KR20200088880A - 신경 세포/조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법, 및 그로부터의 세포 덩어리 - Google Patents

신경 세포/조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법, 및 그로부터의 세포 덩어리 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 다음 단계 (1) 및 (2) 를 포함하는, 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 제조 방법:
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
(2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계.

Description

신경 세포/조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법, 및 그로부터의 세포 덩어리
본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 신경 세포 또는 신경 조직, 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 제조 방법 및 그로부터의 세포 덩어리에 관한 것이다.
비특허문헌 1 에는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 마우스 육종 유래 기저막 제조물 (Matrigel) 의 존재 하에 인간 iPS 세포로부터 제조된 응집체의 현탁 배양에 의해 인간 각막 오가노이드가 생성되었다는 것이 보고되었다. 그러나, 이종 성분 및 미결정 인자에 의한 오염을 피하기 위해, 마우스 육종 유래 기저막 제조물을 사용할 필요가 없는, 신경 세포 또는 신경 조직, 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 제조하는 방법이 요구되었다.
비특허문헌 2 에는 평면 상에의 인간 iPS 세포의 접착 배양에 의해 3 차원 수정체가 생성되었다는 것이 보고되었다. 비특허문헌 3 에는 중추 신경계, 망막, 각막, 수정체 및 표피로 구성된 콜로니가 평면 상에의 인간 iPS 세포의 접착 배양에 의해 2 차원적으로 형성되었다는 것이 보고되었다. 그러나, 특정 처리된 용기를 필요로 하지 않고 용이한 스케일 업을 허용하는 현탁 배양에 의해 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 효율적으로 생성하는 방법이 요구되고 있다.
특허문헌 1 에는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 부재 하에 세포 응집체를 형성하고, 수득된 응집체를 5 nM BMP4 와 장시간 반응시키고, 무혈청 배지에서 현탁 배양을 수행함으로써, 각막, 수정체 등의 전안부 조직이 3차원적으로 형성되었다는 것이 보고되었다.
그러나, 재조합 단백질 (BMP4) 은 고가이기 때문에, 재조합 단백질을 장시간 고농도로 사용할 필요가 없는 신경 세포 또는 신경 조직, 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 제조하는 방법이 요구되고 있다.
WO 2015/020091
Foster et al. Scientific Reports, 7, 2017. Fu et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 58.1, 2017: 517-527. Hayashi et al. Nature, 531.7594, 2016: 376-380.
본 발명의 목적은 다능성 줄기 세포로부터 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 피더-프리 (feeder-free) 배양된 다능성 줄기 세포를 출발 물질로 사용하고, 사용되는 고가의 재조합 단백질의 양을 감소시키고, 더 낮은 비용으로 세포 덩어리를 생성하는, 세포 덩어리를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목표로 한다.
본 발명자들은 전술한 문제를 해결하기 위해 집중적인 연구를 수행하였으며, 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리가 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양함으로써 효율적으로 제조될 수 있음을 발견하였다. 또한, 다능성 줄기 세포를 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 피더 세포의 부재 하에서 소닉 헤지호그 (Sonic hedgehog) 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리함으로써 세포 덩어리의 생산 효율을 개선할 수 있음을 발견하였다. 또한, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가 조건을 최적화하고, 현탁 배양 개시로부터 72 시간 이내라는 최적의 첨가 시간을 확인함으로써, 이전보다 낮은 농도로 BMP4 에 의한 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 분화 유도에 성공하였다.
즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다.
[1] 다음 단계 (1) 및 (2) 를 포함하는, 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법:
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
(2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계.
[2] 다음 단계 (a), (1) 및 (2) 를 포함하는, 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법:
(a) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 2) 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에 피더 세포의 부재 하에서 다능성 줄기 세포를 유지-배양하는 단계,
(1) 단계 a 에서 유지-배양된, 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
(2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계.
[3] 단계 (2) 에서 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 단계 (1) 에서 다능성 줄기 세포의 현탁 배양의 개시로부터 0.5 시간 내지 72 시간 내에 첨가되는, 상기 [1] 또는 [2] 의 제조 방법.
[4] 단계 (2) 에서 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 단계 (1) 에서 형성된 응집체 표층의 세포의 10% 이상이 밀착 연접을 형성하는 경우에 첨가되는, 상기 [1] 또는 [2] 의 제조 방법.
[5] BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP2, BMP4, BMP7, BMP13 및 GDF7 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 단백질인 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 제조 방법.
[6] BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP4 인, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 제조 방법.
[7] 단계 (2) 에서의 현탁 배양이 BMP4 의 농도가 10 pM 내지 5 nM 인 배지에서 수행하는 상기 [6] 의 제조 방법.
[8] Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 비-정규 (non-canonical) Wnt 경로에 대항하는 억제 활성을 가진, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 제조 방법.
[9] Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 PORCN 억제제인, 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 제조 방법.
[10] PORCN 억제제가 IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWP-L6, IWP-12, LGK-974, Wnt-C59, ETC-159, 및 GNF-6231 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물인, 상기 [9] 의 제조 방법.
[11] Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 TANK 억제제인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 제조 방법.
[12] TANK 억제제가 IWR1-endo, XAV939, 및 MN-64 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물인, 상기 [11] 의 제조 방법.
[13] 단계 (1) 및/또는 단계 (2) 에서의 배양이 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 추가 존재 하에 수행되는, 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 제조 방법.
[14] TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이 Alk5/TGFβR1 억제제인, 상기 [13] 의 제조 방법.
[15] Alk5/TGFβR1 억제제가 SB431542, SB505124, SB525334, LY2157299, GW788388, LY364947, SD-208, EW-7197, A 83-01, 및 RepSox 로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물인, 상기 [14] 의 제조 방법.
[16] 단계 (a) 에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질이 SAG, 푸모르파민 (Purmorphamine), 및 GSA-10 으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물인 상기 [2] 내지 [15] 중 어느 하나의 제조 방법.
[17] 단계 (a) 에서 배지에 함유된 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도가 10 nM 내지 700 nM SAG 의 것에 상응하는 소닉 헤지호그 신호 전달 촉진 활성을 나타내는, 상기 [16] 의 제조 방법.
[18] 단계 (1) 및/또는 단계 (2) 에서의 현탁 배양이 혈청-무함유 배지를 사용하는 현탁 배양인, 상기 [1] 내지 [17] 중 어느 하나의 제조 방법.
[19] 혈청-무함유 배지가 혈청 대체물을 포함하는 혈청-무함유 배지인, 상기 [18] 에 기재된 제조 방법.
[20] 상기 [1] 내지 [19] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 수득된 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리.
[21] 하기 단계 (1) 내지 (4) 를 포함하는, 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법:
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
(2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계,
(3) 제 2 단계에서 수득된 세포 덩어리로부터 2) 비신경 상피 조직을 수집하는 제 3 단계,
(4) 제 3 단계에서 수득된 2) 비신경 상피 조직을 분산시키고 이를 평면에서 배양하여, 비신경 상피 조직 시트를 수득하는 제 4 단계.
[22] 하기 단계 (a) 및 하기 단계 (1) 내지 (4) 를 포함하는, 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법:
(a) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 2) 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에 피더 세포의 부재 하에서 다능성 줄기 세포를 유지-배양하는 단계,
(1) 단계 a 에서 유지-배양된, 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
(2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계,
(3) 제 2 단계에서 수득된 세포 덩어리로부터 2) 비신경 상피 조직을 수집하는 제 3 단계,
(4) 제 3 단계에서 수득된 2) 비신경 상피 조직을 분산시키고 이를 평면에서 배양하여, 비신경 상피 조직 시트를 수득하는 제 4 단계.
[23] 단계 (3) 에서 비신경 상피 조직을 수집하는 방법이 세포 덩어리의 동결-해동에 의해 수행되는, 상기 [21] 또는 [22] 의 제조 방법.
[24] 비신경 상피 조직이 느린 동결 방법에 따라 상기 세포 덩어리를 동결-해동하여 수집하는 것인, 상기 [23] 의 제조 방법.
[25] 2) 의 비신경 상피 조직이 각막 또는 이의 전구 조직인, 상기 [21] 내지 [24] 중 어느 하나의 제조 방법.
[26] 상기 [21] 내지 [25] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 수득된 비신경 상피 조직 시트.
[27] 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리로서,
1) 신경 세포 또는 신경 조직의 표면의 30% 이상이 2) 비신경 상피 조직으로 코팅되고,
2) 비신경 상피 조직으로 코팅된 1) 신경 세포 또는 신경 조직의 표면 영역의 적어도 일부에, 30 ㎛ 이상의 외부 상에 1) 신경 세포 또는 신경 조직과 2) 비신경 상피 조직 사이의 거리를 갖는 간극이 형성되는, 세포 덩어리.
[28] 2) 비신경 상피 조직이 심지어 배양 배지에서도 상피 세포에 의해 자율적으로 형성된 구체-유사 구조를 유지할 수 있는 비신경 상피 조직인, 상기 [27] 의 세포 덩어리.
[29] 2) 비신경 상피 조직이 상피 세포 극성을 갖는, 상기 [27] 또는 [28] 의 세포 덩어리.
[30] 2) 비신경 상피 조직이 기저막-유사 구조를 갖는, 상기 [27] 내지 [29] 중 어느 하나의 세포 덩어리.
[31] 기저막-유사 구조가 1) 신경 세포 또는 신경 조직과 2) 비신경 상피 조직 사이에 형성되는, 상기 [30] 의 세포 덩어리.
[32] 2) 비신경 상피 조직이 다열 상피인, 상기 [27] 내지 [31] 중 어느 하나의 세포 덩어리.
[33] 2) 비신경 상피 조직이 중층 상피인, 상기 [27] 내지 [31] 중 어느 하나의 세포 덩어리.
[34] 2) 비신경 상피 조직이 각막 또는 이의 전구 조직인, 상기 [27] 내지 [33] 중 어느 하나의 세포 덩어리.
[35] 1) 신경 세포 또는 신경 조직이 중추 신경계 세포 또는 조직 또는 이의 전구 조직인, 상기 [27] 내지 [34] 중 어느 하나의 세포 덩어리.
[36] 중추 신경계 세포 또는 조직이 망막인, 상기 [35] 의 세포 덩어리.
[37] 2) 비신경 상피 조직의 일부가 플라코드 (placode) 또는 플라코드 유래 조직인, 상기 [27] 내지 [36] 중 어느 하나의 세포 덩어리.
[38] 플라코드가 중층 플라코드인, 상기 [37] 의 세포 덩어리.
[39] 플라코드 유래 조직이 수정체인, 상기 [37] 의 세포 덩어리.
[40] 하기 단계를 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하는 방법으로서,
상기 [27] 내지 [39] 중 어느 하나의 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 시험 물질과 접촉시키는 단계, 및
세포 또는 조직에 대한 시험 물질의 영향을 검출하는 단계.
[41] 하기 단계를 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하는 방법:
상기 [1] 내지 [19] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 수득된 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 시험 물질과 접촉시키는 단계, 및
세포 또는 조직에 대한 시험 물질의 영향을 검출하는 단계.
[42] 하기 단계를 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하는 방법:
상기 [21] 내지 [25] 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 비신경 상피 조직 시트를 시험 물질과 접촉시키는 단계, 및
비신경 상피 조직 시트에 대한 시험 물질의 영향을 검출하는 단계.
[43] 검출하는 단계가 하기 단계를 포함하는, 상기 [40] 내지 [42] 중 어느 하나의 방법:
시험 물질과 접촉한 후 세포 덩어리 또는 비신경 상피 조직 시트를 염료로 염색하는 단계,
염색된 세포 덩어리 또는 비신경 상피 조직 시트로부터 염료를 추출하는 단계, 및
추출된 염료의 양을 정량하여 시험 물질의 자극성을 평가하는 단계.
[44] 상기 [1] 내지 [19] 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 세포 덩어리를 포함하는, 감각 기관의 장애에 기초한 질환에 대한 치료 약물.
[45] 상기 [25] 의 방법에 의해 수득된 비신경 상피 조직 시트를 포함하는, 각막의 장애에 기초한 질환에 대한 치료 약물.
[46] 비인간 동물에서 감각 기관의 장애에 기초한 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 [1] 내지 [19] 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 세포 덩어리로부터의 2) 비신경 상피 조직의 유효량을 이식이 필요한 표적에 이식하는 단계를 포함하는 치료 방법.
[47] 상기 [1] 내지 [19] 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 세포 덩어리를 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하기 위한 시약.
본 발명에 따르면, 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 다능성 줄기 세포로부터 저비용으로 효율적으로 제조할 수 있다.
또한, 신경 세포 또는 신경 조직과 비신경 상피 조직 사이에 간극을 가지며, 신경 세포 또는 신경 조직으로부터 비신경 상피 조직을 용이하게 분리 및 수집할 수 있는 세포 덩어리가 제공될 수 있다.
[도 1] 도 1 의 상부 패널은 비교예 1 의 인간 ES 세포로부터 세포 덩어리를 제조하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A 및 B 는 비교예 1 에서 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 C - M 은 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리에서 각 세포 마커의 발현 상태의 형광 면역염색에 의한 검사 결과를 나타낸다. C - F 는 각각 RLDH3, Chx10, pan-사이토케라틴 (Pan CK) 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. G - J 는 각각 Rx, Pax6, βIII 튜불린 (Tuj1) 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. K - M 은 각각 Bf1, N-캐드헤린 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다.
[도 2-1] 도 2-1 의 상부 패널은 실시예 1 의 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 제조하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A 및 B 는 실시예 2 에서 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 C - R 은 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리에서 각 세포 마커의 발현 상태의 형광 면역염색에 의한 검사 결과를 나타낸다. C 및 D 는 각각 Chx10 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. E 및 F 는 각각 RLDH3 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. G 및 H 는 각각 NCAM 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. I 및 J 는 각각 N-캐드헤린의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. K - N 은 각각 EpCAM, Six1, p63 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. O 및 P 는 각각 PDGFRβ 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. Q 및 R 은 각각 사이토케라틴 18 (CK18) 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다.
[도 2-2] 도 2-2 의 S - AN 은 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리에서 각 세포 마커의 발현 상태의 형광 면역염색에 의한 검사 결과를 나타낸다. S 및 T 는 각각 사이토케라틴 19 (CK19) 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. U 및 V 는 각각 pan-사이토케라틴의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. W - Y 은 각각 C-Maf, Sox1 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. Z - AB 는 각각 Prox1, 아세틸화 튜불린 (AcTub) 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. AC - AE 는 각각 L-Maf, 결정성 (Crystalline) αA (Cry αA) 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. AF - AH 는 각각 Emx2, N-캐드헤린의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. AI - AK 는 각각 Pax6, βIII 튜불린의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. AL - AN 은 각각 Six1, pan-사이토케라틴의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다.
[도 2-3] 도 2-3 의 AO - AV 은 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리에서 각 세포 마커의 발현 상태의 형광 면역염색에 의한 검사 결과를 나타낸다. AO - AP 는 각각 EpCAM 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. AQ - AR 은 각각 라미닌의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. AS - AV 는 각각 RLDH3, Chx10, pan-사이토케라틴의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. 하부 패널 AW 는 배양 28 일에 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 구조를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다.
[도 3] 도 3A - C 는 실시예 2 에서 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리에서 각 세포 마커의 발현 상태의 형광 면역염색에 의한 검사 결과를 나타낸다. A - C 는 각각 N-캐드헤린 및 EpCAM 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. 도 3D 의 하부 패널은 형광 면역염색에 의해 수득된 이미지의, 분석 소프트웨어를 사용한, 측정 결과를 나타낸다.
[도 4] 도 4 의 상부 패널은 실시예 3 에서 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 제조하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A - C 는 실시예 3 에서 현탁 배양 개시 90 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 D - N 은 현탁 배양 개시 90 일 후 세포 덩어리에서 각 세포 마커의 발현 상태의 형광 면역염색에 의한 검사 결과를 나타낸다. D - K 는 각각 사이토케라틴 5 (CK5), 사이토케라틴 12 (CK12) 및 라미닌 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. L - N 은 각각 Mucin4 (MUC4) 및 Pax6 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다.
[도 5] 도 5 의 상부 패널은 실시예 4 에서 BMP4 의 첨가 시간을 변경함에 의한 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 제조하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A - F 는 실시예 2 에서 현탁 배양 개시 10 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. 현탁 배양 개시 10 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지의 다이어그램: A: BMP4 를 첨가하지 않은 대조군 세포, B: 현탁 배양 개시와 동시에 BMP4 를 첨가한 세포, 및 C - F: 현탁 배양 개시 1, 2, 3 및 6 일 후, 각각 BMP4 를 첨가한 세포.
[도 6] 도 6 의 상부 패널은 실시예 5 에서 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법에서 세포 응집체를 제조하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A 및 B 는 실시예 5 에서 현탁 배양 개시 2 및 3 일 후, 각각 세포 응집체의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 C - J 는 현탁 배양 개시 2 또는 3 일 후 세포 응집체에서 각 세포 마커의 발현 상태의 형광 면역염색에 의한 검사 결과를 나타낸다. C 및 D 는 각각 현탁 배양 개시 2 일 후 세포 응집체에서 ZO-1 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. G 및 H 는 각각 현탁 배양 개시 2 일 후 세포 응집체에서 N-캐드헤린 (NCad) 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. E 및 F 는 각각 현탁 배양 개시 3 일 후 세포 응집체에서 ZO-1 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. I 및 J 는 각각 현탁 배양 개시 3 일 후 세포 응집체에서 N-캐드헤린 (NCad) 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다.
[도 7] 도 7 의 상부 패널은 실시예 6 에서 첨가된 BMP4 의 농도를 변경함에 의한 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 제조하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A - H 는 실시예 6 에서 현탁 배양 개시 10 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. 현탁 배양 개시 10 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지의 다이어그램: A: BMP4 를 첨가하지 않은 대조군 세포, 및 B - H: 현탁 배양 개시 2 일 후 다양한 농도 (0.1 nM, 0.25 nM, 0.5 nM, 0.75 nM, 1 nM, 1.5 nM, 5 nM) 로 BMP4 를 첨가하고 현탁 배양을 추가로 수행하여 수득된 세포.
[도 8] 도 8 의 상부 패널은 실시예 7 에서 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 시 각각의 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 효과를 시험하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A - K 는 실시예 7 에서 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. 현탁 배양 개시 10 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지의 다이어그램: A: Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 첨가하지 않은 대조군, 및 B - K: 현탁 배양 개시시 다양한 농도로 다양한 종류의 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 첨가하고 현탁 배양을 추가로 수행하여 수득된 세포.
[도 9] 도 9 의 상부 패널은 실시예 8 에서 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 시 현탁 배양 개시 전 화합물로의 전처리 효과를 시험하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A - C 는 실시예 8 에서 현탁 배양 개시 15 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. A 는 전체 원주의 80% 이상이 비신경 상피로 덮여있는 거의 구형 등급 1 세포 덩어리의 예이고, B 는 전체 원주의 80% 내지 40% 가 비신경 상피로 덮여있거나 불규칙한 형태를 가진 등급 2 세포 덩어리의 예이고; C 는 세포 덩어리 표면 상의 비신경 상피의 비율이 40% 이하인 등급 3 세포 덩어리의 예이다. D 는 각 조건 하에서 화합물 전처리 후 형성된 세포 덩어리의 품질 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 10] 도 10 의 상부 패널은 실시예 9 에서 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 제조하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A 는 실시예 9 에서 현탁 배양 개시 10 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. B 및 C 는 실시예 9 에서 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 D - S 는 현탁 배양 개시 28 일 후 세포 덩어리에서 각 세포 마커의 발현 상태의 형광 면역염색에 의한 검사 결과를 나타낸다. D - G 는 각각 Six1, NCAM 및 E-캐드헤린의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. H - K 는 각각 RLDH3, Chx10 및 pan-사이토케라틴의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. L - O 는 각각 Pax6, Rx 및 βIII 튜불린의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다. P - S 는 각각 p63, N-캐드헤린 및 EpCAM 의 염색 이미지 및 이의 핵 염색 이미지를 나타낸다.
[도 11] 도 11 의 상부 패널은 실시예 10 에서 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 제조하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널은 실시예 10 의 세포 덩어리의 도립 현미경에 의한 명시야 관찰 이미지를 보여주는 다이어그램이며, 여기서 A 는 현탁 배양 개시 34 일 후의 세포 덩어리이고, B 는 A 로부터 단리된 비신경 상피 조직 단독이고, C 는 효소 처리에 의해 단일 세포로 전환되고 세포 배양 디쉬에 시딩된 후 3 일째의 단리된 비신경 상피 조직이다.
