WO2004111212A1 - 動物の虹彩色素上皮細胞由来の多能性幹細胞から組織細胞を生産する方法、およびその方法により得られる組織細胞 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing pluripotent stem cells from animal iris pigmented epithelial cells, producing tissue cells from the pluripotent stem cells, and tissue cells obtained by the method. .
  • One of the cells expected to be used as the transplant source is iris pigmented epithelial cells S of the eyeball.
  • Iris pigment epithelial cells are one of the cells that constitute the iris, a tissue for adjusting the amount of light reaching the retina by opening or narrowing the pupil according to the amount of light.
  • Non-Patent Document 1 Experimental Cell Res. (1998) 245, 245-251: Reported in.
  • Non-Patent Document 1 is a method of isolation and culture iris cells of mammals (mouse, rat, human fetus) by modifying the method of Non-Patent Document 1 described above (Non-Patent Document 1). 2: nature
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and has as its object to address problems such as immunological rejection due to cell transplantation, ethical problems, and imbalance between the supply and demand of transplanted cell sources.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a tissue cell derived from an iris pigmented epithelial cell of an animal, which can solve the problem, and a tissue cell obtained by the method.
  • the present inventors have maintained stem cells obtained by selectively culturing iris pigmented epithelial cells isolated from animal eyeballs by a suspended aggregate culture method under specific culture conditions. Then, aggregates are obtained, and the aggregates form an embryoid body structure, which includes various tissue cells such as muscle cells and vascular endothelial cells. And completed the present invention.
  • the inventors of the present application have proposed that stem cells obtained by selectively culturing iris pigmented epithelial cells isolated from the eyeball of an animal by a suspended aggregate culture method have a pluripotency capable of differentiating into various tissues. It was found to be a stem cell.
  • the method for producing tissue cells of the present invention is to selectively culture iris pigmented epithelial cells isolated from animal eyeballs by a suspended aggregate culture method to obtain pluripotent stem cells. And a step of culturing the pluripotent stem cells to obtain tissue cells from the pluripotent stem cells.
  • the iris pigment epithelium of the animal is isolated from the eyeball of the animal, the iris pigment epithelium is isolated from the iris tissue, and the isolated rainbow pigment is isolated by a conventionally known method for isolating the iris pigment epithelium of an adult animal.
  • Pluripotent stem cells can be obtained by selectively culturing the pigmented epithelium by the suspended aggregate culture method. [0014] By culturing the pluripotent stem cells, it is possible to form an embryoid body structure.
  • the embryoid body is a structure containing an embryo-like tissue that is mainly induced by differentiation from ES cells. Since this embryoid body contains tridermal cells, it is considered that iris-derived stem cells maintain totipotency similar to ES cells. Thus, the cells contained in the iris epithelial cell-derived embryoid body structure are referred to as animal iris pigmented epithelial cell-derived tissue cells in the present invention.
  • the pluripotent stem cells obtained during the production of the tissue cells of the present invention have the advantage that they can be collected and prepared from autologous tissues with relatively simple and low invasiveness. That is, unlike existing ES cells, they do not have the problems of ethics and immune rejection caused by being derived from fetal embryos, and have the potential of multipotent adult progenitor / stem cells (MAPCs). Similarly, it is not necessary to use a highly invasive recovery method such as bone marrow aspiration.
  • the animal is, for example, any of a chicken, a mouse, a rat, and a human.
  • a fetal individual can be used, but an individual after birth can also be used.
  • the above-mentioned postnatal individual means an individual excluding a prenatal fetus.
  • the post-natal individual may be an adult after sexual maturity, a force S including a young body immediately after birth, or an individual at any time.
  • the pluripotent stem cell has at least one of the following properties (1) and (2).
  • the pluripotent stem cell in the step of obtaining the tissue cell from the pluripotent stem cell, the pluripotent stem cell is differentiated into one or more tissue cells by culturing under differentiation conditions. Let it.
  • the culture under the above-mentioned differentiation conditions includes culture under all conventionally known conditions for the purpose of differentiating cells. Specifically, serum and various growth factors (FGF, EGF,
  • the pluripotent stem cells have a differentiation ability to differentiate into one or several types of tissue cells by culturing under differentiation conditions.
  • fetal calf serum or avian serum For example, fetal calf serum or avian serum.
  • a growth factor may be further used.
  • the growth factor include EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor) and the like.
  • tissue cells according to the present invention are derived from iris pigmented epithelial cells from which a part of the cells can be collected from the patient. Therefore, according to the present invention, tissue cells that can be used as a transplant source in regenerative medicine can be produced from iris pigmented epithelial cells of an animal.
  • the iris pigment epithelium cell is an iris tissue extirpation step of extracting iris tissue from an eyeball of an animal, and the iris pigment epithelium is separated from the extracted iris tissue. It is characterized by being isolated by the iris pigment epithelium separation step
  • the tissue cells of the present invention can be efficiently produced by efficiently separating the iris pigmented epithelial cells of the animal.
  • the iris tissue excision step includes an iris tissue excision step of excision of only the iris tissue from the eyeball of the animal, an enzyme treatment step of enzymatically treating the excised iris tissue, and an enzymatic treatment step.
  • Iris tissue recovery step for recovering the iris tissue that has been obtained.
  • the tissue cells of the present invention can be produced more efficiently by efficiently extracting only the iris tissue from the eyeball of the animal.
  • tissue cells that work in the present invention are obtained using the method for producing tissue cells of the present invention, and are derived from animal iris pigment epithelial cells as described above. Therefore, the tissue cells of the present invention can be provided as a transplant cell source that can solve problems such as immunological rejection due to cell transplantation, ethical problems, and imbalance between supply and demand of transplant source cells.
  • the tissue cell according to the present invention may be any one of ectoderm cells or cells derived from ectoderm, mesoderm cells or cells derived from mesoderm, endoderm cells or cells derived from endoderm. is there.
  • tissue cells of the present invention form a tissue constituting an organ in a living body.
  • tissues constituting organs in a living body are, specifically, nervous tissues, muscular tissues, heart tissues, and vascular tissues that constitute each organ such as a nervous system organ, a muscular system organ, a heart, and a blood vessel. And so on.
  • FIG. 1 is a schematic process chart showing one example of a method for producing a tissue cell, which is useful in the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing a state of a stem cell according to Example 1.
  • FIG. 3 (a) is a view showing a desmin (muscle cell marker) antibody and an aggregate obtained by labeling with DAPI staining (nucleus) in Example 1.
  • FIG. 3 (b) is a view showing a desmin (muscle cell marker) antibody and an aggregate obtained by labeling with DAPI staining (nucleus) in Example 1.
  • FIG. 4 is a view showing the appearance of cardiomyocytes in each step of inducing each tissue cell from iris pigmented epithelial cells in Example 2.
  • FIG. 5 is a view for explaining the expression mode of Oct-3 / 4 in the early development process of mice.
  • FIG. 6 (a) In Example 3, stem cells obtained from rats were stained with Oct-3 / 4 antibody and
  • FIG. 6 (b) is a view showing a result of labeling stem cells obtained from a rat by Oct-3 / 4 antibody staining and DAPI staining in Example 3.
  • the present inventors aimed at solving the problems of immune rejection due to cell transplantation in regenerative medicine, ethical problems, and imbalance between the supply and demand of transplanted cell sources, and the like. Tissue cells derived from squamous epithelial cells were produced.
  • the method for producing tissue cells comprises the steps of selectively culturing iris color epithelial cells isolated from the eyeball of an animal by a suspended aggregate culture method to obtain pluripotent stem cells. Culturing the pluripotent stem cells to obtain tissue cells from the pluripotent stem cells.
  • the method for producing tissue cells according to the present embodiment includes, as shown in FIG. 1, at least an iris pigment epithelial cell isolation step of isolating iris pigment epithelial cells from an animal eyeball (Step 1; Step is abbreviated as s), and a step of obtaining a pluripotent stem cell by selectively culturing the isolated iris pigmented epithelial cells by a suspended aggregate culture method (hereinafter referred to as a stem cell production step) (S2) And a step of culturing the pluripotent stem cells using serum or the like to obtain tissue cells from the pluripotent stem cells (hereinafter, referred to as a stem cell culturing step) (S3).
  • the method for producing tissue cells according to the present invention is not limited to this, and may include other steps. Further, the stem cell culture step of S3 can also be called a tissue cell induction step.
  • the animal may be any individual from birth to adult as long as it is an individual after birth.
