CN108291197B - 生成人内耳感觉上皮和感觉神经元的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于指导人多能干细胞分化成内耳感觉上皮和感觉神经元的方法。更特别地，本文提供了用于获得包含以下的三维培养物的方法：人多能干细胞来源的耳前上皮、耳泡，以及含有毛细胞、感觉神经元和支持细胞的内耳感觉上皮。

Description

生成人内耳感觉上皮和感觉神经元的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年10月21日提交的美国临时申请No.62/244,568的权益，其通过引用如其全部内容所示并入本文。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明是在国立卫生研究院授予的DC015624、DC012617和DC013294的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本文提供了用于指导人多能干细胞分化成内耳感觉上皮和感觉神经元的方法。更特别地，本文提供了用于获得包含以下的三维培养物的方法：人多能干细胞来源的耳前细胞上皮、耳泡、以及内耳感觉上皮，所述内耳感觉上皮含有毛细胞和支持细胞，以及支配感觉上皮的感觉神经元。

背景技术

全世界有近5亿人患有听力损失，但并没有可以治疗听力损失的药理学、遗传学或细胞治疗。这种方法可用于生成人内耳干细胞、支持细胞、毛细胞和神经元以用于细胞治疗或用于药物发现。

因此，本领域仍然需要用于使人多能干细胞分化成适用于临床细胞治疗的内耳感觉组织的高效的、可重复的、并且无异种材料的方法。

发明内容

在第一方面中，本文提供了获得人耳前上皮细胞的方法。如本文所述，所述方法包括：(a)在包含骨形态生成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)和转化生长因子β(Transforming Growth Factor Beta，TGFβ)信号传导抑制剂的培养基中培养人多能干细胞聚集体约8天至约10天；(b)在成纤维细胞生长因子(Fibroblast GroMh Factor，FGF)和BMP信号传导抑制剂的存在下进一步培养(a)的经培养的聚集体约4天；和(b)使(b)的经进一步培养的聚集体接触Wnt激动剂约4天，由此经接触的聚集体内的细胞分化成耳前上皮细胞。FGF可以是FGF-2。BMP可以是BMP2、BMP4或BMP7。BMP信号传导抑制剂可以是LDN-193189。TGFβ1介导的信号传导的抑制剂可以选自SB431542和A-83-01。Wnt激动剂可以是GSK3抑制剂。GSK3抑制剂选自CHIR99021、氯化锂(LiCl)和6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)。

在另一个方面中，本文提供了获得包含人内耳感觉组织的三维组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将根据权利要求1所述的方法获得的人耳前上皮细胞包埋在包含细胞外基质蛋白的半固体培养基中；和(b)在促进包埋的耳前上皮细胞自组装成耳泡的条件下，在Wnt激动剂的存在下培养包埋的耳前上皮细胞约40天至约60天，由此获得包含人内耳感觉组织的三维组合物。Wnt激动剂可以是GSK3抑制剂，其中GSK3抑制剂选自CHIR99021、氯化锂(LiCl)和6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)。细胞外基质可以是基底膜提取物(basementmembrane extract，BME)。三维组合物可以包含一种或更多种机械感觉细胞。三维组合物可以包含一种或更多种感觉神经元细胞。三维组合物可以包含一种或更多种与机械感觉细胞形成突触连接的感觉神经元细胞。

在考虑以下附图、详细描述和所附权利要求后，将更好地理解本文描述的这些和其他特征、方面和优点。

附图说明

图1A至1N证实了用于逐步诱导听板样上皮的示例性方案。a，在听板颅区中的哺乳动物外胚层发育的概述。b，人耳诱导的关键事件的时间线。时间线上的第0天表示由hPSC表示的近似发育阶段：约12dpc。c，非神经外胚层(non-nerual ectoderm，NNE)、耳-上鳃祖细胞区域(otic-epibranchial progenitor domain，OEPD)和听板诱导的分化策略。括号内表示可能任选的或细胞系依赖的处理。d，经DMSO(对照)、10μMSB或10μM SB+10ng/ml BMP4(表示为SBB)处理的WA25细胞聚集体分化第2天的qPCR分析。将基因表达相对于未分化的hESC进行归一化；n＝3个生物样品，2个技术重复；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；误差线＝最大/最小值。e、f，经10μM SB或200nM LDN+10μM SB处理6天的WA25聚集体中的代表性TFAP2、ECAD和PAX6表达。g，经10μM SB+2.5ng/ml BMP4(SBB)处理的mND2-0iPSC在第6天的TFAP2、ECAD和PAX6表达。h、i，经SB处理的WA25聚集体在第8天的代表性图像：活的(h)和经PAX8和TFAP2抗体免疫染色的(i)。当比较图(h)和(i)中的形态时，注意到在冷冻切片过程期间外部上皮皱缩成聚集体核心。j、k，在第4天用50ng/ml FGF-2和200nM LDN(SBFL)处理后第8天，经SB处理的WA25聚集体的代表性图像：活的(j)和经PAX8和TFAP2抗体免疫染色的(k)。1至n，在第12天的的经SBFL处理的WA25聚集体。外部上皮包含PAX8⁺ECAD⁺细胞(1)和偶尔的PAX8⁺PAX2⁺听板样细胞的片(patch)(m、n)。所示出的样品在第8天用25μl额外的CDM处理。比例尺，100μm(e至m)，50μm(n)。

图2A至2H证实了未分化的WA25hESC、细胞聚集和初始非神经外胚层分化分析。a、b，保持在E8培养基中的经玻连蛋白-N包被的平板上的WA25细胞表达激发的多能干细胞的标志物。c，分化策略和实验条件的概述。d、e，单细胞hESC的聚集在E8+20μM Y-27632中比在CDM+20μM Y-27632中产生更少的细胞碎片。f，相对于未分化的细胞，在除赋形剂对照以外的所有条件下，多能标志物在第2天显著下调。g，非神经标志物TFAP2和DLX3在SB和SBB条件下上调。h，中胚层标志物BRA和EOMES通过BMP4(B)处理上调。将基因表达相对于d0聚集体进行归一化。对于统计学检验，将处理值与对照(CTRL)值进行比较；n＝3个生物样品，2个技术重复；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns＝不显著；误差线是最大/最小值。比例尺，100μm(a、d、e)，25μm(b)。

图3A至3G证实了使用WA25hESC的非神经诱导。a、b，分化策略的概述。c至e，培养中随时间推移的聚集体直径(c)和圆度(d)。随着外部上皮皱缩，聚集体的圆度随着时间推移而降低(e)。f、g，代表性的第4天聚集体显示出核心中几乎完全缺乏OCT4表达细胞、SOX2/ECAD表达细胞，以及在外部核心和上皮中几乎完全缺乏TFAP2/ECAD表达细胞。误差线是最大/最小值。比例尺，100μm。

图4A至4R证实了Wnt信号传导激活启动包含前庭样毛细胞的内耳类器官的自组织和成熟。a，内耳类器官诱导策略。将第12天聚集体包埋在Matrigel液滴中以支持耳泡形成。b至d，在经CHIR处理的样品但不是DMSO(对照)样品中，耳凹样结构从外表皮外翻(d)。e至i，在第14天至35天之间，耳凹和耳泡表达耳特异性标志物，例如SOX10、SOX2、JAGl、PAX8、PAX2和FBXO2。在第35天，产生耳泡的上皮开始表达表皮角质形成细胞标志物KRT5(h)。j，到第40天至60天，聚集体包含多种类器官，并且通常，在DIC成像下可见到单个表皮单位。内耳类器官可以通过具有约25μm至40μm表观厚度和腔的确定上皮来区分(j插图)。k，内耳类器官通常围绕表皮单元定向并且包含具有ANXA4⁺PCP4⁺毛细胞的感觉上皮。类器官的腔表面富含肌动蛋白，如鬼笔环肽染色所示(k”)所示。l至o，毛细胞是MYO7A⁺SOX2⁺，支持细胞是SOX2⁺。富含F-肌动蛋白的毛束从毛细胞突出进入腔内(n、o；星号表示m中的毛束位置)。p、q，mND2-0iPSC来源的感觉上皮具有与WA25hESC来源的感觉上皮相似的形态并且包含PCP4⁺ANXA4⁺毛细胞。SOX10在整个支持细胞群和非感觉上皮细胞群中表达，但不在毛细胞中表达(p)。支持细胞表达椭圆囊支持细胞标志物SPARCL1(q)。r，类器官中的毛细胞具有带有单一乙酰化的微管蛋白(TUBA4A)⁺动纤毛的ESPN⁺毛束。比例尺，200μm(j)，100μm(b、c、e)，50μm(g、h、k)，25μm(d、f、i、1、m、p)，10μm(n、q)，5μm(r)，2.5μm(o)。

图5A至5K证实了hESC来源的毛细胞具有与天然毛细胞相似的电生理特性。a，ATOH1-2A-eGFP CRISPR设计。两个指导RNA(蓝色，PAM序列为红色)指导Cas9n在ATOH1的终止密码子附近(带有粉红色背景的下划线的)形成两个切口(红色三角形)。产生的DNA双链断裂由供体载体修复，所述供体载体具有2A-eGFP-PGK-Puro盒和1kb的左右同源臂(LHA和RHA)。随后，通过Cre重组酶除去LoxP侧翼的PGK-Puro子盒。在表达ATOH1的毛细胞中，eGFP与ATOH1一起转录。b至d，在50天和100天的内耳类器官中的2A-eGFP⁺毛细胞的代表性活细胞图像。在图(b)中，软骨结节(cn)和星号表示单独的2A-eGFP⁺毛细胞片。图(c)中的星号表示图(d)中毛细胞的大致位置。e，在140天的eGFP⁺毛细胞中的BRN3C表达。f，在100天的eGFP⁺毛细胞的毛束中的ESPN表达。g，人类器官毛细胞表现出突出的外向电流(d64)。h，细胞对电流注入作出反应，校正电压偏差，其特征与在小鼠前庭II型毛细胞中观察到的特征类似。i，人类器官毛细胞能够在上升期后与初始峰一起追随正弦刺激(频率扫描摘录)。j，尽管电压门控电流在培养的这一点上稍小，但总电压依赖性与小鼠毛细胞(在第64至67天收集的非渗漏记录，与P4小鼠椭圆囊相比)中看到的非常相似。k，然而，在小鼠椭圆囊和类器官细胞中低于-80mV的内向整流电流在人类器官细胞中并不突出。比例尺，200μm(b)，100μm(c)，25μm(e)，5μm(d、f)。

图6A至6E证实了经SB处理的聚集体生成角质形成细胞。a，非神经和角质形成细胞诱导过程的概述。b至d，在3D培养中，非神经外胚层诱导伴随着特征性形态变化。到第6天至8天，上皮与核心分离，形成半透明球体(c)。上皮通过轮辐(spoke)状结构保持与核心连接(a、c)。20天后，不存在来自核心的轮辐，并且上皮球体通常充满细胞碎片(d)。e，第20天上皮包含TFAP2+KRT5+细胞，指示表皮角质形成细胞。比例尺，250μm(b至d)，100μm(e)，5μm(e’)。

图7A至7D证实了经SB处理的WA25聚集体中的非神经外胚层诱导是由于内源性BMP信号传导。a，测试内源性BMP信号传导是否影响非神经诱导的实验概述。b至d，LSB处理导致整个聚集体中的NCAD表达。注意，NCAD+PAX6+细胞的亚群(参见图1E)确实出现在经SB处理的聚集体的核心中。比例尺，50μm。

图8A至8G证实了用mND2-0iPSC进行的非神经外胚层诱导。a、b，保持在E8培养基中的经玻连蛋白-N包被的板上的WA25细胞表达激发的多能干细胞的标志物。c，分化策略和实验条件的概述。其他BMP浓度在初步实验(1.25、2.5、5、10、20、40ng/ml)中进行测试，并且选择2.5ng/ml作为在经SB处理的WA25细胞中看到的产生形态变化(即，半透明球体)的最小浓度(参见图6C)。d，第0天至6天之间经SB或SBB处理的聚集体的代表性图像。e、f，经SB处理的聚集体在第6天生成PAX6+NCAD+上皮、TFAP2+迁移细胞和少量ECAD+细胞，表明是神经外胚层和神经嵴细胞的异质混合物。g，内源性BMP信号传导不足以在mND2-0iPSC中进行非神经转换；因此，额外的BMP4是必要的。比例尺，100μm(d)，25μm(a、b、e、f)。