[도 12] 도 12 의 상부 패널은 실시예 11 에서 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 제조하는 절차를 개략적으로 나타내는 다이어그램이다. 하부 패널 A 는 실시예 11 에서 GHS 분류 1 및 2 의 화합물로 세포 덩어리를 처리한 후 플루오레세인 염색법에 의한 세포 덩어리의 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
1. 정의
본 발명에서, "줄기 세포" 는 분화능 및 분화능을 유지하는 증식 능력 (특히 자가-재생 능력) 을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기 세포는 분화능에 따라 다능성 (pluripotent) 줄기 세포, 복능성 (multipotent) 줄기 세포, 단능성 (unipotent) 줄기 세포 등과 같은 소집단을 포함한다. 다능성 줄기 세포는 시험관 내에서 배양되고 살아있는 유기체 (3 가지 배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 으로부터 유래된 조직) 를 구성하는 임의의 세포로 분화할 수 있는 능력 (다능성) 을 가질 수 있는 줄기 세포를 지칭한다. 복능성 줄기 세포는 모든 종류는 아니지만 복수 종류의 조직 또는 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 단능성 줄기 세포는 특정 조직 또는 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다.
다능성 줄기 세포는 수정란, 클론 배아, 생식 줄기 세포, 조직 내 줄기 세포, 체세포 등으로부터 유도될 수 있다. 다능성 줄기 세포의 예는 배아 줄기 세포 (ES 세포), EG 세포 (배아 생식 세포), 및 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 를 포함한다. 중간엽 줄기 세포 (MSC) 로부터 수득된 뮤즈 (Muse) 세포 (다중 계통 분화 스트레스 지속 세포) 및 생식 세포 (예를 들어, 고환) 로부터 생성된 GS 세포가 또한 다능성 줄기 세포에 포함된다. 배아 줄기 세포는 1981 년에 처음 확립되었으며, 1989 년부터 녹아웃 마우스의 생성에도 적용되고 있다. 1998 년에, 인간 배아 줄기 세포가 확립되었으며, 이는 또한 재생 의학에 이용되고 있다. ES 세포는 피더 세포 상에 또는 LIF 를 함유하는 배지에 내부 세포 덩어리를 배양함으로써 생성될 수 있다. ES 세포의 제조 방법은 예를 들어 WO 96/22362, WO 02/101057, US 5,843,780, US 6,200,806, 및 US 6,280,718 에 기재되어있다. 배아 줄기 세포는 소정의 기관에서 구할 수 있거나, 시판 제품을 구입할 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은 교토 대학의 Institute for Frontier Medical Sciences 로부터 입수할 수 있다. 마우스 배아 줄기 세포인 EB5 세포는 Incorporated Administrative Agency RIKEN 으로부터, 마우스 배아 줄기 세포인 D3 세포주는 ATCC 로부터 입수할 수 있다. ES 세포 중 하나인 핵 전이 ES 세포 (ntES 세포) 는 세포핵을 제거한 난자에 체세포의 세포 핵을 이식함으로써 생성된 클론 배아로부터 성립될 수 있다.
EG 세포는 mSCF, LIF 및 bFGF 를 함유하는 배지에서 원시 생식 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다 (Cell, 70: 841-847, 1992).
본 발명에서 "유도된 다능성 줄기 세포" 는 공지된 방법 등에 의해 체세포를 재프로그래밍함으로써 다능성을 갖도록 유도된 세포이다. 구체적으로, Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, 및 Esrrb 를 포함하는 재프로그래밍 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 유전자의 조합의 발현에 의해 섬유아세포 및 말초 혈액 단핵구 등의 분화된 체세포를 재프로그래밍함으로써 다능성을 갖도록 유도된 세포를 언급할 수 있다. 유도된 다능성 줄기 세포는 2006 년 마우스 세포에서 Yamanaka 등에 의해 확립되었다 (Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). 2007 년에, 유도된 다능성 줄기 세포는 또한 인간 섬유아세포로부터 확립되었으며, 배아 줄기 세포의 것과 유사한 다능성 및 자가-재생 능력을 갖는다 (Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106). 유전자 발현에 의한 직접 재프로그래밍에 기초한 제조 방법 이외에, 화합물 등의 첨가에 의해 체세포로부터 유도된 만능 줄기 세포를 수득할 수도 있다 (Science, 2013, 341, pp. 651-654).
유도된 다능성 줄기 세포를 생성하는데 사용되는 체세포는 특별히 제한되지 않지만, 조직-유래 섬유아세포, 혈액 계통 세포 (예를 들어, 말초 혈액 단핵구 세포, T 세포), 간세포, 췌장 세포, 장 상피 세포 및 평활근 세포가 언급될 수 있다.
유도된 다능성 줄기 세포가 몇몇 종류의 유전자 (예를 들어, Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Myc 의 4 가지 인자) 의 발현에 의해 재프로그래밍함으로써 생성될 때, 유전자 발현을 위한 수단은 특별히 제한되지 않는다. 상기 수단의 예는 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터) 를 사용한 감염 방법, 플라스미드 벡터 (예를 들어, 플라스미드 벡터, 에피솜 벡터) 를 사용한 유전자 도입 방법 (예를 들어, 인산칼슘 방법, 리포펙션 방법, 레트로넥틴 방법, 전기천공 방법), RNA 벡터를 이용한 유전자 도입 방법 (예를 들어, 인산칼슘 방법, 리포펙션 방법, 전기천공 방법), 및 단백질의 직접 주사 방법을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 ES 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포이다.
복능성 줄기 세포로서, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포와 같은 조직 줄기 세포 (조직 내의 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포 또는 체세포성 줄기 세포라고도 불림) 가 언급될 수 있다.
유전자 변형된 다능성 줄기 세포는 예를 들어 상동 재조합 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 변형될 염색체 상의 유전자의 예는 세포 마커 유전자, 조직적합성 항원 유전자, 신경 세포 장애로 인한 질환과 관련된 유전자 등을 포함한다. 염색체 상의 표적 유전자는 문헌 Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); 등에 기재된 방법을 사용하여 변형될 수 있다.
구체적으로, 예를 들어 변형될 표적 유전자의 게놈 유전자 (예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직적합성 항원 유전자, 질환-관련 유전자 등) 를 단리하고, 단리된 게놈 유전자를 사용하여 표적 유전자의 상동 재조합에 사용되는 표적화 벡터를 생성한다. 생성된 표적화 벡터를 줄기 세포에 도입하고 표적 유전자와 표적화 벡터 사이에 상동 재조합을 나타내는 세포를 선택함으로써, 염색체 상에 변형된 유전자를 갖는 줄기 세포를 제조할 수 있다.
표적 유전자의 게놈 유전자를 단리하는 방법의 예는 문헌 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) 등에 기재된 공지된 방법을 포함한다. 표적 유전자의 게놈 유전자는 또한 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems 제조), Universal GenomeWalker Kits (CLONTECH 제조) 등을 사용하여 단리할 수 있다.
표적 유전자의 상동 재조합에 사용되는 표적화 벡터의 생성, 및 상동 재조합체의 효율적인 선택은 문헌 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995) 등에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 표적화 벡터로서, 대체 유형 또는 삽입 유형 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 선택 방법으로서는, 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네가티브 선택, polyA 선택 등의 방법을 사용할 수 있다.
선택된 세포주로부터 원하는 상동 재조합체를 선택하는 방법의 예는 게놈 DNA 에 대한 서던 하이브리드화 방법, PCR 방법 등을 포함한다.
본 발명에서 "포유동물" 은 설치류, 유제류, 육식동물 및 영장류를 포함한다. 설치류는 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니피그를 포함한다. 유제류는 돼지, 소, 염소, 말 및 양을 포함한다. 육식동물은 개, 및 고양이를 포함한다. 본 발명에서 "영장류" 는 영장류에 속하는 포유동물을 지칭하며, 영장류는 여우 원숭이, 로리, 투 파이 등과 같은 원숭이 아목과, 원숭이, 유인원 및 인간과 같은 참원숭이 아목을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 다능성 줄기 세포는 포유동물 다능성 줄기 세포, 바람직하게는 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트) 또는 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이) 의 다능성 줄기 세포, 가장 바람직하게는 인간 다능성 줄기 세포이다.
본 발명에서 "신호 전달" 은 세포막 등에 존재하는 수용체 단백질이 화학 물질 등에 결합하여 구조적 변화를 일으키고, 이는 결국 세포 내에서 자극으로서 순차적으로 전달되어 결국은 유전자 발현, 채널 개방 등과 같은 반응을 유발하는 과정 및 메커니즘과 같은, 생화학적 자극에 대한 정보 전달, 증폭 및 처리 및 반응에 대한 세포의 메커니즘을 지칭한다.
본 발명에서 "세포 접착" 은 세포-세포 접착 및 세포-세포외 매트릭스 접착을 말한다. 시험관 내 인공 배양 환경 하에서 발생하는 배양 용기 등에 대한 세포의 접착도 세포 접착에 포함된다. 세포 접착의 종류로서는, 고착 연접, 통신 연접, 폐색 연접을 들 수 있다.
본 발명에서 "밀착 연접 (tight junction)" 은 세포-세포 접착 중에서, 척추동물 및 척색동물에서 발견되는 폐색 연접을 말한다. 밀착 연접은 상피 세포 사이에 형성된다. 본 발명의 제조 방법 등에 의해 생성된 생물학적 기원의 조직 또는 세포 덩어리에 밀착 연접이 존재하는지 여부는, 예를 들어 밀착 연접의 구성 성분에 대한 항체 (항-클라우딘 항체, 및 항-ZO-1 항체) 를 사용하여 면역조직화학 등과 같은 방법에 의해 검출될 수 있다.
본 발명에서 "현탁 배양" 또는 "현탁 배양 방법" 은 배양 배지에 세포, 세포 응집체 또는 세포 덩어리가 현탁된 상태를 유지하면서 배양하는 것 및 배양을 수행하는 방법을 말한다. 즉, 현탁 배양은 세포, 세포 응집체 또는 세포 덩어리가 배양 용기 등에 접착되지 않은 조건 하에서 수행되고, 배양 용기 등에 접착될 수 있는 조건 하에서 배양 (접착 배양 또는 접착 배양 방법) 은 현탁 배양 카테고리에 포함되지 않는다. 이 경우, 세포의 부착은 세포 부착의 하나의 유형인 강한 세포-기질 연접이 세포, 세포 응집체 또는 세포 덩어리와 배양 용기 사이에 형성됨을 의미한다. 더욱 특히, 현탁 배양은 세포, 세포 응집체 또는 세포 덩어리와 배양 용기 사이에 강한 세포-기질 연접이 형성되지 않은 조건 하에서의 배양을 의미하고, 부착 배양은 세포, 세포 응집체 또는 세포 덩어리와 배양 용기 등 사이에 강한 세포-기질 연접이 형성되는 조건 하에서의 배양을 말한다.
현탁 배양 중의 세포 응집체 또는 세포 덩어리에서, 세포와 세포 사이에 평면 부착이 형성된다. 현탁 배양 중의 세포 응집체 또는 세포 덩어리에서, 세포-기질 연접은 배양 용기 등과는 거의 형성되지 않으며, 심지어 형성되더라도 그 기여는 적다. 일부 구현예에서, 내생 세포-기질 연접이 응집체 또는 세포 덩어리 내부에 존재할 수 있으나, 세포-기질 연접은 배양 용기 등과는 거의 형성되지 않으며, 심지어 형성되더라도 그 기여는 적다.
세포와 세포 사이의 평면 부착은 세포가 평면을 통해 또다른 세포에 부착하는 것을 의미한다. 더욱 특히, 세포와 세포 사이의 평면 부착은, 예를 들어, 세포의 표면적의 1% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 이상이 또다른 세포의 표면에 부착하는 것을 의미한다. 세포의 표면은 막을 염색하는 시약 (예를 들어, DiI) 으로의 염색, 세포 부착 인자의 면역염색 (예를 들어, E-캐드헤린 및 N-캐드헤린) 에 의해 관찰될 수 있다.
현탁 배양을 수행할 때 사용되는 배양 용기는 이것이 "현탁 중 배양" 을 가능하게 한다면 특별히 제한되지 않으며, 당업자는 이를 적절히 결정할 수 있다. 이러한 배양 용기의 예는 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 스피너 플라스크, 및 롤러 병을 포함한다. 현탁 배양을 가능하게 하기 위해, 이들 배양 용기는 바람직하게는 비-세포-접착성이다. 유용한 비-세포-접착성 배양 용기는 표면이 세포에 대한 접착성을 개선하기 위해 인위적인 처리 (예를 들어, 기저막 제조물, 라미닌, 엔탁틴, 콜라겐 및 젤라틴과 같은 세포외 매트릭스로의 표면 처리, 또는 폴리리신, 및 폴리오르니틴 등의 중합체로의 코팅 처리, 또는 양전하 처리 등) 등을 받지 않은 배양 용기를 포함한다. 비-세포-접착성 배양 용기로서, 표면이 세포에 대한 접착성을 감소시키기 위해 인공적으로 처리된 (예를 들어, MPC 중합체 등으로의 초친수성 처리, 및 단백질 저 흡착 처리) 배양 용기 등을 사용할 수 있다. 스피너 플라스크, 및 롤러 병을 이용한 롤러 배양이 수행될 수 있다. 배양 용기의 배양 표면은 평평한 바닥일 수 있거나 오목부 및 볼록부를 가질 수 있다.
본 발명에서 세포 배양에 사용되는 배지는 기초 배지로서 동물 세포를 배양하는 데 일반적으로 사용되는 배지로부터 제조될 수 있다. 기초 배지의 예는 BME 배지, BGJb 배지, CMRL1066 배지, Glasgow MEM 배지, 개선된 MEM 아연 옵션 배지, IMDM 배지, Medium199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F-12 배지, IMDM/F12 배지, Ham 배지, RPMI1640 배지, Fischer 배지 및 이들의 혼합 배지 등의 동물 세포 배양에 사용될 수 있는 배지를 포함한다.
다능성 줄기 세포를 배양하기 위해, 상기 언급된 기초 배지를 기본으로서 사용하여 다능성 줄기 세포를 배양하기 위한 배지, 바람직하게는 배아 줄기 세포 및/또는 유도된 다능성 줄기 세포를 위한 공지된 배지, 피더 부재 하에서 다능성 줄기 세포를 배양하기 위한 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, Essential 8 배지, TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지 및 StemFit 배지와 같은 피더-프리 배지가 언급될 수 있다.
본 발명에서 "무혈청 배지" 는 조정되지 않거나 정제되지 않은 혈청이 없는 배지를 의미한다. 본 발명에서, 조정되지 않은 또는 정제되지 않은 혈청이 함유되어 있지 않는 한, 정제된 혈액 유래 성분 및 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 성장 인자) 을 함유하는 배지도 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물의 예에는 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3 '티올글리세롤 또는 이들의 등가물 등을 적절하게 함유하는 것이 포함된다. 이러한 혈청 대체물은 예를 들어 WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 혈청 대체물은 시판 제품일 수 있다. 이러한 시판되는 혈청 대체물의 예는 KnockoutTM 혈청 대체물 (Life Technologies: 이하 종종 KSR 로 언급됨), 화학적으로 정의된 지질 농축물 (Chemically Defined Lipid Concentrated) (Life Technologies 사제) 및 GlutamaxTM (Life Technologies 사제), B27 (Life Technologies 사제) 및 N2 (Life Technologies 사제) 을 포함한다.
현탁 배양에 사용되는 무혈청 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기 염 등을 적절하게 함유할 수 있다.
제조의 번거로움을 피하려면 적절한 양 (예를 들어, 약 0.5% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 20%) 의 시판되는 KSR (Life Technologies 사제) 이 보충된 무혈청 배지 (예를 들어, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물, 5% KSR 및 450 μM 1-모노티오글리세롤이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물의 배지) 가 이러한 무혈청 배지로서 사용될 수 있다. 또한, KSR 에 상당하는 제품으로서, JP-A-2001-508302 에 개시된 배지가 언급될 수 있다.
본 발명에서 "혈청-함유 배지" 는 조정되지 않거나 정제되지 않은 혈청을 함유하는 배지를 의미한다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 1-모노티오글리세롤, 피루브산, 완충제, 무기 염 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 매트리겔 (Matrigel) 등과 같은 기저막 제조물을 사용하여 다능성 줄기 세포가 망막 조직 등으로 분화되도록 유도될 때, 혈청-함유 배지가 사용될 수 있다 (Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)).
본 발명에서 배양은 바람직하게는 제노-프리 (xeno-free) 조건 하에서 수행된다. "제노-프리" 는 배양될 세포와 상이한 종으로부터 유래된 성분을 제거하는 조건을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 배지는 바람직하게는 화학적으로 결정되지 않은 성분으로의 오염을 피하기 위해 화학적으로 결정된 성분을 함유하는 배지 (화학적으로 정의된 배지 (Chemically defined medium); CDM) 이다.
본 발명에서 "기저막 유사 구조"는 세포외 매트릭스로 구성된 박막 구조를 의미한다. 기저막은 생체 내 상피 세포의 기저 측에 형성된다. 기저막의 성분은 IV 형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (펄레칸), 엔탁틴/니도겐, 사이토카인, 성장 인자 등을 포함한다. 기저막이 생체로부터 유래된 조직에 및 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 세포 덩어리에 존재하는 지의 여부는 예를 들어, PAM 염색 등과 같은 조직 염색, 및 기저막의 구성 성분에 대항하는 항체 (항-라미닌 항체, 항-IV 형 콜라겐 항체 등) 를 이용한 면역조직화학 법 등의 방법 등에 의해 결정된다.
본 발명에서 "기저막 제조물" 은 기저막 형성능을 갖는 원하는 세포가 시딩되고 배양될 때, 상피 세포-유사 세포 형태, 분화, 증식, 운동성, 기능적 발현 등을 제어하는 기능을 갖는 기저막 구성 성분을 함유하는 것이다. 예를 들어, 본 발명에 의해 생성된 세포 및 조직이 분산되고 추가로 접착 배양에 적용될 때, 이들은 기저막 제조물의 존재 하에서 배양될 수 있다. 본원에 사용된 "기저막 구성 성분" 은 동물 조직에서 상피 세포 층과 간질 세포 층 등 사이에 존재하는 얇은 막으로서 세포외 매트릭스 분자를 말한다. 기저막 제조물은 예를 들어, 기저막을 통해 지지체에 부착된 세포를 제거하고 세포의 지질을 용해시키는 능력을 갖는 용액, 알칼리성 용액 등을 사용하여 지지체로부터 기저막을 형성하는 능력을 가짐으로써 제조될 수 있다. 기저막 제조물의 예는 기저막 제품으로 시판되는 제품 (예를 들어, MatrigelTM (Becton, Dickinson and Company 사제: 이하 종종 Matrigel 로서 언급됨)) 및 GeltrexTM (Life Technologies 사제), 및 기저막 성분으로서 공지된 세포외 매트릭스 분자 (예를 들어, 라미닌, IV 형 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴) 를 포함한다.
본 발명에 있어서는, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종 등의 조직 또는 세포로부터 추출되어 용해되는 등의 매트리겔 (Matrigel) (Corning 사제) 등의 기저막 제조물을 세포 및 조직 배양 용으로 사용할 수 있다. 유사하게, 세포 배양에 사용되는 기저막 성분으로서, 인간 가용화 양막 (Bioresource Application Institute, Co. 사제), HEK293 세포에 의해 제조된 인간 재조합 라미닌 (BioLamina 사제), 인간 재조합 라미닌 단편 (Nippi, Inc 사제), 및 인간 재조합 비트로넥틴 (Thermo Fisher 사제) 가 또한 사용될 수 있다. 상이한 유기체 종으로부터 유래된 성분으로의 오염을 피하고 감염의 위험을 피하기 위해, 성분이 명확한 재조합 단백질이 바람직하다.
