CN102165058A - 中胚层来源的ISL 1+多潜能细胞(IMPs)的组合物、心外膜祖细胞(EPCs)和多潜能CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)及其使用方法 - Google Patents

中胚层来源的ISL 1+多潜能细胞(IMPs)的组合物、心外膜祖细胞(EPCs)和多潜能CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中胚层来源的ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)产生和维持方法，含有上述细胞的大量多能细胞和心外膜多能细胞(EPCs)的生产以及利用这些细胞生产内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、血管细胞和其它细胞的方法和在本文中另有公开的相关方法，以及其它方面。本发明还涉及包含细胞群的组合物。

Description

中胚层来源的ISL 1+多潜能细胞(IMPs)的组合物、心外膜祖细胞(EPCs)和多潜能CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)及其使用方法
技术领域
本发明涉及了中胚层来源的ISL 1+多潜能祖细胞(Multipotent Progenitors)(IMPs)产生和维持方法及其组合物，如本文中另有公开的生产多种多潜能祖细胞的相关方法，以及其它方面。本发明还公开了在治疗方法中使用这些细胞的方法。本发明还涉及一项发现，即，使用相似的方法，可使人多能干细胞(human pluripotent stem cells)，包括胚胎干细胞(hESCs)和人诱导多能干细胞(hiPSCs)，分化成Isl 1+多潜能心血管祖细胞(multi-potent cardiovascular progenitors)(IMPs)。
本发明还涉及了hESC和hiPSC-来源的IMPs向威尔姆氏肿瘤蛋白(Wilm’s tumor protein)1阳性(Wt1+)的多潜能心外膜祖细胞(multi-potent epicardial progenitor cell，EPC)的有效转化。EPCs能够分化成平滑肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞并随后成为冠状动脉脉管***(coronary vasculature)的组分。由于EPC是构成冠状动脉血管***的细胞的祖细胞，其具有作为治疗细胞、作为药物筛选工具和作为研究工具的用途。如文中所详尽阐述的内容，这些细胞也可以分化成心肌细胞以及其它。
本发明进一步涉及了c-Kit+CXCR4+多潜能祖细胞(C56C细胞)的发现，其可以由多潜能迁移细胞(MMCs)，或者由包括hESCs和hiPSCs的多能干细胞直接制备。如本文中的其它描述，C56C细胞是多能细胞，其具有归巢特性(homing characteristic)的特征(该细胞也可描述为归巢的中胚层来源的多能细胞)，该特征证明其有利于修复继发于多种病态和/或病情的已受损和/或已损伤的组织。本发明择一描述了产生这些细胞的方法和在治疗中使用这些细胞的方法。
相关申请和授权支持
本申请要求以下临时申请的优先权的利益：2008年7月25日提交的题为“源自中胚层的hESC来源的多潜能祖细胞物质的方法和组合物”的US61/137,058；2008年11月10提交的题为“MMCs和C56C在细胞治疗中的应用”的US61/198,861；和2009年5月7日提交的题为“由人多能干细胞产生多潜能心外膜祖细胞(EPCs)″的US61/215,621，通过参考将这些申请全文引入本文。
背景技术
人胚胎干细胞(hESC′s)(hESCs的标记物包括SSEA3，TRA-1-60，TRA-1-81抗原，Nanog，Oct4)是能够分化成三胚胎胚层来源的和胚外谱系(lineage)来源的所有细胞的多能细胞群。图33。hESC′s的该特点在细胞治疗(如糖尿病、心脏病、神经退行性疾病)、药物发现和发育模型中具有重要意义。