  • the method for producing tissue cells according to the present embodiment can produce tissue cells derived from iris pigmented epithelial cells of young animal individuals, but it is possible to produce tissue cells derived from adult animal iris pigmented epithelial cells. Of tissue cells.
  • the iris pigmented epithelial cell isolation step of S1 is not particularly limited as long as the iris pigmented epithelial cells can be isolated.
  • iris tissue may be excised from the eyeball of an animal using a conventionally known technique, and iris pigment epithelial cells may be isolated from the iris tissue.
  • a method for extracting the iris tissue from the eyeball of an animal it is preferable to use the method described in Nature Neuroscience (2001) 4 (12), 1163 (Non-patent Document 2).
  • the S2 stem cell production step is not particularly limited as long as it can selectively culture only the iris pigmented epithelial cells isolated from the eyeball of the animal.
  • the iris pigment isolated from the eyeball of an animal using a conventionally known technique is used. Only the skin cells may be selectively cultured.
  • the iris pigmented epithelial cells isolated in the iris pigmented epithelial cell isolation step (S1) are aggregated in process 6 (hereinafter, the process is abbreviated as P).
  • P7 includes a cell dissociation step for dissociating the cells into individual cells from a state in which the cells are in a culturing state, and a cell culture step for selectively culturing only the isolated iris pigmented epithelial cells as P7.
  • sheet cells of the isolated iris pigmented epithelium are dissociated into individual cells using a commercially available trypsin solution.
  • the isolated iris pigmented epithelium sheet-like cells are dissociated into individual cells by a pipetting operation using a commercially available micropipette without using a trypsin solution. You can also.
  • the reagents and instruments used in the cell dissociation step of P6 are not particularly limited, and it is possible to dissociate the isolated iris pigmented epithelial cells from the aggregated state into individual cells. Possible conventionally known reagents and instruments can be used.
  • fibroblast growth factor LIF (leukemia mhioitory factor), or SCF (human stem cell factor) alone or in combination
  • LIF leukemia mhioitory factor
  • SCF human stem cell factor
  • a commercially available serum-free medium supplemented with a commercially available N2 supplement is used as a culture solution for culturing suspended aggregates.
  • the iris pigmented epithelial cells dissociated in the cell dissociation step of P6 are cultured in the culture solution for culturing suspended aggregates while rotating using a commercially available shaker.
  • pluripotent stem cells The ability to selectively separate and recover cell populations that contain
  • the culture solution and reagent used in the cell culture stage of P7 are not particularly limited, and conventionally known culture solutions and reagents capable of obtaining the above stem cells can be used.
  • the culture period in the cell culture stage of P7 may be appropriately set as needed. However, at this time, if the culture is continued for a long time, the obtained aggregate may become too large and differentiate. Therefore, in the present embodiment, it is desirable that the cells be dissociated and involved (passaged) within 3-4 days.
  • the stem cells obtained in the cell culture stage of P7 are cultured using serum.
  • the specific technique and the like are not particularly limited as long as the stem cells can be cultured using serum.
  • the stem cells may be cultured using a conventionally known technique. Therefore, for example, using a commercially available micropipette, the above stem cells can be transferred to a medium containing serum and cultured.
  • Examples of the above serum include fetal calf serum and avian serum, but these are not particularly limited. In the present embodiment, one kind of these sera may be used, or two or more kinds thereof may be used as needed.
  • the concentration of the serum is preferably 5 to 30%, more preferably 10 to 20%. If the serum is cultured at such a serum concentration, good results can be obtained. can get. However, even if the concentration is lower or higher, the present invention can be carried out and is not limited to the above-mentioned serum concentration.
  • the stem cells may be cultured using a growth factor in addition to the serum.
  • a growth factor include EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor) and the like.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • one type of these growth factors may be used, or two or more types may be used as necessary.
  • the concentration of the growth factor is not particularly limited, and may be appropriately set as needed.
  • the culturing period of the stem cells is preferably 113 months. In the stem cell culture step of S3, if the culture period is 1 month or less (especially 2 weeks or less), the differentiation induction efficiency is reduced, so that it is not preferable. It is not preferable because of its properties.
  • an embryoid body is obtained by performing the stem cell culturing step of S3.
  • the embryoid body is derived from animal iris pigment epithelial cells, which are ectodermal cells. Therefore, the embryoid body obtained in the present embodiment includes neural stem cells, but in addition, various tissue cells such as muscle cells and vascular endothelial-like cells are also included in the embryoid body. I have.
  • tissue cells derived from iris pigmented epithelial cells of an animal can be obtained by the stem cell culturing step of S3.
  • the iris pigmented epithelial cells are used to remove iris tissue from an eyeball of an animal, and the iris tissue epithelium is separated from the extracted iris tissue. It is a method isolated by an iris pigment epithelium separation step.
  • the method for producing tissue cells according to the present invention is not limited to this, and may include other processes.
  • the method of producing a tissue cell according to the present embodiment includes at least an iris pigmented epithelial cell isolation step (S1), a stem cell production step (S2), and a stem cell culture step (S3).
  • the iris pigment epithelium cell isolation step (S1) further includes an iris tissue excision step (P1) and an iris pigment epithelium separation step (P2) described below.
  • the method for producing a tissue cell according to the present invention is not limited to this, and may include other steps.
  • the iris tissue extraction step (P1) is not particularly limited as long as the iris tissue can be extracted from the eyeball of the animal.
  • iris tissue may be extracted from the eyeball of an animal using a conventionally known technique.
  • the iris tissue may be extracted from the eyeball of the animal using the method described in nature neuroscience (2001) 4 (12), 1163 (Non-patent Document 2).
  • the iris tissue excision step (P1) as shown in FIG. Force
  • the iris tissue excision step for excision of only the iris tissue is included as P4, an enzymatic treatment step for enzymatically treating the excised iris tissue, and the iris tissue recovery processing step for recovering the enzyme-treated iris tissue as P5.
  • the method of producing a tissue cell according to the present invention includes, but is not limited to, other steps.
  • the iris tissue excision step of P3 is not particularly limited as long as it can excise only the iris tissue from the eyeball of the animal. Generally, it is sufficient to remove only the iris tissue from the eyeball of the animal using a conventionally known technique.
  • iris tissue excision step of P3 only iris tissue is excised from the eyeball of the animal using commercially available micro scissors.
  • the enzymatic treatment step of P4 involves enzymatic treatment of the iris tissue in order to facilitate separation of the iris pigmented epithelium from the iris tissue, and the specific method and the like are not particularly limited.
  • the iris tissue may be subjected to an enzymatic treatment using a conventionally known technique to facilitate separation of the iris pigmented epidermis from the iris tissue.
  • the iris tissue is reacted in a dispase solution containing a commercially available dispase for 15 to 40 minutes at the stage of the enzyme treatment of P4, and then the ivory tissue is commercially available.
  • the reaction is carried out in an EDTA solution containing EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) for 20 to 30 minutes.
  • Enzymes and reagents used in the enzyme treatment step of P4 are not particularly limited, and are conventionally known enzymes that can process iris tissue so that iris pigmented epidermis can be easily separated from iris tissue. Enzymes and reagents can be used.
  • the iris tissue recovery step of P5 is for recovering the iris tissue weakened by the enzyme treatment, and the specific method and the like are not particularly limited. In general, a conventionally known technique may be used to recover the iris tissue that has been weakened by the enzyme treatment.
  • the iris tissue recovery step of P5 after the reaction in the enzyme treatment step of P4, the iris tissue is reacted for 30 to 60 minutes in a culture solution containing a plate of fetal calf serum to reduce the iris tissue. Let it recover.
  • the culture solution containing serum used in the iris tissue recovery step of As the drug a conventionally known culture solution containing serum capable of recovering a weakened iris tissue, which is not particularly limited, can be used.
  • the reaction times of the P4 enzyme treatment step and the P5 iris tissue recovery treatment step are particularly important.
  • the iris tissue is reacted with the 1000 U / mL dispase solution at 25 to 37 ° C. for 15 to 40 minutes, and the reaction is carried out at room temperature at the temperature of 0.05 to 0.05. Incubate with 0.1% EDTA solution for 16-40 minutes, then fetal serum 8-10. The reaction is preferably performed for 30 to 120 minutes with a culture solution containing / o.
  • the iris tissue is reacted with the 1000 U / mL dispase solution at 37 ° C. for 16 minutes, and the iris tissue is incubated at room temperature for 0.05 min. It is particularly preferable that the reaction is carried out for 20 minutes with a% EDTA solution and for 90 minutes with a culture containing 8% fetal bovine serum.
