffer, Kochsalz, sowie Tween 20. Besonders bevorzugt ist eine solche Formulierung enthaltend 1-5 mg/ml Konjugat, einen Phosphatpuffer aus 1-1,9 mmol/1 NaH2PO4 x H2O; 4-5 mmol/1 KH2PO4; 3,5-4,5 mmol/1 Na2HPO4, 30-100 mmol/1 NaCl; 0,01 w% Tween 20 pro mg/ml Antiköφerkonjugat, (also 0,02 Gewichtsprozent, wenn das Konjugat in einer Konzentration von 2 mg/ml vorliegt, 0,04 Gewichtsprozent bei einer Konjugatkonzentration von 4 mg/ml), bei einem pH von 5-6. Besonders bevorzugt ist der pH 5,5.
Eine weitere bevorzugte Formulierung enthält 1-2,5 mg/ml, bevorzugt 1,8 bis 2 mg/ml eines Konjugates wie vorstehend beschrieben, einen Phosphatpuffer aus ca. 1,45 rnmol/1 NaH2PO4 x H2O, ca. 4,19 mmol/1 KH2PO4, ca. 3,91 mmol/1 Na2HPO4, sowie ca. 60 mmol/1 NaCl, sowie 0,02 w% Tween 20® bei einem pH von 5,5.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält die Zubereitung 4 mg/ml eines Konjugates wie vorstehend beschrieben, einen Phosphatpuffer aus ca. 1 ,45 mmol/1 NaH2PO4 x H2O, ca. 4,19 mmol/1 KH2PO4, ca. 3,91 mmol/1 Na2HPO4, , sowie 0,04 w% Tween 20® bei einem pH von 5,5. Eine weitere bevorzugte Formulierung enthält 1 Ommol/1 Succinatpuffer, beispielsweise
Natriumsuccinatpuffer, 2-5 mg/ml Antiköφerkonjugat, wobei das Antiköφerkonjugat bevorzugt Antiköφer-DMl Konjugat ist, besonders bevorzugt das oben beschriebene
Antiköφerkonjugat aus CD44v6-spezifischem Antiköφer gekoppelt an das Maytansi- noid DM1 ist. Weitere optionale Bestandteile dieser besonders bevorzugten pharmazeutischen Zubereitung sind NaCl im Bereich von 30-100 mmol 1 NaCl, bevorzugt 60 mmol/1 NaCl, und/oder Tween 20 im Bereich von 0,01-0,05 w% Tween 20, bevorzugt Tween 20 bei 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 oder 0,05 Gewichtsprozent bzw. 0,01 +/- 0,01 Gewichtsprozent Tween 20 pro 1 mg/ml Antiköφerkonjugat, also 0, 0,01 oder 0,02 Ge- wichtsprozent pro lmg/ml Antiköφerkonjugat, besonders bevorzugt 0,01 Gewichtsprozent pro 1 mg/ml Antiköφerkonjugat. Der pH wird auf 5-6 eingestellt, besonders bevorzugt 5,5.
Eine weitere bevorzugte Formulierung enthält 5 - 20 mrnol/1 Succinatpuffer, bei- spielsweise Natriumsuccinatpuffer, 2-5 mg/ml Antiköφerkonjugat, , sowie 0,02 - 0,05 Gewichtsprozent Tween® 20. Eine Ausführungsform enthält 4 mg/ml Konjugat, 10 mmol/1 Succinat (bevorzugt das Dinatriumsalz), 0,4 g/1 (0,04 w%) Tween® 20. Das Antiköφerkonjugat ist bevorzugt ein Konjugat aus einem CD44v6-spezifischem Antikörper wie oben beschrieben und dem Maytansinoid DM1. Der pH wird vor der auf 5-6 eingestellt, besonders bevorzugt 5,5.
AUSFUHRUNGSBEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Illustration der erfindungsgemäßen Gegenstände und Verfahren.