其它的多能细胞类型已在小鼠中得到了鉴定。原始外胚层样细胞(primitive ectoderm like cells)(EPL；Rathjen等，1999，J.Cell Sci)表现出由mESC′s形成，并具有分化成mESC′s的能力。近来，鉴定了一种具有hESC′s特征(Nanog+Sox2+Oct4+)的新的小鼠细胞，即着床后外胚层干细胞(post-implantation epiblast stem cells)(EpiSC；Tesar等，Nature 448：196-202；2007)。这些来自小鼠的多能细胞类型都能够在体外或在畸胎瘤检测(teratomaassay)中产生三胚胎胚层。
外胚层干细胞(EpiScs)和诱导多能干细胞(iPS)适合广谱的多能细胞类型，在概念上，本申请所述的技术能够应用于这些多能细胞类型及其它多能细胞类型(即，首要多能细胞(primate pluripotent cells))。EpiScs外胚层干细胞是从早期的着床后阶段的胚胎分离而得的，且表达Oct4并且是多能的(Tesar等，Nature，448卷，p.196，2007年7月12日)。诱导多能干细胞(iPS细胞)是通过4个基因(c-myc，Klf4，Sox2，Oct4)的逆转录病毒转导，将成成体皮肤成纤维细胞或者其它成人体细胞去分化回到多能状态而得到的(Takahashi和Yamanaka，Cell 126，663-676，2006年8月25日)。
开发其它非ESC的、自我更新的、多能/多潜能干细胞的优势将有助于改善发育模型，改善定向分化为成体细胞并实现比传统方法更有效且成本更低的方法。
人多能细胞(如人胚胎干细胞[hESCs]和诱导多能干细胞[iPS细胞])能够通过一个双潜能中内胚层(T+，MixL1+)祖细胞分化得到，该双潜能中内胚层能够进一步分化成宽泛的中胚层谱系，如骨骼、血液、肌肉和肾脏。参见图12。我们通过向培养基中添加小分子化合物已经开发出人多能细胞分化成多潜能迁移细胞(MMCs)的条件。图13。这些化合物是为人熟知的GSK3活性的抑制剂(BIO)和TGFβ/激活素A(Activin A)/诺达尔信号(Nodal signaling)的抑制剂(SB431542)。通过进一步的处理，MMCs能够转化为CXCR4+CD56+细胞群(C56Cs，CXCR4+/CD56+细胞)，该细胞群上调其他细胞表面标记物。间质干细胞表达标记物中的一部分，而不是全部。除了表达细胞因子受体CXCR4和CD56之外，C56Cs能够上调干细胞标记物c-Kit。C56C不表达造血干细胞的标记物，如CD45，或者内皮标记物，如CD31。
由于C56Cs表达中胚层来源的干/祖细胞(如骨胳骨髓衍生间质干细胞)常见的标记物和已公知为与干细胞向缺血性炎症组织的“归巢(homing)”相关的细胞因子信号的受体，因此有可能这些细胞会具有向组织损伤位点的能力。通过静脉注射进行全身给药将成为细胞组织归巢并参与修复过程的一种方法。一旦这些细胞在损伤组织定植，他们可能会通过旁分泌机制或通过转分化成直接参与修复的细胞来促进组织修复。这些细胞也可能通过免疫调节(抑制T细胞，自然杀伤细胞活性)参与炎症反应的抑制过程。
心外膜(epicardium)构成了脊椎动物心脏外表层，由源于横隔膜的原心外膜发育而来。心外膜是由通过心外膜下***与心肌相连的单层平间皮所组成的(Manner等，2001，细胞组织器官(Cell Tissues Organs)169，89-103)。在心脏发育中，心外膜的形成与冠状动脉血管的发育同步(Olivey等，心血管医学动态(Trends in Cardiovasc Med)2004，14，247-251)。原心外膜大概在发育中的心脏跳动时与其开始接触，自此，原心外膜将在心肌上伸展形成一层新膜，心外膜。然后，心外膜产生多种细胞类型，包括平滑肌细胞，内皮细胞，心脏成纤维细胞，它们在一起形成冠状动脉脉管***。见图36。心外膜细胞也具有分化成心肌细胞的能力(Zhou等，2008自然(Nature)454，109-113)。在侵入心肌细胞表面后，紧接着，心外膜细胞亚群经历了一次从上皮到间质的转化且迁移进入心外膜下空间。这些细胞中的一部分接着具有了进一步迁移到心肌紧密区域的能力。在心外膜下空间和心肌层中，随着心外膜来源的的成血管细胞联合形成原生血管丛，冠状动脉血管形成。最终，这些内皮管长合形成更大的成为冠状动脉和静脉的血管。组成冠状动脉动脉脉管***的补充的细胞包括平滑肌和内皮细胞及分散的成纤维细胞-都起源于原心外膜/心外膜中的祖细胞。心外膜通常通过表达威尔姆氏母肿瘤蛋白1(WT1)、T-盒因子18(T-box factor 18，TBx18)，心外膜素(epicardin)(Tcf21)和RALDH2来表示(Zhou等，2008；Cai等，2008，自然(Nature)454，104-108)。WT1+的心外膜被认为是由Isl 1+Nkx2.5+祖细胞形成的(Zhou等，2008)。