图9A至9C证实了在没有中内胚层细胞的脱靶诱导的情况下发生非神经外胚层诱导。在第0天用10ng/ml BMP4(a)、10μM SB(b)和10μMSB+2.5ng/ml BMP4(c)处理的第4天聚集体的代表性Brachyury(BRA)免疫组织化学。比例尺，50μm。

图10A至10D证实了通过FGF-2和LDN(“FL”)处理诱导WA25hESC和mND2-0iPSC聚集体中的OEPD样上皮。a、b，在第4天FL处理后第8天，SOX2、TFAP2和ECAD在整个经SB处理的WA25聚集体中表达。PAX8表达限于外部表皮。上鳃基板和听板的独特特征是ECAD和NCAD的共表达。在此，除了最内部的核心以外，整个聚集体中都观察到NCAD表达。c、d，经SBB处理的iPSC从不表达PAX8。第4天的FL处理诱导更厚的外部上皮形态和PAX8表达。ECAD和TFAP2在整个经SBB+FL(d4)处理的iPSC聚集体中表达。比例尺，100μm。

图11A至11F证实了OEPD诱导的聚集体在基本培养基漂浮培养物中自发生成感觉样神经元。a，实验概述。在分化第8天将经SBFL处理的聚集体转移至OMM。b至d，在第20天，聚集体由围绕ECAD+上皮的BRN3A+TUJ1+HUC+神经元的片构成。神经元片通常与PAX8+上皮相关。当将聚集体平板接种在Matrigel^TM液滴中时，它们产生神经突生长(e)。f，从PAX8+ECAD+上皮出现的BRN3A+神经元与上鳃基板神经发生一致；然而，这些数据并不直接确定PAX8+ECAD+上皮为感觉神经元的起源。比例尺，100μm(b、c、d)，50μm(e)。

图12A至12C证实了在分化8天至10天期间的WNT和FGF信号传导调节和PAX8/PAX2表达。a，这些qPCR数据代表了集中于鉴定可以在OEPD诱导后增加PAX2表达的信号传导调节剂的探索性实验。b、c，使用PD-173074的FGF抑制可能抑制PAX2表达，如基于发育研究(Groves等，Development 139，245-257(2012))所预期的。相比之下，与DMSO对照相比，WNT抑制剂XAV939和WNT激动剂CHIR99021仅对PAX2表达具有适度的正面或负面影响。基于这些结果和对PAX2表达的广泛免疫染色，我们推断OEPD上皮可能需要更多时间才会对耳诱导信号作出反应。因此，我们通过将初始培养期延长至12天(第8天添加新鲜培养基)并测试使聚集体转变为Matrigel^TM液滴的效果来改变策略。

图13A至13G证实了耳泡在表皮角质形成细胞的核心上皮周围径向外翻。a至c，第35天聚集体的显示出表皮和耳泡上皮的内部组织的连续切片。KRT5表达限于表皮，而ECAD在表皮和耳泡上皮细胞二者中均表达。(a)中的箭头标示SOX10+耳泡。注意聚集体的间充质层中的CNC样SOX10+TFAP2-细胞和SOX10+TFAP2+细胞。图(c)中突出显示的耳泡对在图(b)中以较低的放大率和不同方向标示。(c)中看到的耳泡显示出共表达耳泡标志物SOX10、PAX2、FBXO2、JAG1和ECAD。d至g，进行ECAD整体免疫染色以揭示表皮核心和周围耳泡的第35天聚集体。比例尺，250μm(d、f)，100μm(a、b)，25μm(c、g)。

图14A至14E证实了内耳类器官产生前庭样感觉上皮。a，第48天聚集体有三个可见的内耳类器官(箭头)。请注意，该样品来源于相对于图2J所示样品单独的实验。b，类器官毛细胞表达II型前庭和内耳蜗毛细胞标志物CALB2。c，通过感觉上皮的截面示出SPARCL1在整个支持细胞中的表达。SOX2在支持细胞和PCP4+毛细胞二者中均表达。d至f，SOX10在整个支持细胞和非感觉上皮细胞中表达。在感觉上皮和非感觉上皮二者中都观察到富含F-肌动蛋白的圆周带。比例尺，100μm(a、d、e)，25μm(b、c)，10μm(f)。

图15示出了人内耳诱导研究的比较。2D，二维。3D，三维。OEP：耳上皮祖细胞。注意：在Chen等(2012)的方案中，OEP生成效率取决于细胞系、平板接种密度和细胞分离程度。在Ronaghi等(2014)的方案中，由具有中等水平Atoh1-nGFP表达的细胞计算出1.79％的毛细胞样细胞生成效率(19.8％×9.03％＝1.79％)，这被认为是“潜在毛细胞表型的指标”。如果还考虑具有Atohl-nGFP高表达的细胞和Atohl-nGFP表达为阴性的细胞，毛细胞样细胞生成效率为5.89％(77.1％×5.24％+19.8％×9.03％+3.1％×2.08％＝5.89％)。

图16A至16C证实了耳的神经发生。(a至b)SOX2+耳泡和耳凹通常与ISL1+TUJl+成神经细胞相关(第14天)。耳泡的上皮在该阶段看起来是高度神经源性的，整个具有较弱的TUJ1染色。(c)NGN1和NGN2在经CHIR处理的样品中在第14天表达；相对于未分化的PSC进行归一化(n＝3)。比例，100μm(a)，20μm(b)。

图17A至17C证实了感觉神经元的生长和成熟。平板接种在Matrigel上的经HIR处理的类器官产生具有双极形态的TUJ1+BRN3A+神经元。生长锥(b中的插图)。比例，500(a)，50(b)，10(c)。

图18A至18C证实了内耳类器官来源的毛细胞具有带状突触样结构并且受感觉神经元支配。A至B，在分化第60天，WA25hESC来源的PCP4阳性毛细胞中的CTBP2阳性斑点。C，支配内耳类器官感觉上皮的神经元的代表性图像。比例尺，100μm(C)，25μm(A、B)。

图19描述了ATOH1-2A-eGFP-PGK-Puro供体质粒序列(SEQ ID NO：21)。

图20描绘了ATOH1基因座处的纯合/双等位基因ATOH1-2A-eGFP细胞系的基因组序列(SEQ ID NO：22)。

发明详述

本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请都通过引用整体并入本文，就如同每个单独的公开、专利和专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入一样。

本发明至少部分地基于发明人的发现：在允许分化和重塑的条件下培养的人多能干细胞来源的前体细胞形成高度均匀的内耳组织的组合物，所述组合物重现人内耳感觉上皮的复杂性和组织性并且包含功能毛细胞。发明人发现可以生产具有大规模的定量体外建模和筛选应用所必需的均匀性的复合人组织。

因此，本发明涉及包含三维组织构建体和培养物的组合物以及使用这样的组合物作为人内耳组织的高度均匀模型并用于筛选候选药物的方法。特别地，本文提供了有效且可重复地生产和扩增复杂的组织的人内耳感觉组织的方法，所述人内耳感觉组织适合作为用于移植的人毛细胞的来源、作为用于理解感觉缺陷的模型和作为用于筛选候选药物的平台。本文提供的方法和***的一个重要优点是能够由单细胞来源生成包含多种功能细胞类型的复合组织构建体。另外，本文提供的方法和***忠实地重现了复杂的有组织的内耳结构层的体内发育。本发明提供了用于生成人内耳感觉组织的可扩展且稳健的***以及在体外人模型中研究这种组织的重要机会。另外，本发明的方法可用于鉴定人组织工程的材料和组合策略。

方法

在示例性实施方案中，本文提供的方法包括在促进多能干细胞分化成内耳感觉组织的条件下使人多能干细胞分化。一般而言，内耳感觉组织的细胞通过其表面表型，通过对生长因子作出反应的能力以及能够在体内或体外分化成特定细胞谱系来鉴定。

在第一方面中，获得人内耳感觉组织的方法包括使人多能干细胞聚集成球状体以及在包含促进非神经上皮(NNE)诱导的因子的培养基的存在下培养所述球状体约3天至4天。这样的培养基包含以下的化学成分确定的组分或者基本上由以下的化学成分确定的组分组成：骨形态生成蛋白-4(BMP4)和转化生长因子β(TGFβ)信号传导抑制剂例如SB-431542(“SB”)，由此诱导至少一部分的多能干细胞分化以在每个聚集体内形成中胚层细胞的核心。优选地，在BMP4和TGFβ信号传导抑制剂(例如SB)的存在下培养包含中胚层细胞的核心的聚集体约8天至约10天。SB-431542是激活素受体样激酶受体ALK5、ALK4和ALK7的特异性抑制剂。培养8天至10天之后，中胚层核心的细胞迁移至聚集体的表面并产生一层非神经上皮，在其中将发育出内耳类器官。现在衬在聚集体的核心上的产生内耳类器官的非神经上皮可以最终分化成表皮组织。

参照图1，在成纤维细胞生长因子(FGF)(例如，FGF-2)和骨形态生成蛋白(BMP)信号传导抑制剂的组合的存在下培养根据以上概述的培养步骤形成的NNE细胞，由此NNE细胞分化成耳前上皮，也称为耳-上鳃祖细胞区域(OEPD)，由耳前上皮衍生出听板。OEPD相对于在单独存在TGFB信号传导抑制剂的情况下培养的NNE细胞变厚，并且表达后基板标志物如PAX8、SOX2、TFAP2、ECAD和NCAD的组合。适合根据本文提供的方法使用的BMP信号传导抑制剂包括但不限于LDN-193189和SB-431542。LDN-193189是抑制BMP I型受体ALK2和ALK3的转录活性的选择性BMP信号传导抑制剂。

接着，将包含耳前上皮的聚集体(即OEPD)包埋在半固体培养基(例如，细胞外基质蛋白的半固体组合物)中。然后，在Wnt激动剂的存在下培养包埋的聚集体直至耳前上皮自组装成有组织的耳泡。在一些情况下，在Wnt激动剂的存在下培养包含耳前上皮的聚集体约10天至约14天(例如，约10天、11天、12天、13天或14天)。

进一步培养含有耳泡的聚集体至少约40天(例如，约40天、约45天、约50天、约60天、约65天、约70天、约75天或更多天)，期间获得包含机械感觉细胞(例如，毛细胞)的内耳类器官。毛细胞是介导听力和平衡的脊椎动物内耳和侧线器官的特化机械感受细胞。

为了形成聚集体，可以化学地、酶促地或机械地将多能干细胞的汇合培养物从表面例如

分离出团块、聚集体或单细胞。在示例性实施方案中，将分离的细胞(如团块、聚集体或单细胞)平板接种到无蛋白质的基础培养基例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)/F12、mTeSR^TM(StemCell Technologies；Vancouver，British Columbia，Canada)和TeSR^TM的表面上。Ludwig等中描述了TeSR^TM的全部成分和使用方法。参见例如Ludwig T等，“Feeder-independent culture of human embryonic stem cells，”Nat.Methods 3：637-646(2006)；和Ludwig T等，“Derivation of human embryonic stem cells indefined conditions，”Nat.Biotechnol.24：185-187(2006)，其各自如其全部内容所示通过引用并入本文。适用于本文的其他DMEM制剂包括例如X-Vivo(BioWhittaker，Walkersville，MD)和