Material und Methoden:
Chemikalien: Die verwendeten Hilfsstoffe entsprechen den Anforderungen an pharmazeutisch zugelassene Hilfsstoffe. In Tabelle 2 sind die verwendeten Hilfsstoffe zusammengefasst. WFI ist Wasser für Injektionszwecke.
Tabelle 2
Figure imgf000024_0001
HP: Hydroxy-Propyl SBE: Sulfobutylether CD: Cyclodextrin
Alle verwendeten Cyclodextrine sind käuflich erhältlich (vergleiche Tabelle 1).
Der verwendeten Antiköφer-DMl Komplex ist ein Konjugat aus einem CD44v6- spezifischen Antiköφermolekül und dem Maytansinoid DM1, worin das Antiköφermolekül die leichten Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 und die schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 enthält, und worin das Maytansinoid die Formel IV hat und an den Antiköφer über eine Disulfidbindung gekoppelt ist. A. Formulierungsarbeiten an Antikörper-DMl Komplexen
Herstellung einer Antikörper-DM 1 Formulierungen:
Zur Herstellung einer 1.8 mg/ml Antiköφer-DMl Lösung wird die Ausgangslösung in die neu zu testenden Lösungen umgepuffert (nach Standardverfahren) oder die entsprechenden Hilfsstoffe zusammen gegeben. Zusätzlich kann die Proteinkonzentration auf 4-5 mg/ml erhöht werden. Die genaue Zusammensetzung dieser Formulierungen wird in den Beispielen beschrieben.
Analytische Messmethoden:
- Die Bestimmung des pH-Wertes, der Osmolalität, Aussehen, Farbe und Klarheit (AFK) wird nach den gültigen PharmEu und USP Vorschriften durchgeführt.
- HP-SEC (high Performance exclusion chromatography). Mittels HP-SEC wird der Gehalt an Monomer in der Lösung bestimmt. T2 wird isokratisch von der SEC-Säule eluiert, und der Monomeφeak integrativ ausgewertet.
- RP-HPLC (reversed phase high peformance liquid chromatography): Mittels RP- HPLC wird der Gehalt an freiem DM1 bestimmt. Diese Analysemethode beruht auf einer Kombination von HPLC mit einer „shieled" reversed-phase Kolonne, die es erlaubt kleine chemische Moleküle, die UV absorbierend sind in Gegenwart von Protein- molekülen zu diskriminieren. Diese Kombinationsmethode vereint den Vorteil der „si- ze-exlusion" und der Reversen-Phasen Chromatographie. Grosse Moleküle können nicht in die poröse Kolonnenmatrix eindringen und somit können grosse Moleküle nicht im hydrophoben Inneren der Matrix binden. Kleine Moleküle dagegen können in die Kolonnenmatrix eindringen und an den hydrophoberen Innenraum binden. Die Antikör- per-DMl Komplex („gross") Lösung in Anwesenheit von freiem DM1 („klein") wird auf die Kolonne aufgetragen. Nur freies DM1 kann gebunden werden, der AntikÖφer- DM1 Komplex wird eluiert. Mittels eines Acetonitrilgradienten wird DM1 und entsprechende Ansamitocine-Derivate von der Säule eluiert.
Verwendete Primäφackmittel für die Stressstabilitäts-Studien Flüssig-Formulierungen: Vial: 20/25 ml Standard Vial (20R), farblos, GA1 Inj. (Firma Schott, DE) Stopfen: Gusto WS 579, W 1888 grau, Teflon (Firma West, USA)
Bördelkappe: Kombika/Alu-KU (Firma West, DE)
Lyophilisations-Formulierungen:
Vial: 20/25 ml Standard Vial (20R), farblos, GA1 Inj. (Firma Schott, DE) Stopfen: Gusto 1797 PH 4023/50, grau, coat (Firma West, USA)
Bördelkappe: Kombika/Alu-KU (Firma West, DE)
Durchführung der Stressstabilitäts-Studien
Die verschiedenen zu testenden Formulierungen werden über einen Sterilfilter (0.22 micrometer, Firma Millipore) sterilfiltriert und in die Fläschchen (Vials) abgefüllt. Das Füllvolumen beträgt 20 ml für die Flüssig-Formulierungen, 10 ml für die Lyophilisati- ons-Formulierung. Die abgefüllten 10 ml Lyophilisations-Formulierang werden an- schliessend gefriergetrocknet. Die Fläschchen werden mittels Stopfen und Bördelkappe verschlossen und über Kopf gelagert. Die Lagertemperature für die Stressstabilitäts- Studien beträgt 40 °C. Die Probenziehungszeitpunkte betragen: 0, 4, und 8 Wochen.