附图说明
图1：hESCs用(1)Wnt3a(25ng/ml)+BMP4(100ng/ml)处理4-6天之后，或者，用(2)BIO(2μM)+BMP4(100ng/ml)处理4-6天之后，Isl 1+IMPs的产生的示意图。IMP细胞能够保持稳定的自我更新状态至少10个传代而无IMP标记物表达和分化潜能的丧失。
图2：用Bio(2μM)和BMP4(100ng/ml)在已知成分培养基(defined media)中处理IMP′s后，自我更新IMP群的产生。WA09 hESCs以1∶6的比例每4-6天传代并在(P)0-3传代用4％多聚甲醛固定。将每个传代用A)Isl 1，B)Nkx2.5，C)E-钙粘蛋白(E-cadherin)，以及D)β-连环蛋白(β-catenin)和Nanog进行免疫染色。Isl 1和Nkx2.5在所有传代中都表达。开始，β-连环蛋白定位在P0的核中，在传代过程中变得更加分散。E-钙粘蛋白(上皮细胞的标记物)同hESC的标记物Nanog一起消失。在DAPI(核染色剂)下显示融合图像。图像为20×放大率。
图3：Isl 1+多潜能祖细胞(IMPs)的克隆繁殖。在BIO(2μM)和BMP4(100ng/ml)中生长24-336小时并在最初72小时利用甲基纤维素(最终浓度0.9％)处理的AccutaseTM传代的IMP细胞的10X放大率亮视野图像。
图4：来自自我更新的IMP′s(最初来源于WA09hESCs)的心肌细胞的产生。第五传代IMP′s在去除激活素A和IGF并加入VEGF(10ng/ml)和DKK1(150ng/ml)的已知成分培养基中生长十四天。细胞在4％多聚甲醛中固定，并对平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin)(SMA)，肌节肌动蛋白(sarcomeric actin)(Sarc.Actin)和心脏肌钙蛋白T(cardiac troponin)(cTNT)进行免疫染色。共聚焦图像以40×放大率成像。
图5：在去除肌动蛋白A和IGF的已知成分培养基中，用BMP4(10ng/ml)和DKK1(150ng/ml)处理后，来自IMP′s(来源于WA09)的内皮细胞的产生。细胞在4％多聚甲醛中固定，并对VE-钙粘蛋白和CD31进行免疫染色。以Dapi作为核染色剂。所示为Dapi/VE-钙粘蛋白/CD31的融合图片。荧光图像为20和40×放大率。
图6：用Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(100ng/ml)处理14天后，来自IMP′s(来源于WA09)的平滑肌细胞的产生。细胞以1∶4-1∶6比例分开，在4％多聚甲醛中固定，并对A)平滑肌肌动蛋白(SMA)和B)平滑肌钙调理蛋白进行阳性免疫染色并对心肌细胞标记C)肌节肌动蛋白(Sarc.肌动蛋白)进行阴性免疫染色。DNA用dapi染色。所示为SMA/Dapi、钙调理蛋白/Dapi和Sarc.肌动蛋白/Dapi的融合图像。图像为20和40×放大率。
图7：在含Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(100ng/ml)的已知成分培养基中，WA09 hESCs经过4天分化成Islet1+多潜能祖(IMP)细胞。hESCs和IMP细胞用SSEA3或PDGFRα抗体染色，并进行流式细胞术(flow cytometry)分析。标明了每个阶段的SSEA3或PDGFRα呈阳性的细胞的百分比含量。
图8：表示自我更新的MMCs向c-kit+CXCR4+祖细胞类型的分化的示意图。
图9：在已知成分培养基的条件下，加入BMP4、Wnt3a和丁酸钠(NB)后的6天期间，BG02 hESC来源的MMCs的分化。展示了对BG02 ES细胞、第23传代的MMCs(MMC p23)以及在第二天(d2)、第四天(d4)和第六天(d6)的分化MMC p23的PDGFRα、CXCR4、KDR、c-KIT、CD56(N-CAM)和Islet1转录本的6天期的Q-PCR转录分析。