  • the iris tissue is reacted with the 1000 U / mL dispase solution at 37 ° C. for 20 minutes, and the iris tissue is incubated at room temperature for 0 min. It is particularly preferable to react for 25 minutes with a 05% EDTA solution and for 60 minutes with a culture solution containing 8% fetal bovine serum.
  • the iris tissue is reacted with the 1000 U / mL dispase solution at 37 ° C. for 30 minutes, and the mixture is allowed to stand at room temperature. It is particularly preferable to react with a 05% EDTA solution for 40 minutes and to react with a culture solution containing 8% fetal bovine serum for 30 minutes.
  • the iris tissue When isolating the iris pigmented epithelium from rat eyeballs, the iris tissue was reacted with the above 1 OOOU / mL dispase solution at 37 ° C. for 15 to 40 minutes, and the above 0.05 EDTA was added at room temperature. The reaction is preferably performed for 15 to 60 minutes with a solution, and the reaction is preferably performed for 30 to 120 minutes with a culture solution containing 8% to 10% fetal bovine serum.
  • the above iris tissue When separating the iris pigmented epithelium from the human fetal eyeball, the above iris tissue is reacted with the above 500-1000 U / mL dispase solution at 25-37 ° C. for 15-30 minutes, and the above iris tissue is allowed to stand at room temperature. 05-0. It is preferable to react with 1% EDTA solution for 15-40 minutes, and to react with culture solution containing 8-10% of fetal calf serum for 10-60 minutes.
  • the iris tissue When isolating the iris pigmented epithelium from the human fetal eye at the age of 19 weeks, the iris tissue is reacted with the 1000 U / mL dispase solution at 37 ° C. for 30 minutes, and the iris tissue is incubated at room temperature for 30 minutes. It is particularly preferable that the reaction is performed for 30 minutes with a 05% EDTA solution and the reaction is performed for 60 minutes with a culture solution containing 8% fetal bovine serum.
  • a DMEM medium manufactured by Invitrogen
  • a suitable amount of fetal serum from the market has been added may be used.
  • the iris pigment epithelium separation step of P2 is carried out by separating only the iris pigment epithelium from the iris tissue constructed from the iris matrix and the iris pigment epithelium extracted in the iris tissue excision step (P1).
  • the method and the like are not particularly limited. Generally, only the iris pigmented epithelium may be separated from the iris tissue using a conventionally known technique.
  • the iris matrix and the iris pigment epithelium are separated from the recovered iris tissue by peeling off only the iris pigment epithelium using commercially available microtweezers. To separate.
  • the iris pigment epithelial cells are isolated by the iris tissue excision step of P1 and the iris pigment epithelium separation step of P2, whereby the iris pigment epithelium cells are isolated.
  • the cells can be efficiently separated, whereby the above-mentioned tissue cells can be efficiently produced.
  • the tissue cells of the present embodiment are derived from iris pigmented epithelial cells from which a part of the cells can be collected from the patient. Therefore, according to the present embodiment, pluripotent stem cells capable of differentiating into various tissue cells can be produced from the iris pigmented epithelial cells of the subject. By culturing the pluripotent stem cells under various differentiation conditions, it is possible to further produce various types of tissue cells used as a transplant source in regenerative medicine. In addition, if the tissue cells of the present embodiment are used as a transplant cell source, the problem of immune rejection due to cell transplantation, ethical problems, and It can solve problems such as balance between supply and supply.
  • a dispase solution (“dispase”, manufactured by Kondo Sake Co., Ltd.) for 15-40 minutes, and then 0.05% EDTA (RT) was added at room temperature.
  • the reaction was carried out in an ethylenediaminetetraacetic acid (ethylenediaminetetraacetic acid) solution for 20-30 minutes.
  • ethylenediaminetetraacetic acid ethylenediaminetetraacetic acid
  • the iris tissue was allowed to react for 30 to 60 minutes in a culture solution (“DMEM medium” manufactured by Invitrogen) containing 8% of fetal bovine serum to recover the iris tissue. Thereafter, using commercially available microtweezers, only the iris pigment epithelium was peeled off from the iris tissue and collected, thereby separating the iris matrix and the iris pigment epithelium.
  • DMEM medium manufactured by Invitrogen
  • the separated iris pigment epithelium was dissociated into cells using a commercially available trypsin solution. Thereafter, the dissociated iris pigmented epithelial cells were selectively cultured by a suspended aggregate culture method (neurosphere method) described in Science 1992: 225; 1707-1710.
  • the medium of the suspended aggregate culture was a serum-free medium ("DMEM / F12 medium” manufactured by Invitrogen), N2 supplement (manufactured by Invitrogen) in 1/100, FGF2 (fibroblast growth factor-2: Fibroblast growth factor-2, P-mark, manufactured by roTech, alone at 20 ng / mL, and one LIF (leukemia inhibitory factor, ESGRO, manufactured by Chemicon) at 1000 U / mL, and SCF ( Human SCF (Stem Cell Factor: DIACLONE) was added at 10 ng / mU.
  • DMEM / F12 medium manufactured by Invitrogen
  • N2 supplement manufactured by Invitrogen
  • FGF2 fibroblast growth factor-2: Fibroblast growth factor-2, P-mark, manufactured by roTech
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • SCF Human SCF (Stem Cell Factor: DIACLONE) was added at 10 ng / mU.
  • the trypsin-treated iris pigmented epithelial cells are cultured in the above-mentioned suspended aggregate medium in a carbon dioxide incubator for 3 to 7 days while rotating using a commercially available shaker to obtain stem cells. Obtained. The appearance of the obtained stem cells is shown in FIG. (Formation of Agglomerates by Stem Cell Culture)
  • the iris pigmented epithelial cells isolated from the chick chick eyeballs were cultured in the above-mentioned suspended aggregates, and then stem cell culture was performed as follows.
  • the stem cells derived from the iris pigmented epithelial cells of the above-mentioned chicken chicks obtained by the above-mentioned suspended aggregate culture method were transferred to a medium having the composition shown in the following (b) and (c) using a commercially available micropipette. moved.
  • DMEM medium manufactured by Invitrogen
  • EGF and FGF2 (20 ng / mL each) as growth factors.
  • the stem cells were cultured for 12 months using the respective media (b) and (c). As a result, agglomerates were obtained as shown in FIG. 2 ((b) and (c)).
  • the iris pigmented epithelial cells dissociated in the same manner as in Example 1 were cultured in a serum-free medium (“DMEM / F12 medium” manufactured by Invitrogen), 1/100 N2 supplement (manufactured by Invitrogen) and FGF2 (fibroblast growth factor- 2: Fibroblast growth factor _2, P-mark) After culturing at 20 ng / mL for 3 days, the cells are cultured in three types of media containing the following components (1) and (3) by the suspended aggregate method. The culture was performed for one to two months.
  • DMEM / F12 medium manufactured by Invitrogen
  • FGF2 fibroblast growth factor- 2: Fibroblast growth factor _2, P-mark
  • Fetal serum (8. /.), EGF (20 ng / mL), and FGF2 (20 ng / mL).
  • Fetal serum (8. /.), Chicken serum (2. /.), EGF (20 ng / mL), and FGF2 (20 ng / mL) / mL).
  • the resulting extracts RN A from aggregates, RT- PCR method is endoderm markers using non Hue preparative protein, myosin and MEF2 a mesoderm markers are ectodermal markers P AX6 and tubes Phosphorus J was examined for gene expression. As a result, expression of the marker gene was observed under any of the above conditions (1) and (3). This indicates that the aggregate obtained contains cells differentiated into all three germ layers.
  • the above-mentioned aggregates are formed mainly by the induction of differentiation of ES cells and have properties similar to those of a cell structure called an embryoid body containing various kinds of differentiated cells such as embryos. It turned out to be.
  • the iris pigmented epithelial cells are ectodermal cells
  • this example has shown that stem cells derived from animal iris pigmented epithelial cells can be differentiated beyond germ layer.
  • the cells obtained by the stem cell production process were pluripotent stem cells having trigerminal differentiation ability capable of differentiating into any of the mesoderm, endoderm, and ectoderm.
  • FIG. 4 shows the stage of culturing in a serum-free medium for 3 days (ie, stem cell production step S2) and the subsequent stage of culturing for 12 months (stem cell culturing step S3).
  • stem cell production step S2 the stage of culturing in a serum-free medium for 3 days
  • stem cell culturing step S3 stage of culturing for 12 months
  • Lane 1 shows the result of the sample on the second day of culture in the cell culture step (S7) in the stem cell production process of S2.