Beispiel 1: Einfluss des pH Wertes und der Lyophilisation auf die Stabilität von Antikörper-DMl Komplexen
Die Proteinkonzentration (Antiköφer-DMl Komplex) beträgt 1.8 mg/ml für alle Flüssig-Formulierungen und 4.65 mg/ml für die Lyophilisations-Formulierungen. Die Proteinmenge pro Vial ist somit ähnlich: 1.8 mg/ml x 20 ml = 36 mg/vial (Flüssig- Formulierung), 4.65 mg/ml x 10 ml = 46.5 mg/vial (Lyophilisations-Formulierung). Die Vergleichsformulierung (Tabelle 3) besteht aus folgenden Hilfsstoffen:
Tabelle 3:
Figure imgf000027_0001
Der pH Wert der verschiedenen zu untersuchenden Formuliemngen wurden ausgehend von der Vergleichsformulierung (Tabelle 3) mit 1 N Phosphorsäure auf pH 6.0 und 5,5 eingestellt. 20 ml der jeweiligen Formulierung wurden in ein 20 R Vial abgefüllt und die Vials kopfüber bei 40 °C gelagert. Die Lyophilisations-Formuliemng besteht aus (Tabelle 4): Tabelle 4:
Figure imgf000027_0002
Die Ergebnisse der Stress-Studie sind in Abbildung 1 sowie in Tabelle 5 zusammenge- fasst.
Figure imgf000028_0001
In Abbildung 1 ist der Unterschied von freiem DM1 Gehalt dargestellt. Dargestellt ist der Unterschied von freiem DM1 zwischen dem Nullwert und dem 4- Wochenwert, und der Unterschied zwischen dem Nullwert und dem 8-Wochenwert.
Beschreibung der Auswertung DM1 Gehaltsbestimmung: Die für die verschiedenen DM1 -Moleküle gemessenen Flächen wurden für jeden Ziehungszeitpunkt addiert. Somit erhält man eine Flächensumme für DM1 -Derivate in den einzelnen Proben. Die Grafiken zeigen den Anstieg dieser Flächen (den Anstieg an freien Maytansinoiden in der entsprechenden Formulierung) zwischen 0 und 4 Wochen (hell) und den Anstieg dieser Flächen zwischen 0 und 8 Wochen (dunkel) für jede Formulierung.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass der pH Wert einen erheblichen Einfluss hat auf die Stabilität des Antiköφer-DMl Komplex. Aus Abbildung 1 ist der Effekt des pH Wertes deutlich. Der Gehalt an freien DM1 ist um den Faktor 2-3 geringer bei Formulierungen mit pH 5,5 als bei pH 6,5.
Der Monomergehalt ist um 2-6 % höher für pH 5,5 als für Formuliemngen bei pH 6,5. Einen vorteilhaften Einfluss hat die pH Erniedrigung auch auf den AFK (Aussehen, Farbe Klarheit) Parameter (vergleiche Tabelle 4). Über einen Zeitraum von 8 Wochen (bei 40°C gelagert) nimmt der Monomergehalt um 12 % ab (Formulierung bei pH 6.5).
Zusammenfassend kann man festhalten, dass eine Erniedrigung des pH Wertes von pH 6,5 auf pH 5,5 einen positiven Einfluss auf die Stabilisierung von Antiköφer-DMl Komplexen hat. Im Vergleich zu der Formulierung mit pH 6,5 kann man erwarten, dass die Laufzeit der Lagerung bei 2-8 °C um den Faktor 2-3 verlängert werden kann.