(Invitrogen；Carlsbad，CA)。

在一些情况下，在Rho激酶(ROCK)抑制剂的存在下培养多能干细胞的聚集体。已知激酶抑制剂例如ROCK抑制剂保护单一细胞和小的细胞聚集体。参见例如美国专利申请公开No.2008/0171385，其如全部内容所示通过引用并入本文；和Watanabe K等，“A ROCKinhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells，”Nat.Biotechnol.25：681-686(2007)。以下示出了显著增加在化学成分确定的表面上的多能细胞存活率的ROCK抑制剂。适用于本文的ROCK抑制剂包括但不限于(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]高哌嗪二盐酸盐(非正式名称：H-1152)、1-(5-异喹啉磺酰基)哌嗪盐酸盐(非正式名称：HA-100)、1-(5-异喹啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(非正式名称：H-7)、1-(5-异喹啉磺酰基)-3-甲基哌嗪(非正式名称：异H-7)、N-2-(甲基氨基)乙基-5-异喹啉-磺酰胺二盐酸盐(非正式名称：H-8)、N-(2-氨基乙基)-5-异喹啉磺酰胺二盐酸盐(非正式名称：H-9)、N-[2-对溴肉桂基氨基]乙基]-5-异喹啉磺酰胺二盐酸盐(非正式名称：H-89)、N-(2-胍基乙基)-5-异喹啉磺酰胺盐酸盐(非正式名称：HA-1004)、1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪二盐酸盐(非正式名称：H-1077)、(S)-(+)-2-甲基-4-甘氨酰基-1-(4-甲基异喹啉基-5-磺酰基)高哌嗪二盐酸盐(非正式名称：甘氨酰基H-1152)和(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐(非正式名称：Y-27632)。激酶抑制剂可以以足够高的浓度提供以使细胞存活并保持附着于表面。约3μM至约10μM的抑制剂浓度可以是合适的。在较低浓度下，或者当不提供ROCK抑制剂时，未分化细胞通常分离，而分化细胞保持附着于确定的表面。

图2是FGF信号传导的激动剂，并且FGF信号传导可以使用例如小分子抑制剂PD-173074来拈抗。BMP4是BMP信号传导的激动剂，并且BMP信号传导可以使用例如小分子抑制剂LDN-193189来拈抗。TGFβ-1和激活素A是TGFβ信号传导的激动剂，并且TGFβ信号传导可以使用例如小分子抑制剂SB-431542来拈抗。CHIR-99021是Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的激动剂，并且Wnt/β-连环蛋白信号传导可以使用例如小分子抑制剂XAV-939来拈抗。其他Wnt激动剂包括分子糖原合酶激酶3(Glycogen Synthase Kinase 3，GSK3)的抑制剂/拮抗剂。

在一些情况下，细胞外基质蛋白质的半固体组合物是可商购获得的产品，例如

基底膜基质。

基底膜基质适用于使用

hESC SFM或Essential 8^TM培养基***的人多能干细胞应用。在其他情况下，半固体组合物包含两种或更多种细胞外基质蛋白，例如层黏连蛋白，巢蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、胶原或其组合。

优选地，在化学成分确定的基础培养基制剂中培养人多能干细胞，所述化学成分确定的基础培养基制剂包含如Chen等，Nature Methods8：424-429(2011)中列出的培养基“DF3S”的确定组分，其如全部内容所示通过引用并入本文。如本文所使用的，术语“E7培养基”和“E7”可互换使用并且是指这样的化学成分确定的培养基：其包含补充以另外包含胰岛素(20μg/mL)、转铁蛋白(10.67ng/mL)和人成纤维细胞生长因子2(FGF2)(100ng/mL)的DF3S，或者基本上由其组成。如本文所使用的，术语“E8培养基”和“E8”可互换使用并且是指这样的化学成分确定的培养基：其包含通过添加胰岛素(20μg/mL)、转铁蛋白(10.67ng/mL)、人FGF2(100ng/mL)和人TGFβ1(转化生长因子β1)(1.75ng/mL)而补充的DF3S，或者基本上由其组成。

可以使用任何合适的方法来检测本文描述的细胞类型的特征性的生物标志物的表达。例如，可以使用例如RNA测序、免疫组织化学、聚合酶链反应、qRT-PCR或者检测或测量基因表达的其他技术来检测一种或更多种生物标志物的存在与否。在示例性实施方案中，评估根据本文提供的方法获得的细胞群的耳前上皮细胞和听板的生物标志物(例如，Foxil、Dlx基因、Pax8、Pax2、Sox3、Eyal、Gata3、Gbx2和Sox9)的表达(或不存在)。用于评估细胞群中蛋白质水平的标志物表达的定量方法也是本领域已知的。例如，使用流式细胞术来确定给定细胞群中表达或不表达目的生物标志物的细胞的分数。分化细胞的同一性还与多能性标志物例如NANOG和OCT4的下调(相对于人ES细胞或诱导多能干细胞)相关。

如本文所使用的，适合根据本发明的方法使用的“多能干细胞”是具有分化成所有三个胚层的细胞的能力的细胞。适用于本文的多能细胞包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干(iPS)细胞。如本文所使用的，“胚胎干细胞”或“ESC”意指来源于胚泡的内细胞团的多能细胞或多能细胞群。参见Thomson等，Science 282：1145-1147(1998)。这些细胞表达Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，并且表现为具有高核质比和突出核仁的致密集落。ESC可从诸如WiCell Research Institute(Madison，WI)的来源商购获得。如本文所使用的，“诱导多能干细胞”或“iPS细胞”意指这样的多能细胞或多能细胞群：其可以根据其来源的分化体细胞而变化，可以根据一组特定的潜能决定因子而变化并且可以根据用于其分离的培养条件而变化，但是基本上与其各自来源的分化体细胞基因相同并且展现出与本文所述的更高潜能的细胞(例如ESC)类似的特征。参见例如Yu等，Science 318：1917-1920(2007)。

诱导多能干细胞表现出与ESC类似的形态特征(例如，圆形、大核仁和少量细胞质)和生长特性(例如，约17小时至18小时的倍增时间)。此外，iPS细胞表达多能细胞特异性标志物(例如，Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60或Tra-1-81，但不是SSEA-1)。然而，诱导多能干细胞不直接由胚胎获得。如本文所使用的，“不直接由胚胎获得”意指用于产生iPS细胞的起始细胞类型是非多能细胞，例如多能细胞或终末分化细胞，如从出生后个体获得的体细胞。

根据本文所述的方法可以使用人iPS细胞来获得具有特定人对象的遗传互补的原始巨噬细胞和小胶质细胞。例如，可以有利地获得表现出与特定哺乳动物对象的特定疾病或病症相关或者由其产生的一种或更多种特定表型的内耳感觉细胞。在这样的情况下，iPS细胞根据本领域已知的方法通过对特定人对象的体细胞进行重编程而获得。参见例如，Yu等，Science 324(5928)：797-801(2009)；Chen等，Nat.Methods 8(5)：424-9(2011)；Ebert等，Nature 457(7227)：277-80(2009)；Howden等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108(16)：6537-42(2011)。诱导多能干细胞来源的内耳感觉组织可以用于筛选在具有例如特定疾病的个体中重现内耳感觉组织的组织构建体中的候选药物。用于重编程为诱导多能干细胞的对象特异性体细胞可以通过活组织检查或其他组织取样方法得自于或分离自目的靶组织。在一些情况下，在用于本发明的三维组织构建体之前在体外处理对象特异性细胞。例如，在引入三维组织构建体之前，可以对对象特异性细胞进行扩增，分化，遗传修饰，与多肽、核酸或其他因子接触，冷冻保存，或者以其他方式修饰。

优选地，在不存在饲养层(例如，成纤维细胞层)、条件培养基、或者包含成分没有确定或不确定的培养基的情况下培养人多能干细胞(例如，人ESC或iPS细胞)。如本文所使用的，术语“化学成分确定的培养基”和“化学成分确定的培养介质”还指包含完全公开或可确认的成分的制剂的培养基，成分的确切量是已知的或可确认的并且可以单独控制。因此，如果(1)所有的培养基成分的化学和结构特性未知，(2)培养基包含未知量的任何成分或者(3)两者，则培养基不是化学成分确定的。通过使用化学成分确定的培养基来标准化培养条件使得在细胞培养期间细胞所暴露于的材料的批量间或批次间变化的可能性最小化。因此，多种分化因子在添加到在化学成分确定的条件下培养的细胞和组织中时的效果更可预测。如本文所使用的，术语“无血清”是指不含从动物(例如，胎牛)血液获得的血清的细胞培养材料。通常，在不存在动物来源材料的情况下(即，在无异源物质的条件下)培养细胞或组织减少或消除了跨物种病毒或朊病毒传播的可能性。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料，但本文描述了优选的方法和材料。

如本文所使用的，“基本上由……组成的培养基”意指包含所指定成分和不会实质上影响其基本特性的那些成分的培养基。

如本文所使用的，“有效量”意指试剂足以引起根据本发明的指定细胞效应的量。

如本文所使用的，“约”意指在所述浓度范围、密度、温度或时间范围的5％内。

考虑以下非限制性实施例将更全面地理解本发明。具体地预期所公开的方法通常适用于多能干细胞。本文公开的所有论文和专利均通过引用并入本文，就如列出其全部内容一样。

实施例

实施例1-由人多能干细胞产生具有功能性毛细胞的内耳类器官

人内耳包含约20000个感觉毛细胞，其通过机械敏感的静纤毛束检测声音和运动¹。遗传突变或环境损伤(如大噪音)可能会对这些毛细胞造成不可挽回的损害，导致头晕或听力损失^2，3。我们以前展示了如何在3D培养***中使用FGF、TGFβ、BMP和Wnt信号通路的定时操纵来从小鼠多能干细胞(PSC)产生内耳类器官^4-6。我们已经证明，小鼠内耳类器官包含与小鼠内耳中的天然前庭毛细胞具有相似结构和功能的感觉毛细胞⁷。此外，我们过去的发现支持耳诱导信号传导动力学的工作模型，其中BMP信号传导激活和TGFβ抑制最初指定非神经外胚层并且随后的BMP抑制和FGF激活诱导耳前命运^8，9。尽管最近有多次尝试，但从人PSC(hPSC)得到功能性毛细胞的发育上正确的方法尚待描述^10-15。在此，为了从hPSC产生人内耳组织，我们首先建立了体外人内耳器官发生的时间线(图1A，1B)。内耳来自外胚层，并且在人中，在怀孕后约52天(days post conception，dpc)产生第一种终末分化的毛细胞¹⁶。从外胚层中的多能细胞开始，内耳诱导开始于约12dpc，形成外胚层上皮。然后，上皮***成非神经外胚层(也称为表面外胚层)和神经外胚层(图1A，1B)。非神经外胚层最终产生内耳以及皮肤的表皮；因此，在我们最初的实验中，我们试图建立化学成分确定的(chemically defined)3D培养***用于定向得到非神经外胚层上皮，由其我们可以得到内耳类器官(图1A-1C)。

我们首先证实解离的人胚胎干细胞(hESC；WA25细胞系，WiCell)在含有ROCK抑制剂Y-27632的E8培养基中很好地聚集，并且与在化学成分确定的分化培养基(以下称为CDM)中聚集的细胞相比表现出优异的均匀性和细胞存活(图2A-2H和表1)。

表1.化学成分确定的分化培养基(CDM)

在E8培养基中孵育2天后，我们将聚集体转移到含有低浓度Matrigel和FGF-2的CDM中以刺激聚集体表面上的上皮形成和外胚层分化。我们先前表明，BMP4和TGFβ抑制剂SB-431542(以下称“SB”)的组合促进了从小鼠PSC(mPSC)的非神经诱导⁶。我们发现10ng/mlBMP4和10μMSB的组合(双重SB/BMP4处理，称为“SBB”)不仅诱导非神经标志物基因，例如TFAP2和DLX3，而且诱导胚外标志物CDX2(图1D；图3A-3G)¹⁷。相比之下，单独SB处理导致TFAP2和DLX3表达增加，但没有相应的CDX2表达(图1D)。值得注意的是，100％的SB处理的聚集体在分化的第4至6天产生具有表面外胚层样形态的TFAP2⁺E-钙黏蛋白(ECAD)⁺上皮——时间尺度与人胚胎发生一致(n＝15个聚集体，3个实验；图1B-1E；图3A-3G)。经过20天，上皮扩展成由TFAP2⁺角蛋白-5(KRT5)⁺角质形成细胞样细胞组成的椭圆囊(图6A-6E)。根据这些发现，我们推断用SB处理WA25细胞聚集体足以诱导非神经上皮。