  • Lane 2 shows the results of the S3 stem cell culturing process at Sampnolet two months after the culturing under the condition (3). From the results shown in this figure, it can be concluded that the pluripotent stem cells were in the state before differentiation into tissue cells in the stem cell production process in lane 1, and were differentiated into cardiomyocytes during the stem cell culture process in lane 2. Understand.
  • Oct-3 / 4 is a molecule that is specifically expressed in totipotent undifferentiated cells, and the cells for which its expression is confirmed are extremely limited (see "Oct-3 / 4). At birth, it is known to be expressed only in spermatogonia, which is a reproductive stem cell, and has not been expressed in other somatic tissues. [0094] In this example, the expression of Oct-3 / 4 in post-natal mouse and rat iris tissues and a portion of stem cells obtained therefrom was examined. The results are shown in FIGS. 6 (a) and 6 (b). FIG. 6 (a) and FIG. 6 (b) show that stem cells obtained from rats at 11 days and 3 weeks after birth using the method of the present invention were stained with Oct-3 / 4 antibody and stained with DAPI.
  • the iris may also contain cells that maintain undifferentiated totipotency, and these cells are purified, cultured, and cultured under suitable conditions. If it is possible to induce differentiation by, various tissue cells can be produced. Research on regenerative medicine using ES cells has been actively conducted, but there are serious ethical problems. With iris tissue, it is possible to use the patient's own cells, which is expected to lead to the realization of regenerative medicine by autologous transplantation.
  • pluripotent stem cells capable of differentiating into various tissue cells are produced from iris pigmented epithelial cells of an animal.
  • the effect is that various tissue cells can be produced from the competent stem cells.
  • This tissue cell can be used as a transplant source in regenerative medicine.
  • Tissue cells obtained by the production method of the present invention can be used as a transplant source that can solve the problems of immune rejection due to cell transplantation, ethical problems, and imbalance between supply and demand of transplant source cells. Can be provided.

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Abstract

　細胞移植による免疫拒絶の問題、倫理的問題、移植細胞源の需要と供給のアンバランスなどの問題を解決し得る、動物の虹彩色素上皮細胞由来の組織細胞の生産方法、およびその方法により得られる組織細胞を提供する。 　本発明の組織細胞の生産方法では、先ず動物の眼球から単離した虹彩色素上皮細胞を浮遊凝集塊培養方法により選択的に培養して多能性幹細胞を得る。続いて、この多能性幹細胞を、血清などを用いて培養することによって各種組織細胞を生産する。

Description

明 細 書
動物の虹彩色素上皮細胞由来の多能性幹細胞から組織細胞を生産する 方法、およびその方法により得られる組織細胞
技術分野
[0001] 本発明は、動物の虹彩色素上皮細胞から多能性幹細胞を生産し、その多能性幹 細胞から組織細胞を生産する方法、およびその方法により得られる組織細胞に関す るものである。
背景技術
[0002] 近年、脳、脊髄由来の神経幹細胞や、 ES細胞 (胚性幹細胞）の多分化機能を利用 して細胞をつくり、これを移植するとレ、う再生医療が注目されてレ、る。
[0003] 上記神経幹細胞や ES細胞の医療への応用を考えた場合には、細胞移植による免 疫拒絶の問題、倫理的問題、移植細胞源の需要と供給のアンバランスなどの多くの 問題が生じる。
[0004] そこで、移植対象となる個体自身に由来する細胞を移植源として用いることが可能 となれば、 自家移植が可能となり上記の問題を解決することができる。
[0005] 上記移植源としての利用が期待されている細胞として、眼球の虹彩色素上皮細胞 力 Sある。
[0006] 虹彩色素上皮細胞は、光量に応じて瞳孔を開いたり、狭めたりして網膜に届く光量 を調節するための組織である虹彩を構築している細胞のひとつである。
[0007] 本発明者は、これまでにニヮトリの雛の虹彩色素上皮細胞を単離培養することに成 功したことを、非特許文献 1 : Experimental Cell Res. (1998) 245, 245-251 :で報告し ている。
[0008] さらに、本発明者は、上記非特許文献 1の方法に改変を加えることにより、哺乳動 物（マウス、ラット、ヒト胎児）の虹彩細胞の単離培養を可能とした (非特許文献 2 : nature
neuroscience (2001) 4 (12), 1163 :を参照）。
[0009] 虹彩色素上皮細胞は、患者本人からその細胞の一部を採取することが可能である ので、もし、虹彩色素上皮細胞を用いた組織細胞の生産が可能となれば、患者自身 の細胞を用いた再生医療が実現することになる。 （なお、本発明者が調査した限りで は、本発明にかかる、動物の虹彩色素上皮細胞由来の幹細胞から組織細胞を生産 する方法、およびこの方法により得られる組織細胞に関する従来技術文献は見出さ れなかった。 )
し力、しながら、動物の虹彩色素上皮細胞から神経系以外の組織細胞を生産する方 法は確立されていない。
[0010] 本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は、細胞 移植による免疫拒絶の問題、倫理的問題、移植細胞源の需要と供給のアンバランス などの問題を解決し得る、動物の虹彩色素上皮細胞由来の組織細胞の生産方法、 およびその方法により得られる組織細胞を提供することにある。
発明の開示
[0011] 本発明者は、上記課題について鋭意検討した結果、動物の眼球から単離した虹彩 色素上皮細胞を浮遊凝集塊培養方法により選択的に培養して得た幹細胞を特定の 培養条件で維持すると凝集塊が得られること、また該凝集塊は胚様体 (embryoid body)構造を形成しており、その中には、例えば筋肉細胞や血管内皮様細胞などの 様々な組織細胞が含まれることを見出し、本発明を完成させるに至った。つまり、本 願発明者は、動物の眼球から単離した虹彩色素上皮細胞を浮遊凝集塊培養方法に より選択的に培養して得た幹細胞は、種々の組織に分化する能力を有する多能性幹 細胞であることを見出した。