图10：在已知成分培养基的条件下，加入BMP4、Wnt3a和丁酸钠后的2(A)、4(B)和6(C)天，BG02来源的分化的MMC的流式细胞术分析的直方图。相对于每种抗体的同型对照(isotype control)，分别计算了SSEA3、c-KIT、CXCR4、CD56、CD31、PDGFRα和KDR的阳性细胞百分比。(D)如(A-C)所述的2、4和6天的分化的MMCs亮视野图片(c-KIT+CXCR4+)。10×，20×放大率。
图11：用于阐述在激活素/Nodal信号的抑制剂和/或BMP信号(头蛋白(Noggin)，例如C化合物)的抑制剂存在下，通过与GSK3抑制剂(如BIO)接触，在已知成分培养基中培养的hESCs产生多种多潜能间质祖细胞的原理的通用模型。这些细胞一般称为GABi细胞——GSK3、激活素/Nodal信号、BMP信号抑制剂细胞。
图12.表示自我更新人多能干细胞(hESCs，iPS细胞)向中内胚层(MesEnd)然后向中胚层(Meso)的分化的示意图。多能细胞和中内胚层的标记物按照能够在中胚层谱系中产生的谱系类型进行指示。
图13.表示自我更新人多能干细胞(hESCs，iPS细胞)向称为多潜能迁移细胞(MMC)的中胚层来源的祖细胞的分化的示意图。例如BIO和SB431542的小分子抑制剂可添加到hESCs以促进细胞向MMCs的转化。MMCs能够保持稳定的细胞群并且因此自我更新。
图14.表示自我更新人多能干细胞(hESCs，iPS细胞)向MMCs然后向CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)的分化的示意图。MMCs的产生如图2中所示。然后通过去除BIO和SB431542并加入BMP4、Wnt3a和丁酸钠，MMCs在3-6天期间里转化为C56Cs。C56Cs和间质干细胞类似，表达CXCR4和CD56但不表达造血干细胞(CD45)或内皮细胞(CD31)的标记物。通过hESCs直接分化成MMCs或者由自我更新MMCs可产生C56Cs。
图15.利用C56Cs作为细胞治疗策略一部分的策略，例如，在该策略中通过静脉注射进行全身给药。然后细胞向组织受损位点、炎症位点和骨髓(例如)“归巢”，在该位点它们将会刺激组织修复/再生。这不会阻碍这些细胞对组织受损/炎症位点的直接应用。
图16.在C56Cs向炎症位点、组织受损位点“归巢”后，他们能够通过几种方式潜在地参与组织再生-修复。首先，通过旁分泌机制，“归巢”的C56Cs释放细胞因子(cytokines)、生长因子(growth factors)和其它分子以刺激修复过程。这涉及到局部环境中具有一些再生功能的细胞的募集。其次，这些细胞可转分化成直接促进组织修复/再生的功能细胞类型。
图17、18.WA09 hESCs、由WA09 hESCs产生的MMCs、用BMP4，Wnt3a和丁酸钠处理2、4和6天产生的C56Cs的流式细胞术分析。
图19.由流式细胞术测得的MMCs和C56Cs的细胞表面标记物的总结。
图20.MMCs和C56Cs能够用于缺血心脏组织再生的一般示意图。MMCs和C56Cs(都为CXCR4+)静脉给药(例如)至动物体内。然后，细胞归巢至局部缺血和炎症位点。通过所示方法评估动物的功能恢复。
图21.[111In]肟-标记的细胞向缺血心脏、骨和肝-肺的“归巢”。用[111In]肟将C56Cs标记5分钟，用10％大鼠血清清洗以去除未结合的放射性标记(Caveliers等，2007核医学和分子影像季刊(Q J Nucl Med Mol)51：61-66)，然后注射(约2-4×106细胞每0.1ml盐水)到因手术结扎左冠状动脉前降支导致心脏缺血的史-道二氏(Sprague Dawley)大鼠的尾静脉中。然后在输注后24、48和72小时，用伽玛摄像机对动物进行“活体”核成像。用箭头指示了标记的心脏区域。其它积累的区域也进行了指示。经过72小时，信号由于放射性衰变和清除而减弱。所示为整体二维图像。
图22.如图10中所示相同的大鼠心脏的连续短轴切面的放射自显影图。在细胞输注72小时以后，取出心脏，组织固定(如下层图所示)并接触放射自显影膜8天(上层图)。
图23、24.实验1.[111In]肟-标记细胞向2只大鼠(图8-大鼠#1；图9-大鼠#2)的缺血心脏、骨骼和肝、肺、脾的“归巢”。用[111In]肟标记C56Cs，然后注射(约2×106细胞每0.1ml盐水)到史-道二氏大鼠的尾静脉中，然后在输注后0.1、2和24小时用伽玛摄像机进行‘活体’核成像。灰色箭头表示骨骼的吸收：黑色箭头表示心脏的吸收(incorporation)。