본 발명에서, "물질 X 를 함유하는 배지" 및 "물질 X 의 존재 하에서" 는 각각 외인성 물질 X 이 보충된 배지 또는 외인성 물질 X 를 포함하는 배지, 및 외인성 물질 X 의 존재 하에서를 말한다. 외인성 물질 X 는 예를 들어, 배지에 존재하는 세포 또는 조직에 의해 내생적으로 발현, 분비 또는 생성되는 물질 X 인 내인성 물질 X 와 구별된다.
예를 들어, "소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지" 는 외인성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질이 보충된 배지 또는 외인성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지이다.
본 발명에서, "피더 세포" 는 줄기 세포를 배양할 때 공존하는 줄기 세포 이외의 세포를 말한다. 미분화 상태를 유지하면서 다능성 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 피더 세포의 예는 마우스 섬유아세포 (MEF), 인간 섬유아세포 및 SNL 세포를 포함한다. 피더 세포로서는, 성장 억제 처리된 피더 세포가 바람직하다. 성장 억제 처리의 예는 성장 억제제 (예를 들어, 미토마이신 C) 로의 처리, 및 UV 조사를 포함한다. 미분화 상태를 유지하면서 다능성 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 피더 세포는 체액 인자 (바람직하게는 미분화 상태를 유지하기 위한 인자) 의 분비, 또는 세포 접착 (세포외 매트릭스) 을 위한 스캐폴드의 생성에 의한 다능성 줄기 세포의 미분화 상태의 유지에 기여한다.
본 발명에서, 세포의 "응집체 (aggregate)" 는 배지에 분산된 세포의 집합에 의해 형성된 뭉치 (clump) 를 말하며, 여기서 세포는 서로 접착하고 있다. 세포 뭉치, 배아체, 구체 (sphere), 회전타원체 (spheroid) 및 오르가노이드 (organoid) 도 세포 응집체에 포함된다. 바람직하게는, 세포의 응집체에서 세포와 세포 사이에 평면 부착이 형성된다. 일부 구현예에서, 세포는 종종 일부 또는 모든 응집체에서 세포-세포 연접 및/또는 세포 접착, 예를 들어 접착 연접을 형성한다. 본 발명에서 "응집체" 는 구체적으로 후술하는 "2. 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법" 의 제 1 단계에서 생성된 응집체를 포함하며, 이것은 현탁 배양 개시시에 분산된 세포에 의해 형성된다.
본 발명에서, "균일 응집체" 는 복수의 응집체가 배양될 때 각각의 응집체의 크기가 일정하고, 응집체의 크기가 최대 직경의 길이에 의해 평가될 때 최대 직경의 길이의 편차가 작은 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 이는 전체 응집체 집단에서 응집체의 75% 이상이 세포 덩어리 집단에서 최대 직경의 평균 ± 100%, 바람직하게는 평균 ± 50%, 더욱 바람직하게는 평균 ± 20% 내에 있다는 것을 의미한다.
본 발명에서 "균일 응집체를 형성하는 것” 은 세포 응집체를 형성하도록 세포를 수집하고 현탁액에서 응집체를 배양할 때, 세포 응집체의 크기를 균일하게 형성하도록 주어진 수의 분산된 세포를 신속하게 응집시키는 것을 의미한다.
"분산" 은 효소 처리 및 물리적 처리와 같은 분산 처리에 의해 세포 또는 조직을 소세포 잔해물 (2 개 이상 세포 및 100 개 이하 세포, 바람직하게는 50 개 이하 세포) 또는 단일 세포로 분리시키는 것을 말한다. 주어진 수의 분산된 세포는 특정 수의 세포 잔해물 또는 단일 세포의 모음이다.
다능성 줄기 세포를 분산시키는 방법의 예는 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리, 및 세포 보호제 첨가 처리를 포함한다. 이들 처리는 조합하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포 분산액 처리가 수행된 다음 기계적 분산 처리가 수행된다.
기계적 분산 처리 방법으로서는, 피펫팅 처리 또는 스크래퍼에 의한 스크래핑 조작을 언급할 수 있다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로서는, 트립신, 콜라게나제, 히알루로니다제, 엘라스타제, 프로나제, DNase, 및 파파인 등의 효소 및 에틸렌디아민테트라아세트산 등의 킬레이트제 중 임의의 것을 함유하는 용액을 언급할 수 있다. Accumax (Innovative cell technologies 사제) 및 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 등의 시판되는 세포 분산액도 사용할 수 있다.
세포 보호제 첨가 처리에 사용되는 세포 보호제로서는, FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, 헤파린, ROCK 억제 물질, 혈청 또는 혈청 대체물을 언급할 수 있다. 바람직한 세포 보호제로서는 ROCK 억제제를 언급할 수 있다.
예를 들어, 다능성 줄기 세포를 분산시키는 방법은 세포 보호제로서 ROCK 억제 물질의 존재 하에 다능성 줄기 세포의 콜로니를 세포 분산액 (Accumax) 으로 처리하고, 이를 피펫팅에 의해 추가로 분산시키는 단계를 수반하는 방법을 포함한다.
본 발명의 제조 방법에서, 다능성 줄기 세포를 신속하게 수집함으로써 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성하는 것이 바람직하다. 다능성 줄기 세포의 응집체가 이러한 방식으로 형성될 때, 형성된 응집체로부터 유도되고 분화된 세포에서 우수한 재현성을 갖는 상피 유사 구조가 형성될 수 있다. 응집체를 형성하기 위한 실험 조작의 예는 작은 웰을 갖는 플레이트 (예를 들어, 평평한 바닥을 기준으로 계산할 때, 베이스 영역이 약 0.1-2.0 cm2 인 웰을 갖는 플레이트), 마이크로포어 등을 사용하여 세포를 작은 공간에 유지하는 방법, 소형 원심분리 튜브를 사용하여 단시간 동안 원심분리에 의해 세포를 응집시키는 방법을 포함한다. 작은 웰을 갖는 플레이트로서는, 예를 들어 24 웰 플레이트 (평평한 바닥을 기준으로 계산할 때, 약 1.88 cm2 의 면적), 48 웰 플레이트 (평평한 바닥을 기준으로 계산할 때, 약 1.0 cm2 의 면적), 96 웰 플레이트 (평평한 바닥을 기준으로 계산할 때, 약 0.35 cm2 의 면적, 약 6-8 mm 의 내경) 및 384 웰 플레이트를 언급할 수 있다. 96 웰 플레이트가 바람직하다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 형상으로서는, 웰을 위에서 볼 때의 바닥면의 형상이, 예를 들어 다각형, 직사각형, 타원, 진원, 바람직하게는 진원이다. 웰을 측면에서 볼 때의 작은 웰을 갖는 플레이트의 형상으로서는, 바닥면의 형상은 바람직하게는 외부 둘레가 높고 내부 오목부가 낮은 구조로서, 이것은 예를 들어 U-바닥, V-바닥 또는 M-바닥, 바람직하게는 U-바닥 또는 V-바닥, 가장 바람직하게는 V-바닥이다. 작은 웰을 갖는 플레이트로서, 오목한 볼록부가 있거나 바닥면에 움푹 패인 세포 배양 디쉬 (예를 들어, 60 mm-150 mm 디쉬, 배양 플라스크) 가 또한 사용될 수 있다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 바닥면은 바람직하게는 비-세포-접착성 바닥면, 바람직하게는 상기 언급된 비-세포-접착성-코팅된 바닥면이다.
다능성 줄기 세포의 응집체의 형성, 및 응집체를 형성하는 각 세포 내 상피-유사 구조의 형성은 응집체의 크기 및 세포 수, 응집체의 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미시적 형태 및 이의 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 이의 균일성, 분화 마커의 발현의 제어 및 이의 동기성, 응집체 사이의 분화 효율의 재현성 등에 근거하여 결정될 수 있다.
본 발명에서 "조직" 은 상이한 형태 및 특성을 갖는 복수 유형의 세포가 주어진 패턴으로 입체적으로 배열된 구조를 갖는 세포 집단의 구조를 말한다.
본 발명에서, "신경 조직" 은 발생 단계 또는 성체 단계에서 대뇌, 중뇌, 소뇌, 척수, 망막, 말초 신경 등을 포함하는 신경 세포로 구성된 조직을 말한다. 신경 조직은 종종 층 구조를 갖는 상피 구조 (신경상피) 를 형성하고, 신경 조직에서의 신경상피의 양은 광학 현미경을 사용하는 명시야 관찰에 의해 평가될 수 있다.
본 발명에서, "신경 세포" 는 외배엽 유래의 조직에서 표피 계통 세포 이외의 세포를 말한다. 즉, 신경 전구 세포, 뉴런 (뉴런 세포), 아교 세포, 신경 줄기 세포, 뉴런 전구 세포, 아교 전구 세포 등과 같은 세포를 포함한다. 신경 세포는 또한 하기 언급된 망막 조직 (망막 세포), 망막 전구 세포, 망막 층-특이적 뉴런, 신경 망막 세포 및 망막 색소 상피 세포를 구성하는 세포를 포함한다. 신경 세포는 마커로서 Nestin, TuJ1, PSA-NCAM, N-캐드헤린 등을 사용하여 식별될 수 있다.
뉴런은 신경 회로를 형성하고 신호 전달에 기여하는 기능성 세포이며, TuJ1, Dcx, 및 HuC/D 와 같은 미성숙 뉴런 마커 및/또는 Map2, 및 NeuN 과 같은 성숙 뉴런 세포 마커의 발현을 지표로서 이용하여 식별될 수 있다.
아교 세포로는 성상세포, 희소돌기아교세포 및 뮐러 아교세포를 언급할 수 있다. 성상세포 마커로서, GFAP 가 언급될 수 있으며; 희소돌기아교세포 마커로서 O4 가 언급될 수 있고; 뮐러 아교세포 마커로서, CRALBP 등이 언급될 수 있다.
신경 줄기 세포는 뉴런 및 아교 세포로의 분화능 (다능성), 및 다능성을 유지하는 증식능 (종종 자가-재생 능력으로 언급됨) 을 갖는 세포이다. 신경 줄기 세포 마커로는, Nestin, Sox2, Musashi, Hes 패밀리, CD133 등이 언급될 수 있으나, 이들 마커는 일반적으로 선조/전구 세포에 대한 마커이고 신경 줄기 세포-특이적 마커로 간주되지 않는다. 신경 줄기 세포의 수는 신경구 어세이 및 클론 어세이에 의해 평가될 수 있다.
뉴런 전구 세포는 증식능을 갖는 세포로서, 이것은 뉴런을 생성하고 아교 세포를 생성하지 않는다. 뉴런 전구 세포 마커로서는, Tbr2, Tα1 등이 언급될 수 있다. 대안적으로, 미성숙 뉴런 마커 (TuJ1, Dcx, HuC/D)-양성 및 성장 마커 (Ki67, pH3, MCM)-양성 세포는 또한 뉴런 전구 세포로서 식별될 수 있다.
아교 전구 세포는 증식능을 갖는 세포로서, 이것은 아교 세포를 생성하고 뉴런을 생성하지 않는다.
신경 전구 세포는 신경 줄기 세포, 뉴런 전구 세포 및 아교 전구 세포를 포함하는 전구 세포의 집합체로서, 증식능 및 뉴런 및 아교 세포 생산성을 갖는다. 신경 전구 세포는 마커로서 Nestin, GLAST, Sox2, Sox1, Musashi, Pax6 등을 사용하여 식별될 수 있다. 대안적으로, 뉴런 세포 마커-양성 및 성장 마커 (Ki67, pH3, MCM)-양성 세포는 또한 뉴런 전구 세포로서 식별될 수 있다.
본 발명에서, "망막 조직" 은 생체 내 망막에서 각각의 망막 층을 구성하는, 광수용기 세포, 수평 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 그들의 선조/전구 세포 및 망막 선조 세포 등의 적어도 2 종 이상의 유형의 세포가 층 내에 입체적으로 배열되는 것을 의미한다. 어느 망막 세포가 각 세포로 구성되는지는 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 또는 그 수준 등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에서 "망막 층" 은 망막을 구성하는 각 층을 의미한다. 이의 구체적인 예는 망막 색소 상피층, 광수용기 세포층, 외부 제한 막, 외부 핵층, 외부 플렉시폼 층, 내부 핵층, 내부 플렉시폼 층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내부 제한 막을 포함한다.
본 발명에서 "망막 선조 세포" 는 광수용기 세포, 수평 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 망막 색소 상피 세포 등을 포함하는 임의의 성숙 망막 세포로 분화될 수 있는 전구 세포를 말한다.
광수용체 전구 세포, 수평 세포의 전구 세포, 양극 세포의 전구 세포, 아마크린 세포의 전구 세포, 망막 신경절 세포의 전구 세포, 및 망막 색소 상피 전구 세포는 각각 광수용기 세포, 수평 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 및 망막 색소 상피 세포로 분화되도록 하는 전구 세포를 말한다.
본 발명에서, "망막 층-특이적 뉴런" 은 망막 층을 구성하는 세포이고 망막 층에 특이적인 뉴런이다. 망막 층-특이적 뉴런의 예는 양극 세포, 망막 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 광수용기, 망막 색소 상피 세포, 막대 세포 및 원추 세포를 포함한다.
본 발명에서 "망막 세포" 는 상기 언급된 망막 전구 세포 및 망막 층-특이적 신경 세포를 포함한다.
망막 세포 마커의 예는 다음을 포함한다: 망막 전구 세포에서 발현되는 Rx (또한 Rax 라고도 언급됨), Aldh1a3, 및 PAX6, 망막 전구 세포에서는 발현되지 않으나 시상하부 뉴런의 전구 세포에서는 발현되는 Nkx2.1, 망막에서는 발현되지 않으나 시상하부 신경표피에서는 발현되는 Sox1, 광수용체의 전구 세포에서 발현되는 Crx 및 Blimp1 등. 망막 층-특이적 뉴런의 마커의 예는 양극 세포에서 발현되는 Chx10, PKCα 및 L7, 망막 신경절 세포에서 발현되는 TUJI 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현되는 Calretinin, 수평 세포에서 발현 된 Calbindin, 성숙 광수용체에서 발현되는 로돕신 및 레코베린 (Recoverin), 막대 세포에서 발현되는 Nrl, 원추 세포에서 발현되는 Rxr-감마, 및 망막 색소 상피 세포에서 발현되는 RPE65 및 Mitf 를 포함한다.
본 발명에서, "비신경 상피 조직" 은 상피 구조를 갖는 조직 중에서 신경상피 조직 이외의 조직을 말한다. 상피 조직은 또한 외배엽, 중배엽, 내배엽 또는 영양 외배엽의 임의의 생식 층으로부터 형성될 수 있다. 상피 조직은 상피, 중피 및 내피를 포함한다. 비신경 상피 조직에 포함되는 조직의 예는 표피, 각막 상피, 비강 상피, 구강 상피, 기관 상피, 기관지 상피, 기도 상피, 신장 상피, 신장 피질 상피, 태반 상피 등을 포함한다.
상피 조직은 일반적으로 다양한 세포간 연접에 의해 연결되고, 단층 또는 다층 구조를 갖는 조직을 형성한다. 이러한 상피 조직의 존재 또는 부재의 확인 및 이의 양의 정량은 광학 현미경 또는 상피 세포 마커에 대항하는 항체 (항-E-캐드헤린 항체, 항-N-캐드헤린 항체, 항-EpCAM 항체 등) 등을 사용하는 면역조직화학과 같은 방법으로 관찰함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에서, "상피 극성" 은 상피 세포에서 분포 및 세포 기능의 공간적으로 형성된 편향을 나타낸다. 예를 들어, 각막 상피 세포는 안구의 최외곽 층에 위치하며, 눈물을 유지하기 위해 정점 측에서 막-결합 뮤신 (MUC-1, 4, 16) 등과 같은 정단-특이적 단백질을 발현하고, 기저막에 접착하도록 기저면 상에 α6 인테그린, β1 인테그린 등과 같은 기저-특이적 단백질을 발현한다.
상피 극성이 생체로부터 유래된 조직 및 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 세포 덩어리에 존재하는 지의 여부는, 예를 들어 팔로이딘 (Phalloidin), 정단 마커 (항-MUC -1 항체, 항-PKC-제타 항체 등) 및 기저 마커 (항-α6 인테그린 항체, 항-β1 인테그린 항체 등) 등을 사용하는 면역조직화학과 같은 방법에 의해 검출될 수 있다.
각막은 한 종류의 비신경 상피 조직이며, 안구 벽의 외부 층의 약 1/6 전방을 차지하는 투명한 시계-유리와 같은 조직이다. 각막의 부분 구조의 예는 각막 상피, 보우만 (Bowman) 막, 각막 간질, 데시메트 (Descemet) 막 및 각막 내피를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 각막은 신체 표면으로부터 순서대로 보통 각막 상피, 보우만 막, 각막 기질, 데시메트 막 및 각막 내피로 이루어진 5 개의 층으로 구성된다. 각막의 유도, 그의 일부 구조 또는 그의 전구 조직은 마커의 발현에 의해 확인될 수 있다. 각막 마커, 그의 일부 구조 또는 이의 전구 조직의 예는 pan-사이토케라틴 (각막 상피 전구 조직), 사이토케라틴 18 (각막 상피 전구 조직), 사이토케라틴 19 (각막 상피 전구 조직), EpCAM (각막 상피 전구 조직), PDGFR-β (표면층 외배엽), Six1 (표면층 외배엽 및 플라코드), E-캐드헤린 (각막 상피 전구 조직), N-캐드헤린 (각막 상피 줄기 세포, 전구 조직), 사이토케라틴 3 (각막 상피), 사이토케라틴 12 (각막 상피), 사이토케라틴 14 (각막 상피), p63 (각막 상피), ZO-1 (각막 상피), PDGFR-α (각막 기질, 각막 내피 또는 이들의 전구 조직), Pitx2 (각막 기질 및 각막 상피의 전구 조직), ABCG2 (각막 간질 및 각막 내피의 전구 조직) 등을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포 덩어리에 함유된 각막 상피의 전구 조직은 pan-사이토케라틴-양성 및 E-캐드헤린-양성 상피 세포층이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포 덩어리에 함유된 각막 상피는 사이토케라틴 3-양성, 사이토케라틴 12-양성, 사이토케라틴 14-양성, p63-양성 및 ZO-1-양성 상피 구조이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포 덩어리에 함유된 각막 기질 및 각막 상피의 전구 조직은 중간엽 세포의 응집체 층이다. 하나의 구현예에서, 중간엽 세포의 응집체 층은 판pan-사이토케라틴 양성, PDGFR-α 양성, 또는 Pitx2 양성 및 ABCG2 양성이다. 각막 기질 및 각막 내피는 모두 중간엽 세포로부터 유래되지만, 각막 내피는 상피 내피 세포층-유사 형태를 취한다. 따라서, 상기 언급된 마커 발현 분석 및 형태학적 관찰을 수행함으로써 각막 기질 (또는 이의 전구 조직) 을 각막 내피 (또는 이의 전구 조직) 로부터 구별하고 각막 내피 또는 이의 전구 조직의 유도를 확인할 수 있다.
본 발명에서, "플라코드 (placode)" 는 주로 척추 동물의 발달 과정에서 표피 외배엽의 일부를 비후시킴으로써 형성된 장기의 원기를 말한다. 플라코드로부터 유래된 조직으로서는, 수정체, 코, 내이, 삼차 신경 등이 언급될 수 있다. 플라코드 또는 이의 전구 조직 (프리플라코드 (preplacode) 영역) 의 마커로서, Six1, Six4, Dlx5, Eya2 등이 언급될 수 있다.
렌즈 플라코드는 농축된 표피 외배엽 세포층으로 구성된 수정체 전구 조직이다. 배아 발생시, 이는 안포의 표피 외배엽과의 접촉 및 접촉 영역의 비후에 의해 형성된다.
수정체는 플라코드에서 유래된 조직 중 하나이며, 외부에서 안구로 들어오는 빛을 굴절시켜 망막에 초점을 맞추는 렌즈 역할을 하는 조직이다. 수정체의 부분 구조의 예는 수정체 상피, 수정체 핵, 및 수정체 낭을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 수정체의 전구 조직으로서, 렌즈 플라코드 및 수정체 낭포가 언급될 수 있다.
수정체 낭포는 렌즈 플라코드의 함입에 의해 형성된 소포이다.
