JP2018531031A - ヒト内耳感覚上皮および感覚ニューロンを生成する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年10月21日に出願された米国特許仮出願公開第62/244,568号明細書の利点を主張し、それは、その全体が記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたDC015624、DC012617およびDC013294の下で、政府支援を受けて行われた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
ヒト多能性幹細胞の、内耳感覚上皮および感覚ニューロンへの分化を導く方法が、本明細書中で提供される。より詳細には、ヒト多能性幹細胞由来の前耳(pre-otic)上皮、耳胞、ならびに有毛細胞および支持細胞を含有する内耳感覚上皮、ならびに感覚上皮を神経支配する感覚ニューロンを含む三次元培養物を獲得する方法が、本明細書中で提供される。
本明細書中で言及する刊行物、特許および特許出願は全て、それぞれ個々の刊行物、特許および特許出願が、具体的にかつ個々に、参照により組み込まれるように示されるかのように、その全体が参照により本明細書に援用される。
例示的な実施形態では、本明細書中に提供する方法は、多能性幹細胞の内耳感覚組織への分化を促進する条件下で、ヒト多能性幹細胞を分化させることを含む。概して、内耳感覚組織の細胞は、それらの表面の表現型によって、増殖因子に応答する能力によって、および特定の細胞系列へin vivoまたはin vitroで分化することが可能であることによって同定される。
[実施例]
ヒト内耳は、機械感受性不動毛束を介して音および動きを検出するおよそ20,000個の感覚有毛細胞を含有する1。遺伝子突然変異または大きな雑音などの環境障害は、これらの有毛細胞に対して回復不能な損傷を引き起こして、眩暈または聴力損失を引き起こし得る2、3。本発明者らはこれまでに、3D培養系においてFGF、TGFβ、BMPおよびWntシグナル伝達経路の時限操作を使用して、マウス多能性幹細胞(PSC)から内耳オルガノイドをどのように生成するかを示した4〜6。本発明者らは、マウス内耳オルガノイドが、マウス内耳における自然前庭有毛細胞に類似した構造および機能を有する感覚有毛細胞を含有することを示してきた7。さらに、本発明者らの過去の見解は、BMPシグナル伝達活性化およびTGFβ阻害が非神経外胚葉を最初に特定し、続くBMP阻害およびFGF活性化が前耳の運命を誘導するという8、9、耳誘導シグナル伝達動態の実用モデルを支持した。幾つかの最近の試みにもかかわらず、ヒトPSC(hPSC)から機能性有毛細胞を獲得するための発生的に忠実なアプローチは、いまだに記載されていない10〜15。ここで、hPSCからヒト内耳組織を生成するために、本発明者らはまず、in vitroでのヒト内耳器官形成の時系列を確立させた(図1A、図1B)。内耳は、外胚葉層から生じ、ヒトでは、受胎のおよそ52日後(dpc)までに、第1の最終分化有毛細胞を生じる16。エピブラストにおける多能性細胞から始まって、内耳誘導は、外胚葉上皮の形成を伴って、およそ12dpcで開始される。続いて、上皮は、非神経外胚葉(表面外胚葉としても知られている)および神経外胚葉に分割する(図1A、図1B)。非神経外胚葉は、最終的には内耳および皮膚の表皮を生じ、したがって、本発明者らの初期の実験では、本発明者らは、非神経外胚葉上皮の標的誘導に関して、化学的に明確な3D培養系を確立しようとしており、本発明者らは、それから内耳オルガノイドを得ることができた(図1A〜図1C)。
hPSC培養:ヒトPSC(WA25hESC、継代数22〜50;mND2−0iPSC、継代数28〜46)を、確立したプロトコールに従って、組換えヒトビトロネクチン−N(Invitrogen)でコーティングした6ウェルプレート上で、100μg/ml ノルモシン(Invitrogen)を補充したEssential 8(E8)培地またはEssential 8 Flex培地(E8f)(Invitrogen)中で培養した12、13。80%コンフルエンシーで、または4〜5日毎に、EDTA溶液を使用して、1:10〜1:20の分割比で、細胞を継代培養した。細胞株はともに、WiCell Research Instituteから獲得し、検証および信頼性の記述とともに届けられた。さらなる確証および試験情報は、ワールドワイドウェブ上のwicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/wa25.cmsxおよびwicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/mirjt7i-mnd2-0.cmsxで利用可能な細胞株ウェブページに見出すことができる。細胞株は、MycoAlert Mycoplasma検出キット(Lonza)を使用して、マイコプラズマ混入を含まないと確定された。