很好奇内源BMP活性是否足以用于非神经分化，我们用BMP抑制剂LDN-193189进行了共同处理(下文称LSB；称为LSB的双重LDN/SB处理)。如以前在hESC单层培养物中所示¹⁸，对WA25聚集体的LSB处理上调神经外胚层标志物，例如PAX6和N-钙黏蛋白(NCAD)，并且消除TFAP2和ECAD表达，表明内源BMP信号驱动非神经转化(图1F；图7A-7D)。为了进一步验证我们的方法，我们用SB处理了人iPSC(mND2-0，WiCell)，发现与我们用WA25hESC的结果相反，仅SB的条件产生了PAX6⁺神经外胚层和TFAP2⁺ECAD-神经嵴样细胞(图8A-8G)。我们推论内源BMP水平的变化可能是不同结果的基础，并且可能需要针对每种细胞系对BMP浓度进行微调。因此，SB加上低浓度的BMP4(2.5ng/ml)(SSB)可以从mND2-0iPSC产生TFAP2⁺ECAD⁺非神经上皮(图1G；图8A-8G)。使用SB或SBB方法，产生的上皮非常类似于用mPSC产生的非上皮^5，6。与我们的小鼠培养物相反，发生了非神经转化而没有Brachyury(BRA)⁺中内胚层细胞的脱靶诱导(图9A-9C)。使用SB(WA25)或SBB(mND2-0)方法生成了以下数据。

接下来，我们尝试在角质形成细胞定型之前将非神经上皮转化为听板上皮。人颅骨基板出现在约在18至24dpc；因此，假设hPSC代表约12dpc的细胞，在适当的信号调节下，听板将在分化的前6至12天内在我们的培养物中发育(图1B)。基于我们先前发现的FGF活化和BMP抑制对于来自mPSC培养物的基板前和耳诱导是必需的，我们用FGF-2和LDN的组合(下文称为“SBFL”)处理第4天的聚集体。利用SBFL处理，相对于SB处理的样品，外上皮增厚，并表达后基板标志物如PAX8、SOX2、TFAP2、ECAD和NCAD的组合，表明表型类似于得到听板的耳-上鳃祖细胞区域(OEPD)(图1H-1K；图10A-10D)。当允许在基本培养基中进行自我指导的分化时，我们发现SBFL聚集体在第10至30天产生BRN3A⁺TUJ1⁺感觉样神经元(图11A-11F)。由于上鳃基板和耳泡两者都产生感觉神经元，所以我们想知道哪种组织类型得以发育。值得注意的是，在SBFL处理的聚集体中，我们既没有检测到耳标志物PAX2的表达，也没有观察到任何囊泡，而这些指示耳诱导(数据未示出)。因此，我们推断SBFL处理可能足以诱导上鳃神经元，但不能启动耳诱导。

为了促进PAX2表达和囊泡形成，我们开始测试多种信号调节剂(图12A-12C)。使用qPCR分析，尽管我们测试的所有条件都没有对PAX2基因表达产生可检测的影响，但是广泛的免疫染色把我们的注意力吸引到了第12天对照样品的聚集体上皮中的PAX2⁺PAX8⁺ECAD⁺细胞的小群体，使人联想到体内听板(图1L-1N)。我们怀疑细胞外基质可以为囊泡形成提供结构支持；因此，我们将第12天的聚集体转移至基本培养基中的Matrigel小滴中(图4A)。在这些培养物中，我们观察到迁移细胞的放射状产生，但没有明显的囊泡样结构或PAX2⁺细胞(图2B)。Wnt激活看起来对于体内耳发育是必要的，但对于上鳃发育不是，并且可以增强体外小鼠内耳类器官的产生^4，19-21。值得注意的是，在用Wnt信号传导激动剂CHIR99021处理的90.9±5.2％的

-嵌入的聚集体中，在第12至16天(n＝84，7个实验)，我们发现了上皮突起，让人想到体内囊泡发育之前的耳凹(图4C)。我们确定了耳凹样结构是PAX2⁺PAX8⁺SOX2⁺SOX10⁺JAG1⁺，证实了耳身份(图4D-4H)。有趣的是，耳凹伴有迁移的TFAP2⁺SLUG⁺SOX10⁺颅神经嵴样细胞，其在耳凹周围形成间充质，类似于体内的耳周间充质(图4C-4F)。

我们将聚集体以在静止小滴培养至第18天，然后将其转移到轨道摇床上的24孔板中或旋转瓶中以进一步自组织成熟——两种形式均产生可比较的结果。在培养20至30天时，71.7±23.3％检查的聚集体中囊泡保持通过表面可见(n＝37，3个实验；图13A-13G)。在我们免疫染色的每个聚集体中，我们发现多个耳泡围绕表达基底角化细胞标志物TFAP2和KRT5的中央核心上皮(图4G-4I)。直到第35天，我们观察到囊泡和听板样上皮看起来部分附着或并入到表皮上皮中(图4H)。另外，较久的囊泡(＞30天)表达转录因子FBXO2，其最近发现是小鼠内耳上皮发育中高度特异性的(图4I)²²。

孵育40至60天后，具有复杂多室形态的囊泡通过聚集体表面可见(图4J)。值得注意的是，我们发现在WA25和mND2-0来源的聚集体中，一小部分囊泡产生了包含表达多种毛细胞标志物(包括MYO7A、PCP4、ANXA4、SOX2和CALB2)的细胞的上皮(图4K-Q；图14A-14E)。感觉样上皮还包含SOX2⁺SOX10⁺SPARCL1⁺细胞，令人联想到哺乳动物椭圆囊中的支持细胞²³。这些上皮中的腔细胞具有伸长的形态，具有内耳感觉上皮的富含F-肌动蛋白的顶端连接特征(图4L-4O)。表达毛细胞标志物的细胞还具有伸入囊泡腔内的富含F-肌动蛋白和espin(ESPN)⁺顶端静纤毛束，其与乙酰化α-微管蛋白(TUBA4A)⁺动纤毛相关(图4M-4P，4R)。总之，这些发现证实了hPSC来源的耳泡产生具有含毛细胞和支持细胞的感觉上皮的内耳类器官。

为了促进活细胞成像和电生理学实验，我们设计了新的hESC报道细胞系，以用增强的绿色荧光蛋白(eGFP)内源标记毛细胞。我们使用CRISPR/Cas9***在ATOH1基因的终止密码子处***2A-eGFP基因盒，其在毛细胞诱导和早期成熟期间高度表达(图5A)⁷。我们使用我们建立的方案(下文称ATOH1-2A-eGFP细胞)从包含2A-eGFP盒的适当双等位基因***的两个克隆验证了内耳类器官诱导。值得注意的是，早在第39天，我们观察到在内耳类器官中出现eGFP⁺毛细胞样细胞(数据未示出)。我们注意到，单个类器官通常包含具有数百个eGFP⁺细胞的多个离散片(图5B-5D)。用毛细胞标志物如BRN3C和ESPN进行免疫染色证实了eGFP⁺细胞的毛细胞身份(图5E，5F)。在第60至100天，17.4±4.0％的聚集体含有至少一个具有毛细胞的类器官(n＝146，6个实验)。毛细胞诱导的表面效率低可能是由于我们无法检测聚集体深处的类器官，或者可能表明感觉上皮形成所需的内源信号因聚集体而异。值得注意的是，在第60至100天检测的所有WA25和mND2-0聚集体包含具有SOX10⁺非感觉上皮的类器官，表明类器官诱导可能是高度可重现的，但非感觉内耳上皮优先诱导(n＝17，4个实验；图14E)。出现的2A-eGFP⁺毛细胞可以在漂浮培养中维持超过150天并且甚至在解离和继代培养后仍保留毛束形态(图5B-F)。

最后，我们想知道得到的毛细胞是否类似于天然哺乳动物毛细胞发挥功能。使用由ATOH1-2A-eGFP细胞产生的聚集体，我们在分化第63至67天将内耳类器官解剖并平面装片。据我们所知，这些构成了来源于hPSC的人毛细胞的首次记录。在我们的样品中检测到细胞具有大的向外整流电流，但没有Na⁺电流(在发育中的啮齿动物毛细胞中可见，但在大多数成熟毛细胞中不存在)(图5G，5J)。标称100mV的K⁺电流幅度如下：第63天：399、747、340pA；第64天：4695、2538、2609pA；第67天：5198、6528、6127pA。这与第22天小鼠类器官毛细胞的平均值6099pA相当。对阶梯和正弦电流注入的响应(图5H，5I)类似于啮齿动物毛细胞的响应，具有初始峰值然后复极化，以及比去极化电流更大的超极化偏转。然而，细胞的静息电位一直略高于在啮齿动物中见到的：第64天：-43、-45；第67天：-48、-49mV。可能相关地，显著的亚阈值内向整流电流在人器官细胞中不存在或大幅减少，其被认为是由在毛细胞分化早期发育并存在于所有啮齿类动物前庭毛细胞和小鼠类器官毛细胞中的Kir2.1携带的(图5K)^24，25。有可能在人组织中Kir2.1的发育、表达、功能或调节不同。重要的是，在大多数＞60天龄的类器官和用于记录的所有类器官中观察到的收缩的内腔形态使得直接接近毛束，以用于机械转导分析的挑战(图5B-5E)。尽管如此，我们的数据强烈表明与小鼠内耳类器官²⁵一样，人类器官包含未成熟的前庭毛细胞。

总之，我们已经建立了强大的培养***来指导培养中的人内耳类器官的发育(图15)。我们的研究结果进一步支持我们以前的体外耳前诱导模型，并突出了Wnt信号传导在耳祖分化中的重要性。有趣的是，所得人耳类器官的旋绕、多室形态与由一系列包含感觉和非感觉上皮的管和室组成的内耳的膜迷路具有很大相似之处。此外，很像小鼠类器官，hPSC来源的类器官看起来仅默认形成前庭感觉上皮；因此，需要额外的信号传导操作来启动耳蜗器官发生^6，25。我们预期这种培养***将是揭示人内耳发育机制和检测潜在内耳治疗的有力工具。

方法和材料

hPSC培养：根据建立的方案^12，13，在重组人玻连蛋白-N(Invitrogen)包被的6孔板上的补充有100μg/ml Normocin(Invitrogen)的Essential 8(E8)培养基或Essential8Flex培养基(E8f)(Invitrogen)中培养人PSC(WA25hESC，第22-50代；mND2-0iPSC，第28至46代)。在80％汇合时或每4-5天，使用EDTA溶液以1∶10至1∶20的分流比传代细胞。这两种细胞系都是从WiCell研究所获得的，并附有验证和真实性声明。其他验证和测试信息可以在细胞系网页上找到，可获自万维网上wicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/wa25.cmsx和wicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/mirjt7i-mnd2-0.cmsx。使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza)确定细胞系无支原体污染。

hPSC分化。为了开始分化，用StemPro Accutase(Invitrogen)解离hPSC细胞，并以每孔5,000个细胞分配到含有20μM Y-27632(Stemgent)和Normocin的E8培养基中的96孔V底板中。孵育48小时后，将聚集体转移到含有4ng ml^-1FGF-2(Peprotech)、10μM SB-431542(Stemgent)以及对于一些实验2.5ng ml^-1BMP4(Stemgent)和2％Growth Factor Reduced(GFR)Matrigel(Corning)的100μl化学成分确定的培养基(CDM)中的以开始非神经诱导，即分化第0天。CDM含有具GlutaMAX的F-12营养素混合物(Gibco)和具GlutaMAX的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM；Gibco)的50∶50混合物，额外补充有0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1X化学成分确定的脂质浓缩物(Invitrogen)、7μg ml^-1胰岛素(Sigma)、15μg ml^-1转铁蛋白(Sigma)、450μM单硫代甘油和Normocin(详细配方见表1)。孵育4天后，向每孔中预先存在的100μl培养基中添加25μl含有250ng ml^-1FGF-2(50ng/ml终浓度)和1μM LDN-193189(200nM终浓度)的CDM。再过4天(总共8天)后，向培养基中添加25μl CDM。对于一些实验，向每孔中预先存在的125μl培养基中添加含有18μMCHIR99021(3μM终浓度；Stemgent)的CDM——我们确定该处理对于内耳类器官生产是任选的，但可改善听板样细胞的诱导。在分化第12天，将聚集体汇集在一起并用类器官成熟培养基(Organoid Maturation Medium，OMM)洗涤，所述培养基含有Advanced DMEM：F12(Gibco)和神经基础培养基(Gibco)的50∶50混合物，补充有0.5X N2补充剂(Gibco)、0.5X不含维生素A的B27(Gibco)、1X GlutaMAX(Gibco)、0.1mM β-巯基乙醇(Gibco)和Normocin(详细配方见表3)。