수정체의 유도, 그의 일부 구조 또는 그의 전구 조직은 마커의 발현에 의해 확인될 수 있다. 수정체의 마커, 이의 부분 구조 또는 이의 전구 조직의 예는 Six1 (표면층 외배엽 및 플라코드), FoxC1 (플라코드), Emx2 (플라코드), Sox1 (중추 신경계 및 수정체 전구 조직), FoxE3 (수정체 전구 조직), Prox1 (수정체 전구 조직), L-Maf (수정체 전구 조직), α, β 및 γ 크리스탈린 (수정체) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 하나의 구현예에서, 수정체 플라코드는 L-Maf 양성, 비후된 외피 외배엽 세포층이다. 하나의 구현예에서, 수정체 낭포는 L-Maf 양성 소포이다.
본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 후술하는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 하나의 구현예로서, 전안부 조직이 언급될 수 있다. 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 전구 조직을 함유하는 세포 덩어리는 다능성 줄기 세포로부터 생성된 응집체에서, 다능성 세포의 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 전구 조직으로의 분화를 유도함으로써 얻을 수 있다. 상기 언급된 전안부 조직은, 한 종류의 비신경 상피 조직인 각막 조직, 한 종류의 플라코드-유래 조직인 수정체, 및 한 종류의 신경 조직인 망막 조직을 포함한다.
2. 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법
본 발명은 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법을 제공한다. 이하, 이것을 또한 본 발명의 제조 방법이라고도 한다.
본 발명의 제조 방법의 하나의 구현예는 하기 단계 (1) 및 (2) 를 포함하여, 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 제조하는 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
(2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계.
본 발명의 제조 방법의 더욱 바람직한 하나의 구현예는 하기 단계 (a), (1) 및 (2) 를 포함하여, 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 제조하는 방법이다:
(a) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 2) 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에 피더 세포의 부재 하에서 다능성 줄기 세포를 유지-배양하는 단계,
(1) 단계 a 에서 유지-배양된, 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
(2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계.
<단계 (a)>
1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 2) 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에 피더 세포의 부재 하에서 다능성 줄기 세포를 유지-배양하는 단계는 하기에 설명된다.
다능성 줄기 세포가 단계 a 에서 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리되고, 제 1 단계에서 현탁 배양될 때, 다능성 줄기 세포의 상태가 변하고, 비신경 상피 조직 형성의 효율이 개선되고, 응집체의 품질이 개선되고, 분화가 용이해지고, 세포 사멸이 쉽게 일어나지 않으며, 내부의 조밀한 미분화 상태를 유지하는 세포 응집체가 고효율로 생성될 수 있다.
피더 세포의 부재 하에 단계 (a) 를 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 피더 세포의 부재 (피더-프리) 는 피더 세포가 실질적으로 없는 상태를 의미한다 (예를 들어, 총 세포 수에 대한 피더 세포의 수의 비는 3% 이하이다).
단계 (a) 에서 사용되는 배지는 피더-프리 조건 하에서 미분화 상태를 유지하도록 다능성 줄기 세포를 배양할 수 있는 배지 (피더-프리 배지) 인 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 미분화 상태를 유지하기 위한 인자 및 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지가 언급될 수 있다.
배양이 미분화된 상태를 유지할 수 있게 하도록, 단계 (a) 에서 사용된 배지는 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자를 함유한다. 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 다능성 줄기 세포의 분화를 억제하는 작용을 갖는 물질이라면 특별히 제한되지 않는다. 당업자가 널리 사용하는 미분화 상태를 유지하기 위한 인자의 예는 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 활성화 물질 및 프라이밍된 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 의 경우 인슐린을 포함한다. FGF 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 섬유아세포 성장 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4, FGF8) 가 구체적으로 언급될 수 있다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 활성화 물질로서, TGFβ 신호 전달 경로 활성화 물질, Nodal/Activin 신호 전달 경로 활성화 물질이 언급될 수 있다. TGFβ 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 가 언급될 수 있다. Nodal/Activin 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 예를 들어, Nodal, Activin A, Activin B 가 언급될 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 (인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 가 배양될 때, 단계 (a) 의 배지는 바람직하게는 미분화 상태를 유지하기 위한 인자로서 bFGF 를 함유한다.
본 발명에서 사용되는 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 일반적으로 포유동물의 미분화 상태를 유지하기 위한 인자이다. 포유동물은 예를 들어 상기 언급된 것들이다. 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 포유동물 종 사이에서 교차-반응성을 가질 수 있기 때문에, 배양될 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지시킬 수 있는 한, 임의의 포유동물의 미분화 상태를 유지하기 위한 인자가 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 배양될 세포와 동일한 종의 포유동물의 미분화 상태를 유지하기 위한 인자가 사용된다. 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포의 배양을 위해, 미분화된 상태를 유지하기 위한 인간 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4, FGF8, EGF, Nodal, Activin A, Activin B, TGFβ 1, 및 TGFβ 2) 가 사용된다. 여기서, "인간 단백질 X" 는 단백질 X (미분화된 상태를 유지하기 위한 인자 등) 가 생체 내 인간에서 자연적으로 발현된 단백질 X 의 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 바람직하게는 단리된다.
"단리된" 은 의도된 성분 또는 세포 이외의 인자를 제거하는 조작이 수행되었고, 성분 또는 세포가 더 이상 자연적으로 발생하지 않는 것을 의미한다. 따라서, "단리된 단백질 X" 는 배양될 세포 또는 조직으로부터 생성되고 세포 또는 조직에 또는 배지에 함유된 내인성 단백질 X 를 포함하지 않는다. "단리된 단백질 X” 의 순도 (총 단백질 중량에 대한 단백질 X 의 중량의 백분율) 는 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 미분화된 상태를 유지하기 위한 단리된 인자를 제공하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 미분화된 상태를 유지하기 위해 단리된 인자를 단계 (a) 에서 사용된 배지에 외인성으로 첨가하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자가 단계 (a) 에서 사용되는 배지에 미리 첨가될 수 있다.
단계 (a) 에서 사용되는 배지 중의 미분화 상태를 유지하기 위한 인자의 농도는 배양될 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지할 수 있는 농도이며, 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, 피더 세포의 부재 하에 bFGF 가 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자로서 사용되는 경우, 그 농도는 일반적으로 약 4 ng/mL - 500 ng/mL, 바람직하게는 약 10 ng/mL - 약 200 ng/mL, 더욱 바람직하게는 약 30 ng/mL - 150 ng/mL 이다.
피더-프리 배지로서, 많은 합성 배지가 개발되어 시판되고 있으며, 예를 들어 Essential 8 배지가 언급될 수 있다. Essential 8 배지는 L-아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 (64 mg/l), 나트륨 셀레늄 (14 ㎍/l), 인슐린 (19.4 mg/l), NaHCO3 (543 mg/l), 트랜스페린 (10.7 mg/l), bFGF (100 ng/mL) 및 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 활성화 물질 (TGFβ 1 (2 ng/mL) 또는 Nodal (100 ng/mL)) 을 첨가제로서 함유하는 DMEM/F12 배지이다 (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)). 시판되는 피더-프리 배지의 예는 Essential 8 (Life Technologies 사제), S-배지 (DS Pharma Biomedical 사제), StemPro (Life Technologies 사제), hESF9, mTeSR1 (STEMCELL Technologies 사제), mTeSR2 (STEMCELL Technologies 사제), 및 TeSR-E8 (STEMCELL Technologies 사제) 을 포함한다. 이들 외에, StemFit (Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 피더-프리 배지로서 언급할 수 있다. 본 발명은 상기 언급된 단계 (a) 에서 이들을 사용함으로써 편리하게 수행될 수 있다. StemFit 배지는 Nakagawa et al., Scientific Reports, 4, 3594, 2014 에 설명된 바와 같이 미분화된 상태를 유지하기 위한 성분으로서 bFGF 를 함유한다.
단계 (a) 에 사용된 배지는 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있고, 이것은 바람직하게는 화학적으로 정의되지 않은 성분으로의 오염을 피하기 위해, 무혈청 배지이다.
화학적으로 정의되지 않은 성분으로의 오염을 피하기 위해, 단계 (a) 에 사용되는 배지는 바람직하게는 그 성분이 화학적으로 정의된 배지이다.
단계 (a) 에서, 다능성 줄기 세포는 현탁 배양 및 접착 배양, 바람직하게는 접착 배양의 임의의 조건 하에서 배양될 수 있다.
단계 (a) 에서 피더-프리 조건 하에 다능성 줄기 세포를 배양하기 위해, 상기 언급된 피더-프리 배지를 배지로서 사용할 수 있다.
단계 (a) 에서 피더-프리 조건 하에 다능성 줄기 세포를 배양하기 위해, 피더 세포 대신에 스캐폴드를 다능성 줄기 세포에 제공하기 위해 적절한 매트릭스가 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 다능성 줄기 세포는 그의 표면이 스캐폴드로서 매트릭스로 코팅된 세포 용기에서 접착 배양된다.
스캐폴드로서 이용가능한 매트릭스로서, 라미닌 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)), 라미닌 단편 (Nat Commun 3, 1236 (2012)), 기저막 제조물 (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001)), 젤라틴, 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴, 비트로넥틴 등이 언급될 수 있다.
"라미닌" 은 α, β, γ 사슬로 이루어진 이종삼량체 분자이며, 상이한 서브유닛 사슬 조성을 갖는 이소형을 함유하는 세포외 매트릭스 단백질이다. 구체적으로, 라미닌은 이종삼량체와 5 종의 α 사슬, 4 종의 β 사슬 및 3 종의 γ 사슬의 조합에 기초하여 약 15 종의 이소형을 갖는다. 라미닌의 명칭은 α 사슬 (α1-α5), β 사슬 (β1-β4) 및 γ 사슬 (γ1-γ4) 의 각각의 수를 조합하여 결정된다. 예를 들어, α5 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합을 갖는 라미닌은 라미닌 511 로 명명된다. 본 발명에서, 라미닌 511 이 바람직하게 사용된다 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)).
본 발명에 사용되는 라미닌 단편은 다능성 줄기 세포에 대한 접착성을 갖고, 피더-프리 조건 하에서 다능성 줄기 세포의 유지 배양을 가능하게 하는 한 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 E8 단편이다. 라미닌 E8 단편은 엘라스타제로의 라미닌 511 의 소화에 의해 수득된 단편들 중에서 강한 세포 접착 활성을 갖는 단편으로 확인되었다 (EMBO J., 3:1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105:589-598, 1987). 본 발명에서, 라미닌 511 의 E8 단편이 바람직하게 사용된다 (Nat Commun 3, 1236 (2012), Scientific Reports 4, 3549 (2014)). 본 발명에 사용되는 라미닌 E8 단편은 라미닌의 엘라스타제 소화 생성물일 필요는 없으며 재조합체일 수 있다. 대안적으로, 이것은 유전자 재조합 동물 (누에 나방 등) 에 의해 생성될 수 있다. 미확인된 성분의 오염을 피하기 위해, 재조합 라미닌 단편이 본 발명에 바람직하게 사용된다. 라미닌 511 의 E8 단편은 상업적으로 입수 가능하고, 예를 들어, Nippi, Inc. 등에서 구입할 수 있다.
미확인된 성분으로의 오염을 피하기 위해, 본 발명에서 사용되는 라미닌 또는 라미닌 단편은 바람직하게는 단리된다.
바람직하게는, 단계 (a) 에서 피더-프리 조건 하에 다능성 줄기 세포를 배양함에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포는 단리된 라미닌 511 또는 라미닌 511 의 E8 단편 (가장 바람직하게는, 라미닌 511 의 E8 단편) 으로 코팅된 표면을 갖는 세포 용기에서 접착된 상태로 배양된다.
단계 (a) 에서 다능성 줄기 세포의 배양 기간은 후속 단계 (1) 에서 형성된 응집체의 품질을 향상시키는 효과가 달성될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않지만, 이것은 일반적으로 0.5 내지 144 시간, 바람직하게는 2 내지 96 시간, 더욱 바람직하게는 6 내지 48 시간, 더욱 바람직하게는 12 내지 48 시간, 더욱 더 바람직하게는 18 내지 28 시간 (예를 들어, 24 시간) 이다.
즉, 단계 (a) 는 단계 (1) 의 시작 전 0.5 내지 144 시간 (바람직하게는, 18 내지 28 시간) 에 시작되고, 단계 (a) 가 완료되면 연속적으로 단계 (1) 이 수행된다.
단계 (a) 에서의 배양 온도 및 CO2 농도와 같은 배양 조건은 적절하게 결정될 수 있다. 배양 온도는 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어, 약 1% 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
하나의 바람직한 구현예에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 는 피더 세포의 부재 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 접착된 상태로 배양된다. 접착 배양은 바람직하게는 라미닌 511, 라미닌 511 의 E8 단편 또는 비트로넥틴으로 코팅된 표면이 있는 세포 용기에서 수행된다. 접착 배양은 바람직하게는 피더-프리 배지로서 StemFit 배지를 사용하여 수행된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 는 피더 세포의 부재 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 현탁 배양된다. 현탁 배양에서, 인간 다능성 줄기 세포는 인간 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성할 수 있다.
소닉 헤지호그 (이하, 종종 Shh 로 언급됨) 신호 전달 경로 활성화 물질은 Shh 에 의해 매개되는 신호 전달을 향상시킬 수 있는 물질이다. Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 예는 헤지호그 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Shh, Ihh), Shh 수용체, Shh 수용체 작용제, Smo 작용제, 푸모르파민 (Purmorphamine), GSA-10, Hh-Ag1.5 및 20 (S)-히드록시콜레스테롤 또는 SAG (평탄화된 작용제; N-메틸-N'-3-피리디닐벤질)-N'-(3-클로로벤조[b]티오펜-2-카르보닐)-1,4-디아미노시클로헥산) 을 포함한다. Shh 신호 전달 경로 활성화 물질은 바람직하게는 SAG 이다.
배지 중의 Shh 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기 효과를 달성할 수 있는 범위에 속하는 것으로 적절히 결정될 수 있다. 단계 (a) 에서, SAG 는 일반적으로 약 1 nM - 약 2000 nM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 1000 nM, 더욱 바람직하게는 약 10 nM - 약 700 nM, 더욱 바람직하게는 약 50 nM - 약 700 nM, 특히 바람직하게는 약 100 nM - 약 600 nM, 가장 바람직하게는 약 100 nM - 약 500 nM 의 농도로 사용된다. SAG 이외의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용하는 경우, 상기 언급된 농도에서 SAG 와 동등한 Shh 신호 전달 촉진 활성을 나타내는 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 소닉 헤지호그 신호 전달 촉진 활성은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 Gli1 유전자의 발현에 초점을 맞춘 리포터 유전자 어세이에 의해 결정될 수 있다 (Oncogene (2007) 26, 5163-5168). 예를 들어, 10 nM 내지 700 nM SAG 에 상응하는 소닉 헤지호그 신호 전달 촉진 활성을 갖는 Shh 전달 경로 활성화 물질로서, 20 nM 내지 2 μM 의 푸모르파민, 20 nM 내지 3 μM 의 GSA-10, 10 nM 내지 1 μM 의 Hh-Ag1.5 등이 언급될 수 있다.
TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 (즉, TGFβ 수퍼패밀리 신호 전달 경로) 는 리간드로서 TGFβ, Nodal/Activin 또는 BMP 를 갖는 Smad 패밀리에 의해 세포내에서 전달되는 신호 전달 경로이다.
TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로, 즉 Smad 패밀리에 의해 전달된 신호 전달 경로를 억제하는 물질이다. 구체적으로, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질, Nodal/Activin 신호 전달 경로 억제 물질 및 BMP 신호 전달 경로 억제 물질이 언급될 수 있다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질로는, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이 바람직하다.
TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 TGFβ 에 의해 유발된 신호 전달 경로를 억제하는 물질인 한 특별히 제한되지 않으며, 핵산, 단백질 및 저분자 유기 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 물질로서, 예를 들어 TGFβ 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 단백질, 항체 및 앱타머), TGFβ 를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA), TGFβ 수용체 및 TGFβ 의 결합을 억제하는 물질, 및 TGFβ 수용체에 의한 신호 전달에 의해 야기된 생리 활성을 억제하는 물질 (예를 들어, TGFβ 수용체 억제제 및 Smad 억제제) 이 언급될 수 있다. TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로 알려진 단백질로서, Lefty 등이 언급될 수 있다.
TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서, 당업자에게 공지된 화합물이 사용될 수 있다. 구체적으로, Alk5/TGFβR1 억제제, 예컨대 SB431542 (종종 본 명세서에서 SB431 로 약칭됨), SB505124, SB525334, LY2157299, LY2109761, GW788388, LY364947, SD-208, EW-7197, A 83-01, 및 RepSox, 및 SMAD3 억제제, 예컨대 SIS3 등이 언급될 수 있다. SB431542 (4-(5-벤조일[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드) 및 A-83-01 (3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드) 는 TGFβ 수용체 (ALK5) 및 액티빈 수용체 (ALK4/7) 의 억제제 (즉, TGFβR 억제제) 로 알려진 화합물이다. SIS3 은 TGFβ 수용체의 제어 하에 세포내 신호 전달 인자인 SMAD3 의 인산화를 억제하는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이다. 본 발명에서 사용되는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 바람직하게는 SB431542 또는 A-83-01 이다.
배지 중의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 상기 효과가 달성될 수 있는 한 적절하게 결정될 수 있다. 단계 (a) 에서 TGFβ 전달 경로 억제 물질로서 SB431542 가 사용되는 경우, 이는 전형적으로 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 50 μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM - 약 50 μM, 더욱 바람직하게는 약 1 μM - 약 10 μM 의 농도로 사용된다. SB431542 이외의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이 사용되는 경우, 상기 언급된 농도에서 SB431542 와 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
<단계 (1)>
미분화 조건, 바람직하게는 단계 (a) 에서 수득된 다능성 줄기 세포 하에서 유지된 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는, 제 1 단계가 설명된다.
Wnt 신호 전달 경로는 Wnt 패밀리 단백질을 리간드로 사용하고 주로 프리즐드 (Frizzled) 를 수용체로 사용하는 신호 전달 경로이다. 신호 경로의 예는 β-카테닌 (정규 (Canonical) Wnt 경로) 에 의해 전달된 고전적인 Wnt 경로 뿐만 아니라 β-카테닌-독립적 비-고전적 Wnt 경로 (비-정규 (Non-Canonical) Wnt 경로) 등을 포함한다. 비-정규 Wnt 경로는 평면 세포 극성 (PCP) 경로, Wnt/칼슘 경로, Wnt-RAP1 경로, Wnt-Ror2 경로, Wnt-PKA 경로, Wnt-GSK3MT 경로, Wnt-aPKC 경로, Wnt-RYK 경로, 및 Wnt-mTOR 경로를 포함한다. 비-정규 Wnt 경로에는, Wnt 이외의 다른 신호 경로에서도 활성화되는 공통 신호 전달 인자가 존재한다. 본 발명에서, 이러한 인자는 또한 Wnt 신호 전달 경로의 구성 인자로 간주되며, 인자의 억제 물질은 또한 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질에도 포함된다.
본 발명에서, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 Wnt 패밀리 단백질에 의해 유도된 신호 전달을 억제할 수 있는 한 제한되지 않는다. 이것은 핵산, 단백질 및 저분자 유기 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 물질의 예는 Wnt 프로세싱 및 세포외 분비를 억제하는 물질, Wnt 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 항체 및 앱타머), Wnt 를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA), Wnt 수용체와 Wnt 의 결합을 억제하는 물질, 및 Wnt 수용체에 의한 신호 전달에 의해 야기되는 생리 활성을 억제하는 물질을 포함한다. Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로 알려진 단백질로서, 분비된 프리즐드 관련 단백질 (Frizzled Related Protein: sFRP) 클래스에 속하는 단백질 (sFRP1 내지 5, Wnt 억제 인자-1 (WIF-1), Cerberus), Dickkopf (Dkk) 클래스에 속하는 단백질 (Dkk1 내지 4, Kremen) 등이 언급될 수 있다.
Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서, 당업자에게 공지된 화합물이 사용될 수 있다. Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서, 예를 들어, 포르큐핀 (Porcupine) 억제제 (PORCN 억제제로도 지칭됨), 프리즐드 억제제, Dvl 억제제, 탄키라제 (Tankyrase) 억제제 (TANK 억제제로도 지칭됨), 카제인 키나제 1 억제제, 카테닌 반응성 전사 억제제, p300 억제제, CBP 억제제, 및 BCL-9 억제제 (Am J Cancer Res. 2015; 5(8): 2344-2360) 가 언급될 수 있다. 작용 메커니즘은 보고되지 않았지만, KY 02111 및 KY03-I 은 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 언급될 수 있다.