[0012] 本発明の組織細胞の生産方法は、上記課題を解決するために、動物の眼球から 単離した虹彩色素上皮細胞を浮遊凝集塊培養方法により選択的に培養することで 多能性幹細胞を得る工程と、上記多能性幹細胞を培養して、当該多能性幹細胞から 組織細胞を得る工程とを含むことを特徴としてレ、る。
[0013] 上記の構成によれば、従来公知の動物成体の虹彩色素上皮の単離方法により、動 物の眼球から虹彩組織を摘出し、虹彩組織から虹彩色素上皮を単離し、単離した虹 彩色素上皮を、浮遊凝集塊培養方法により選択的に培養することにより多能性幹細 胞を得ることができる。 [0014] そして、上記多能性幹細胞を培養することにより、胚様体 (embrioid body)構造を形 成すること力 Sできる。
[0015] 上記胚様体は、主に ES細胞から分化誘導されて生じる胚のような組織を含む構造 体である。この胚様体は、三胚葉性細胞を含んでいることから、虹彩由来幹細胞が E S細胞に似た全能性を保持すると考えられる。そこで、この虹彩上皮細胞由来の胚様 体構造に含まれる細胞を、本発明では動物の虹彩色素上皮細胞由来の組織細胞と 称する。
[0016] なお、本発明の組織細胞の生産途中で得られる多能性幹細胞は、 自家組織から比 較的簡便かつ低侵襲性に採取、作製できるという優位性を有している。即ち、既存の ES細胞のように、胎児胚由来であるということに起因する倫理性や免疫拒絶の問題 を有さず、また、多能性成体幹細胞（multipotent adult progenitor/stem cells:MAPC) の様に骨髄穿刺といった侵襲性の高い回収法を用いる必要もない。
[0017] 本発明では、上記動物は、例えば、ニヮトリ、マウス、ラット、またはヒトのいずれかで ある。また、上記動物は、胎児期の個体を使用することが可能であるが、出生後の個 体も使用可能である。上記出生後の個体とは、出生前の胎児を除く個体のことを意 味する。この出生後の個体としては、性成熟後の成体、出生直後の幼体などが挙げ られる力 S、どの時期の個体でもよい。
[0018] また、上記多能性幹細胞は、以下の（1)、（2)の性質のうちの少なくとも何れ力を有 している。
(1) Oct— 3/4陽性である。
(2)三胚葉性分化能を有する。
上記（1)、（2)については、実施例において説明する。
[0019] また、本発明の組織細胞の生産方法において、上記多能性幹細胞から組織細胞 を得る工程では、上記多能性幹細胞を、分化条件下の培養において、 1種類以上の 組織細胞に分化させる。
[0020] ここで、上記分化条件下の培養とは、細胞を分化させることを目的とした従来公知 のあらゆる条件下の培養を含む。具体的には、血清や各種成長因子（FGF、 EGF、
CNTF、 RAなど）を加えた培地で、様々な細胞外基質成分をコートした培養皿中での 培養方法のことを言う。このように、上記多能性幹細胞は、分化条件下の培養によつ て、 1種類もしくは数種類の組織細胞に分化する分化能を有している。
[0021] 上記分化条件下の培養では、血清を用いて培養を行うことが好ましい。上記血清は
、例えば、ゥシ胎児血清またはトリ血清である。
[0022] また、上記分化条件下の培養において、さらに成長因子を用いてもよい。上記成長 因子としては、例えば、 EGF (epidermal growth factor:上皮成長因子）、 FGF ( fibroblast growth factor :繊維芽細胞成長因子）等を用いることができる。
[0023] 本発明にかかる上記組織細胞は、患者本人からその細胞の一部を採取することが 可能な虹彩色素上皮細胞に由来している。したがって、本発明によれば、動物の虹 彩色素上皮細胞から、再生医療で移植源として活用できる組織細胞を生産すること ができる。
[0024] また、本発明の組織細胞の生産方法では、上記虹彩色素上皮細胞は、動物の眼 球から虹彩組織を摘出する虹彩組織摘出工程と、摘出した上記虹彩組織から虹彩 色素上皮を分離する虹彩色素上皮分離工程とにより単離されることを特徴としている
[0025] これによれば、動物の虹彩色素上皮細胞を効率よく分離することで、本発明の組織 細胞を効率よく生産することができる。
[0026] また、本発明では、上記虹彩組織摘出工程は、動物の眼球から虹彩組織のみを切 除する虹彩組織切除段階と、上記切除した虹彩組織を酵素処理する酵素処理段階 と、上記酵素処理した虹彩組織を回復させる虹彩組織回復段階とを含んでレ、ることを 特徴としている。
[0027] これによれば、動物の眼球から虹彩組織のみを効率よく摘出することで、本発明の 組織細胞をより効率よく生産することができる。
[0028] 本発明に力かる組織細胞は、本発明の組織細胞の生産方法を用いて得られるもの であり、上述したように、動物の虹彩色素上皮細胞に由来したものである。したがって 、本発明の組織細胞を、細胞移植による免疫拒絶の問題、倫理的問題、移植源細胞 の需要と供給のアンバランスなどの問題を解決し得る移植細胞源として提供すること ができる。 [0029] そして、本発明にかかる組織細胞は、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚 葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞のうちの何 れかである。
[0030] さらに、本発明の組織細胞は、生体内の器官を構成する組織を形成するものである 。この「生体内の器官を構成する組織」とは、具体的には、神経系器官、筋肉系器官 、心臓、血管などといった各器官を構成している神経組織、筋組織、心臓組織、血管 組織などのことである。
[0031] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十 分分かるであろう。また、本発明の利点は、次の説明によって明白になるであろう。 図面の簡単な説明
[0032] [図 1]本発明に力かる組織細胞の生産方法の一例を示す概略工程図である。
[図 2]実施例 1にかかる幹細胞の様子を示す図である。
[図 3(a)]実施例 1において、デスミン (筋肉細胞マーカー）抗体、および DAPI染色 (核 )にて標識を行った凝集塊を示す図である。
[図 3(b)]実施例 1において、デスミン (筋肉細胞マーカー）抗体、および DAPI染色 (核 )にて標識を行った凝集塊を示す図である。
[図 4]実施例 2において、虹彩色素上皮細胞から各組織細胞を誘導する各工程にお ける心筋細胞の出現を示す図である。
[図 5]マウス初期発生過程における Oct— 3/4発現様式を説明する図である。
[図 6(a)]実施例 3において、ラットから得た幹細胞を Oct— 3/4抗体による染色および
DAPI染色にて標識を行った結果を示す図である。
[図 6(b)]実施例 3において、ラットから得た幹細胞を Oct— 3/4抗体による染色および DAPI染色にて標識を行った結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0033] 本発明の実施の一形態について図 1に基づいて説明すれば、以下の通りである。
なお、本発明はこれに限定されるものではない。
[0034] 本発明者は、再生医療における細胞移植による免疫拒絶の問題、倫理的問題、移 植細胞源の需要と供給のアンバランスなどの問題を解決する目的で、動物の虹彩色 素上皮細胞由来の組織細胞を生産した。
[0035] 本実施の形態にかかる組織細胞の生産方法は、動物の眼球から単離した虹彩色 素上皮細胞を浮遊凝集塊培養方法により選択的に培養することで多能性幹細胞を 得る工程と、上記多能性幹細胞を培養して、当該多能性幹細胞から組織細胞を得る 工程とを含む構成である。
[0036] すなわち、本実施形態の組織細胞の生産方法は、図 1に示すように、少なくとも、動 物の眼球から虹彩色素上皮細胞を単離する虹彩色素上皮細胞単離工程 (ステップ 1 、以下ステップを sと略す）と、単離した虹彩色素上皮細胞を浮遊凝集塊培養方法に より選択的に培養することで多能性幹細胞を得る工程（以下、幹細胞生産工程と呼 ぶ）（S2)と、上記多能性幹細胞を血清などを用いて培養して、当該多能性幹細胞か ら組織細胞を得る工程（以下、幹細胞培養工程と呼ぶ）（S3)とを含んでいる。なお、 本発明にかかる組織細胞の生産方法はこれに限定されるものではなぐ他の工程が 含まれていてもよい。また、 S3の幹細胞培養工程は、組織細胞誘導工程と呼ぶことも できる。
[0037] 上記動物は、出生後の個体であれば、幼体から成体に至るまでのどの時期の個体 であってもよい。すなわち、本実施の形態にかかる組織細胞の生産方法は、動物幼 若個体虹彩色素上皮細胞由来の組織細胞を生産することが可能なことは言うまでも ないが、動物成体の虹彩色素上皮細胞由来の組織細胞を生産することが可能であ る。
[0038] S 1の虹彩色素上皮細胞単離工程は、虹彩色素上皮細胞を単離できればよぐそ の具体的な手法等については特に限定されるものではない。一般的には、従来公知 の手法を利用して、動物の眼球から虹彩組織を摘出し、摘出した虹彩組織から虹彩 色素上皮細胞を単離すればよい。動物の眼球から虹彩組織を摘出する方法としては 、 nature neuroscience (2001) 4 (12)， 1163 (前記非特許文献 2)に記載の方法を用い ることが好ましい。