表3.类器官成熟培养基(OMM)

表3中列出的配方提供50mL培养基，其应使用＜2周。OMM是以前用于产生脑和胃器官的两种培养基^6，7的定制混合物。使用不含维生素A的B27来限制内源产生的视黄酸的影响。

将聚集体重悬在冰冷的未稀释的GFR Matrigel中并置于约100mm细菌培养板表面上的约25μl小滴中。在37℃孵育至少30分钟后，将小滴浸入含有3μM CHIR99021的10ml OMM中。对于非小滴耳诱导，将聚集体洗涤并单独铺板在含有3μM CHIR和1％GFR Matrigel的OMM中的24孔低细胞粘附板的每个孔中。分化18天后，通过洗涤从培养基中除去CHIR，并将小滴聚集体移至漂浮培养物中。使用宽口1000P尖端小心地移出小滴，并将其转移到125ml一次性旋转瓶(Coming)中的75ml新鲜OMM中。将旋转瓶在65RPM的培养箱内搅拌板(ThermoScientific)上维持长达180天的分化。对于一些实验，将聚集体在培养箱内轨道摇床(Thermo Scientific)上1ml OMM中的24孔低细胞粘附板的各个孔中维持长达140天。

培养基组分的选择：我们使用由于缺乏确定性或与人细胞相容性差而可导致结果变化的两种培养基组分：GFR Matrigel和BSA。GFR(生长因子降低的)Matrigel含有：＜0.1pg ml^-1FGF-2，＜0.5ng ml^-1EGF，5ng ml^-1IGF-1，＜5pg ml^-1PDGF，＜0.2ng ml^-1NGF和1.7ng ml^-1TGFβ。特别地，在培养阶段期间由于在培养基中未包含TGFβ抑制剂，所以在第12天或更晚GFR Matrigel中的TGFβ可能已经影响细胞命运规格。选择GFRMatrigel，因为已证明其是3D培养中来自多能干细胞的自组织上皮的可靠诱导剂²⁶。GFR Matrigel是Matrigel的更加明确的替代品，其中生长因子如Egf、Igfl、Fgf2和TGFβ的浓度已经最小化至对细胞命运规格具有可忽略的影响的水平。Matrigel的其他替代品包括但不限于基于合成水凝胶和重组蛋白的基质，其支持基底膜形成以及PSC分化成上皮的自组织。例如，纯化的层粘连蛋白/巢蛋白复合物(Corning)可能是合适的、完全化学成分确定的替代品²⁷。在CDM中，选择BSA分别作为人血清白蛋白和聚乙烯醇(PVA)的成本效益和易溶解的替代品。PVA已被证明是CDM²⁸中BSA合适的化学定义的替代物。

信号传导分子和重组蛋白。使用以下小分子和重组蛋白：重组人BMP4(2.5至10ngml^-1；Stemgent)、人FGF-2(25ng ml^-1；Peprotech)、SB-431542(10μM；Tocris Bioscience)、CHIR99021(3μM；Stemgent)和LDN-193189(200nM；Stemgent)。

定量PCR。如前所述在ABI PRISM 7900HT序列检测***(Applied Biosystems)或Bio-Rad CFX96定量PCR仪(Bio-Rad)⁶上进行分析。将数据相对于L27表达(内部对照)进行归一化，并且使用ΔΔCt方法相对于来自d0WA25聚集体的Ct值计算倍数变化。除非另有说明，否则数据代表来自独立实验的至少3个独立生物样品。统计显著性的所有指标均指给定条件与对照组之间的比较。引物细节参见表4。

表4.qPCR引物

免疫组织化学。将聚合物用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟或在4℃下固定过夜。将固定样品用15％和30％蔗糖梯度处理冷冻保护，然后包埋在组织冷冻培养基中。将冷冻的组织块在Leica CM-1860低温恒温器上切成12μm冷冻切片。对于免疫染色，使用0.1％Triton X-1001X PBS溶液中的10％山羊或马血清进行封闭，并使用0.1％Triton X-1001XPBS溶液中的3％山羊或马血清用于一抗/二抗孵育。使用Alexa Fluor缀合的抗小鼠、兔或山羊IgG(Invitrogen)作为二抗。使用具有DAPI的Prolong Gold(Thermo Scientific)固定样品并使细胞核可视化。对于wholemount染色，使用类似的染色范例；然而，将Triton X-100浓度增加到0.5％，封闭和第一/第二孵育分别在旋转振荡器上在37℃下进行24小时和48小时。每次孵育后，将样品在旋转振荡器上在含有0.5％Triton X-100的1X PBS中在37℃下进行三次1小时洗涤。在成像前，将Wholemount样品在ScaleA2清洁溶液中封固1-2天或ScaleSQ(5)清洁溶液中封固1-2小时²⁹。在Lieca DMi8倒置显微镜、Nikon TE2000倒置显微镜或Olympus FV1000-MPE Confocal/Multiphoton显微镜上进行显微镜检查。使用安置在印第安纳生物显微镜中心(Indiana Center for Biological Microscopy)的Imaris 8软件包(Bitplane)进行3D重建。对于分割分析，使用Imaris中的‘Spots’模块处理2A-eGFP细胞。基于估计的大小、质量和信号强度分类。排除触摸图像边界的物体。使用以下构建参数鉴定2A-eGFP⁺细胞体：估计的XY直径＝3.50μm；估计的Z直径＝7.00μm；‘质量’高于20.0；‘与图像边界的距离XYZ’大于0.001μm；‘强度中心Ch＝1’高于1500。在Imaris中从原始图像文件生成电影，并在Adobe Premiere Pro中编译以添加标题和文本。抗体列表参见5。

表5.抗体

电生理记录。在第62天将人类器官包装在补充有1X GlutaMax、1XB27补充剂和Normocin的冷Hibernate A培养基中。在第63天，将其重新放回5％CO₂、37℃的培养箱中的OMM中。在记录日，使用尖锐的钨针(Fine Science Tools)将类器官解剖开并固定在玻璃盖玻片上。使用2A-eGFP⁺信号来寻找具有毛细胞的区域并靶向毛细胞用于记录。用4-5MΩ玻璃电极在半完好组织上进行全细胞膜片钳。使用Axopatch 200B放大器(MolecularDevices)获取数据，以5000Hz过滤，然后通过Digidata1322A转换器以20kHz数字化。记录移液器溶液包含(单位mM)：135KCl、5HEPES、5EGTA、2.5MgCl₂、2.5K₂-ATP、0.1CaCl₂，用KOH调节至pH 7.4，约285mmol kg^-1。外部溶液包含：137NaCl、5.8KCl、0.7NaH₂PO₄、10HEPES、1.3CaCl₂、0.9MgCl₂、5.6葡萄糖，并补充维生素和必需氨基酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用NaOH调节至pH 7.4，约310mmol kg^-1。将记录补偿40％，细胞保持在-66mV用于电压钳平均值报告为±SEM。

ATOH1-2A-eGFP报道细胞系的产生。将靶向ATOH1的终止密码子区的gRNA(5’-TCGGATGAGGCAAGTTAGGA-3’(SEQ ID NO：17)和5’-GTCACTGTAATGGGAATGGG-3’(SEQ ID NO：18)，偏移＝0bp)克隆到在CBh启动子(Addgene#48873)的控制下表达Cas9n的pSpCas9n(BB)载体中。为了构建供体载体，将从提取的WA25hESC基因组DNA PCR扩增的侧翼为两个1kb同源臂的2A-eGFP-PGK-Puro盒(Addgene#31938)¹⁷克隆到pUC19骨架中。使用P3PrimaryCell4D-Nucleofector X试剂盒和程序CB-150，将两种gRNA载体和供体载体以及在CMV启动子的控制下表达Cas9n的载体(Addgene#41816)¹⁸利用4D Nucleofector(Lonza)转染到WA25hESC中。核转染后，将细胞铺在生长培养基中，所述培养基包含1X RevitaCell(ThermoFisher)用于提高细胞存活率，以及1μM的Scr7(Xcessbio)用于更高的HDR效率³¹。从核转染后48小时开始，进行0.5μg μl^-1嘌呤霉素选择10天。在嘌呤霉素选择后，通过Cre重组酶表达载体(Addgene#13775)的核转染从基因组中去除了侧翼是两个LoxP位点的PGK-Puro亚盒。通过分离的单hESC的低密度接种(1至3个细胞cm^-2)然后在扩增5-7天后分离hESC集落来建立克隆细胞系。通过PCR扩增然后通过凝胶电泳以及通过克隆到TOPO载体中的总PCR扩增子或单个PCR扩增子的Sanger测序来分析克隆细胞系的基因型。将具有双等位基因2A-eGFP整合的细胞系用于内耳毛细胞分化。

统计分析。所有统计使用GraphPad Prism 7软件进行。在分析之前使用Shapiro-Wilk正态性检验来确定数据具有正态分布。使用单因素方差分析(ANOVA)以及随后用于与对照组(载剂处理)的多重比较的Dunnett事后检验来确定统计学显著性。使用Brown-Forsythe检验来确定样本组之间的差异是相似的。没有统计学检验用于预先确定样本量，研究者对处理组并不知情，样本不是随机的。

代表性数据和重现性。除非另有说明，否则图像是从至少3个独立实验获得的样本的代表。对于第0至12天的聚集体的IHC分析，我们通常在每个实验中将来自每种条件的3至6个聚集体切片。对于方案的后期阶段的IHC分析，在每个实验的每种条件的至少2个聚集体上进行。四名独立研究人员使用WA25(野生型或ATOH1-2A-eGFP)细胞系将完成的培养方法成功重复了15次。使用mND2-0iPSC系在显著修改下将方法重复了3次。通过在第12至18天期间确认小窝/囊泡形成并在分化的第50至100天的至少一个聚集体中确定地鉴定了内耳类器官，认为复制是成功的。如果在12至18天期间没有观察到小窝，则将实验排除在分析之外。

参考文献

1.Géléoc，G.S.G& Holt，J.R.Sound strategies for hearingrestoration.Science 344，1241062(2014).

2.Müller，U.& Barr-Gillespie，P.G.New treatment options for hearingloss.Nat Rev Drug Discov 14，346-365(2015).

3Sergeyenko，Y.，Lall，K.，Liberman，M.C.& Kujawa，S.G.Age-Related CochlearSynaptopathy：An Early-Onset Contributor to Auditory Functional Decline.33，13686-13694(2013).

4.DeJonge，R.E.，Deig，C.R.，Heller，S.，Koehler，K.R.& Hashino.E.Modulationof Wnt signaling enhances inner ear organoid developmentin 3D culture PLoSONE

5.Koehler，K.R.& Hashino，E.3D mouse embryonic stem cell culture forgenerating inner ear organoids.Nature Protocols 9，1229-1244(2014).

6.Koehler，K.R.，Mikosz，A.M.，Molosh，A.I.，Patel，D.& Hashino，E.Generationofinner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3Dculture.Natitre 500，217-221(2013).

7.Liu，X-P.，Koehler，K.R.，Mikosz，A.M.，Hashino，E.& Hoit，J.R.Functionaldevelopment of meclianosensitive har cells in stem cell-derivedorganoids parallels native vestibular hair cells.Nature Commmications(2016).

8.Leung，A.W.，Kent Morest，D.& Li，J.Y.H.Differential BMP signalingcontrols formation and differentiation of multipotent preplacodal ectodermprogenitors from human embryonic stem cells.Developmental biology379,208-220(2013).

9.Kwon，H-J.，Bhat，N.，Sweet，E.M.，Comell，R.A.& Riley，B.B Identificationof early requirements for preplacodal ectoderm and sensory organ development，PLoSgenetics6，e1001133(2010).