PORCN 억제제로서는, 예를 들어 IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWP-L6, IWP-12, LGK-974, ETC-159, GNF-6231, 및 Wnt-C59 가 언급될 수 있다.
TANK 억제제로서는, 예를 들어 IWR1-endo, XAV939, MN-64, WIKI4, TC-E 5001, JW 55, 및 AZ6102 가 언급될 수 있다.
본 발명에 사용되는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 바람직하게는 PORCN 억제제, TANK 억제제 또는 KY 02111, 더욱 바람직하게는 PORCN 억제제이다.
본 발명에서 사용되는 PORCN 억제제는 바람직하게는 IWP-2 또는 Wnt-C59 이다. 본 발명에서 사용되는 TANK 억제제는 바람직하게는 XAV939 이다.
본 발명에 사용되는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 또한 바람직하게는 비-정규 Wnt 경로에 대한 억제 활성을 갖는다. 비-정규 Wnt 경로에 대한 억제 활성을 갖는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로는, 예를 들어 PORCN 억제제, 항-프리즐드 항체 및 Box5 펩티드가 언급될 수 있다. 포르큐핀은 정규 Wnt 경로 리간드 Wnt1, Wnt3a 등 뿐 아니라, 비-정규 Wnt 경로 리간드 Wnt5a, Wnt5b, Wnt11 의 지질 변형에 관여하는 것으로 알려져 있으며 (Dev Biol. 2012 Jan 15; 361(2):392-402., Biochem J. 2007 Mar 15; 402(Pt 3): 515-523.), PORCN 억제제는 정규 Wnt 경로 및 비-정규 Wnt 경로 둘 다를 억제한다.
배지 중의 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기 효과를 달성할 수 있는 범위에 속하는 것으로 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, 한 종류의 PORCN 억제제인 IWP-2 가 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 사용되는 경우, 그 농도는 전형적으로 약 0.01 μM - 약 30 μM, 바람직하게는 약 0.1 μM - 약 30 μM, 보다 바람직하게는 약 2 μM 이다. 한 종류의 PORCN 억제제인 Wnt-C59 가 사용되는 경우, 그 농도는 전형적으로 약 1 pM - 약 30 μM, 바람직하게는 약 100 pM - 약 30 μM, 보다 바람직하게는 약 1 nM - 약 1 μM 이다. 한 종류의 TANK 억제제인 XAV939 가 사용되는 경우, 그 농도는 전형적으로 약 0.01 μM - 약 30 μM, 바람직하게는 약 0.1 μM - 약 30 μM, 보다 바람직하게는 약 1 μM 이다. KY 02111 이 사용되는 경우, 그 농도는 전형적으로 약 0.01 μM - 약 30 μM, 바람직하게는 약 0.1 μM - 약 30 μM, 보다 바람직하게는 약 5 μM 이다.
단계 (1) 에서, 현탁 배양은 바람직하게는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 수행된다.
단계 (1) 에서 사용되는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서, 단계 (a) 에서 예시된 것과 유사한 것들이 사용될 수 있다. 단계 (a) 및 단계 (1) 에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 동일하거나 상이할 수 있으며, 바람직하게는 동일할 수 있다.
배지 중의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 상기 효과를 달성할 수 있는 범위에 속하는 것으로 적절히 결정될 수 있다. TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서 SB431542 가 사용되는 경우, 이는 전형적으로 약 1 nM - 약 100 μM, 바람직하게는 약 10 nM - 약 50 μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM - 약 50 μM, 더욱 바람직하게는 약 500 nM - 약 10 μM 의 농도로 사용된다. SB431542 이외의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이 사용되는 경우, 상기 언급된 농도에서 SB431542 와 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
단계 (1) 에서 사용된 배지는 상기 정의에 기술된 한 특별히 제한되지는 않는다. 단계 (1) 에서 사용되는 배지는 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적으로 정의되지 않은 성분의 오염을 피하기 위해, 무혈청 배지가 본 발명에 바람직하게 사용된다. 복잡한 제조를 피하기 위해, 예를 들어, KSR 등과 같은 적절한 양의 시판되는 혈청 대체물이 보충된 무혈청 배지 (예를 들어, 5% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤 및 1x 화학적으로 정의된 지질 농축물이 보충된, IMDM 과 F-12 의 1:1 혼합물의 배지, 또는 5%-20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-메르캅토에탄올이 보충된 GMEM 배지) 가 바람직하게 사용된다. 인간 ES 세포의 경우 무혈청 배지에 첨가되는 KSR 의 양은 일반적으로 약 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
단계 (1) 에서 응집체를 형성하기 위해, 단계 (a) 에서 수득된 다능성 줄기 세포의 분산 작업이 먼저 수행되는 것이 바람직하다. 분산 조작에 의해 얻어진 "분산 세포" 는, 예를 들어, 세포의 70% 이상이 단일 세포이고 세포의 30% 이하가 2 내지 50 개 세포의 뭉치인 상태를 말한다. 바람직하게는, 분산 세포로서, 예를 들어, 세포의 80% 이상이 단일 세포이고 세포의 20% 이하가 2 내지 50 개 세포의 뭉치인 상태가 언급될 수 있다. 분산된 세포는 세포의 상호 접착이 거의 없는 상태 (예를 들어, 평면 부착) 를 말한다. 일부 구현예에서, 분산된 세포는 세포-세포 연접이 거의 없는 상태 (예를 들어, 접착 결합) 를 말한다.
단계 (a) 에서 수득된 다능성 줄기 세포의 분산 작업은 상기 언급된 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리 및 세포 보호제 첨가 처리를 포함할 수 있다. 이들 처리는 조합하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포 분산액 처리는 세포 보호제 첨가 처리와 동시에 수행된 다음 기계적 분산 처리가 수행된다.
세포 보호제 첨가 처리에 사용되는 세포 보호제로서는, FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, 헤파린, ROCK 억제 물질, 미오신 억제 물질, 혈청 또는 혈청 대체물을 언급할 수 있다. 바람직한 세포 보호제로서는 ROCK 억제제를 언급할 수 있다. 분산에 의해 유도된 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포 사멸을 억제하기 위해, Rho-관련 코일-코일 키나제 (ROCK) 억제 물질이 제 1 단계 배양의 시작부터 첨가될 수 있다. ROCK 억제 물질로서는 Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152, HA-100 등을 언급할 수 있다. 대안적으로, 제조 후 세포 보호제가 또한 사용될 수 있다. 제조 후의 세포 보호제의 예는 RevitaCell Supplement (Thermo Fisher Scientific 사제) 및 CloneR (Stemcell Technologies 사제) 을 포함한다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로서는, 트립신, 콜라게나제, 히알루로니다제, 엘라스타제, 프로나제, DNase, 및 파파인 등의 효소 및 에틸렌디아민테트라아세트산 등의 킬레이트제 중 임의의 것을 함유하는 용액을 언급할 수 있다. TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific 사제), TrypLE Express (Tour Fisher Scientific 사제), Accumax (Innovative Cell Technologies 사제) 와 같은 시판되는 세포 분산액도 사용할 수 있다.
기계적 분산 처리 방법으로서는, 피펫팅 처리 또는 스크래퍼에 의한 스크래핑을 언급할 수 있다. 분산된 세포는 상기 언급된 배지에 현탁된다.
이후, 분산된 다능성 줄기 세포의 현탁액을 상기 언급된 배양 용기에 시딩하고, 분산된 다능성 줄기 세포를 배양 용기에 비-접착성 조건 하에서 배양하여, 복수의 세포를 모아서 응집체를 형성한다.
이 경우, 분산된 다능성 줄기 세포를 10 cm 디쉬와 같은 비교적 큰 배양 용기에 시딩함으로써 하나의 배양 용기에 복수의 세포 응집체를 동시에 형성할 수 있다. 각 응집체의 크기 분산의 용이한 발생을 방지하기 위해, 예를 들어, 주어진 양의 분산된 다능성 줄기 세포를 96-웰 마이크로플레이트와 같은 멀티웰 플레이트 (U-바닥, V-바닥) 의 각 웰에 배치하고, 정적 배양이 수행됨으로써, 세포는 신속하게 응집하여 바람직하게는 각 웰에 하나의 응집체를 형성한다. 각 웰에 형성된 응집체는 복수의 웰로부터 회수되어 균일한 응집체 집단이 수득될 수 있다.
단계 (1) 에서, 응집체의 복잡한 제조를 피하기 위해, 응집체가 각각의 웰에 함유되어 있는 동안 전체 플레이트의 배지를 교환할 수 있는 3 차원 세포 배양 용기가 사용될 수 있다. 3 차원 세포 배양 용기의 예는 PrimeSurface 96 Slit 웰 플레이트 (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD. 사제) 등을 포함한다.
단계 (1) 에서 다능성 줄기 세포의 농도는 세포 응집체가 보다 균일하고 효율적으로 형성될 수 있도록 적절하게 설정될 수 있다. 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 단계 (a) 에서 얻어진 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 가 96-웰 마이크로웰 플레이트를 사용하여 현탁액에서 배양될 때, 일반적으로 웰 당, 약 1 x 103 내지 약 1 x 105 세포, 바람직하게는 약 3 x 103 내지 약 5 x 104 세포, 더욱 바람직하게는 약 4 x 103 내지 약 2 x 104 세포, 더욱 바람직하게는 약 4 x 103 내지 약 1.6 x 104 세포, 특히 바람직하게는 약 8 x 103 내지 약 1.2 x 104 세포를 달성하기 위해 제조된 액체가 웰에 첨가되고, 플레이트가 응집체를 형성하도록 방치된다.
단계 (1) 에서의 배양 온도, CO2 농도 등과 같은 배양 조건은 적절하게 결정될 수 있다. 배양 온도는 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어, 약 1% 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
단계 (1) 에서, 배지 교환 조작이 수행될 때, 예를 들어, 기존 배지를 폐기하지 않고 신선한 배지를 추가하는 조작 (배지 첨가 조작) 에 의해 수행될 수 있고, 기존 배지의 약 절반의 양 (예를 들어, 기존 배지의 부피의 약 30 내지 90%, 예를 들어, 약 40 내지 60%) 를 폐기하고 신선한 배지의 약 절반의 양 (기존 배지의 부피의 약 30 내지 90%, 예를 들어, 약 40 - 60%) 을 첨가하는 조작 (절반-배지 교환 조작), 및 기존 배지의 약 전체 량 (기존 배지의 부피의 90% 이상) 을 폐기하고 신선한 배지의 약 전체 량 (기존 배지의 부피의 90% 이상) 을 첨가하는 조작 (전체-배지 교환 조작) 등이 수행될 수 있다.
특정 성분 (예를 들어, 분화-유도 인자) 이 특정 시점에 첨가될 때, 예를 들어, 최종 농도를 계산하고, 약 절반의 양의 기존 배지를 폐기하고, 최종 농도보다 높은 농도로 특정 성분을 함유하는 약 절반의 양의 신선한 배지를 첨가하는 조작 (절반의 양의 배지 교환 조작) 이 수행될 수 있다.
기존 배지에 함유된 성분의 농도가 특정 시점에서 희석에 의해 감소되는 경우, 예를 들어, 배지 교환 작업은 하루에 복수 회, 바람직하게는 1 시간 내에 복수 회 (예를 들어, 2 내지 3 회) 수행될 수 있다. 또한, 특정 시점에서 희석에 의해 기존 배지에 함된된 성분의 농도를 감소시켜야 하는 경우, 세포 또는 응집체를 또다른 배양 용기로 옮길 수 있다.
배지 교환 작업에 사용되는 도구는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 피펫터, 피펫맨, 멀티채널 피펫맨 및 연속 디스펜서가 언급될 수 있다. 예를 들어, 96 웰 플레이트가 배양 용기로서 사용되는 경우, 멀티채널 피펫맨이 사용될 수 있다.
세포 응집체를 형성하는데 필요한 현탁 배양 기간은 사용되는 다능성 줄기 세포에 따라 적절하게 결정될 수 있어서, 세포가 균일하게 응집될 수 있다. 균일한 세포 응집체를 형성하기 위해서는, 가능한 짧은 것이 바람직하다. 분산된 세포가 세포 응집체를 형성하는 단계는, 세포를 수집하는 단계와, 수집된 세포로부터 세포 응집체를 형성하는 단계로 나눌 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 의 경우 세포를 수집할 수 있도록 분산된 세포를 시딩하는 단계 (즉, 현탁 배양 개시시) 에서, 예를 들어, 수집된 세포는 바람직하게는 약 24 시간 내에, 보다 바람직하게는 약 12 시간 내에 형성된다. 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 의 경우 세포 응집체를 형성할 수 있도록 분산된 세포를 시딩하는 단계 (즉, 현탁 배양 개시시) 에서, 응집체는 예를 들어, 바람직하게는 약 72 시간 내에, 보다 바람직하게는 약 48 시간 내에 형성된다. 세포 응집체 형성 기간은 세포를 응집시키기 위한 도구, 원심분리 조건 등을 제어함으로써 적절하게 조정될 수 있다.
세포 응집체의 형성은 응집체의 크기 및 세포 수, 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미세한 형태 및 이의 균일성, 분화 및 미분화 상태에 대한 마커의 발현 및 이의 균일성, 분화 마커의 발현의 제어 및 이들의 동기화, 응집체 사이의 분화 효율의 재현성에 근거하여 결정될 수 있다.
응집체 형성 후, 응집체는 그대로 연속으로 배양될 수 있다. 단계 (1) 에서 현탁 배양 기간은 일반적으로 약 8 시간 - 6 일, 바람직하게는 약 12 시간 - 48 시간이다.
<단계 (2)>
단계 (1) 에서 수득된 세포 응집체가 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계가 하기에 설명된다.
BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP 에 의해 매개되는 신호 전달을 향상시킬 수 있는 물질이다. BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 예는 BMP2, BMP4 및 BMP7 과 같은 BMP 단백질, GDF7 과 같은 GDF 단백질, 항-BMP 수용체 항체, BMP 부분 펩티드 등을 포함한다.
BMP2 단백질 및 BMP4 단백질은 예를 들어 R&D Systems 으로부터 이용가능하고, BMP7 단백질은 Biolegend 로부터 이용가능하고, GDF7 단백질은 예를 들어 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 로부터 이용가능하다. BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 바람직하게는 BMP4 이다.
배지 중의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기 효과를 제공할 수 있는 범위에 속하는 것으로 적절히 결정될 수 있다. BMP 신호 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4 가 사용되는 경우, 이는 일반적으로 약 1 pM - 약 100 nM, 바람직하게는 약 10 pM - 약 50 nM, 더욱 바람직하게는 약 100 pM - 약 25 nM, 더 바람직하게는 약 250 pM - 약 10 nM 의 농도로 사용된다. BMP4 이외의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 사용되는 경우, 상기 언급된 농도에서 BMP4 와 동등한 BMP 신호 전달 경로 촉진 활성을 나타내는 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
단계 (2) 에서 사용된 배지는 BMP 신호 전달 경로 활성화 활성을 갖는 한 특별히 제한되지는 않는다. 단계 (2) 에서 사용되는 배지는 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적으로 정의되지 않은 성분의 오염을 피하기 위해, 무혈청 배지가 본 발명에 바람직하게 사용된다. 복잡한 제조를 피하기 위해, 예를 들어, KSR 등과 같은 적절한 양의 시판되는 혈청 대체물이 보충된 무혈청 배지 (예를 들어, 5% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤 및 1x 화학적으로 정의된 지질 농축물이 보충된, IMDM 과 F-12 의 1:1 혼합물의 배지, 또는 5%-20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-메르캅토에탄올이 보충된 GMEM 배지) 가 바람직하게 사용된다. 인간 ES 세포의 경우 무혈청 배지에 첨가되는 KSR 의 양은 일반적으로 약 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다. 제 2 단계에서, 제 1 단계에서 수득된 다능성 줄기 세포 응집체는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 에서 현탁 배양되어 세포 덩어리를 형성하고, 이에 의해 세포 덩어리의 품질이 향상된다. 구체적으로, 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리 (여기서 1) 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는 이의 표면의 30% 이상) 이 2) 비신경 상피 조직에 코팅됨), 보다 바람직하게는 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직 사이에 30 ㎛ 이상의 간극이 형성되는 세포 덩어리가 고효율로 형성될 수 있다.
소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않고 단계 (2) 를 수행하는 것이 바람직하다. 단계 (2) 는 바람직하게는 실질적으로 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 부재 하에 수행된다. 단계 (2) 는 또한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 수행될 수 있다.
3. 신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리
본 발명은 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리, 바람직하게는 1) 신경 세포 또는 신경 조직이 2) 비신경 상피 조직으로 코팅되는 (바람직하게는 1) 의 표면의 30% 이상이 2) 로 코팅됨) 것을 특징으로 하는 세포 덩어리를 제공한다. 이하, 이것을 또한 본 발명의 세포 덩어리라고도 한다. 본 발명의 세포 덩어리는 바람직하게는 상기 언급된 본 발명의 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 세포 덩어리에서, 1) 신경 세포 또는 신경 조직은 바람직하게는 중추 신경계의 세포 또는 조직, 또는 이의 전구 조직이고, 중추 신경계의 세포 또는 조직으로서, 망막, 대뇌 피질, 간뇌 (예를 들어, 시상 하부) 및 이러한 조직으로부터 유래된 세포가 언급될 수 있다.
본 발명의 세포 덩어리에서, 2) 비신경 상피 조직은 바람직하게는 상피 세포 극성을 가지며, 보다 바람직하게는 1) 신경 세포 또는 신경 조직 사이에 기저막 유사 구조를 갖는다.
비신경 상피 조직은 바람직하게는 다열 상피 또는 중층 상피이다. 비신경 상피 조직은 구체적으로, 예를 들어 표피 또는 이의 전구 조직, 각막 또는 이의 전구 조직, 및 구강 상피 또는 이의 전구 조직, 보다 바람직하게는 각막 또는 이의 전구 조직이다.
본 발명의 세포 덩어리에서, 2) 비신경 상피 조직의 일부가 플라코드 또는 플라코드-유래 조직인 구현예가 또한 바람직하다. 플라코드로서, 두개골 플라코드가 언급될 수 있고, 플라코드-유래 조직으로서, 수정체, 내이 조직 및 삼차 신경이 언급될 수 있다.
본 발명의 세포 덩어리에서, 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직 사이에 30 ㎛ 이상, 바람직하게는 40 ㎛ 이상, 보다 바람직하게는 50 ㎛ 이상, 전형적으로 30-1000 ㎛ 의 간극이 형성될 수 있다. 이러한 간극이 1) 과 2) 사이에 형성되는 경우, 외부에 존재하는 비신경 상피 조직 (예를 들어, 각막) 은 내부에 존재하는 신경 세포 또는 신경 조직으로부터 분리되어 수집될 수 있다. 따라서, 보다 정확한 이식 재료로서 제공될 수 있다.
또한, 조직 (예를 들어, 신경 능선-유래 세포로 구성된 조직, 간엽 세포로 구성된 조직) 은 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직 사이에 형성될 수 있다.
4. 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법
본 발명은 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법의 하나의 구현예는 하기 단계 (1) 내지 (4) 를 포함하는 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
(2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계,
(3) 제 2 단계에서 수득된 세포 덩어리로부터 2) 비신경 상피 조직을 수집하는 제 3 단계,
(4) 제 3 단계에서 수득된 2) 비신경 상피 조직을 분산시키고 이를 평면에서 배양하여, 비신경 상피 조직 시트를 수득하는 제 4 단계.
본 발명의 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법의 하나의 구현예는 상기 언급된 단계 (1) 내지 (4) 전에 하기 단계 (a) 를 포함하는 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법이다:
(a) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 2) 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자를 포함하는 배지 중에 피더 세포의 부재 하에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계.