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12日目の凝集体において、本発明者らは、耳プラコードを連想させるPAX8+PAX2+上皮のパッチを観察し、したがって、本発明者らは、耳胞形成を促進する培養条件に関してアッセイした。対照条件(DMSO)下で、本発明者らは、小胞形成を観察しなかった(データは示していない)。耳誘導は、Wntシグナル伝達に依存しているため、本発明者らは、12日目の凝集体を、12〜18日目の間に、強力なGSK3β阻害剤および公知のWntシグナル伝達アゴニスト27、CHIR99021(CHIR)で処理した。これらの条件下で、PAX8+PAX2+SOX10+小胞は、外側上皮から膨出する(凝集体1個当たりおよそ10〜30個の小胞、図4A〜図4R)。注目すべきことに、Islet1+(ISL1+)神経芽細胞は、耳胞から離層するようである(図16A〜図16B)。本発明者らはまた、DMSO処理凝集体において、およびCHIR処理凝集体の非耳内部において、神経芽細胞を確認する(図16A、矢頭)。したがって、本発明者らは、CHIR処理凝集体が、耳(即ち、小胞由来)および上鰓(即ち、上皮由来の)ニューロンの混合物を生じると仮定した(図4Aを参照)。この仮定の裏付けとして、本発明者らは、耳ニューロンのマーカーであるニューロン原性因子Neurog1(NGN1)、および上鰓ニューロンのマーカーであるNeurog2(NGN2)が、CHIR処理凝集体において発現されることを確認した(図16C)。
この実施例は、ヒト多能性幹細胞から非神経外胚葉および内耳感覚組織の形成を誘導するためのプロトコールについて記載する。下記パラグラフにおいてより詳細に記載するように、多能性幹細胞凝集体を、基底膜タンパク質に富んでいるMatrigelを含有する培地中で培養して、凝集体表面上に外胚葉発生および外胚葉上皮の産生を誘導した。次に、本発明者らは、骨形成タンパク質−4(BMP4)および小分子SB−431542(「SB」)などのトランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFβ)阻害剤の組合せ処理を使用して、上皮において非神経分化を促進した。内耳誘導をさらに開始させるために、BMPシグナル伝達を阻害して、初期BMP4およびSB処理のおよそ24時間後に、組換えFGF−2を使用して、線維芽細胞増殖因子(FGF)シグナル伝達を活性化させた。意外にも、組合せ処理プロトコールは、機能性前庭感覚上皮を含有する内耳オルガノイドへ後に発生する耳胞の自己組織化を開始させた。
ビトロネクチンでコーティングされたプレート上でのE8培地におけるES細胞培養(ステップ1〜ステップ7)。本発明者らは、フィーダーを含まない条件下でE8培地において本発明者らのhPS細胞を維持して、継代培養にEDTAを使用する(Beersらによるこれまでのプロトコールを参照)。hPS細胞維持のこの方法は、本発明者らが扱う限り、限られた時間および労力で自発的な分化を低減させるので、本発明者らは、それを好む。
hpSC培養:ヒトPSC(WA25hESC、継代数22〜50;mND2−0iPSC、継代数28〜46)を、確立したプロトコールに従って、組換えヒトビトロネクチン−N(Invitrogen)でコーティングした6ウェルプレート上で、100μg/ml ノルモシン(Invitrogen)を補充したEssential 8(E8)培地またはEssential 8 Flex培地(E8f)(Invitrogen)中で培養した12、13。80%コンフルエンシーで、または4〜5日毎に、EDTA溶液を使用して、1:10〜1:20の分割比で、細胞を継代培養した。細胞株はともに、WiCell Research Instituteから獲得し、検証および信頼性の記述とともに届けられた。さらなる確証および試験情報は、ワールドワイドウェブ上のwicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/wa25.cmsxおよびwicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/mirjt7i-mnd2-0.cmsxで利用可能な細胞株ウェブページに見出すことができる。細胞株は、MycoAlert Mycoplasma検出キット(Lonza)を使用して、マイコプラズマ混入を含まないと確定された。
ヒト組換えBMP7ストック溶液(100ng/μL):バイオセーフティキャビネットにおいて、滅菌4mM HCL 100μLを、BMP7 10μgに添加する;溶液をボルテックスして、卓上用遠心分離機において遠心沈殿させる。BMP4溶液を5μL分取量で、−20℃にて6カ月間または−80℃で1年間保管する。
hES細胞維持および継代培養:
1.バイオセーフティキャビネットにおいて、DPBS 6mL中にビトロネクチン60μLを希釈して、希釈したビトロネクチン1mLを、6−ウェル培養プレートの各ウェルに添加する。RTで少なくとも1時間インキュベートして、平均時間で、ステップ2に進む。