10.Chen，J.-R.et al.Effects of genetic correction on thedifferentiation of hair cell-like cells from iPSCs with MYO15A mutation.CellDeath & Differentiation(2016).doi：10.1038/cdd.2016.16

11.Tang，Z-H.et al.Genetic Correction of Induced Pluripotent StemCells From a Deaf Patient With MYO7A Mutation Results in Morphologic andFunctional Recovery of the Derived Hair Cell-Like Cells.Stem Cells Transl Med5，561-571(2016).

12.Ohnishi，H.et al.Limited hair cell induction from human inducedpluripotent stem cells using a simple stepwise method.Neuroscience Letters599,49-54(2015).

13.Ealy，M.，Ellwanger，D.C.，Kosaric，N.，Stapper，A.P.& Heller，S.Single-cell analysis delineates a trajectory toward the human early oticlineage.PNAS 201605537(2016).doi：10.1073/pnas，1605537113

14.Ronaghi，M.el al.Tnner Ear Hair Cell-Like Cells from HumanEmbryonic Stem Cells.Stem Cells and Developmenl 23，1275-1284(2014).

15.Chen，W.et al.Restoration of auditory evoked responses by human.ES-cell-derived otic progenitors.Nature 490,278-282(2012).

16.Lim，R.& Brichta，A.M.Anatomical and physiological development ofthe human inner ear.Hearing research(2016).doi：10，1016/j，heares，2016.02.004

17.Roberts，R.M.ei al.Differentiation of trophoblast cells from humanembryonic stem cells：to be or not to be？Reproduction147，D1-12(2014).

18.Chambers，S.M.el al.Combined small-molecule inhibition acceleratesdevelopmental timing and converts human pluripotent stem cells intonociceptors.Nature Biotechnology30，715-720(2012).

19.Ladher，R.K.，ONeill，P.& Begbie、J.From shared lineage to distinctfunctions：the development of the inner ear and epibranchialplacodes.Development 137，1777-1785(2010).

20.Groves，A，K.& Fekete，D.M.Shaping sound in space：the regulation ofinner ear patterning.Development 139，245-257(2012).

21.Ohyama，T.，Mohamed，O.A.，Taketo，M.M.，Dufort，D.& Groves，A.K.Wntsignals mediate a fate decision between otic placode andepidermis.Developmenl 133，865-875(2006).

22.Hartman，B.H.，Durmthy-Durruthy，R.，Laske，R.D.，Losorelli，S.& Heller，S.Identification and characterization of mouse otic sensory lineagegenes.Frontiersin cellular neuroscience 9,79(2015).

23.Burns，J.C.，Kelly，M.C.，Hoa，M.，Morell，R.J.& Kelley，M.W.Single-cellRNA-Seq resolves cellular complexity in sensory organs from the neonatalinner ear.Nature Communications 6，8557(2015).

24.Géléoc，G.S.G.，Risner，J.R.& Holt，J.R.Developmental acquisition ofvoltage-dependent conductances and sensory signaling in hair cells of theembryonic mouse inner ear.The Journal of neuroscience：the official journal ofthe Society for Neuoscience 24，11148-11159(2004).

25.Liu，X.-P.，Koehler，K.R.，Mikosz，A.M.，Hashino，E.& Holt，J.R.Functionaldevelopment ofmechanosensitive hair cells in stem cell-derived organoidsparallels native vestibular hair cells.Nature Communications 7,11508(2016).

26.Huch，M.& Koo，B.-K.Modeling mouse and human development usingorganoid cultures.Development 142,3113-3125(2015).

27.Nasu，M.et al.Robust Formation and Maintenance of ContinuousStratified Cortical Neuroepithelium by Laminin-Containing Matrix in Mouse ESCell Culture.PLoS ONE 7，e53024(2012).

28.Hannan，N.R.F.，Segeritz，C.-P.，Touboul，T.& Vallier，L.Production ofhepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells.Nature Protocols 8,430-437(2013).

29.Hama，H.et al.ScaleS：an optical clearing palette for biologicalimaging.Nature Neuroscience 18，1518-1529(2015).

30.Ran，F.A.el al.Genome engineering using the CRISPR-Cas9system.Nature Protocols 8,2281-2308(2013).

31.Maruyama，T.et al.Increasing the efficiency of precise genomeediting with CRISPR-Cas9by inhibition of nonhomologous end joining.NatureBiotechnology33，538-542(2015).

实施例2-耳神经发生建模

在第12天的聚集体中，我们观察到PAX8+PAX2+上皮的片，使人联想到听板；因此，我们测定了促进耳泡形成的培养条件。在对照条件下(DMSO)，我们没有观察到囊泡形成(数据未示出)。由于耳诱导依赖于Wnt信号传导，我们在第12-18天用强效的GSK3β抑制剂和已知的Wnt信号激动剂27，CHIR99021(CHIR)处理第12天的聚集体。在这些条件下，PAX8+PAX2+SOX10+囊泡从外部上皮外翻(每个聚集体约10-30个囊泡；参见图4A-4R)。值得注意的是，Islet1+(ISL1+)成神经细胞看起来从耳泡中分层(图16A-16B)。我们还看到DMSO处理的聚集体中和CHIR处理的聚集体的非耳内部中的神经母细胞(图16A，箭头)。因此，我们假设CHIR处理的聚集体产生耳(即囊泡来源的)和上鳃(即上皮来源的)神经元的混合物(参见图4A)。为了支持这一假设，我们证实在CHIR处理的聚集体中表达耳神经元的标志物神经因子Neurog1(NGN1)和上鳃神经元标志物Neurog2(NGN2)(图16C)。

分化12天后，将耳诱导的聚集体铺在含有3μM CHIR的培养基中的Matrigel小滴中的细菌培养皿上。参见图17A-17C。在第22天，将聚集体固定并用感觉神经元标志物BRN3A和βIII-微管蛋白(TUJ1)的抗体进行免疫染色。径向取向的BRN3A+TUJ1+神经元产生具有生长锥的向外生长的突起，证实了类器官培养物中广泛的感觉神经发生。

作为我们培养***中内耳器官发生的进一步证据，毛细胞在培养第60至70天显示CTBP2⁺斑点，指示假定的带状突触样结构(图18A-18B；n＝7感觉上皮)。如前所述，我们在囊泡形成阶段期间在细胞聚集体中观察到BRN3a阳性感觉样神经元。此外，我们观察到靶向感觉上皮的TUJ1⁺神经突起(图18C)。总之，我们的发现表明，人内耳类器官模型可概括毛细胞和感觉神经元之间感觉神经回路的组装。

实施例3-用于体外产生内耳类器官的示例性方案

本实施例描述了用于从人多能干细胞诱导形成非神经外胚层和内耳感觉组织的方案。如以下段落中更详细描述的，将多能干细胞聚集体培养在含有富含基膜蛋白的Matrigel的培养基中，以诱导外胚层发育并在聚集体表面上产生外胚层上皮。然后，我们使用骨形态发生蛋白-4(BMP4)和转化生长因子β(TGFβ)抑制剂如小分子SB-431542(“SB”)的组合处理来促进上皮中的非神经分化。为了进一步启动内耳诱导，在初始BMP4和SB处理后约24小时，使用重组FGF-2抑制BMP信号传导并激活成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导。值得注意的是，组合处理方案启动了耳泡的自我组织，其后来发展成含有功能性前庭感觉上皮的内耳类器官。

方法

在玻连蛋白包被的板上的E8培养基中进行ES细胞培养(步骤1至7)。我们将我们的hPS细胞在无饲养条件下维持在E8培养基中，并使用EDTA进行传代(参见Beers等人以前的方案)1。我们优选这种hPS细胞维持方法，因为在我们手中，其在有限时间和努力下减少了自发分化。

非神经外胚层和耳前诱导(步骤8至27)。为了开始分化，将hPS细胞解离并以每孔5,000个细胞分配到96孔V底板上。对于该初始聚集步骤，我们使用含有强效ROCK信号传导抑制剂Y-27632的E8培养基。已显示ROCK信号传导抑制限制hPS细胞中解离诱导的细胞凋亡的量。此外，我们发现E8培养基中的聚集有助于细胞存活并导致更均匀的细胞聚集，这会影响方案的重现性。SB处理抑制TGFβ诱导外胚层发育。内源BMP信号传导产生非神经外胚层而不是神经外胚层。FGF-2和LDN处理诱导基板前发育。到第8天，外部上皮开始表达PAX8，表明耳上鳃基板(OEPD)样特征。第8天的CHIR处理诱导PAX2+细胞的小片，表明在第12天听板发育的最早迹象。

耳前感觉囊泡和内耳类器官形成(步骤28至43)。低浓度的细胞外基质蛋白(例如Matrigel^TM)看起来不支持耳泡形成。为了促进听板样片作为耳泡囊外翻并从上皮中夹断，我们将第12天的聚集体植入到了Matrigel中。将植入Matrigel的聚集体固化在细菌培养皿的表面上，并浸在含有N2和B27添加物的无血清培养基中，该培养基先前显示支持组织自身组织(下文称类器官培养基)。这种支持性环境加上CHIR的持续暴露导致许多囊泡在12至18天从上皮出芽。在四个独立实验中，在＞95％的聚集体(＞100个聚集体)中观察到囊泡形成。此外，在第12至18天，成神经细胞从上皮的其他部分分层并分化成感觉神经元。目前还不清楚这些感觉神经元是否是上鳃神经元，例如颅神经VII、IX和X的那些，或者内耳神经元，例如前庭神经元或螺旋神经节神经元。还观察到含有软骨细胞祖细胞的间充质的形成。然而，目前还不清楚软骨细胞祖细胞是产生自外胚层上皮还是另外的中胚层细胞群。

在第18天，将植入

的聚集体从静止的培养皿中取出并移液到含有未添加任何生长因子或小分子的Organoid培养基的旋转瓶中。总共22天后，使用相差成像在每个聚集体中观察到10至30个囊泡。这些囊泡表达PAX2、PAX8、SOX2和JAG1蛋白，指示耳细胞命运。囊泡看起来在22至35天之间缓慢生长，并且由于它们所嵌入的间充质细胞团的密度增加，在此期间使用相差成像难以观察到囊泡。到35至40天，聚集体内部的囊泡通常更明显。囊泡通常表现出旋绕的、多室形态，与简单的球形和卵圆形耳泡形成对比。到第45天，囊泡已经发育出MYO7A⁺毛细胞样细胞并被鉴定为内耳类器官。在60-80天之间，我们观察到富含F-肌动蛋白和Espin⁺毛束的MYO7A⁺毛细胞，表明确定的毛细胞身份。

材料和试剂

hPSC培养：根据建立的方案^12，13，在重组人玻连蛋白-N(Invitrogen)包被的6孔板上的补充有100μg/ml Normocin(Invitrogen)的Essential 8(E8)培养基或Essential8Flex培养基(Invitrogen)中培养人PSC(WA25hESC，第22-50代；mND2-0iPSC，第28-46代)。在80％汇合时或每4-5天，使用EDTA溶液以1∶10-1∶20的分流比传代细胞。这两种细胞系都是从WiCell研究所获得的，并附有验证和真实性声明。其他验证和测试信息可以在细胞系网页上找到，可获自万维网上wicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/wa25.cmsx和wicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/mirjt7i-mnd2-0.cmsx。使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza)确定细胞系无支原体污染。

在该示例性方案中使用的其他试剂列于表6中。

表6.试剂

培养基和储备溶液

人重组BMP7储备溶液(100ng/μL)：在生物安全柜中，向10μg BMP7中添加100μL无菌4mM HCl；将溶液涡旋并在台式离心机中旋转。将BMP4溶液以5μL等分试样在-20℃储存6个月或在-80℃储存1年。

人重组FGF-2储备溶液(200ng/μL)：在生物安全柜中，向50μgFGF-2中添加250μL无菌PBS或5mM Tris(pH 7.6)；将溶液涡旋并在台式离心机中旋转。将FGF-2溶液以6μL等分试样在-20℃储存6个月或在-80℃储存1年。