Beispiel 2: Einfluss von Cyclodextrinen auf die Stabilität von Antikörper-DMl Komplexen
In einem zweiten Versuch wurde der Einfluss von Cyclodextrinen auf die Stabilität von Antiköφer-DMl Komplexen in einer Stress-Studie evaluiert. Es wurden 4 verschiedenen Cyclodextrine getestet:
• Hydroxy-Propyl-beta-Cyclodextrin (HP-ß-CD)
• Hydroxy-Propyl-gamma-Cyclodextrin (HP-γ-CD)
• Gamma-Cyclodextrin (HP-γ-CD)
• Sulfobutylether-beta-Cyclodextrin (SBE-ß-CD, Captisol)
Die Gnmdformulierung besteht aus folgenden Hilfsstoffen (Tabelle 6):
Tabelle 6:
Figure imgf000029_0001
Bei allen CD-Formulierungen wurde der pH Wert konstant auf pH 6.5 gehalten.
Die Cyclodextringehalt wurde zwischen 1 und 15 w% variiert (Tabelle 7). Tabelle 7:
Figure imgf000030_0001
Basierend auf der Grandformuliemng aus Tabelle 6 wurde durch Zugabe der entsprechenden Menge an Cyclodextrin, die in Tabelle 7 dargestellten 11 CD-Flüssig- Formulierungen hergestellt. 20 ml wurden jeweils in eine Vial (Röhrchen, n=2) angefüllt, die Vials verschlossen und über Kopf bei 40 °C gelagert. Die Bezeichnungen der jeweiligen Formulierangen findet man in Tabelle 6. Formulierung Dl bedeutet: 1 w% Cyclodextrin D (SBE-ß-CD, Captisol). Die Ergebnisse aus der Stressstudie sind in Abbildung 2 sowie Tabellen 8-11 zusammengefasst. (zu der Darstellung der Ergebnisse vergleiche Beispiel 1).
Tabelle 8:
Figure imgf000030_0002
Tabelle 9:
Figure imgf000031_0001
Tabelle 10:
Figure imgf000031_0002
Tabelle 11:
Figure imgf000031_0003
Aus Abbildung 2 geht hervor, dass der Gehalt an freiem DM1 für die Formulierungen D (Captisol) am geringsten ist. Der Vergleich von z.B. Formulierung Dl mit Bl (gleicher Gehalt an Cyclodextrin) zeigt, dass der freie DM1 Gehalt im Vergleich zu der Formulierung Bl halbiert ist. Die Monomergehalte der verschiedenen Cyclodextrin- Formulierungen sind vergleichbar mit der Vergleichsformulierang bei pH 6.5 (Tabelle 3). Zusammenfassend kann man sagen, dass die Formulierungen mit Cyclodextrinen, insbesondere Captisol eine Stabilisierung des Antiköφer-DMl Komplexes bewirken. Die Laufzeit des Produktes kann somit im Vergleich zur Vergleichsformulierung verlängert werden. Literatur
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Figure imgf000038_0001
VOM ANMELDEAMT AUSZUFÜLLEN
Figure imgf000038_0002
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BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL REOOGNITION OF THE DEPOSIT OF MfCROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT FROCEOURE
INTERNATIONAL FORM
Boehringer Ingelheim Int. GmbH Postfach 200 55216 Ingelheim am Rhein RECEIPT IN THE OASE OJ AN ORIGINAL DEPOSIT üsued pureuant to Eule 7,1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY ϊύeπtified at th botto of thii page
I. IDENTIFICATION OF THE ICROORGANISM
Identification raferenee glven by the DEPOSITOR: Acceuioα number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY: VFF-18 DSM ÄCC217
II. SCIBNTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONO ÖO DESIGNATION
The inicroorgani-cn idoπtϊfied under I. above as a companϊed by: ( ) a εclentLfic dascription ( ) a proposed taxonoπuc decignation
(Mark with a cross where applicable).