본 방법의 단계 (a), 단계 (1) 및 단계 (2) 는 상기 언급된 본 발명의 세포 덩어리의 제조 방법에서 단계 (a), 단계 (1) 및 단계 (2) 와 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
<단계 (3)>
단계 (3) 에서, 제 2 단계에서 수득된 세포 덩어리로부터 비신경 상피 조직을 수집하는 단계는 전형적으로 현미경 관찰 하에 핀셋 등을 사용하여 세포 덩어리 외부에 존재하는 비신경 상피 조직을 박리 및 수집함으로써 수행된다. 제 3 단계에서 비신경 상피 조직을 수집하는 방법으로서, 동결-해동 방법, 바람직하게는 느린 동결 방법을 사용한 동결-해동 방법이 언급될 수 있고 바람직하게 사용된다. 상기 방법에 따르면, 외부에 비신경 상피 조직 및 내부에 뉴런 또는 신경 조직을 갖는 세포 덩어리는 동결-해동되어 외부의 비신경 상피 조직이 물리적 처리 없이 세포 덩어리로부터 박리된다.
<단계 (4)>
단계 (4) 에서, 제 3 단계에서 얻어진 비신경 상피 조직에 분산 처리를 실시하고, 분산된 세포 및/또는 세포 응집체를 평평한 평면 상에 배양함으로써 비신경 상피 조직-유래 세포 시트를 형성할 수 있다. 분산 처리는 전술한 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리 또는 세포 보호제 첨가 처리를 포함할 수 있다. 이들 처리는 조합하여 수행될 수 있다. 분산된 세포 및/또는 세포 응집체의 평면 배양을 위해, 관련 분야에서 전형적으로 수행되는 방법이 적절하게 선택되고 사용된다.
본 발명의 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법의 또다른 구현예는 상기 언급된 단계 (1) 내지 (4) 전에 상기 언급된 단계 (a) 를 수행하는 것을 포함하는 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법이다.
5. 화합물 자극성 시험의 수행 방법
본 발명은 전술한 "신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리" 또는 "비신경 상피 조직 시트" 를 사용하여 화합물 자극성 시험을 수행하는 방법을 제공할 수 있다.
화합물 자극성 시험을 수행하는 방법으로서, "신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리" 또는 "비신경 상피 조직 시트" 를 시험 물질과 접촉시키는 단계, 및 세포 또는 조직에 대한 시험 물질의 영향을 검출하는 단계를 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하는 방법이 언급될 수 있다.
본 발명의 화합물 자극성 시험을 수행하는 방법의 하나의 구현예는 염료로의 염색 및 추출에 의해 화합물의 독성 및 효능을 평가하는 화합물 자극성 시험을 수행하는 방법이다.
본 발명의 화합물 자극성 시험을 수행하는 방법의 하나의 구현예는 하기 단계 (A) - (D) 를 포함하는 화합물 자극성 시험을 수행하는 방법이다:
(A) "신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리" 또는 "비신경 상피 조직 시트" 를 시험 물질과 접촉시키는 단계, (B) 시험 물질과 접촉된 "신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리" 또는 "비신경 상피 조직 시트" 를 염료로 염색하는 단계,
(C) 염색된 "신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리" 또는 "비신경 상피 조직 시트" 로부터 염료를 추출하는 단계,
(D) 추출된 염료의 양을 정량하여 평가 표적 화합물의 자극성을 평가하는 단계.
<단계 (A)>
"신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리" 또는 "비신경 상피 조직 시트" 를 시험 물질과 접촉시키는 단계는 하기에 설명된다.
시험 물질과 접촉하는 표적은 세포 덩어리 또는 비신경 상피 조직 시트일 수 있다. 이러한 세포 덩어리 또는 비신경 상피 조직 시트를 구성하는 비신경 상피 조직은 바람직하게는 밀착 연접을 형성하고, 더욱 바람직하게는 다열 상피 또는 중층 상피이고, 더욱 바람직하게는 비신경 상피 조직은 각막이다. 이들 비신경 상피 조직은 바람직하게는 기저막 유사 구조를 형성한다. 비신경 상피 조직 시트로서, 임의의 형태의 평평한 세포 배양 디쉬, 및 Transwell 등과 같은 박막형 세포 배양 용기가 사용될 수 있다. 이러한 세포 배양 디쉬 또는 세포 배양 용기는 세포 접착을 촉진시키기 위해 라미닌과 같은 세포외 매트릭스, 또는 폴리-D-라이신과 같은 합성 매트릭스로 코팅될 수 있다.
단계 (A) 에서 사용되는 시험 물질은 그대로 또는 용매로 희석한 후에 사용될 수 있다. 희석에 사용하는 용매로서는, 시험 결과에 영향을 미치지 않는 용매가 바람직하다. 예를 들어, 생리 식염수, PBS, HBSS, DMEM 및 세포 배양용 배지가 사용될 수 있다. 시험 물질이 배양 배지에 불용성이고 양호한 현탁 특성을 달성할 수 없는 경우, DMSO, 에탄올, 미네랄 오일 등이 필요에 따라 가용화 용매로서 사용될 수 있다.
단계 (A) 에서 시험 물질의 노출 조건에서 배양 온도, CO2 농도 등과 같은 배양 조건은 적절하게 결정될 수 있다. 배양 온도는 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어, 약 1% 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다. 단계 (A) 에서 시험 물질의 노출 기간은 또한 적절하게 결정될 수 있다. 노출 기간은 예를 들어, 30 초 내지 2 일, 바람직하게는 1 분 내지 1 일이다.
실험 시스템의 신뢰성을 보장하기 위해, 공지된 양성 대조군 및 음성 대조군 화합물을 시험 물질의 평가와 함께 평가하는 것이 바람직하다. 양성 대조군 화합물로서, 눈 손상 또는 자극과 관련하여 GHS 분류가 1 또는 2 인 화합물, 예를 들어 소듐 도데실 설페이트, 아세트산 및 벤즈알코늄 클로라이드가 사용될 수 있다.
<단계 (B)>
단계 (A) 에서 수득된 시험 물질과 접촉된 "신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리" 또는 "비신경 상피 조직 시트" 를 염료로 염색하는 단계가 하기에 설명된다.
단계 (B) 에서 사용된 염료는 시험 물질에 의해 야기된 밀착 연접의 손상이 평가될 수 있는 한 제한되지 않는다. 염료로서는, 세포 독성이 낮고 시험 결과에 미치는 영향이 적은 것이 바람직하다. 하나의 예는 플루오레세인이다.
단계 (B) 에서의 염료의 농도, 염료를 용해시키기 위한 용매 및 염색 시간과 같은 염색 조건을 적절히 설정할 수 있다. 플루오레세인을 사용하는 경우, 염료의 농도는 예를 들어, 0.0001% 내지 1%, 바람직하게는 0.02% 이다. 염료를 용해시키기 위한 용매는 예를 들어, 생리 식염수, PBS, HBSS, DMEM 과 같은 세포 배양용 배지, 바람직하게는 PBS 이다. 플루오레세인의 경우, 염색 시간은 예를 들어, 10 초 내지 10 분, 바람직하게는 30 초이다. 배경 감소를 목적으로, 샘플은 단계 (B) 의 염색 조건 하에서 적합한 염색 전 및 후에 세척될 수 있다.
<단계 (C)>
염색된 "신경 세포 또는 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리" 또는 "비신경 상피 조직 시트" 로부터 염료를 추출하는 단계가 하기에 설명된다.
단계 (C) 에서의 염료에 대한 추출 조건, 예컨대 염료를 용해시키기 위한 용매 및 추출 시간을 적절히 설정할 수 있다. 염료를 용해시키기 위한 용매의 예는 생리 식염수, PBS, HBSS, DMEM 과 같은 세포 배양용 배지, 바람직하게는 단계 (B) 에서 염료를 용해시키기 위해 사용된 용매와 동일한 것을 포함한다. 플루오레세인이 사용되는 경우, 추출 시간은, 예를 들어 10 초 내지 24 시간, 바람직하게는 10 분이다. 단계 (C) 에서의 추출 조건으로서, 염색된 샘플을 함유하는 튜브 또는 디쉬가 진탕될 수 있다.
<단계 (D)>
단계 (C) 에서 수득된 추출된 염료의 양을 정량하여 평가 표적 화합물의 자극성을 평가하는 단계가 하기에 설명된다.
단계 (D) 에서 추출된 염료의 양을 정량하는 방법은 용매 중의 염료의 양을 평가할 수 있는 한 제한되지 않는다. 이러한 정량 방법으로서는, 예를 들어 흡수 분광광도법 및 형광 분광법이 언급될 수 있고, 형광 분광법이 바람직하다.
시험 물질의 자극성은 단계 (D) 에서 측정된, 시험 물질 처리 샘플로부터 추출된 염료의 농도의 측정 값을 양성 대조 처리군 및 음성 대조 처리군의 측정 값과 비교함으로써 평가될 수 있다.
6. 독성 및 효능 평가용 시약
본 발명의 세포 덩어리, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 세포 덩어리 및 본 발명에 의해 제조된 비신경 상피 조직 시트는 감각 조직일 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 덩어리, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 세포 덩어리 및 본 발명에 의해 제조된 비신경 상피 조직 시트를 함유하는 시험 물질의 독성 및 효율의 평가용 시약이 제공될 수 있다.
7. 치료 약물 및 질환의 치료 방법
본 발명의 세포 덩어리, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 세포 덩어리 및 본 발명에 의해 제조된 비신경 상피 조직 시트를 함유하는 감각 기관의 장애에 기초한 질환에 대한 치료 약물이 제공될 수 있다.
감각 기관의 장애에 기초한 질환에 대한 치료 약물의 예는 본 발명의 세포 덩어리 또는 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 세포 덩어리를 함유하는 현탁액 및 본 발명에 의해 제조된 비신경 상피 조직 시트를 함유하는 이식편을 포함한다.
현탁액의 예는 인공 누액 또는 생리식염수에 세포 덩어리를 현탁시켜 수득한 액체를 포함한다. 현탁액은 세포 덩어리로부터 단리된 비신경 상피 세포를 함유할 수 있고, 또한 세포외 매트릭스 및 히알루론산과 같은 세포의 접착을 촉진하는 인자를 함유할 수 있다.
비신경 상피 조직 시트를 함유하는 이식편은 양막, 및 콜라겐 겔 막과 같은 막-유사 담체 상에 비신경 상피 조직 시트가 형성된 이식편일 수 있다.
추가로, 본 발명의 세포 덩어리, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 세포 덩어리, 또는 본 발명에 의해 제조된 비신경 상피 조직 시트로부터의 비신경 상피 조직의 유효량을 이식을 필요로 하는 표적에게 이식하는 단계를 포함하는, 감각 기관의 장애에 기초한 질환의 치료 방법이 제공될 수 있다.
세포 덩어리에 함유된 비신경 상피 조직이 각막 상피 조직인 경우, 상기 언급된 치료 약물 또는 치료 방법은 장벽 기능 등과 같은 각막 상피 기능이 손상되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이 질환의 예는 재발성 각막 영양장애, 스티븐스-존슨 증후군, 화학적 외상 및 각막 상피 줄기 세포 피폐증을 포함한다.
상기 감각 기관의 장애에 기초한 질환은 감각 기관의 장애에 근거한 동물 질환, 또는 시각 기관, 청각 기관, 후각 기관, 미각 기관 및 피부 등의 비-인간 동물의 감각 기관의 장애에 기초한 질환일 수 있다.
[실시예]
본 발명은 실시예를 참조하여 하기에 보다 상세하게 설명되며, 이것은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 특별히 제한되지 않는 한, 사용되는 시약 및 물질은 상업적으로 입수가능하다.
비교예 1: 인간 ES 세포에서 생성된 신경 조직
인간 ES 세포 (KhES-1 균주, 교토 대학에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기술된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에서 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지 (AK02N, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 (Laminin 511-E8) (Nippi, Inc. 사제) 을 사용하였다.
특정 유지 배양 조작으로서, 서브컨플루언트 인간 ES 세포 (KhES-1 균주) 를 먼저 PBS 로 세척하고, Accumax (Innovative Cell Technologies 사제) 를 사용한 효소 처리를 행하고, StemFit 배지를 첨가하고, 세포를 세포 스크래퍼를 사용하여 배양 디쉬의 표면으로부터 스크래핑하고, 피펫팅에 의해 단일 세포로 분산시켰다. 그 후, 단일 세포 내에 분산된 상기 언급된 인간 ES 세포를 라미닌 511-E8 로 코팅된 플라스틱 배양 디쉬에 시딩하고, Y27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 에 의해 제조된 ROCK 억제 물질, 10 μM) 의 존재 하에 StemFit 배지에서 피더-프리 조건 하에 배양하였다. 6 웰 플레이트 (Corning 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.5 cm2) 를 상기 언급된 플라스틱 배양 디쉬로서 사용하는 경우, 단일 세포 내에 분산된 상기 언급된 인간 ES 세포의 플레이팅된 세포의 수를 1.2 x 104 로 조정하였다. 시딩 한 다음날, 배지의 전체 량을 Y27632 가 없는 StemFit 배지로 교환하였다. 이후, 1 내지 2 일에 1 회, 배지의 전체 량을 Y27632 가 없는 StemFit 배지로 교환하였다. 그 후, 세포가 서브컨플루언스 (배양 면적의 60% 가 세포로 덮힘) 에 도달하는 파종 후 7 일까지 세포를 배양하였다. 배양된 세포를 분화 유도에 사용하는 경우, SB-431542 (TGF-β 신호 전달 경로 억제 물질, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제, 5 μM) 및 SAG (Shh 신호 경로 활성화 물질, Enzo Life Sciences 사제, 300 nM) 를 시딩 후 6 일에 첨가하고 동시에 Stemfit 로 배지 교환하였다.
이렇게 제조된 서브컨플루언트 인간 ES 세포를 PBS 로 세척하고, Accumax 를 사용한 효소 처리를 행하고, 분화 유도를 위해 무혈청 배지를 첨가하고, 세포를 세포 스크래퍼를 사용하여 배양 디쉬의 표면으로부터 스크래핑하고, 피펫팅에 의해 단일 세포로 분산시켰다.
그 후, 단일 세포 내에 분산된 상기 언급된 인간 ES 세포를 비-세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 당 1 x 104 개 세포로 100 ㎕ 의 무 혈청 배지에 현탁시키고, 37℃, 5% CO2 의 조건 하에 현탁액 중에 배양하였다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 5% 녹아웃 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노 티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1x 화학적으로 정의된 지질 농축액 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 유닛/ml 페니실린-50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제) 이 보충된 F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 및 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합물을 사용하였다. 현탁 배양 개시 시 (현탁 배양 시작 후 0 일, 1 단계 시작), Y27632 (최종 농도 20 μM), IWP-2 (Wnt 신호 전달 경로 억제 물질, Tocris Bioscience 사제, 2 μM), 및 SB-431542 (TGF-β 신호 전달 경로 억제 물질, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제, 1 μM) 를 상기 무혈청 배지에 첨가하였다. 이후, Y27632 를 함유하지 않고 IWP-2 및 SB-431542 를 함유하는 무혈청 배지를 현탁 배양 개시 후 3 일에 웰 당 100 ㎕ 로 첨가하였다. 그 후, 절반 양의 배지를, Y27632 를 함유하지 않고 IWP-2 및 SB-431542 (도 1 에서 SB431 로 약칭됨) 를 함유하는 무혈청 배지로 변경시키고, 현탁 배양 시작 6, 10, 13, 17, 21, 24 일에 첨가하였다. 현탁 배양 개시 28 일 후 디쉬에 세포 덩어리를 수집하고, 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION, BIOREVO 사제) 으로 명시야 관찰을 실시하였다 (도 1A-B). 도 1A 의 우측 하단의 스케일 바는 1000 ㎛ 을 나타내고, 도 1B 의 우측 하단의 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 상기 분화 유도법에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 세포 덩어리가 형성되었다.
현탁 배양 개시 후 28 일에 상기 언급된 세포 덩어리를 각각 실온에서 15 분 동안 4% 파라-포름알데히드로 고정시키고, 동결보호 처리로서 밤새 4℃ 에서 20% 수크로스/PBS 에 침지시키고, 동결절편을 제조하였다. 동결절편을 신경 및 망막 조직에서 발현되는 RLDH3 에 대한 항체 (Sigma Aldrich 사제, 토끼), 항-Chx10 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제, 염소), 항-Rx 항체 (Takara Bio Inc. 사제, 기니피그), 대뇌 피질 마커인 항-Bf1 항체 (Takara Bio Inc. 사제, 토끼), 각막 및 중추 신경계 마커인 항-Pax6 항체 (Covance 사제, 토끼) , 각막 및 비신경 조직 마커인 항-pan-사이토케라틴 (Pan CK) 항체 (Sigma Aldrich 사제, 마우스), 뉴런 마커인 항-βIII 튜불린 (Tuj1) 항체 (Sigma Aldrich Ltd. 사제, 마우스), 또는 신경상피 마커인 항-N-캐드헤린 항체 (BD Bioscience 사제, 마우스) 로의 형광 면역염색에 적용하였다. 형광 표지된 2 차 항체로서, Alexa488-표지된 당나귀 항-토끼 항체 (Thermo Fisher Scientific 사제), CF555-표지된 당나귀 항-마우스 항체 (Biotium 사제), CF555-표지된 당나귀 항-염소 항체, CF543-표지된 당나귀 항-기니피그 항체 및 Alexa647-표지된 당나귀 항-마우스 항체를 사용하여 다중 염색을 수행하였다. Hoechst33342 (Sigma Aldrich 사제) 를 핵의 비교 염색에 사용하였다.
직립형 형광 현미경 Axio Imager M2 및 첨부된 소프트웨어인 Axio Vision (Carl Zeiss 사제) 을 사용하여 염색된 섹션의 이미지를 관찰하고 수득하였다. 도 1C 의 우측 하단에 있는 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 도 1F 는 도 1C, D, E 에 대한 핵의 비교 염색 이미지이고, 도 1J 는 도 1G, H, I 에 대한 핵의 비교 염색 이미지이며, 도 1M 은 도 1K 및 L 에 대한 핵의 비교 염색 이미지이다.
결과적으로, 상기 언급된 분화 유도 방법에 의해 유도된 현탁 배양 개시 후 28 일째의 세포 덩어리는 망막에서 발현된 RLDH3, Chx10, Rx 에 대해서는 음성이고 (도 1C, D, G), 대뇌 및 중추 신경계에서 발현된 Bf1, Pax6 에 대해서는 양성이며 (도 1K, H), 뉴런 마커인 Tuj1, N-캐드헤린에 대해서는 양성이기 때문에 (도 1I, L), 이들은 중추 신경계의 세포로부터 형성된 세포 덩어리인 것으로 밝혀졌다. pan-사이토케라틴 양성 조직을 확인할 수 없기 때문에, 비신경 상피 조직이 포함되지 않은 것으로 밝혀졌다 (도 1E).
실시예 1: 인간 ES 세포로부터 생성된 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리
인간 ES 세포 (KhES-1 균주, 교토 대학에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기술된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에서 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다. 비교예 1 과 동일한 방식으로 구체적인 유지 배양 작업을 수행하였다. 그 후, 비교예 1 과 유사한 조건 하에서 96 웰 플레이트에서 현탁 배양을 시작하였다. 이후, Y27632 를 함유하지 않고 IWP-2, SB-431542, BMP4 를 함유하는 무혈청 배지를 현탁 배양 개시로부터 제 2 일에 웰 당 100 ㎕ 로 첨가하였다. BMP4 를 3 nM 로 배지에 첨가하여 웰 내의 그의 최종 농도가 1.5 nM 이 되도록 하였다. 그 후, 절반 양의 배지를, Y27632 또는 BMP 를 함유하지 않고 IWP-2 및 SB-431542 를 함유하는 무혈청 배지로 변경시키고, 현탁 배양 시작 6, 10, 13, 17, 21, 24 일에 첨가하였다. 현탁 배양 개시로부터 28 일 째에 디쉬에 세포 덩어리를 수집하고, 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION, BIOREVO 사제) 으로 명시야 관찰을 실시하였다 (도 2A-B). 도 2A 의 우측 하단의 스케일 바는 1000 ㎛ 을 나타내고, 도 2B 의 우측 하단의 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 결과적으로, 직경이 약 1 mm 이고 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리가 상기 언급된 분화 유도 방법에 의해 인간 ES 세포로부터 형성되었다. 또한, 현탁 배양 21 일 내지 28 일까지 외부의 비신경 상피 조직이 빠르게 부어 오르고 조직과 내부의 신경 조직 사이에 공간이 형성되는 것으로 밝혀졌다.