人转铁蛋白储备溶液(20mg/ml)：在生物安全柜中，将100mg重组人转铁蛋白溶解在5ml IMDM中。为了完全溶解，在室温(RT)下将管涡旋并放置在旋转振荡器上5至10分钟。将转铁蛋白溶液以150μl等分试样在-20℃储存6个月或在-80℃储存1年。

EDTA溶液(用于hES细胞传代)：在生物安全柜中，将50μl 0.5MEDTA混入50ml DPBS中。将溶液过滤灭菌。EDTA溶液可以在RT下储存6个月。

化学成分确定的培养基(CDM)：为了制备200mL CDM，在250mL瓶中测量出1g BSA。将BSA溶解在100mL F-12营养素混合物+GlutaMAX、100mL IMDM+GlutaMAX、2mL化学成分确定的脂质浓缩物、140μL胰岛素、150μL转铁蛋白和8μL 1-硫代甘油中。使用低蛋白结合过滤器的无菌过滤器。CDM应使用至多2周，并保存在4℃。临使用前，将Normocin以2μl每1mL CDM的稀释度添加培养基中。参见表1的快速参考配方。

分化CDM：在50mL锥形管中，将450μL冰冷的Geltrex添加到34.5mL冰冷的CDM(1.25％终浓度)中。将管充分涡旋以完全溶解Geltrex。将30mL该溶液置于新的50mL锥形管中。添加0.6μL的FGF-2(4ng/mL终浓度)和30μL的SB-431542(10μM终浓度)。将管充分涡旋混合。分化CDM应在分化第0天新鲜制备。铺板前使用剩余的5mL CDM+Geltrex洗涤聚集体。

类器官成熟培养基(OMM)：为制备50mL OMM，将24.5mLAdvanced DMEM/F12，、24.5mL神经基础培养基、500μL不含维生素A的B-27补充物、500μL GlutaMAX、250μL N2补充物和100μL Normocin在无菌50mL锥形管中组合。如果储存在4℃，OMM可以使用至多2周。参见表3的快速参考配方。

程序

hES细胞维持和传代：

1.在生物安全柜中，在6mL DPBS中稀释60μL玻连蛋白溶液。向6孔培养板的每个孔中添加1mL稀释的玻连蛋白。在室温下孵育至少1小时，同时进行至步骤2。

2.将至少20mL含Normocin的E8培养基平衡至室温。

3.为了开始解离70至80％汇合的hES细胞，从一个孔中吸出耗尽的E8培养基并用DPBS洗涤两次。

4.添加1mL EDTA溶液并在37℃保温箱中孵育4-8分钟。在显微镜下，确认在菌落中心形成了孔。

5.在EDTA孵育期间中，从6孔板中移出玻连蛋白溶液，并在表面干燥之前迅速向每个孔中添加1.5mL E8培养基。

6.将解离的细胞收集到6mL的E8培养基中。关键：你可能需要剧烈研磨(triturate)培养基以从板中除去细胞簇。不要过度吸取细胞，因为这会导致细胞凋亡。应注意不要将气泡引入培养基。

7.将细胞铺在准备好的6孔板上(从步骤5)。根据你接下来希望何时分割细胞来选择铺板密度。我们通常向每个孔中添加500mL(在2-3天内传代)或250μL(在4-5天内传代)细胞悬液。在37℃、5.0％CO₂条件下孵育细胞，直到准备好通过或用于实验。

hES细胞分化(第-2天至第0天)：聚集：

8.在生物安全柜中，制备含有22mL和10mL具有Normocin的E8培养基的锥形管。将44μLY-27632添加到22mL管中(终浓度20μM；以下称E8-Y20)，以及10μLY-27632添加到10mL管中(终浓度10μM；以下称E8-Y10)。

9.当细胞达到70至80％汇合时，从一个孔中吸出E8培养基，并在室温下用DPBS洗涤三次。

10.添加350μL的TrypLE并在37℃孵育2至4分钟。孵育后，水平摇动板以打散细胞。在显微镜下，确认细胞已经变圆并脱离板表面。

11.将解离的细胞收集到5mL的E8-Y10培养基中，并将其转移到15mL锥形管中。

12.通过用P1000吸头吸取将细胞团块打散成单细胞。通过在200g离心5分钟来使细胞沉淀。

13.完全除去上清液并使细胞沉淀重悬在1mL E8-Y10培养基中。

14.通过细胞过滤器顶部试管强力吸取1mL E8-Y10培养基以启动过滤器。逐滴吸取1mL的hES细胞到细胞过滤器。接下来，逐滴吸取1mL的E8-Y10培养基到细胞过滤器上。试管中应有3mL。这一步对于确保细胞完全解离成单细胞很重要。

15.通过用P1000尖端吸取来混合细胞悬液，并使用血细胞计数器或自动细胞计数器测定细胞浓度。

16.在22mL E8-Y20培养基中稀释适当体积的细胞悬浮液以获得50,000个细胞/mL的最终浓度(即1.1×10⁶个总细胞)。例如，如果细胞悬液含有1x10⁶个细胞/mL，则将1.1mL细胞悬液(1.1x10⁶除以1x10⁶)在20.9mL E8-Y20培养基中稀释。颠倒几次混合。

17.将细胞悬液倒入储液器中，并使用多通道移液器将100μl细胞悬液等分到两个96孔V底板的每个孔中。

18.在RT下以120g离心板5分钟。

19.将板置于具5.0％CO2的37℃培养箱中48小时。24小时后，向每个孔中添加50μl新鲜E8培养基(不含Y-27632)。

分化第0天：转移至分化CDM：

20.制备30ml含有Geltrex、FGF-2和SB-431542的分化CDM。使培养基平衡至RT。

21.将多通道移液器设置为125μl(即比每个孔的体积小25μl)，小心从步骤18的96孔板的每个孔中收集聚集体。将聚集体沉积在细菌培养皿中，然后转移到2ml管中。

22.用CDM洗涤聚集体至少3次以完全除去痕量的E8培养基。

23.在分化CDM中重新悬浮聚集体并将它们转移到新的细菌培养皿中。

24.使用P200移液器，将每个聚集体单独转移到100μl培养基中的两个96孔U底板的每个孔中。在这个阶段可能很难看到聚集体。我们通常将细菌培养皿置于非反射白色表面(例如Kimwipe)上以增强聚集体的对比度。

25.将板放回培养箱4天。每天观察聚集体的形态。

分化第4天：添加FGF-2和LDN-193189(FGF/LDN)：

26.在15ml锥形管中，以5X浓度将FGF-2和LDN-193189添加到CDM中。例如，我们将6.25μl 200ng/μl FGF-2和0.5μl 10mM LDN-193189添加到5ml CDM中。

27.将25μl含有FGF/LDN的CDM添加到步骤24的板的每个孔中。每孔现在含有125μl终浓度为50ng/ml FGF-2和200nM LDN-193189的培养基。将细胞再孵育4天。

28.在15ml锥形管中，以6X浓度将CHIR99021添加到CDM中。例如，我们将9μl10mMCHIR99021添加到5ml CDM中。

29.将25μl含有CHIR的CDM添加到步骤26的板的每个孔中。每孔现在含有125μl终浓度为3μM CHIR的培养基。将细胞再孵育4天。

分化第12天：转换为静态ECM培养：

30.在进行以下步骤前约2小时，从冷冻箱中取出Geltrex的1ml等分试样，并使其在冰上或冷冻箱中完全融化。

31.在50ml锥形管中准备50ml的类器官培养基。

32.使用经切割的P1000移液器尖端将聚集体从步骤28中板的每个孔中转移到2ml管中。

33.让聚集体沉降在管底部，然后小心地吸出培养基。

34.用1至2ml RT类器官培养基洗涤聚集体至少3次。最后一次洗涤后尽可能多地除去培养基。

35.将凝胶重悬于冰冷的Geltrex中。将移液器设置为20μl，然后单独将聚集体转移到100mm的细菌培养皿中。我们通常为每个板添加20至30滴。在不同的方向上轻轻摇动板有助于使液滴变平并黏附到板表面。在室温下10至15分钟后，Geltrex开始聚合。建议在移液步骤之间，在放置聚集体/Geltrex混合物的生物安全柜中保持小的冰容器。

36.将没有培养基的板在37℃孵育30分钟。

37.添加10至12ml含有CHIR的类器官培养基。缓慢添加类器官培养基，使液滴不会从培养皿上脱落。如果一些液滴可能分离，这是好着的。

38.将细胞再孵育6天。3天后进行半培养基更换。

分化第18天：转化为旋转瓶：

39.使用广口P1000尖端，从细菌培养皿表面刮下并吸出每个聚集体。将聚集体转移到2ml管中。

40.用类培养基洗涤聚集体3次。

41.将50至75ml的类器官培养基倒入125ml的旋转瓶中。

42.将聚集体添加到转瓶中。确认侧端口打开1/4圈并将旋转瓶置于搅拌器板上的培养箱中。将搅拌器控制器设置在60至65rpm。

43.将细胞再孵育22至42天。每周完全更换培养基。对于较长时间的实验，可以无限期地将聚集体保持在转瓶中。为了监测发育，我们定期使用广口P1000将聚集体转移到细菌培养皿中，并使用倒置显微镜获得图像。

时间：

步骤1至7，hES细胞维持和传代：30分钟

步骤8至19，hES细胞分化：聚集：40分钟

步骤20至25，分化第0天：转移至分化CDM：1小时

步骤26至27，分化第4天：添加FGF至2和LDN至193189：20分钟

步骤28至29，分化第8天：添加CHIR99021：20分钟

步骤30至38，分化第12天：转变为静态ECM培养物：45分钟

步骤39至43，分化第18天：转换为生物反应器：30分钟

步骤1至43，产生内耳类器官的总时间：45至60天至＞1年

序列表

<110> Indiana University Research and Technology Corporation

Koehler, Karl R.

Hashino, Eri

<120> 生成人内耳感觉上皮和感觉神经元的方法

<130> 144578.00195

<150> 62/244,568

<151> 2015-10-21

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 1

cgtgaagaac attgatgatg gc 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 2

gcgatcttct tcttgcccat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 3

tactcgccca agtcggaata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 4

ttcttgggct tcccattcac 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 5

tttcagccat ggaccgtca 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 6

gggagattga cctacagtgc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 7

gggctctctg agaggcaggt 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 8

cctttgctct gcggttctg 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 9

tgcttccctg agacccagtt 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 10

gatcacttct ttcctttgca tcaag 25

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 11

agtgagaggc aacctggaga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 12

acactcggac cacatccttc 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成引物

<400> 13

catgagtgtg gatccagctt g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 14

cctgaataag cagatccatg g 21

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 15

caacataaac ggactcaatc cca 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 16

accacctcta cgaacacatt gt 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 17

tcggatgagg caagttagga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 18

gtcactgtaa tgggaatggg 20

<210> 19

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

gggaattttc cccccattcc cattacagtg actcggatga ggcaagttag gaaggtgaca 60

gaag 64

<210> 20

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

cccttaaaag gggggtaagg gtaatgtcac tgagcctact ccgttcaatc cttccactgt 60

cttc 64

<210> 21

<211> 7354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420

ccccagcccc agccgcatca tctcccgcaa ccgccgccgc cgccgcagcc acctgcaact 480

ttgcaggcga gagagcatcc cgtctacccg cctgagctgt ccctcctgga cagcaccgac 540

ccacgcgcct ggctggctcc cactttgcag ggcatctgca cggcacgcgc cgcccagtat 600

ttgctacatt ccccggagct gggtgcctca gaggccgctg cgccccggga cgaggtggac 660

ggccgggggg agctggtaag gaggagcagc ggcggtgcca gcagcagcaa gagccccggg 720

ccggtgaaag tgcgggaaca gctgtgcaag ctgaaaggcg gggtggtggt agacgagctg 780

ggctgcagcc gccaacgggc cccttccagc aaacaggtga atggggtgca gaagcagaga 840

cggctagcag ccaacgccag ggagcggcgc aggatgcatg ggctgaacca cgccttcgac 900

cagctgcgca atgttatccc gtcgttcaac aacgacaaga agctgtccaa atatgagacc 960

ctgcagatgg cccaaatcta catcaacgcc ttgtccgagc tgctacaaac gcccagcgga 1020

ggggaacagc caccgccgcc tccagcctcc tgcaaaagcg accaccacca ccttcgcacc 1080

gcggcctcct atgaaggggg cgcgggcaac gcgaccgcag ctggggctca gcaggcttcc 1140

ggagggagcc agcggccgac cccgcccggg agttgccgga ctcgcttctc agccccagct 1200

tctgcgggag ggtactcggt gcagctggac gctctgcact tctcgacttt cgaggacagc 1260

gccctgacag cgatgatggc gcaaaagaat ttgtctcctt ctctccccgg gagcatcttg 1320

cagccagtgc aggaggaaaa cagcaaaact tcgcctcggt cccacagaag cgacggggaa 1380

ttttcccccc attcccatta cagtgactcg gatgaggcaa gtgctagcgc cactaacttc 1440

tccctgttga aacaagcagg ggatgtcgaa gagaatcccg ggccaatggt gagcaagggc 1500

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 1560

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 1620

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 1680

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 1740

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 1800

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 1860

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 1920

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 1980

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 2040

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 2100

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 2160

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaagaatt ccgatcatat 2220

tcaataaccc ttaatataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatt aggtctgaag 2280