[0039] S2の幹細胞生産工程は、動物の眼球から単離した虹彩色素上皮細胞のみを選択 的に培養できればよぐその具体的な手法等については特に限定されるものではな レ、。一般的には、従来公知の手法を利用して、動物の眼球から単離した虹彩色素上 皮細胞のみを選択的に培養すればよい。
[0040] ここで、幹細胞生産工程（S2)には、プロセス 6 (以下、プロセスを Pと略す）として、 虹彩色素上皮細胞単離工程 (S1 )において単離された虹彩色素上皮細胞を、凝集 している状態から個々の細胞に解離するための細胞解離段階と、 P7として、単離し た虹彩色素上皮細胞のみを選択的に培養する細胞培養段階とが含まれる。
[0041] 以下、幹細胞生産工程（S2)の各段階 P6および P7について詳細に説明する。ま ず、 P6の細胞解離段階では、単離された虹彩色素上皮のシート状の細胞を個々の 細胞に解離する。
[0042] 例えば、 P6の細胞解離段階は、市販のトリプシン溶液を用いて、単離された虹彩 色素上皮のシート状の細胞を個々の細胞に解離する。また、例えば、 P6の細胞解離 段階は、トリプシン溶液を用いずに、市販のマイクロピペットを用いたピペッティング操 作により、単離された虹彩色素上皮のシート状の細胞を個々の細胞に解離することも できる。
[0043] なお、 P6の細胞解離段階に用いられる試薬および器具は、特に限定されるもので はなぐ単離された虹彩色素上皮細胞を凝集している状態から個々の細胞に解離す ることが可能な従来公知の試薬および器具を用いることができる。
[0044] P7の細胞培養段階では、単離した虹彩色素上皮細胞を浮遊状態で FGF (
fibroblast growth factor :繊 牙細胞成 因子)、 LIF (leukemia mhioitory factor:白 血病阻害因子）、あるいは SCF (human SCF (Stem Cell Factor：ヒト幹細胞因子）の単 独、または組み合わせによる因子添加の無血清培地で培養する。これにより、上記 虹彩色素上皮細胞を未分化状態で増やすことが可能となるので、その結果得られる 組織細胞も多くなる。この段階では、 Science 1992: 225; 1707-1710に記載の浮遊凝 集塊培養法 (neurosphere法）を用いて、動物の眼球から単離した虹彩色素上皮細胞 を選択的に培養することが好ましい。
[0045] 例えば、 P7の細胞培養段階では、市販の無血清培地に市販の N2サプリメントをカロ えたものを浮遊凝集塊培養用の培養液として使用する。 P6の細胞解離段階にて解 離された上記虹彩色素上皮細胞を、上記浮遊凝集塊培養用の培養液中にて、市販 のシェーカーを用いて回転を加えながら培養する。これによつて、多能性幹細胞を多 く含む細胞集団を選択的に分離、回収すること力 Sできる。
[0046] なお、 P7の細胞培養段階に用いられる培養液および試薬は、特に限定されるもの ではなぐ上記幹細胞を得ることが可能な従来公知の培養液および試薬を用いること ができる。
[0047] また、本実施の形態では、 P7の細胞培養段階における培養期間は、必要に応じて 適宜設定すればよいものとする。ただし、このとき培養を長く続けすぎると、得られる 凝集塊が大きくなりすぎて分化してしまう虞がある。そこで、本実施の形態では、 3-4 日以内に細胞を解離して巻き込む (継代)することが望ましレ、。
[0048] そして、 S3の幹細胞培養工程で、血清を用いて P7の細胞培養段階で得られた幹 細胞を培養する。 S3の幹細胞培養工程では、血清を用いて上記幹細胞を培養でき ればよぐその具体的な手法等については特に限定されるものではなレ、。一般的に は、従来公知の手法を利用して、上記幹細胞を培養すればよい。したがって、例え ば、市販のマイクロピペットを用いて、上記幹細胞を血清を含む培地に移し替えて培 養すること力 Sできる。
[0049] 上記血清としては、例えば、ゥシ胎児血清およびトリ血清等が挙げられるが、これら は特に限定されるものではなレ、。また、本実施の形態では、これら血清を 1種類用い てもよく、必要に応じて 2種類以上用いてもよい。
[0050] また、上記血清の濃度は、 5— 30%であることが好ましぐ 10— 20%であることがよ り好ましぐこのような血清濃度で培養を行えば、良好な結果が得られる。しかしなが ら、それ以下あるいはそれ以上の濃度であっても、本発明は実施可能であるため、上 述の血清濃度に限定されるわけではない。
[0051] 本実施の形態では、上記血清に加えて、さらに成長因子を用いて上記幹細胞を培 養してもよレ、。上記成長因子としては、具体的には、例えば、 EGF (epidermal growth factor :上皮成長因子）、 FGF (fibroblast growth factor :繊維芽細胞成長因子）等が 挙げられる。本実施の形態では、これら成長因子を 1種類用いてもよぐ必要に応じ て 2種類以上用いてもよい。
[0052] また上記成長因子の濃度は、特に限定されるものではなぐ必要に応じて適宜設定 すればよいものとする。 [0053] また、本実施の形態では、特に限定されるものではないが、 S3の幹細胞培養工程 において、上記幹細胞の培養期間を 1一 3ヶ月とすることが好ましい。上記 S3の幹細 胞培養工程において、培養期間が 1ヶ月以下 (特に、 2週間以下)だと分化誘導効率 が下がるため好ましくなぐ逆に 3ヶ月以上では凝集塊の内部の細胞生存が悪くなる 可能性があるので好ましくない。
[0054] 本実施の形態では、上記 S3の幹細胞培養工程を行うことで胚様体を得る。この胚 様体は、動物の虹彩色素上皮細胞由来であり、この虹彩色素上皮細胞は外胚葉性 の細胞である。したがって、本実施の形態で得られる上記胚様体には神経幹細胞が 含まれるが、それ以外に、例えば筋肉細胞や血管内皮様細胞等、様々な組織細胞 が上記胚様体には含まれている。このように、本実施の形態によれば、 S3の幹細胞 培養工程により、動物の虹彩色素上皮細胞由来の組織細胞を得ることができる。
[0055] 本実施の形態にかかる組織細胞の生産方法は、上記虹彩色素上皮細胞が、動物 の眼球から虹彩組織を摘出する虹彩組織摘出工程と、摘出した上記虹彩組織から 虹彩組織上皮を分離する虹彩色素上皮分離工程とにより単離される方法である。な お、本発明に力かる組織細胞の生産方法はこれに限定されるものではなぐ他のェ 程が含まれていてもよい。
[0056] すなわち、本実施の形態の組織細胞の生産方法は、図 1に示すように、少なくとも 虹彩色素上皮細胞単離工程 (S1 )幹細胞生産工程 (S2)、および幹細胞培養工程（ S3)とが含まれ、さらに、上記虹彩色素上皮細胞単離工程（S1)には、後述する虹彩 組織摘出工程 (P1)および虹彩色素上皮分離工程 (P2)が含まれる。なお、本発明 にかかる組織細胞の生産方法はこれに限定されるものではなぐ他の工程が含まれ ていてもよい。
[0057] 上記虹彩組織摘出工程 (P1)は、動物の眼球から虹彩組織を摘出できれば良ぐ その具体的な手法等については特に限定されるものではない。一般的には、従来公 知の手法を利用して、動物の眼球から虹彩組織を摘出すればよい。好ましくは、 nature neuroscience (2001) 4 (12)， 1163 (前記非特許文献 2)に記載の方法を利用し て、動物の眼球から虹彩組織を摘出すればよい。
[0058] ここで、上記虹彩組織摘出工程（P1)は、図 1に示すように、 P3として、動物の眼球 力 虹彩組織のみを切除する虹彩組織切除段階を、 P4として、切除した虹彩組織を 酵素処理する酵素処理段階を、 P5として、酵素処理した虹彩組織を回復させる虹彩 組織回復処理段階を含んでいる。なお、本発明に力かる組織細胞の生産方法はこ れに限定されるものではなぐ他の工程が含まれてレ、てもよレ、。
[0059] 以下、虹彩組織摘出工程 (P1)の各段階 P3 P5について詳細に説明する。まず、 P3の虹彩組織切除段階は、動物の眼球から虹彩組織のみを切除できればよぐそ の具体的な手法等については特に限定されるものではない。一般的には、従来公知 の手法を利用して、動物の眼球から虹彩組織のみを切除すればよい。
[0060] 例えば、 P3の虹彩組織切除段階は、市販のマイクロ鋏を用いて動物の眼球から虹 彩組織のみを切除する。
[0061] P4の酵素処理段階は、虹彩組織から虹彩色素上皮を分離しやすくするために虹 彩組織を酵素処理するものであり、その具体的な手法等については特に限定される ものではない。一般的には、従来公知の手法を利用して、虹彩組織から虹彩色素上 皮を分離しやすくするために虹彩組織を酵素処理すればよい。