图25、26.实验2.[111In]肟-标记细胞向2只大鼠(图21-大鼠#1；图22-大鼠#2)缺血心脏的“归巢”。用[111In]肟对C56Cs进行标记，然后注射(约2×106细胞每0.1ml盐水)到史-道二氏大鼠的尾静脉，然后在输注2小时后用伽玛摄像机进行‘活体’核成像。箭头表示心脏的吸收。
图27.接受盐水(0.1ml)给药至尾静脉的有急性心肌梗塞的无胸腺大鼠的经胸超声波心动描记检查(trans-thoracic echocardiography)。梗塞后三天期间，每天进行盐水给药。输注后2周进行超声波心动描记检查。短轴视图和长轴视图如图中所示。在缺血区域清晰可见薄的，无跳动的心肌壁。
图28.接受C56Cs(一剂量为每0.1ml盐水约2×106细胞)给药至尾静脉的有急性心肌梗塞的无胸腺大鼠的经胸超声波心动描记检查。梗塞后三天期间，每天进行一剂量细胞的给药。输注后2周进行超声心动图。短轴视图和长轴视图如图中所示。与图25所图示的大鼠相反，可观察到增厚的跳动的心肌壁。
图29.在用盐水单独(细胞；动物2)处理或C56Cs(-细胞，动物3)处理后2周时无胸腺大鼠(如图23，24中所示)的高分辨率MRI扫描图。2张动物各自的舒张视图和收缩视图如图所示。
图30.在用盐水单独(-细胞；动物7)处理或C56Cs(+细胞，动物5)处理后2周时无胸腺大鼠(3，4)的高分辨率MRI扫描图。2张动物各自的舒张视图和收缩视图如图所示。
图31.定位在光血栓形成(photothrombiotic)的脑卒中区域的GFP+细胞的2-光子共聚焦图像。德克萨斯红染色使脉管呈红色。
图32.取自患有光血栓形成的脑卒中的小鼠的冷冻脑切片的免疫荧光染色。图像显示了GFP+融合的C56C来源的细胞在边缘区(penumbra)和脉络丛附近的定位。GPF+细胞的定位如箭头指示。这些切片中呈现的细胞显示了指示动态行为的多重进程(由实时2-光子成像观察到)。
图33.图显示了人多能干细胞(如hESCs和hiPSCs)分化成三个胚胎胚层(外胚层，中胚层和定型内胚层(definitive endoderm))和胚外谱系的能力。多能细胞通常是Oct4+和Nanog+。在适当条件下，多能细胞可以在稳定，自我更新的状态下维持。
图34.多能细胞(Oct4+，Nanog+)生长为IMP(Isl 1+)细胞，然后生长为Wt1+原心外膜/心外膜的分化途径的示意图。
图35.Wt1+原心外膜/心外膜能够分化成平滑肌、内皮细胞、心脏成纤维细胞和心肌细胞。它们因此能够产生冠状动脉脉管***和心肌。
图36.初始细胞参与了冠状动脉脉管***和冠状动脉脉管***的主要血管的形成。
图37.用BMP4和Wnt3a处理人iPSCs(Fib-iPS4)经过4天可分化成Islet1多潜能祖细胞(IMPs，Isl 1+)。免疫染色表明用BMP4和Wnt3a处理后，hiPSCs将失去Nanog，Nct4的表达，但是，会上调Nkx2.5和Isl 1。作为该过程的一部分，如E-钙粘蛋白的下调和斯奈尔(Snail)的上调所指示的，iPSCs经历了上皮细胞至***的转化。
图38.通过Q-PCR分析，分析了用BMP4和Wnt3a处理(Fib-iPS4)4天的hiPSCs(Fib-iPS4)和hiPSCs的标志物转录本。在这期间，Isl 1和汉德(Hand)2显著增加。试验进行了三次重复。误差线代表平均值的标准误(standard error)。
图39.显示多能细胞(hESCs和hiPSCs等)的分化途径的示意图，最初分化成IMP(Isl 1+)细胞，接着分化成我们称为心外膜祖细胞(EPCs，Wt1+)的原心外膜/心外膜样细胞。每个阶段在已知成分培养基(DM)中加入的因子如图所示。
图40.用BMP4、Wnt3a和全反式视黄酸对来源自hESCs(WA09)的IMPs细胞进行了所示时间处理。随着IMP细胞向EPCs的转变，它们下调了Isl 1、汉德(Hand)1和Nkx2.5，但是上调了其它标记，如Raldh2、Tbx18、Tcf21(心外膜素)和Tbx5。q-PCR试验进行了三次重复且以平均值的标准误显示。
图41.免疫染色分析表明EPCs表达Wt1。20×物镜。
图42.用BMP4，Wnt3a和全反式视黄酸对来源自hiPSCss(Fib-hPS4)的IMPs细胞进行了为期16天的处理。随着IMP细胞向EPCs的转化，它们会下调Isl 1，但是上调Wt1、Tbx18和Tbx5。q-PCR试验进行了三次重复且以平均值标准误显示。