8.バイオセーフティキャビネットにおいて、E8培地とノルモシンとを22mLおよび10mLを含有するコニカルチューブを調製する。Y−27632 44μLを、22mLのチューブに(最終濃度20μM、これ以降、E8−Y20)、およびY−27632 10μLを、10mLのチューブに(最終濃度10μM、これ以降、E8−Y10)添加する。
20.Geltrex、FGF−2およびSB−431542を含有する分化CDM30mlを調製する。培地をRTに平衡化させる。
26. 15mlのコニカルチューブにおいて、FGF−2およびLDN−193189を、5倍濃度でCDMに添加する。例えば、本発明者らは、200ng/μl FGF−2 6.25μlおよび10mM LDN−193189 0.5μLを、CDM 5mlに添加する。
30.下記ステップを実施する約2時間前に、Geltrex 1ml分取量を冷凍庫から取り出し、それを氷上でまたは冷蔵庫内で、完全に融解させる。
39.広口P1000チップを使用して、各凝集体を、細菌皿の表面から掻把して、ピペットで吸い上げる。凝集体を2mlのチューブに移動する。
ステップ1〜ステップ7、hES細胞の維持および継代培養:30分
ステップ8〜ステップ19、hES細胞分化:凝集:40分
ステップ20〜ステップ25、分化0日目:分化CDMへの移動:1時間
ステップ26〜ステップ27、分化4日目:FGF−2およびLDN−193189の添加:20分
ステップ28〜ステップ29、分化8日目:CHIR99021の添加:20分
ステップ30〜ステップ38、分化12日目:静置ECM培養への移行:45分
ステップ39〜ステップ43、分化18日目:バイオリアクターへの移行:30分
ステップ1〜ステップ43、内耳オルガノイドを生成するための総時間:45〜60日から1年超。
Claims (14)
- ヒト前耳上皮細胞を得る方法であって、
(a)骨形成タンパク質(BMP)、およびトランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFβ)シグナル伝達の阻害剤を含む培養培地中で、約8〜約10日間、ヒト多能性幹細胞凝集体を培養するステップと、
(b)(a)の培養した凝集体を、線維芽細胞増殖因子(FGF)、およびBMPシグナル伝達の阻害剤の存在下で約4日間、さらに培養するステップと、
(b)(b)のさらに培養した凝集体を、Wntアゴニストに約4日間接触させるステップであって、それにより、接触させた凝集体内の細胞が、前耳上皮細胞へ分化する、ステップと
を含む方法。 - 前記FGFがFGF−2である、請求項1に記載の方法。
- 前記BMPが、BMP2、BMP4およびBMP7からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- BMPシグナル伝達の前記阻害剤が、LDN−193189である、請求項1に記載の方法。
- TGFβ1媒介性シグナル伝達の前記阻害剤が、SB431542およびA−83−01からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記Wntアゴニストが、GSK3の阻害剤である、請求項1に記載の方法。
- GSK3の前記阻害剤が、CHIR99021、塩化リチウム(LiCl)および6−ブロモインジルビン−3’−オキシム(BIO)からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- ヒト内耳感覚組織を含む三次元組成物を得る方法であって、
(a)細胞外マトリックスタンパク質を含む半固体培養培地中に、請求項1に記載の方法に従って得られたヒト前耳上皮細胞を包埋するステップと、
(b)包埋した前耳上皮細胞を、Wntアゴニストの存在下で約40〜約60日間、包埋した前耳上皮細胞の耳胞への自己集合を促進する条件下で培養し、それにより、ヒト内耳感覚組織を含む三次元組成物が得られる、ステップと
を含む方法。 - 前記Wntアゴニストが、GSK3の阻害剤である、請求項8に記載の方法。
- GSK3の前記阻害剤が、CHIR99021、塩化リチウム(LiCl)および6−ブロモインジルビン−3’−オキシム(BIO)からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスが、基底膜抽出物(BME)である、請求項8に記載の方法。
- 前記三次元組成物が、1つまたは複数の機械感覚細胞を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記三次元組成物が、1つまたは複数の感覚ニューロン細胞を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記三次元組成物が、機械感覚細胞とシナプス結合を形成する1つまたは複数の感覚ニューロン細胞を含む、請求項8に記載の方法。
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