[0062] 例えば、ニヮトリの眼球から虹彩色素上皮を分離する場合は、 P4の酵素処理段階 で、虹彩組織を市販のディスパーゼを含むディスパーゼ溶液中にて 15— 40分間反 応させた後、市販の EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid :エチレンジァミン四酢酸 )を含む EDTA溶液中にて 20— 30分間反応させる。なお、 P4の酵素処理段階に用 レ、られる酵素および試薬は、特に限定されるものではなぐ虹彩組織から虹彩色素上 皮を分離しやすくするように虹彩組織を処理することが可能な従来公知の酵素およ び試薬を用いることができる。
[0063] P5の虹彩組織回復処理段階は、酵素処理によって衰弱した虹彩組織を回復させ るものであり、その具体的な手法等については特に限定されるものではない。一般的 には、従来公知の手法を利用して、酵素処理によって衰弱した虹彩組織を回復すれ ばよい。
[0064] 例えば、 P5の虹彩組織回復段階は、 P4の酵素処理段階の反応後、虹彩組織を巿 版のゥシ胎児血清を含む培養液中にて、 30— 60分間反応させて虹彩組織を回復さ せる。なお、 P5の虹彩組織回復処理段階に用いられる血清を含む培養液および試 薬は、特に限定されるものではなぐ衰弱した虹彩組織が回復することが可能な従来 公知の血清を含む培養液を用いることができる。
[0065] また、虹彩組織摘出工程 (P1)においては、 P4の酵素処理段階および P5の虹彩 組織回復処理段階の反応時間が特に重要である。 P4の酵素処理段階の上記虹彩 組織のデイスパーゼ溶液による反応時間、および上記 EDTA溶液による反応時間、 並びに P5の虹彩組織回復処理段階の上記ゥシ胎児血清を含む培養液による反応 時間を調節することによって、ニヮトリだけではなぐマウス、ラット、ヒトの眼球から虹 彩色素上皮を分離することができる。
[0066] マウスの眼球から虹彩色素上皮を分離する場合は、上記虹彩組織を 25— 37°Cの 上記 1000U/mLのデイスパーゼ溶液により 15— 40分間反応させ、室温下にて上記 0. 05-0. 1%EDTA溶液により 16— 40分間反応させ、ゥシ胎児血清を 8— 10。/o含 む培養液により 30 120分間反応させることが好ましい。
[0067] また、生後 10日のマウス眼球から虹彩色素上皮を分離する場合は、上記虹彩組織 を 37°Cの上記 1000U/mLのデイスパーゼ溶液により 16分間反応させ、室温下にて 上記 0. 05%EDTA溶液により 20分間反応させ、ゥシ胎児血清を 8%含む培養液に より 90分間反応させることが特に好ましい。
[0068] また、生後 12日のマウスの眼球から虹彩色素上皮を分離する場合は、上記虹彩組 織を 37°Cの上記 1000U/mLのデイスパーゼ溶液により 20分間反応させ、室温下に て上記 0. 05%EDTA溶液により 25分間反応させ、ゥシ胎児血清を 8%含む培養液 により 60分間反応させることが特に好ましい。
[0069] また、生後 2ヶ月のマウスの眼球から虹彩色素上皮を分離する場合は、上記虹彩組 織を 37°Cの上記 1000U/mLのデイスパーゼ溶液により 30分間反応させ、室温下に て上記 0. 05%EDTA溶液により 40分間反応させ、ゥシ胎児血清を 8%含む培養液 により 30分間反応させることが特に好ましい。
[0070] ラットの眼球から虹彩色素上皮を単離する場合は、上記虹彩組織を 37°Cの上記 1 OOOU/mLのデイスパーゼ溶液により 15— 40分間反応させ、室温下にて上記 0. 05 EDTA溶液により 15 60分間反応させ、ゥシ胎児血清を 8 10%含む培養液により 30— 120分間反応させることが好ましい。 [0071] ヒト胎児の眼球から虹彩色素上皮を分離する場合は、上記虹彩組織を 25— 37°C の上記 500— 1000U/mLのデイスパーゼ溶液により 15— 30分間反応させ、室温下 にて上記 0. 05-0. 1 %EDTA溶液により 15— 40分間反応させ、ゥシ胎児血清を 8 一 10%含む培養液により 10— 60分間反応させることが好ましい。
[0072] また、生後 19週のヒト胎児の眼球から虹彩色素上皮を分離する場合は、上記虹彩 組織を 37°Cの上記 1000U/mLのデイスパーゼ溶液により 30分間反応させ、室温下 にて上記 0. 05%EDTA溶液により 30分間反応させ、ゥシ胎児血清を 8%含む培養 液により 60分間反応させることが特に好ましい。
[0073] なお、上記培養液としては、例えば、 DMEM培地（invitrogen社製）を用いて、巿販 のゥシ胎児血清を適量添加したものを用いればょレ、。
[0074] P2の虹彩色素上皮分離工程は、虹彩組織摘出工程 (P1)にて摘出した虹彩基質 と虹彩色素上皮とから構築される虹彩組織から、虹彩色素上皮のみを分離できれば よぐその具体的な手法等については特に限定されるものではない。一般的には、従 来公知の手法を利用して、虹彩組織から虹彩色素上皮のみを分離すればよい。
[0075] 例えば、 P2の虹彩色素上皮分離工程は、回復させた上記虹彩組織から、市販の マイクロピンセットを用いて、虹彩色素上皮のみをはがして回収することにより、虹彩 基質と虹彩色素上皮とを分離する。
[0076] このように、本実施の形態によれば、上記虹彩色素上皮細胞を、 P1の虹彩組織摘 出工程と、 P2の虹彩色素上皮分離工程により単離することで、上記虹彩色素上皮細 胞を効率よく分離することができ、これにより上記組織細胞を効率よく生産することが できる。
[0077] 以上のように、本実施の形態に力、かる組織細胞は、患者本人からその細胞の一部 を採取することが可能な虹彩色素上皮細胞に由来している。したがって、本実施の 形態によれば、本人の虹彩色素上皮細胞から、種々の組織細胞への分化能を有す る多能性幹細胞を生産することができる。そして、この多能性幹細胞を種々の分化条 件下で培養することによって、さらに、再生医療において移植源として活用される各 種の組織細胞を生産することができる。また、本実施の形態の組織細胞を移植細胞 源として用いれば、細胞移植による免疫拒絶の問題、倫理的問題、移植源細胞の需 要と供給のアンバランスなどの問題を解決することができる。
[0078] 〔実施例〕
以下、実施例および図 2—図 6 (b)に基づいて本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれに限定されるものではない。
[0079] 〔実施例 1〕
(虹彩色素上皮細胞の単離）
市販のマイクロ鋏を用いて、ニヮトリ雛の眼球から虹彩組織のみを切除した。この虹 彩組織を 37°Cのデイスパーゼ溶液（「デイスパーゼ（dispase)」合同清酒社製） 1000 U/mL中にて、 15— 40分間反応させた後、室温下で 0. 05%EDTA (
ethylenediaminetetraacetic acid:エチレンジァミン四酢酸）溶液中にて 20— 30分間 反応させた。
[0080] 反応後、上記虹彩組織をゥシ胎児血清を 8%含む培養液（「DMEM培地」 invitrogen 社製）中にて、 30— 60分間反応させ、上記虹彩組織を回復させた。その後、市販の マイクロピンセットを用いて、虹彩色素上皮のみを上記虹彩組織からはがして回収す ることにより、虹彩基質と虹彩色素上皮とを分離した。
[0081] (浮遊凝集塊培養法）
上記分離した虹彩色素上皮は、市販のトリプシン溶液を用いて細胞に解離した。そ の後、この解離した虹彩色素上皮細胞を、 Science 1992: 225; 1707-1710に記載の 浮遊凝集塊培養法 (neurosphere法）によって、選択的に培養した。
[0082] 浮遊凝集塊培養の培地には、無血清培地（「DMEM/F12培地」 invitrogen社製）に、 N2サプリメント（invitrogen社製）を 100分の 1量、 FGF2 (fibroblast growth factor-2 :繊 維芽細胞成長因子- 2， P印 roTech社製）を 20ng/mL単独、あるレ、は、 LIF (leukemia inhibitory factor:白血病阻害因子， ESGRO, Chemicon社製）を 1000U/mL、および SCF (human SCF (Stem Cell Factor：ヒト幹細胞因子)， DIACLONE社製）を 10ng/m Uこなるように加えた。
[0083] トリプシン処理した上記虹彩色素上皮細胞を、上記の浮遊凝集塊培地にて、市販 のシェーカーを用いて回転を与えながら炭酸ガス培養機中で 3— 7日間培養をするこ とで幹細胞を得た。得られた幹細胞の様子を図 2の（a)に示す。 [0084] (幹細胞培養による凝集塊の形成）
上記ニヮトリ雛の眼球より単離した虹彩色素上皮細胞を上記浮遊凝集塊培養後、 幹細胞培養を以下のように行った。
[0085] 上記浮遊凝集塊培養法により得られた上記ニヮトリ雛の虹彩色素上皮細胞由来の 幹細胞を、市販のマイクロピペットを用いて、以下の（b)および（c)に示す組成の培 地に移動した。
(b)ゥシ胎児血清（8%)およびニヮトリ血清 (2%)を含む DMEM培地（invitrogen社製）
(c)ゥシ胎児血清（8%)、および成長因子としての EGFおよび FGF2 (各々 20ng/mL )を含む DMEM培地（invitrogen社製）。
[0086] そして、上記 (b)および (c)それぞれの培地を用いて上記幹細胞を 1一 2ヶ月間培 養した。その結果、図 2 ( (b)， （c) )にそれぞれ示すような凝集塊を得た。