图43.A.显示了Wt1+心外膜的可能的分化结果的示意图，例如平滑肌、内皮细胞、心脏成纤维细胞和心肌细胞。显示了每个潜在因子处理方案。B.表示心外膜能够分化产生冠状动脉脉管***谱系(平滑肌，内皮细胞，心脏成纤维细胞)和心肌细胞。
图44.来源自hESCs(WA09)的EPCs在DM培养基-激活素+VEGFA(DM-media-Activin+VEGFA)中传代(1.25×105细胞/cm2)12天。生成的细胞对(a)CD31和VE-钙粘蛋白(CDH5)和(b)原胶原和平滑肌肌动蛋白染色。40×和63×放大率下获得的图像如图所示。
图45.来源自hESCs(WA09)的EPCs在10％FBS，DMEM，1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺中传代(1.25×105细胞/cm2)12天。得到培养物对原胶原和平滑肌肌动蛋白染色。
图46，表1.由hIPSCs(hFib2-iPS4)产生的IMPs的的微阵列图谱(昂飞人基因组U133升级版2.0(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0))表明了与起始多能细胞群相比，一系列基因上调＞log23。在加入Wnt3a和BMP4的已知成分培养基中，细胞分化通过了IMPs(Isl 1+)阶段(四天)。
图47，表2.由hESCs(WA01，WA07，WA09，BG02)和hIPSCs(hFib2-iPS4)产生的EPCs的微阵列图谱(昂飞人基因组U133升级版2.0(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0)表明了与起始多能细胞群相比，共同的一系列基因上调＞log23。细胞分化通过了IMP(Isl 1+)阶段(四天)并接着向EPCs又分化了16天。
图48：我们用来定义hESCs或hiPSCs向IMP细胞(Isl 1+)，接着EPCs(Wt1+)，然后向血管状管(CD31+)发展的分化步骤顺序。
图49：由心外膜祖细胞(EPCs)形成的内皮管的亮视野图像。此图像以4×和10×放大率所示。
图50：来自心外膜细胞的内皮管的共聚焦图像。A.在一个焦平面上用CD31(绿色)和CDH5(红色)对管染色的共聚焦图像表明了管腔(lumen)的存在。所有图像为40×放大率。B.来自Z堆叠(Z-stacked)的40×放大率共焦图像的内皮管重构。黄色表示CD31和CDH5表达的重合。
图51：由EPCs产生的球体并铺板于(plated)胶原基基质(吉尔垂科斯(Geltrex))上。A.表示球体在t＝0的贴壁性。B.在bFGF+10％胎牛血清(B)中或者，在缺乏血清和bFGF(C)下培养的铺板的球体。EPC球体铺板后24小时时获取的亮视野图像。当球体铺板在胶原I基质(未显示)上时可获得类似结果。
图52.WA09 hESCs铺板在吉尔垂科斯(Geltrex)上并用抗体探测细胞角蛋白(cytokeratin)(红色)和波形蛋白(vimentin)(绿色)。可通过DAPI染色检测DNA。hESCs对上皮标记物细胞角蛋白呈阳性(+ve)但是对***标记物波形蛋白呈阴性。
图53.如图4所示将铺板在Geltrex上的EPCs用PFA固定并用抗体对细胞角蛋白(红色)和波形蛋白(绿色)染色。通过DAPI染色检测DNA。细胞对波形蛋白(绿色)呈阳性表明其已经经历了上皮细胞向***转化的过程，且为***样的和迁移的。
图54.在胶原I基质上将EPCs铺板。固定细胞且用抗体对细胞角蛋白(红色)和波形蛋白(绿色)染色。通过DAPI检测DNA。细胞呈波形蛋白阳性表明其已经经历了上皮细胞向***转化的过程，且为***样的和迁移的。
图55.这些为相同心脏在不同焦平面上的2幅图像，可见植入鸡胚三天后，D14EPC发生聚集。棕色细胞簇(GFP染色)清晰可见(箭头)。箭头指示已经附着但未侵入的PE细胞簇。
图56，57.EPC聚集体被移植到发育中的鸡心脏附近(图8)。组织用PFA固定，石蜡包封并切片。然后用抗GFP抗体对切片染色以检测移植体中的GFP+EPC细胞。免疫荧光染色表明了EPCs迁移经过鸡的心肌并因此为高度侵入性的。
图58.IMP细胞生长成球体然后与小鼠心脏组织片共培养。经过8天的共培养之后，小鼠心脏组织用PFA固定，石蜡包封并切片。然后用抗人β肌球蛋白重链(棕色)的抗体探测切片。数据说明小鼠心脏组织中存在人体的，IMP-来源的心肌细胞，说明IMP细胞能够分化成心肌细胞。