현탁 배양 개시로부터 28 일 째에 상기 언급된 세포 덩어리를 각각 실온에서 15 분 동안 4% 파라-포름알데히드로 고정시키고, 밤새 4℃ 에서 20% 수크로스/PBS 에 침지시키고, 동결보호 처리에 적용하고, 동결절편을 제조하였다. 동결절편은 항-Chx10 항체, 항-RLDH3 항체, 항-CD56/NCAM 항체 (BioLegend 사제, 마우스), 신경 및 망막 조직 마커인 항-N-캐드헤린 항체, 항-CD326/EpCAM 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 항-Six1 항체 (Sigma Aldrich 사제, 토끼), 항-p63 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제, 마우스), 항-PDGFRβ 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 항-사이토케라틴 18 항체 (Sigma Aldrich 사제, 마우스), 항-사이토케라틴 19 항체 (Thermo Fisher Scientific 사제, 마우스), 비신경 상피 조직 및 각막 마커인 항-pan-사이토케라틴 항체, 기저막 마커인 항-라미닌 항체 (KYOWA PHARMA CHEMICAL CO., LTD. 사제, 마우스), 뉴런 마커인 항-βIII 튜불린 (Tuj1) 항체, 항-C-Maf 항체 (R&D Systems 사제, 마우스), 항-Prox1 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 항-L-Maf 항체 (abcam 사제, 토끼), 수정체 마커인 항-크리스탈린 (Crystallin) αA 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 수정체 및 중추 신경계 마커인 항-Sox1 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 플라코드 마커인 항-Emx2 항체 (R&D Systems 사제, 양) 및 안정화된 미세소관 마커인 항-아세틸화 튜불린 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제, 마우스) 로의 형광 면역염색에 적용하였다. 형광 표지된 2 차 항체로서, Alexa488-표지된 당나귀 항-토끼 항체, CF555-표지된 당나귀 항-마우스 항체, CF555-표지된 당나귀 항-염소 항체, CF543-표지된 당나귀 항-양 항체, Alexa647-표지된 당나귀 항-마우스 항체 및 Alexa647-표지된 당나귀 항-염소 항체를 사용하여 다중 염색을 수행하였다. Hoechst 33342 (Sigma Aldrich 사제) 를 핵의 비교 염색에 사용하였다. 도 2D 는 C 에 대한 핵의 비교 염색 이미지이고, 도 2F 는 E 에 대한 것이고, 도 2H 는 G 에 대한 것이고, 도 2J 는 I 에 대한 것이고, 도 2N 은 K, L 및 M 에 대한 것이며, 도 2P 는 O 에 대한 것이고, 도 2R 은 Q 에 대한 것이고, 도 2T 는 S 에 대한 것이고, 도 2V 는 U 에 대한 것이고, 도 2Y 는 W 및 X 에 대한 것이고, 도 2AB 는 Z 및 AA 에 대한 것이고, 도 2AE 는 AC 및 AD 에 대한 것이고, 도 2AH 는 AF 및 AG 에 대한 것이고, 도 2AK 는 AI 및 AJ 에 대한 것이고, 도 2AN 은 AL 및 AM 에 대한 것이고, 도 2AP 는 AO 에 대한 것이고, 도 2AR 은 AQ 에 대한 것이고, 도 2AV 는 AS, AT 및 AU 에 대한 것이다. 직립형 형광 현미경 Axio Imager M2 및 첨부된 소프트웨어인 Axio Vision 을 사용하여 염색된 섹션의 이미지를 관찰하고 수득하였다. 도 2C, 도 2S 의 우측 하단의 스케일 바는 200 ㎛ 을 나타내고, 도 2W, AO 의 우측 하단의 스케일 바는 100 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, 상기 분화 유도법에 의해 유도된 현탁 배양 개시 후 28 일째의 세포 덩어리 내부는 Chx10, RLDH3, NCAM, N-캐드헤린 양성의 신경 망막의 상피 조직이었고 (도 2C-J), 외부는 EpCAM, Six1, p63, PDGFRβ, 사이토케라틴 18, 19, pan-사이토케라틴 양성의 각막 및 안구 표면 외배엽의 비신경 상피 조직이었던 (도 2K-V) 것으로 밝혀졌다. 또한, 비신경 상피 조직의 일부는 약 100 ㎛ 의 두께로 비후되었고, 비후된 부분은 C-Maf, L-Maf, Sox1, Prox1, Emx2, Pax6, N-캐드헤린, 결정성 (크리스탈린: Crystalline) αA 양성 및 Tuj1 음성이었다. 상기 언급된 제조 방법에 의해 세포 덩어리에서 수정체 플라코드가 형성되고, 수정체 낭포가 함입되고, pan-사이토케라틴, EpCAM, 함입된 수정체의 표면을 덮도록 Six1 양성 각막 조직이 형성되고, 라미닌-양성 기저막 조직이 형성된 수정체의 중심 근처에서 망막 조직과 접촉하는 측에 형성되었다. 또한, 라미닌-양성 기저막 조직은 상피 조직의 한쪽 표면에만 형성되었기 때문에, 형성된 각막 조직은 상피 세포 극성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 형성된 각막 조직의 핵이 층화되었기 때문에, 형성된 각막 조직은 다열 상피 또는 중층 상피인 것으로 밝혀졌다 (도 2W-AR). 또한, RLDH3 및 Chx10 에 대해 양성인 망막 내부 조직과 pan-사이토케라틴에 양성인 외부 비신경 상피 조직 사이에 pan-사이토케라틴-양성의, 비-상피 중간엽 세포가 존재하는 것으로 밝혀졌다 (도 2AS-AV). 전술한 제조 방법에 의해 형성된 세포 덩어리의 개략도가 도 2AW 에 도시되어 있다.
실시예 2: 인간 ES 세포로부터 생성된 세포 덩어리 중의 신경 조직과 비신경 상피 조직 사이의 간극 측정
상기 언급된 실시예 1 에서 수득되고 현탁 배양 개시로부터 28 일째의 상기 언급된 세포 덩어리는 실시예 1 에 기재된 방법에 따르고 신경 및 망막 상피 조직 마커인 항-N-캐드헤린 항체 및 비신경 상피 조직 및 각막 마커인 항-CD326/EpCAM 항체를 사용하여 형광 이중 염색을 실시하고, 형광 현미경에 부착된 소프트웨어인 Axio Vision 을 사용하여 분석하였다 (도 3A-D). 도 3A, 도 3D 의 우측 하단에 있는 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 배양 28 일째의 세포 덩어리 내부의 N-캐드헤린 양성 신경 조직과 그 외부의 EpCAM 양성 비신경 상피 조직 사이에 형성된 간극은 최소 33.37 ㎛, 최대 118.34 ㎛ 이며, 세포 덩어리의 거의 전체 원주에서 신경 상피와 비신경 상피 사이에 30 ㎛ 이상의 간극이 형성됨을 발견하였다 (도 3A-D). 위에서 언급한 간극에는 핵이 없으며 무세 포성이지만, 비상피 세포의 분포는 그 일부에서 확인될 수 있다.
실시예 3: 인간 ES 세포로부터 생성된 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 장기간 배양 및 성숙
인간 ES 세포 (KhES-1 균주, 교토 대학에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기술된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에서 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다. 비교예 1 과 동일한 방식으로 구체적인 유지 배양 작업을 수행하였다. 그 후, 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트를 사용하여 현탁 배양을 수행하였다. 현탁 배양 개시 28 일째에, 세포 덩어리를 1 디쉬 당 48 세포 덩어리로 현탁 배양 (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD. 사제) 을 위해 10 cm 디쉬에 넣고, 무혈청 배지 중에서 최대 90 일의 배양까지 배양하였다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% 녹아웃 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노 티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1x 화학적으로 정의된 지질 농축액 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 유닛/ml 페니실린-50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제) 이 보충된 F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 및 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합물을 1 개 디쉬 당 15 ml 로 사용하였고, 절반 양의 배지를 매 3 내지 4 일마다 교환하였다.
현탁 배양 개시로부터 90 일 째에 상기 언급된 세포 덩어리를 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION, BIOREVO 사제) 으로 명시야 관찰을 실시하였다 (도 4A-C). 도 4A 의 우측 하단의 스케일 바는 1000 ㎛ 을 나타내고, 도 4B, 4C 의 우측 하단의 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 관찰 결과, 배양 90 일째에 세포 덩어리 외부의 조직은 배양 배지에서 구형 구조를 자율적으로 유지하였다 (도 4A). 외부의 중공 조직은 세포가 서로 밀접하게 접착된 상피 조직으로부터 형성되었다 (도 4C). 관찰 후, 세포 덩어리를 실온에서 15 분 동안 4% 파라-포름알데히드로 고정시키고, 밤새 4℃ 에서 20% 수크로스/PBS 에 침지시키고, 동결보호 처리에 적용하고, 동결절편을 제조하였다. 동결절편은 성숙 각막 상피 마커인 항-사이토케라틴 12 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제, 염소), 항-사이토케라틴 5 항체 (Spring Biosciences 사제, 토끼) 및 각막 상피 세포 마커인 항-Mucin4 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 각막 및 중추 신경계 세포 마커인 항-Pax6 항체 및 실시예 1 의 것들과 유사한 조건 하에서 기저막 마커인 항-라미닌 항체로의 형광 면역염색에 적용하였다. 도 4D, 4H, 4L 의 우측 하단에 있는 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, 배양 90 일째의 세포 덩어리에서, 외부의 비신경 상피 조직이 신장되고, 200 ㎛ 이상의 간극이 형성되었다. 상기 언급된 비신경 상피 조직은 사이토케라틴 12, 사이토케라틴 5, Mucci4-양성 각막 상피 조직이며, 라미닌 등으로 구성된 기저막 조직을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 각막 상피 세포막 표면의 정단 측에서 발현된 Mucin4 는 비신경 상피 조직의 외부 표면에 위치하며, 형성된 비신경 상피 조직은 상피 세포 극성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 내부 조직은 Pax6-양성 망막 또는 중추 신경계 조직이었다. 상기 언급된 결과로부터, 현탁 배양에 의해 성숙 각막 상피 조직이 세포 덩어리로부터 수득되었음이 밝혀졌다 (도 4D-N).
실시예 4: 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 생성에서 BMP4 의 첨가 시기의 고려 (1)
인간 ES 세포 (KhES-1 균주, 교토 대학에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기술된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에서 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
비교예 1 과 동일한 방식으로 구체적인 유지 배양 작업을 수행하였다. 그 후, 비교예 1 과 유사한 조건 하에서 96 웰 플레이트에서 현탁 배양을 시작하였다. 현탁 배양 기간 동안 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않은 조건을 대조군으로 하였다 (-BMP4 조건, 도 5A). 현탁 배양 개시와 동시에 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가 한 조건 (Day0+BMP4 조건, 도 5B) 에서, 인간 재조합 BMP4 (R&D Systems 사제, 1.5 nM, 단계 2) 의 개시) 를 추가하였다. 그 후, 현탁 배양 개시로부터 제 1, 2, 3 일에 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가한 조건에서 (Day1 - 3+BMP4 조건, 도 5C-E), Y27632 를 함유하고 IWP-2, SB-431542, BMP4 를 함유하는 무혈청 배지를 웰 당 100 ㎕ 로 첨가하였다. BMP4 를 3 nM 로 배지에 첨가하여 웰 내의 그의 최종 농도가 1.5 nM 이 되도록 하였다. 오직 Day0+BMP4 조건에서만, Y27632 를 함유하지 않고 IWP-2, SB-431542, BMP4 를 함유하는 무혈청 배지를 현탁 배양 개시로부터 제 3 일에 웰 당 100 ㎕ 로 첨가하였다. 분화 유도 개시로부터 제 6 일에 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가한 조건에서 (Day6+BMP4 조건, 도 5F), Y27632 또는 BMP4 를 함유하지 않고 IWP-2 및 SB-431542 를 함유하는 무혈청 배지를 분화 유도 개시로부터 제 3 일에 웰 당 100 ㎕ 로 첨가하고, 제 6 일에 절반 양의 배지를 Y27632 를 함유하지 않고 IWP-2, SB-431542, BMP4 를 함유하는 무혈청 배지로 변경하였다. 다른 조건 하에서, 현탁 배양 개시로부터 제 6 일에 절반 양의 배지를, Y27632 또는 BMP 를 함유하지 않고 IWP-2 및 SB-431542 를 함유하는 무혈청 배지로 변경시켰다. 현탁 배양 개시로부터 제 10 일에 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION, BIOREVO 사제) 으로 명시야 관찰을 실시하였다 (도 5A-B).
그 결과, BMP4 를 첨가하지 않은 조건 하에서, 매끄러운 표면을 갖는 배아체 (embryoid body) 가 형성되었고, 배아체 표면 상에서 비신경 상피 유사 구조를 확인할 수 없었다 (도 5A). 분화 유도의 개시와 동시에 BMP4 를 첨가한 조건에서 (Day0+BMP4), 배아체의 형성이 현저히 억제되었다 (도 5B). 분화 유도의 개시로부터 1 일 및 2 일에 BMP4 를 첨가한 조건에서 (Day1, 2+BMP4), 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하고 중심 부분이, 신경상피 유사 구조가 비신경 상피 유사 층으로 덮힌 2 층 구조를 갖는 세포 덩어리가 형성되었다 (도 5C, D). 양쪽 조건을 비교하여, 제 2 일에 BMP4 를 첨가하면, 제 1 일에 BMP4 를 첨가한 조건에서 수득된 배아체보다 (도 5C), 직경이 약 1.3 배 더 크고 부피가 약 2.2 배 더 큰 배아체가 형성되었다 (도 5D). 분화 유도 개시로부터 제 3 일 및 제 6 일에 BMP4 를 첨가한 조건에서, 외부의 비신경 상피-유사 조직의 형성 효율은 제 2 일에 BMP4 를 첨가한 조건보다 낮았다. 상기 언급된 결과로부터, 현탁 배양 개시로부터 72 시간 이내에 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가가 인간 다능성 줄기 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 형성에 효과적이라는 것이 밝혀졌다.
실시예 5: 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 생성에서 BMP4 의 첨가 시기의 고려 (2)
인간 ES 세포 (KhES-1 균주, 교토 대학에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기술된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에서 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다.
비교예 1 과 동일한 방식으로 구체적인 유지 배양 작업을 수행하였다. 그 후, 비교예 1 과 유사한 조건 하에서 96 웰 플레이트에서 현탁 배양을 수행하였다. 현탁 배양 개시로부터 제 2 일 및 제 3 일에 도립 현미경을 사용하여 응집체의 명시야 관찰을 수행하였다. 도 6A 의 우측 하단에 있는 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 관찰 결과, BMP4 의 첨가에 적합한 현탁 배양 개시로부터 제 2 일의 응집체는 표면에 요철을 나타내고, 왜곡된 형상을 가졌다 (도 6A). 한편, 현탁 배양 개시로부터 제 3 일의 응집체는 제 2 일에 발견된 요철이 감소하였으며, 구에 가까운 형상을 가졌다 (도 6B).
상술한 바와 같이, 현탁 배양 개시로부터 제 2 일 및 제 3 일의 응집체를 실시예 1 에 기재된 방법으로 고정하고, 동결절편을 제조하였다. 동결절편을 신경상피 마커인 항-N-캐드헤린 (NCad) 항체 및 밀착 연접 마커인 항-ZO-1 항체 (Thermo Fisher Scientific 사제, 토끼) 를 사용하여 형광 면역염색에 적용하였다. 사용된 핵의 형광 표지 이차 항체 및 비교 염색은 실시예 1 에 기재된 것들이었다. 도 6C 의 우측 하단에 있는 스케일 바는 100 ㎛ 를 나타낸다. 결과적으로, 현탁 배양 개시로부터 제 2 일의 응집체에서, 응집체의 표면층에 가장 가까운 세포의 일부는 ZO-1 양성이고 밀착 연접을 형성하였다 (도 6C). 한편, 현탁 배양 개시로부터 제 3 일의 응집체에서는, 응집체 내부에서 ZO-1 양성 세포를 취하여 최외각 층에는 국부화가 보이지 않았다 (도 6E). 또한, 현탁 배양 개시로부터 제 3 일의 응집체에서는 N-캐드헤린이 강하게 발현되어, 외층의 세포가 서로 더욱 밀접하게 접착된 영역과 응집체 내부의 세포가 희박한 영역의 2 층 구조를 더욱 명확하게 확인할 수 있다 (도 6I, J). 상기 언급된 결과로부터, 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 제조하는 과정에서 BMP4 의 첨가 시기를 결정하는 방법으로서, 최외층 응집체 중의 세포의 밀착 연접의 검출이 사용될 수 있음을 발견하였다.
실시예 6: 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 생성에서 BMP4 의 농도의 고려
인간 ES 세포 (KhES-1 균주, 교토 대학에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기술된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에서 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다. 비교예 1 과 동일한 방식으로 구체적인 유지 배양 작업을 수행하였다.
이렇게 제조된 서브컨플루언트 인간 ES 세포를 PBS 로 세척하고, Accumax 를 사용한 효소 처리를 행하고, 분화 유도를 위해 무혈청 배지를 첨가하고, 세포를 세포 스크래퍼를 사용하여 배양 디쉬의 표면으로부터 스크래핑하고, 피펫팅에 의해 단일 세포로 분산시켰다. 그 후, 단일 세포 내에 분산된 상기 언급된 인간 ES 세포를 비-세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 당 1 x 104 개 세포로 100 ㎕ 의 무 혈청 배지에 현탁시키고, 37℃, 5% CO2 의 조건 하에 현탁액 중에 배양하였다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 5% 녹아웃 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노 티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1x 화학적으로 정의된 지질 농축액 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 u/ml 페니실린-50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제) 이 보충된 F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 및 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합물을 사용하였다. 현탁 배양 개시 시점에 (현탁 배양 개시부터 제 0 일, 단계 1 의 개시), Y27632 (최종 농도 20 μM), IWP-2 (2 μM) 및 SB-431542 (1 μM) 를 상기 언급된 무혈청 배지에 첨가하였다. 이후, Y27632 를 함유하지 않고 IWP-2, SB-431542 및 BMP4 를 함유하는 무혈청 배지를 현탁 배양 개시로부터 제 2 일에 웰 당 100 ㎕ 로 첨가하였다. 이 경우, 첨가되는 BMP4 의 양은 0.1 nM, 0.25 nM, 0.5 nM, 0.75 nM, 1 nM, 1.5 nM, 5 nM 의 8 가지 조건이었고 첨가 대조군은 없었다. BMP4 를 배지에 대해 설정된 농도의 2 배로 첨가하여 웰에 대해 설정된 최종 농도가 달성되도록 하였다. 이후, 현탁 배양 개시로부터 제 6 일에 절반 양의 배지를, Y27632 또는 BMP 를 함유하지 않고 IWP-2 및 SB-431542 를 함유하는 무혈청 배지로 변경시켰다. 현탁 배양의 개시로부터 제 10 일에 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION, BIOREVO 사제) 하에서 명시야 관찰을 수행하였다 (도 7A-H). 도 7A 의 우측 하단에 있는 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, BMP4 를 첨가하지 않은 조건 하에서, 매끄러운 표면을 갖는 배아체 (embryoid body) 가 형성되었고, 배아체 표면 상에서 비신경 상피 유사 구조를 확인할 수 없었다 (도 7A). 한편, BMP4 를 첨가한 조건 하에서, 신경 표피 유사 세포 덩어리가 0.1 nM 내지 5 nM 중 임의의 농도로 내부에 존재하고, 표면 상에 비신경 상피 조직을 갖는 세포 덩어리가 형성되었다 (도 7B-H). 상기 언급된 결과로부터, 현탁 배양 개시로부터 제 2 일에 BMP4 가 첨가될 때, 농도가 0.1 nM 이상인 한, 비신경 상피 조직이 세포 덩어리의 표면 상에 형성될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 생성에서 각각의 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 영향
인간 ES 세포 (KhES-1 균주) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기술된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에서 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다. 실시예 1 과 동일한 방식으로 구체적인 유지 배양 작업을 수행하였다.