aggagtttac gtccagccaa gcttaggatc tcgacctcga aattctaccg ggtaggggag 2340

gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc 2400

tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg ccaaccggct 2460

ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc 2520

cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt 2580

ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc 2640

caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg 2700

ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc gaaggtcctc cggaggcccg 2760

gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc ctcatctccg 2820

ggcctttcga cctgcatcca tctagatctc gagcagctga agcttaccat gaccgagtac 2880

aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc 2940

gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag 3000

cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg 3060

tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg 3120

ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc 3180

gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc 3240

ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg 3300

ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg 3360

ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg 3420

cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgacg cccgccccac 3480

gacccgcagc gcccgaccga aaggagcgca cgaccccatg catcgatgat atcagatccc 3540

cgggatgcag aaattgatga tctattaaac aataaagatg tccactaaaa tggaagtttt 3600

tcctgtcata ctttgttaag aagggtgaga acagagtacc tacattttga atggaaggat 3660

tggagctacg ggggtggggg tggggtggga ttagataaat gcctgctctt tactgaaggc 3720

tctttactat tgctttatga taatgtttca tagttggata tcataattta aacaagcaaa 3780

accaaattaa gggccagctc attcctccca ctcatgatct atagatctat agatctctcg 3840

tgggatcatt gtttttctct tgattcccac tttgtggttc taagtactgt ggtttccaaa 3900

tgtgtcagtt tcatagcctg aagaacgaga tcagcagcct ctgttccaca tacacttcat 3960

tctcagtatt gttttgccaa gttctaattc catcagaagc tggtcgagat ccggaaccct 4020

taatataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatta ggtccctcga agaggttcac 4080

taggcgcgcc gaaggtgaca gaagcctgaa aactgagaca gaaacaaaac tgccctttcc 4140

cagtgcgcgg gaagccccgc ggttaaagat ccccgcaccc tttaattttt gctctgcgat 4200

ggtcgttgtt tagcaacgac ttggcttcag atggcagcta catttgatgg tttgcaaatg 4260

ccgccgctgt tccaaacttc ctacggtcca tattgtttga tgaaaacttt ctgttaaaat 4320

tgtgtccttt ccgcccacct tctgctcccc ctttagatag atacggtata attgtaggta 4380

cccgtatatg gcatcattat tctagttccc tgctgccaat acgctgctaa aacgtcgcat 4440

cttctctgtc actggtttgg gtttaattta ttttacgccc tgggcatcca tccttgtgtg 4500

ttgcgcactc aagtgtggga gatttagtct tccgaagttg ttttccaaaa tgcacaatga 4560

aacgcaaaat tagtgcttcc aaagtggata acttttgact atggaattgt tagaaaacaa 4620

gaaactttaa ggtttatata ttgtataaac atacccagta tgtgcatccg atcgcgagaa 4680

cgttggcgtc ttttaggaaa ctccgcgcac gcactttatc agccgctgct gcggtggtgg 4740

ctccaggaga aactcaactg ccaattgcag accagttttt ttttttttaa acacagccac 4800

ttataattct taagctcttt gcaaatgttt gtttaaaaaa tgaaaaatta aaaaaaatct 4860

agtagtgtca aacgcatttg gtcaatttta ttttgctttg ttaatattag aaaacttatt 4920

tattattgtt tgctaccatt tctacttatc ttgattcatt ttttacgttt tctactcgag 4980

atcattttat tttaatttag caaagccaac tgcccttgtt taatgtattt tgttttgcaa 5040

atgattaaaa taaatgtgaa aagaagcctt ttgtcactta ttccttgagt tctagagtcg 5100

acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 5160

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 5220

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 5280

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 5340

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 5400

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 5460

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 5520

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 5580

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 5640

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 5700

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 5760

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 5820

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 5880

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 5940

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 6000

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 6060

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 6120

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 6180

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 6240

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 6300

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 6360

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 6420

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 6480

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 6540

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 6600

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 6660

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 6720

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 6780

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 6840

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 6900

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 6960

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 7020

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 7080

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 7140

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 7200

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 7260

acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 7320

tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 7354

<210> 22

<211> 3496

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

ctttgattgg ctgctcgcac gcgcctgccc gcgccctcca ttggctgaga agacacgcga 60

ccggcgcgag gagggggttg ggagaggagc ggggggagac tgagtggcgc gtgccgcttt 120

ttaaaggggc gcagcgcctt cagcaaccgg agaagcatag ttgcacgcga cctggtgtgt 180

gatctccgag tgggtggggg agggtcgagg agggaaaaaa aaataagacg ttgcagaaga 240

gacccggaaa gggccttttt tttggttgag ctggtgtccc agtgctgcct ccgatcctga 300

gcctccgagc ctttgcagtg caatgtcccg cctgctgcat gcagaagagt gggctgaagt 360

gaaggagttg ggagaccacc atcgccagcc ccagccgcat catctcccgc aaccgccgcc 420

gccgccgcag ccacctgcaa ctttgcaggc gagagagcat cccgtctacc cgcctgagct 480

gtccctcctg gacagcaccg acccacgcgc ctggctggct cccactttgc agggcatctg 540

cacggcacgc gccgcccagt atttgctaca ttccccggag ctgggtgcct cagaggccgc 600

tgcgccccgg gacgaggtgg acggccgggg ggagctggta aggaggagca gcggcggtgc 660

cagcagcagc aagagccccg ggccggtgaa agtgcgggaa cagctgtgca agctgaaagg 720

cggggtggtg gtagacgagc tgggctgcag ccgccaacgg gccccttcca gcaaacaggt 780

gaatggggtg cagaagcaga gacggctagc agccaacgcc agggagcggc gcaggatgca 840

tgggctgaac cacgccttcg accagctgcg caatgttatc ccgtcgttca acaacgacaa 900

gaagctgtcc aaatatgaga ccctgcagat ggcccaaatc tacatcaacg ccttgtccga 960

gctgctacaa acgcccagcg gaggggaaca gccaccgccg cctccagcct cctgcaaaag 1020

cgaccaccac caccttcgca ccgcggcctc ctatgaaggg ggcgcgggca acgcgaccgc 1080

agctggggct cagcaggctt ccggagggag ccagcggccg accccgcccg ggagttgccg 1140

gactcgcttc tcagccccag cttctgcggg agggtactcg gtgcagctgg acgctctgca 1200

cttctcgact ttcgaggaca gcgccctgac agcgatgatg gcgcaaaaga atttgtctcc 1260

ttctctcccc gggagcatct tgcagccagt gcaggaggaa aacagcaaaa cttcgcctcg 1320

gtcccacaga agcgacgggg aattttcccc ccattcccat tacagtgact cggatgaggc 1380

aagtgctagc gccactaact tctccctgtt gaaacaagca ggggatgtcg aagagaatcc 1440

cgggccaatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 1500

gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 1560

cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 1620

gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 1680

catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 1740

catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 1800

caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 1860

ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 1920

gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 1980

gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 2040

caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 2100

catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 2160

caagtaagaa ttccgatcat attcaataac ccttaatata acttcgtata atgtatgcta 2220

tacgaagtta ttaggtccct cgaagaggtt cactaggcgc gccgaaggtg acagaagcct 2280

gaaaactgag acagaaacaa aactgccctt tcccagtgcg cgggaagccc cgcggttaaa 2340

gatccccgca ccctttaatt tttgctctgc gatggtcgtt gtttagcaac gacttggctt 2400

cagatggcag ctacatttga tggtttgcaa atgccgccgc tgttccaaac ttcctacggt 2460

ccatattgtt tgatgaaaac tttctgttaa aattgtgtcc tttccgccca ccttctgctc 2520

cccctttaga tagatacggt ataattgtag gtacccgtat atggcatcat tattctagtt 2580

ccctgctgcc aatacgctgc taaaacgtcg catcttctct gtcactggtt tgggtttaat 2640

ttattttacg ccctgggcat ccatccttgt gtgttgcgca ctcaagtgtg ggagatttag 2700

tcttccgaag ttgttttcca aaatgcacaa tgaaacgcaa aattagtgct tccaaagtgg 2760

ataacttttg actatggaat tgttagaaaa caagaaactt taaggtttat atattgtata 2820

aacataccca gtatgtgcat ccgatcgcga gaacgttggc gtcttttagg aaactccgcg 2880

cacgcacttt atcagccgct gctgcggtgg tggctccagg agaaactcaa ctgccaattg 2940

cagaccagtt tttttttttt taaacacagc cacttataat tcttaagctc tttgcaaatg 3000

tttgtttaaa aaatgaaaaa ttaaaaaaaa tctagtagtg tcaaacgcat ttggtcaatt 3060

ttattttgct ttgttaatat tagaaaactt atttattatt gtttgctacc atttctactt 3120

atcttgattc attttttacg ttttctactc gagatcattt tattttaatt tagcaaagcc 3180

aactgccctt gtttaatgta ttttgttttg caaatgatta aaataaatgt gaaaagaagc 3240

cttttgtcac ttattccttg agtataacta ctgaaaacaa ttttcaaatg aatgactttg 3300

aagaattgag ttaagtcttc tattcaatgt catttatgcg atcttacagt tttgaagaaa 3360

aatgttgtaa acttggtgcc ttcaggtagt atcaaaaccc cttcaaagaa aagcactcaa 3420

gtcaataatt aaattgtgag ataaaacttc ttccaaattt gcagcacagt tttgcctctt 3480

tgatggccag gatctt 3496

Claims (6)

1.获得包含人内耳感觉组织的三维组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)在包含FGF-2、骨形态生成蛋白(BMP)和转化生长因子β(TGFβ)信号传导小分子抑制剂的培养基中培养人多能干细胞聚集体4天，所述骨形态生成蛋白(BMP)包含BMP-4，所述转化生长因子β(TGFβ)信号传导小分子抑制剂包含SB431542；

(b)在成纤维细胞生长因子(FGF)和BMP信号传导抑制剂的存在下进一步培养(a)的经培养的聚集体4天，所述BMP信号传导抑制剂包含LDN-193189；和

(c)使(b)的经进一步培养的聚集体接触Wnt激动剂4天，其中所述Wnt激动剂是GSK3抑制剂，由此经接触的聚集体内的细胞分化成耳前上皮细胞；

(d)将步骤(c)中获得的耳前上皮细胞包埋在包含含有基底膜提取物的细胞外基质蛋白的半固体培养基中；以及

(e)在Wnt激动剂的存在下培养所包埋的耳前上皮细胞6天；

(f)在促进所包埋的耳前上皮细胞自组装成耳泡的条件下，再培养(e)的所包埋的耳前上皮细胞至少22至42天，由此获得包含人内耳感觉组织的三维组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述FGF是FGF-2。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述GSK3抑制剂选自CHIR99021、氯化锂(LiCl)和6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述三维组合物包含一种或更多种机械感觉细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述三维组合物包含一种或更多种感觉神经元细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述三维组合物包含一种或更多种与机械感觉细胞形成突触连接的感觉神经元细胞。

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