[0087] 上記 (b)、 （c)それぞれの培地にて培養することで得られた凝集塊を、デスミン (筋 肉細胞マーカー）抗体、および DAPI染色 (核）にて標識を行った。その結果を図 3 (a )および図 3 (b)に示す。図 3 (a)は、図 2における（b)に示す培地で培養することで得 られた凝集塊を示し、図 3 (b)は、図 2における（c)に示す培地で培養することで得ら れた;疑集塊を示している。図 3 (a)および図 3 (b)において、白色の部分がデスミンで 標識された凝集塊の像を示しており、灰色で示す部分が DAPI染色 (核)で標識され た凝集塊の像を示している。
[0088] 〔実施例 2〕
実施例 1と同様にして解離した虹彩色素上皮細胞を、無血清培地（「DMEM/F12培 地」 invitrogen社製）、 N2サプリメント（invitrogen社製） 100分の 1量および FGF2 ( fibroblast growth factor- 2 :繊維芽細胞成長因子 _2, P印 roTech社製） 20ng/mLで 3 日間培養した後、下記（1)一（3)の組成を含む 3種類の培地中で、浮遊凝集塊培養 法による培養を 1一 2ヶ月間行った。
(1)ゥシ胎児血清（8。/。）、 EGF (20ng/mL)、および FGF2 (20ng/mL)。
(2)ゥシ胎児血清（8。/。）およびニヮトリ血清（2%)。
(3)ゥシ胎児血清（8。/。）、ニヮトリ血清（2。/。）、 EGF (20ng/mL)、および FGF2 (20ng /mL)。
[0089] 得られた凝集塊から RN Aを抽出し、 RT— PCR法を用いて内胚葉マーカーである ひフエトプロテイン、中胚葉マーカーであるミオシンおよび MEF2、外胚葉マーカー である Pax6およびチューブリン Jについて、遺伝子発現の有無を調べた。その結果、 上記（1)一（3)のどの条件下でも、上記マーカー遺伝子の発現が認められた。このこ とから、得られた凝集塊には、三胚葉すベての組織系列に分化した細胞が含まれて レ、ることがわかる。
[0090] この結果より、上記凝集塊は、主に ES細胞が分化誘導により形成し、胚のように多 種多様な分化細胞を含む胚葉体と呼ばれる細胞構造体と同様の性質を有したもの であることがわかった。虹彩色素上皮細胞は外胚葉性の細胞だが、本実施例により、 動物の虹彩色素上皮細胞由来の幹細胞から、胚葉性を超えた分化を起こすことがで きること力示された。つまり、幹細胞生産工程によって得られる細胞は、中胚葉、内胚 葉、外胚葉の何れにも分化することのできる三胚葉性分化能を有する多能性幹細胞 であることが示された。
[0091] また、図 4には、 3日間の無血清培地での培養の段階 (すなわち、幹細胞生産工程 S2)と、その後の 1一 2ヶ月の培養の段階 (幹細胞培養工程 S3)、それぞれにおける 培養細胞について、 RNAを抽出し、 RT-PCR法にて心筋細胞特異的遺伝子の発現 誘導を確認した結果を示す。
[0092] レーン 1は、 S2の幹細胞生産工程における細胞培養段階（S7)の培養 2日目のサ ンプルでの結果である。また、レーン 2は、 S3の幹細胞培養工程における、上記（3) の条件下で培養 2ヶ月後のサンプノレでの結果である。この図に示す結果から、レーン 1の幹細胞生産工程では、多能性幹細胞が組織細胞へ分化する以前の状態であり、 レーン 2の幹細胞培養工程中に、心筋細胞へと分化していることがわかる。
[0093] 〔実施例 3〕
Oct— 3/4は、全能性未分化細胞に特異的に発現する分子であり、その発現が確 認される細胞は極めて限定される（図 5に示す「マウス初期発生過程における Oct— 3 /4発現様式」を参考)。生後においては、生殖幹細胞である、精原細胞でのみ発現 すると知られており、他の体細胞組織には発現はないとされてきた。 [0094] 本実施例では、出生後のマウスおよびラットの虹彩組織およびそれから得た幹細胞 の一部における Oct— 3/4の発現を調べた。その結果を図 6 (a)、図 6 (b)に示す。な お、図 6 (a)および図 6 (b)は、本発明による方法を用いて出生後 11日および 3週間 目のラットそれぞれから得た幹細胞を、 Oct— 3/4抗体による染色および DAPI染色 にて標識を行った結果を示しており、白色が標識された部分を示している。図 6 (a)、 図 6 (b)の結果から、出生後のマウスおよびラットの虹彩組織およびそれから得た幹 細胞の一部において、〇ct_3/4遺伝子の発現、および、遺伝子産物（〇ct_3/4タ ンパク質）の発現がある（すなわち、 Oct_3/4陽性である）ことがわかる。
[0095] この結果は、虹彩という体細胞組織中にも、未分化全能性を維持する細胞が含ま れている可能性を強く示唆するものであり、これらの細胞を純化、培養し、適する条件 で分化誘導できれば、様々な組織細胞を生産することが可能となる。 ES細胞を応用 した再生医療の研究は盛んに行われているが、倫理的問題が大きい。虹彩組織であ れば、患者本人の細胞を用いることが可能であるので、 自家移植による再生医療を 実現することにつながると期待される。
[0096] 尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様また は実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような 具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記 載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。 産業上の利用の可能性
[0097] 以上のように、本発明の組織細胞の生産方法によれば、動物の虹彩色素上皮細胞 から、種々の組織細胞への分化能を有する多能性幹細胞を生産し、さらに、この多 能性幹細胞から種々の組織細胞を生産することができるという効果を奏する。この組 織細胞は、再生医療で移植源として活用すること可能である。
[0098] また、本発明の生産方法によって得られた組織細胞は、細胞移植による免疫拒絶 の問題、倫理的問題、移植源細胞の需要と供給のアンバランスの問題などを解決し 得る移植源として提供することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 動物の眼球から単離した虹彩色素上皮細胞を浮遊凝集塊培養方法により選択的 に培養することで多能性幹細胞を得る工程と、上記多能性幹細胞を培養して、当該 多能性幹細胞から組織細胞を得る工程とを含むことを特徴とする組織細胞の生産方 法。
[2] 上記動物は、ニヮトリ、マウス、ラット、ヒトのいずれかであることを特徴とする請求項 1 に記載の組織細胞の生産方法。
[3] 上記動物は、出生後の個体であることを特徴とする請求項 1または 2に記載の組織 細胞の生産方法。
[4] 上記多能性幹細胞は、 Oct— 3/4陽性であること、および/または、三胚葉性分化 能を有すること、を特徴とする請求項 1一 3の何れか 1項に記載の組織細胞の生産方 法。
[5] 上記虹彩色素上皮細胞は、動物の眼球から虹彩組織を摘出する虹彩組織摘出ェ 程と、
摘出した上記虹彩組織から虹彩色素上皮を分離する虹彩色素上皮分離工程とに より単離されることを特徴とする請求項 1一 4の何れ力 4項に記載の組織細胞の生産 方法。
[6] 上記虹彩組織摘出工程は、動物の眼球から虹彩組織のみを切除する虹彩組織切 除段階と、
上記切除した虹彩組織を酵素処理する酵素処理段階と、
上記酵素処理した虹彩組織を回復させる虹彩組織回復段階とを含んでいることを 特徴とする請求項 5に記載の組織細胞の生産方法。
[7] 上記の多能性幹細胞から組織細胞を得る工程では、上記多能性幹細胞を、分化 条件下の培養において、 1種類以上の組織細胞に分化させることを特徴とする請求 項 1一 6の何れ力 1項に記載の組織細胞の生産方法。
[8] 上記分化条件下の培養では、血清を用いて培養を行うことを特徴とする請求項 7に 記載の組織細胞の生産方法。
[9] 上記血清は、ゥシ胎児血清またはトリ血清であることを特徴とする請求項 8に記載の 組織細胞の生産方法。
[10] 上記分化条件下の培養において、さらに成長因子を用いることを特徴とする請求項
8または 9に記載の組織細胞の生産方法。
[11] 上記成長因子は、 EGFまたは FGFであることを特徴とする請求項 10に記載の組織 細胞の生産方法。
[12] 請求項 1一 11の何れ力、 1項に記載の組織細胞の生産方法により得られる組織細胞
[13] 上記組織細胞は、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚 葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞のうちの何れかであることを特 徴とする請求項 12に記載の組織細胞。
[14] 上記組織細胞は、生体内の器官を構成する組織を形成することを特徴とする請求 項 12または 13に記載の組織細胞。
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