图59.GFP+IMP细胞并入鸡胚胎的胚胎结构中。通过GFP免疫检测，定位HES细胞的全标本包埋(whole mount)图像(A，C，E)和胚胎横切片(B-G)。(A)第12阶段胚胎和相应横切片(B)显示了HES细胞向内胚层(箭头)体腔和内脏中胚层(星标)，和血管周细胞(双箭头)的广泛并入。(C)第12阶段和相应横切片(D)显示了IMP来源的内胚层(尖箭头)、内皮细胞(箭头)和中间中胚层(白色箭头)。(E)第12阶段胚胎和相应横切片(F)显示了主动脉中IMP-来源的内皮细胞。(G)第13阶段胚胎的横切片显示了IMPs来源的细胞以前肠门的水平并入到肝原基中。
图60.Isl 1+细胞由钙粘蛋白11和PDGFRβ的存在所标记。在Wnt3a和BMP4存在下(如前所述)4和6天WA09细胞会分化。WA09，第4天和第6天细胞用阿科尤斯酶(Accutase)处理以形成单细胞悬浮液和对钙粘蛋白11和PDGFRβ进行染色。同时，细胞分别利用驴抗羊488二抗和IgG2aPE同型对照进行染色。利用蓝色(Cyan)流式细胞仪(DAKO)使细胞可视化。群为可视化的FL4抗体，红色代表对照群且蓝色代表抗体染色群。
图61.通过C56C向局部缺血/受损组织的迁移来研究机制，我们在保易登(Boyden)小室试验中测试了这些细胞。将300,000 C56C细胞接种到保易登(Boyden)小室的上小室中。在下小室中，这些数据表明C56C细胞对SDFI细胞因子有反应并向其迁移(图61)。迁移可用抗拮剂AMD3100阻断，说明迁移是通过CXCR4受体介导的。
发明内容
本发明的目的
本发明的一个目的是提供长期维持Islet 1+多潜能祖细胞(IMPs)的方法，以便提供在装运和/或使用前培养这些细胞的实用方法。
本发明的另一个目的是提供增强Islet 1+多潜能祖细胞(IMPs)克隆传代和扩增的方法。
本发明更进一步的目的是提供由自我更新IMPs产生内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和血管的方法。
本发明另外的目的涉及由直接来源于hPSCs，包括hESCs和hiPSCs的的IMPs产生内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞方法。
本发明其它的目的涉及可将IMPs表达可观测数量的细胞表面标记物(PDGFRα)的事实用于鉴定IMPs和分离这些细胞达到有效的纯度。
本发明还有的其它目的涉及由MMCs和常规方法产生c-kit+CXCR4+多潜能祖细胞(C56Cs)的方法和物质组合物，其中GSK3抑制剂、激活素/Nodal信号和/或BMP信号的抑制剂的组合能够用于产生不同类型的自我更新祖细胞。
本发明另外方面涉及利用C56Cs可归巢向受损组织区域并能够用于重建和/或治疗这类受损/炎症组织的预料不到的发现，用于将C56Cs靶向患者受损和/或炎症组织的方法。
本发明还有的进一步目的涉及由hPSCs，包括hESCs和hiPSCs，产生多潜能心外膜祖细胞(EPCs)的方法。本发明的其它目的涉及所产生的这些多潜能心外膜祖细胞(EPCs)。
本发明还有的其它目的涉及利用EPCs的方法，包括产生内皮细胞、平滑肌和心脏成纤维细胞。
本发明这些和/或其它目的的任一或多个都可从本发明以下说明中容易地得到。
发明概述
本发明特别提供了由人多能干细胞，包括胚胎干细胞(hESCs)和人体诱导多能干细胞(hiPSC)产生多潜能间质祖细胞(MMCs)，ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)的方法，以及其它方面，在本文中另有详述。
在特定方面，本发明涉及以下创造性方面的一个或多个。
1.长期保持(＞10个传代)Islet 1+多潜能祖细胞(IMPs)的方法。
2.IMPs的克隆传代和扩增的方法和应用。
3.由自我更新IMPs产生内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞的方法
4.由直接来源自hPSCs，包括hESCs和hiPSCs的IMPs产生内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞的方法。
5.能够用于鉴定IMPs并分离这些细胞达到很高纯度的细胞表面标记物(PDGFRα)和方法。