IH. RECEIPT AND ACCEPTANCE
Thia International Dcpo.itary Authority acccpbs the microorgam-m identified under I. above, which waβ reeeived byit oπ 1994-06-07 (Date o he oripnal depo.it)1.
IV RECEIPT OF RBQUEST FOR CONVERSION
The mϊcroorϊ&ni.m identified under I above was reeeived by thie International Depσsitar Authority r o <_π__.
(date of original depoiit) and a rβflueat to convert the original depos'it to a deposit under the Budapest Treaty was recöived by ϊt on (date of reeeipt of Tβqurat for eoπvcrsion)
V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name: DSM-DEUTSCHE SAM LUNO VON Signaturen} of pcr*en(-) havmg tho power MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH to repreaent the International Depoeitary Authority or of authorieed offieial(s):
Addrcaβ: Maseheroder Weg 1b D-381K Braunjςhweig Date. 1994-06-17
J Where Rulc 6.4 (d) applies. D eh date is th- date on whleh the Status of international dcpoäϊtary authority s acquύed. Form DSM-BP/4 (»olc pofe) 12/93 BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL REC GN1TION OF THE DEPOSIT OF MICROORCANISMS FORTHE PURPOSES OF PATENT PROOEDURE
INTERNATIONAL FORM
Boehringer Ingelheim Int. GmbH Postfach 200 55216 Ingelheim am Rhein VIABI ITY STATEMENT iωued pureuant to Rule 10.2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at ehe bottσm of thi» page
I. DEPOSITOR π. IDENTIFICATION OF THE MICROOROANIS
Nam: Boehringer Ingelheim Int. GmbH Atc-sβion number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY:
Addr«κ Pos fac 200 DS A.CC217 55216 Ingelheim am Rhein Date of the deposit or the transfcr1: 1994-06-07
Ht VIABILITY STATEMENT
The vϊabtlity of the πύcroorganiim identified under II above was teated on 1994 — 06 — 07 2 . On that date, the laid micrσOrganism v«4 (X)3 viablc ( )3 no longer viablc
IV. OONÖITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFORMED4
V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name: DSM-DEUTSOHE SAMMLUNG VON Sign»ture(g) of person(β) having the powet MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH to repreaent the International Deponitary Authority or of authorited offlcial(s):
Addreα: Maseherσdcr Wer lb D-3S124 Bnuns hwoij Date: 1994-06-17 indleacc the date of origi al deposit αr, whoro a new d«po« or a transfor haa becn made, the mott recent relevant date (date of the new doposlt or date of the tranefer). In the catte- referred to in Rule 10.2(a) (ü) and(lii), refer to the most receπt viability test
3 ark with a cro-i the applicable box.
4 Fül in if tb« Information hu beert requested and If the resulte of ehe test were negative.
Form DSM-BP/9 (lole page) 12/93

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Konjugat aus einem Antiköφer und einem Maytansinoid in Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass die- Lösung einen pH- Wert von 5-6 hat.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Puffer enthält, vorzugsweise einen Succinat-, Phosphat- oder Acetatpuffer.
3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Detergenz enthält, vorzugsweise Polysorbat 20, 60, oder 80.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Konjugats 0,1 bis 20 mg/ml beträgt, vorzugsweise 1 - 10 mg/ml.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Detergenzkonzentration 0,01 bis 0,1 % w beträgt.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Konjugat aus einem Antiköφer und einem Maytansinoid in Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Cyclodextrin enthält.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Cyclo- dextrin Sulfobutylether-ß-Cyclodextrin, Hydroxy-Propyl-ß-Cyclodextrin, Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin oder γ-Cyclodextrin ist.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Cyclodextrin in 0,01-40 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,1-10 Ge- wichtsprozent enthalten ist.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Antiköφer eine leichte Kette mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4, oder SEQ ID NO: 8, und eine schwere Kette mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6 enthält.
10. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Behandlung einer Krebserkrankung.
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