이렇게 제조된 서브컨플루언트 인간 ES 세포를 PBS 로 세척하고, Accumax 를 사용한 효소 처리를 행하고, 분화 유도를 위해 무케세이 (mukessei) 배지를 첨가하고, 세포를 세포 스크래퍼를 사용하여 배양 디쉬의 표면으로부터 스크래핑하고, 피펫팅에 의해 단일 세포로 분산시켰다. 그 후, 단일 세포 내에 분산된 상기 언급된 인간 ES 세포를 비-세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 당 1.2 x 104 개 세포로 100 ㎕ 의 무 혈청 배지에 현탁시키고, 37℃, 5% CO2 의 조건 하에 현탁액 중에 배양하였다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 5% 녹아웃 혈청 대체물, 450 μM 1-모노 티오글리세롤, 1x 화학적으로 정의된 지질 농축액, 50 u/ml 페니실린-50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 F-12+Glutamax 배지 및 IMDM+Glutamax 배지의 1:1 혼합물을 사용하였다. 현탁 배양 개시 시점에 (현탁 배양 개시부터 제 0 일, 단계 1 의 개시), Y27632 (최종 농도 (2 μM) 및 SB-431542 (1 μM) 를 상기 언급된 무혈청 배지에 첨가하였다. Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서, IWP-2 (Tocris Bioscience 사제, 2 또는 5 μM), C-59 (Cayman Chemicals 사제, 2 μM), IWP-L6 (AdooQ bioscience 사제, 1 또는 10 μM), LGK974 (Cayman Chemicals 사제, 1 또는 5 μM), KY 02111 (Cayman Chemicals 사제, 1 또는 5 μM), 또는 XAV939 (Cayman Chemicals 사제, 1 μM) 를 현탁 배양 개시 시에 첨가하였고, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 첨가되지 않는 대조군으로서 DMSO 단독의 첨가 조건이 수행되었다. 이후, Y27632 를 함유하지 않고 각각의 Wnt 신호 전달 경로 억제 성분, SB-431542 및 BMP4 를 함유하는 무혈청 배지를 현탁 배양 개시로부터 제 2 일에 웰 당 100 ㎕ 로 첨가하였다. BMP4 를 3 nM 로 배지에 첨가하여 웰 내의 최종 농도가 1.5 nM 이 되도록 하였다. 현탁 배양 개시로부터 제 6 일에 절반 양의 배지를, Y27632 또는 BMP 를 함유하지 않고 각각의 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 SB-431542 를 함유하는 무혈청 배지로 교체하였다. 현탁 배양의 개시로부터 제 10 일에 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION, BIOREVO 사제) 하에서 명시야 관찰을 수행하였다 (도 8A-K). 도 8A 의 우측 하단에 있는 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다.
그 결과, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 첨가하지 않은 조건에서, 현탁 배양 개시로부터 제 2 일에 심지어 BMP4 를 첨가한 경우에도 비신경 상피 조직이 배아체 표면에 형성되지 않았다 (도 8A). 한편, 현탁 배양 개시 시점으로부터 IWP-2, C-59, IWP-L6, LGK974, KY02111, XAV939 를 첨가한 각 조건 하에서 신경상피 유사 세포 덩어리가 내부에 존재하였고, 표면 상에 비신경 상피 조직을 갖는 세포 덩어리가 형성되었다 (도 8B-K). 상기 언급된 결과로부터, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가가 BMP4 의 첨가에 의한 비신경 상피 조직을 갖는 세포 덩어리의 형성에 유용한 것으로 밝혀졌다.
실시예 8: 인간 ES 세포로부터 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리의 생성에서 분화 유도 전 화합물 처리의 영향
인간 ES 세포 (KhES-1 균주) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기술된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에서 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다. 실시예 1 과 동일한 방식으로 구체적인 유지 배양 작업을 수행하였다. 배양된 세포를 분화 유도에 사용하는 경우, Stemfit 배지 (대조군) 를 사용한 배지 변경과 동시에 아무것도 첨가되지 않는 조건, 300 nM SAG 단독 첨가 조건 (+300 nM SAG), 5 μM SB-431542 단독이 첨가되는 조건 (+5 μM SB-431542), 및 시딩 후 제 6 일에 SAG 및 SB431542 가 동시에 첨가되는 조건 (+SAG/SB) 을 포함하여 4 가지 조건 하에서 세포를 제조하였다.
상기 언급된 처리의 다음날, 서브컨플루언스에 도달한 4 가지 조건 하의 인간 ES 세포를 각각 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리로 현탁 배양함으로써 분화 유도시켰다. 이후, 분화 유도 제 15 일에 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION, BIOREVO 사제) 으로 명시야 관찰을 실시하였다. 각각의 전처리 후 형성된 세포 덩어리는 전체 원주의 80% 이상이 비신경 상피로 코팅된 거의 구형인 세포 덩어리 (등급 1, 예를 들어, 도 9A); 전체 원주의 80% 내지 40% 가 비신경 상피로 코딩된 또는 왜곡된 형태를 가진 세포 덩어리 (등급 2, 예를 들어, 도 9B); 및 세포 덩어리 표면 상의 비신경 상피의 비율이 40% 이하인 세포 덩어리 (등급 3, 예를 들어, 도 9C) 의, 3 단계로 평가되었다.
결과적으로, 배양된 세포는 분화 유도를 위해 사용되며, 시딩 (대조군) 후 제 6 일에 Stemfit 배지의 배지 변화와 동시에 첨가하지 않은 조건 하에 32 개의 세포 덩어리는 6 개의 등급 1 세포 덩어리, 18 개의 등급 2 세포 덩어리, 및 8 개의 등급 3 세포 덩어리를 함유하였다. 300 nM SAG 단독 (+300 nM SAG) 을 첨가한 조건 하의 32 개의 세포 덩어리는 10 개의 등급 1 세포 덩어리, 18 개의 등급 2 세포 덩어리 및 4 개의 등급 3 세포 덩어리를 함유하였다. 5 μM SB-431542 단독 (+5 μM SB-431542) 을 첨가한 조건 하의 32 개의 세포 덩어리는 28 개의 등급 1 세포 덩어리, 4 개의 등급 2 세포 덩어리 및 0 개의 등급 3 세포 덩어리를 함유하였다. SAG 및 SB431542 (+SAG/SB) 을 동시 첨가한 조건 하의 32 개의 세포 덩어리는 30 개의 등급 1 세포 덩어리, 2 개의 등급 2 세포 덩어리 및 0 개의 등급 3 세포 덩어리를 함유하였다. 평가 결과를 도 9D 에 그래프로서 나타낸다. 상기 언급된 결과로부터, 전체 원주의 80% 이상이 비신경 상피로 코팅된 거의 구형인 등급 1 세포 덩어리의 비율이, 처리되지 않은 대조군에 비해, 배양된 세포가 분화 유도에 사용되는 경우 5 μM SB-431542 로의 전처리 또는 SAG 및 SB431542 의 동시 첨가에 의한 전처리를 수행함으로써 현저하게 향상됨을 보여주었다 (도 9D).
실시예 9: 인간 iPS 세포로부터 생성된 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리
인간 iPS 세포 (201B7 균주, iPS Academia Japan, Inc. 에서 입수) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기술된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에서 배양하였다. 피더-프리 배지로는 StemFit 배지를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 을 사용하였다. 비교예 1 과 동일한 방식으로 구체적인 유지 배양 작업을 수행하였다. 그 후, 실시예 1 과 동일한 조건 하에 96 웰 플레이트를 사용하여 현탁 배양을 수행하였다. Y27632 를 함유하지 않고 IWP-2, SB-431542 및 BMP4 를 함유하는 무혈청 배지를 현탁 배양 개시로부터 제 2 일에 웰 당 100 ㎕ 로 첨가하였다. BMP4 를 3 nM 로 배지에 첨가하여 웰 내의 최종 농도가 1.5 nM 이 되도록 하였다. 현탁 배양 개시로부터 제 6 일에 절반 양의 배지를, Y27632 또는 BMP 를 함유하지 않고 IWP-2 및 SB-431542 를 함유하는 무혈청 배지로 변경시켰다. 현탁 배양의 개시로부터 제 10 일 및 제 28 일에 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION, BIOREVO 사제) 하에서 명시야 관찰을 수행하였다 (도 10A-C). 도 10A 및 C 의 우측 하단의 스케일 바는 200 ㎛ 을 나타내고, 도 10B 의 우측 하단의 스케일 바는 100 ㎛ 를 나타낸다. 그 결과, 비신경 상피 조직이 인간 iPS 세포주 201B7 로부터 중심부의 신경 조직을 둘러싸는 세포 덩어리가 실시예 1 에서 인간 ES 세포주 KhES-1 로부터 생산하는 경우와 같이 형성되는 것이 발견되었다.
현탁 배양 개시로부터 제 28 일에 상기 언급된 인간 iPS 세포주 201B7 로부터 제조된 세포 덩어리로부터 실시예 1 에 기재된 방법에 의해 동결절편을 제조하고, 항-Chx10 항체, 항-RLDH3 항체, 항-CD56/NCAM 항체, 항-N-캐드헤린 항체, 항-Pax6 항체 또는 신경 및 망막 조직 마커인 항-Rx 항체, 항-CD326/EpCAM 항체, 항-E-캐드헤린 항체 (R&D Systems 사제, 염소), 항-Six1 항체, 항-p63 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제, 토끼) 또는 비신경 상피 조직 및 각막 마커인 항-pan-사이토케라틴 항체, 또는 뉴런 마커인 항-β III 튜불린 (Tuj1) 항체를 사용하여 형광 면역염색을 수행하였다. 형광 표지된 이차 항체 및 현미경 관찰 조건은 실시예 1 의 방법에 기재된 바와 같았다. 도 10G 는 도 10D-F 에 대한 핵의 비교 염색 이미지이고, 도 10K 는 도 10H-J 에 대한 것이고, 도 10O 는 도 10L-N 에 대한 것이며, 도 10S 는 10P-R 에 대한 것이다.
그 결과 내부가 Chx10, RLDH3, NCAM, N-캐드헤린, Pax6, Rx, Tuj1 양성 신경 망막 조직이고, 외부가 EpCAM, E-캐드헤린, Six1, p63, pan-사이토케라틴 양성 비신경 상피 조직인 세포 덩어리가 실시예 1 의 인간 ES 세포주 KhES-1 로부터 생산하는 경우와 같이, 상기 언급된 생산 방법에 의해 iPS 세포주 201B7 로부터 형성되었다는 것이 발견되었다 (도 10D-S).
실시예 10: 인간 ES 세포로부터의 각막 상피 시트의 제조예
인간 ES 세포주 KhES-1 로부터 실시예 3 에 기재된 방법에 의해 세포 덩어리를 제조하였다. 현탁 배양 개시로부터 제 28 일에 미세 피펫팅에 의해 세포 덩어리를 수집하고, 현탁 배양용 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD. 사제) 에 두고, 추가로 6 일 동안 37℃, 5% CO2 의 조건 하에 현탁 배양하였다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% 녹아웃 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노 티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1x 화학적으로 정의된 지질 농축액 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 유닛/ml 페니실린-50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제) 이 보충된 F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 및 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합물을 사용하였다. 각막 상피 세포를 단리하기 위해, 입체 현미경 하에 5 번 정밀 핀셋을 사용하여 현탁 배양 개시로부터 제 34 일에 배아체로부터 내부의 신경 조직을 제거하고 외부의 각막 상피 조직만 회수하였다. 각막 상피 조직의 회복 전 (도 11A) 및 회복 후 (도 11B) 도립 현미경 하에서 명시야 관찰을 수행하였다. 도 11A 의 우측 하단에 있는 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 관찰 결과, 세포 덩어리 외부에 존재하는 각막 상피 조직이 효율적으로 단리될 수 있음이 밝혀졌다 (도 11B). 그 후, 회수된 조직을 PBS 로 세척하고, Accumax+10 μM Y-27632 를 첨가하고, 혼합물을 37℃ 에서 15 분 동안 따뜻한 배쓰에서 반응시켰다. 첫 번째 반응 후, 피펫팅으로 조직을 해리시키고 37℃ 에서 5 분 동안 따뜻한 배쓰에서 추가로 반응시켰다. 제 2 반응의 완료 후 및 다시 피펫팅한 후, 10% KSR gfcdm 배지를 첨가하고, 공극 크기가 40 ㎛ 인 세포 스트레이너 (Corning 사제) 에 의해 불순물을 제거하였다. 수득한 세포 현탁액을 220G 에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 10% KSR gfcdm+10 μM Y-27632 에 재현탁시키고, 세포를 계수하였다. 4 웰 플레이트 (Thermo Fisher 사제) 를 0.5 ㎍/cm2 의 라미닌 511E8 로 코팅하고, 세포를 5 x 104 세포/cm2 의 밀도로 시딩하였다. 이를 위해 사용된 무혈청 배지는 10 μM Y-27632 및 10 ng/ml bFGF 가 보충된 10% KSR gfcdm 이고, 세포를 37℃, 5% CO2 의 조건 하에 배양하였다. 3 일 동안 배양한 후, 도립 현미경 하에서 명시야 관찰을 수행하였다 (도 11C). 도 11C 의 우측 하단에 있는 스케일 바는 100 ㎛ 를 나타낸다. 관찰 결과, 단리된 각막 상피 세포의 장치에의 접착 및 세포의 밀접한 접착이 관찰되었으며, 각막 상피 시트가 형성될 수 있음을 보여주었다.
실시예 11: 인간 ES 세포로부터 생성된 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 함유하는 세포 덩어리를 사용하는 화합물 자극성 시험
인간 ES 세포주 KhES-1 로부터 실시예 3 에 기재된 방법에 의해 세포 덩어리를 제조하였다. 현탁 배양 개시로부터 제 28 일에 마이크로피펫을 사용하여 세포 덩어리를 수집하고, 현탁 배양용 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD. 사제) 에 두고, 추가로 9 일 동안 37℃, 5% CO2 의 조건 하에 현탁 배양하였다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% 녹아웃 혈청 대체물 (Thermo Fisher Scientific 사제), 450 μM 1-모노 티오글리세롤 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사제), 1x 화학적으로 정의된 지질 농축액 (Thermo Fisher Scientific 사제), 50 유닛/ml 페니실린-50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (Nacalai Tesque 사제) 이 보충된 F-12+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 및 IMDM+Glutamax 배지 (Thermo Fisher Scientific 사제) 의 1:1 혼합물을 사용하였다.
현탁 배양 제 37 일에 상기 언급된 방법에 의해 제조된 세포 덩어리를 튜브 당 3 개의 덩어리로 1.5 ml 마이크로튜브에 첨가하고, PBS 로 2 회 세척하였다. 그 후, 시험 화합물을 PBS 로 2.5% 의 농도로 희석하여 얻은 화합물 용액을 마이크로튜브에 첨가하고, 세포 덩어리를 37℃, 5% CO2 의 조건 하에서 24 시간 동안 화합물로 처리하였다. 이때의 시험 화합물로서, 카테고리 1: 심한 눈 손상 (비가역적 작용) 으로 분류된 GHS 눈 자극성을 갖는 프로메타진 히드로클로라이드 (Sigma Aldrich 사제), 및 카테고리 2: 자극성 (가역적 작용) 으로 분류된 4-포르밀벤조산 (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. 사제) 을 사용하였고, PBS 단독으로 처리된 세포 덩어리는 첨가 없이 대조군으로 사용되었다. 화합물 처리 후의 세포 덩어리를 PBS 로 3 회 세척하고, 0.02% 플루오레세인/PBS 용액 (Sigma Aldrich 사제) 으로 30 초 동안 추가로 염색한 후, PBS 로 4 회 세척하였다. 세척 후 세포 덩어리를 200 ㎕ PBS 로 10 분 동안 처리하고 세포 덩어리에 혼입된 플루오레세인을 추출하였다. 상기 언급된 방법에 의해 제조된 추출물 중의 플루오레세인의 농도는 여기 485 nm 및 방출 535 nm 의 조건 하에서 형광 플레이트 판독기 (2104 EnVision 멀티표지 계수기, Perkin Elmer 사제) 를 사용하여 측정되었다.
결과적으로, 카테고리 1 에서 프로메타진 히드로클로라이드로 처리된 세포 덩어리와 카테고리 2 에서 4-포르밀벤조산으로 처리된 세포 덩어리 사이에 플루오레세인의 혼입 후 용출량에서 상당한 차이가 발견되었다 (도 12A). 이때, 대조군으로서 PBS 로만 처리된 세포 덩어리로부터의 용출량은 검출 한계 미만이었다. 상기 언급된 결과로부터, 신경 조직 및 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 사용하여 시험관 내에서 화합물 자극성 시험을 수행할 수 있고 본 명세서에 기재된 제조 방법에 의해 제조될 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명에 따르면, 신경 조직, 예컨대 망막 등, 신경 세포 및 비신경 상피 조직, 예컨대 각막 등을 함유하는 세포 덩어리를 다능성 줄기 세포로부터 저비용으로 효율적으로 제조할 수 있다.
본원은 일본에 출원된 일본 특허출원 2017-226308 (출원일: 2017 년 11 월 24 일)을 기초로 하며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.

Claims (16)

  1. 다음 단계 (1) 및 (2) 를 포함하는, 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법:
    (1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
    (2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계.
  2. 다음 단계 (a), (1) 및 (2) 를 포함하는, 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리의 제조 방법:
    (a) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 2) 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에 피더 세포의 부재 하에서 다능성 줄기 세포를 유지-배양하는 단계,
    (1) 단계 a 에서 유지-배양된, 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
    (2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 PORCN 억제제인, 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1) 및/또는 단계 (2) 에서의 배양이 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 추가 존재 하에 수행되는, 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 수득된 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리.
  6. 하기 단계 (1) 내지 (4) 를 포함하는, 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법:
    (1) 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
    (2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계,
    (3) 제 2 단계에서 수득된 세포 덩어리로부터 2) 비신경 상피 조직을 수집하는 제 3 단계,
    (4) 제 3 단계에서 수득된 2) 비신경 상피 조직을 분산시키고 이를 평면에서 배양하여, 비신경 상피 조직 시트를 수득하는 제 4 단계.
  7. 하기 단계 (a) 및 하기 단계 (1) 내지 (4) 를 포함하는, 비신경 상피 조직 시트의 제조 방법:
    (a) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 2) 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에 피더 세포의 부재 하에서 다능성 줄기 세포를 유지-배양하는 단계,
    (1) 단계 a 에서 유지-배양된, 다능성 줄기 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제 1 단계,
    (2) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 제 1 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를 수득하는 제 2 단계,
    (3) 제 2 단계에서 수득된 세포 덩어리로부터 2) 비신경 상피 조직을 수집하는 제 3 단계,
    (4) 제 3 단계에서 수득된 2) 비신경 상피 조직을 분산시키고 이를 평면에서 배양하여, 비신경 상피 조직 시트를 수득하는 제 4 단계.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 2) 비신경 상피 조직이 각막 또는 이의 전구 조직인 제조 방법.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 수득된 비신경 상피 조직 시트.
  10. 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리로서, 1) 신경 세포 또는 신경 조직의 표면의 30% 이상이 2) 비신경 상피 조직으로 코팅되고,
    2) 비신경 상피 조직으로 코팅된 1) 신경 세포 또는 신경 조직의 표면 영역의 적어도 일부에, 30 ㎛ 이상의 외부 면 상에 1) 신경 세포 또는 신경 조직과 2) 비신경 상피 조직 사이의 거리를 갖는 간극이 형성되는, 세포 덩어리.
  11. 제 10 항에 있어서, 2) 비신경 상피 조직이 각막 또는 이의 전구 조직인 세포 덩어리.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 1) 신경 세포 또는 신경 조직이 중추 신경계 세포 또는 조직 또는 이의 전구 조직인, 세포 덩어리.
  13. 제 12 항에 있어서, 중추 신경계 세포 또는 조직이 망막인, 세포 덩어리.
  14. 하기 단계를 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하는 방법:
    제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리, 또는
    제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 수득된 1) 신경 세포 또는 신경 조직 및 2) 비신경 상피 조직을 포함하는 세포 덩어리를, 시험 물질과 접촉시키는 단계, 및
    세포 또는 조직에 대한 시험 물질의 영향을 검출하는 단계.
  15. 하기 단계를 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하는 방법:
    제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 비신경 상피 조직 시트를 시험 물질과 접촉시키는 단계, 및
    비신경 상피 조직 시트에 대한 시험 물질의 영향을 검출하는 단계.
  16. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 세포 덩어리, 또는 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 비신경 상피 조직 시트를 포함하는, 감각 기관의 장애로 인한 질환에 대한 치료 약물.
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