6.(i)由MMCs产生CXCR4+CD56+多潜能祖细胞(C56Cs)的方法和物质组合物。(ii)常规方法，其中，GSK3抑制剂，激活素/Nodal信号和/或BMP信号抑制剂的组合能够用于产生不同类型的自我更新祖细胞。
7.利用C56Cs可归巢向受损组织区域并能够用于重建和/或治疗这类受损/炎症组织的预料不到的发现，用于将C56Cs靶向患者受损和/或炎症组织的方法。
8.由hPSCs，包括hESCs和hiPSCs产生的多潜能心外膜祖细胞(EPCs)的方法。
9.多潜能心外膜祖细胞(EPCs)的物质组合物。
10.使用EPCs来i)鉴定影响心肌细胞增殖、存活功能和分化的由心外膜所产生的分泌因子的方法；ii)作为能够用于心血管药物筛选的细胞源的方法；iii)作为能够用于修复缺血心脏，再生冠状动脉脉管***的治疗目的细胞源的方法；iv)为获得心脏或冠状动脉组分的组织工程的目的的方法；和v)作为研究心血管发育和疾病的研究工具的方法。
11.由心外膜细胞(EPCs)产生内皮细胞、平滑肌和心脏成纤维细胞的方法。
药物组合物代表了本发明其他方面，其含有有效量的C56Cs或EPCs以及药物可接受载体，添加剂或辅料以及任选地，其他生物活性剂，所述生物活性剂治疗上适用于与C56Cs或EPCs一起的建议治疗。
本发明也涉及通过给药有效量的MMCs群或优选C56Cs至有需要的患者，来治疗一种或多种以下疾病状态或病状的方法。治疗方法适用于以下疾病状态或病状：心血管疾病(心肌病(cardiomyopathy)，局部缺血)、视网膜肌病(retinomyopathy)、神经病变、糖尿病(I和II型)、中风、头部外伤、自身免疫性疾病(狼疮，关节炎，多发性硬化症)、免疫抑制、移植物抗宿主病、骨修复、创面修复、炎症性疾病(关节炎，克隆氏病(Crohn’s disease)，囊肿性纤维化)和帕金森症，亨廷顿症，等等。MMCs或C56Cs的全身给药可通过静脉给药，或者通过输注，直接作用在受损或病灶位点。由于MMCs尤其是C56Cs的归巢特性，这些细胞可给药至远离受损/炎症的位点而这些细胞会“归巢”至患者体内的所述位点实施治疗。
如本文中所述的，在体外或体内由EPC细胞产生内皮细胞，平滑肌细胞和心脏成纤维细胞和血管或血管细胞的方法，代表了本发明的其他方面。
具体实施方式
发明详述
以下术语将用于描述本发明。
除非特别指出，应根据相关领域普通技术人员的常规用法理解本文所用的术语。除以下提供的术语定义之外，分子生物学的普通术语定义也可查询Rieger等，1991，遗传学精要：经典和分子(Glossary of genetics：classical and molecular)，第五版，柏林：施普林格-瓦莱格(Springer-Verlag)和分子生物学现代实验方法(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等，Eds.，现代实验方法(Current Protocols)，格林尼出版合资有限公司(Greene Publishing Associates，Inc.)和约翰威利圣子有限公司(John Wiley & Sons，Inc.)的联合公司，(1998增补本)。需要理解说明书和权利要求中使用的″a″或″an″可能表示一个或多个，取决于其应用的语境。因此，例如，提及″a cell″表示可利用至少一个细胞。
通过参考以下本发明优选实施方式和本文所含实施例的详述可更容易地理解本发明。然而，在公开和描述本发明组合物和方法之前，需要理解的是，本发明不限于具体条件，或具体方法等，因为这些必然可以变化，且为数众多的修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
生长细胞，分离细胞，和相关的，克隆，DNA分离，扩增和纯化DNA，涉及DNA连接酶，DNA聚合酶，限制性内切酶等的酶反应的标准技术，以及多种分离技术是本领域技术人员熟知且经常使用。许多标准技术在Sambrook等，1989，分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，简装版，纽约；Maniatis等，1982，分子克隆(Molecular Cloning)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，简装版，纽约；Wu(Ed.)，1993，酶学方法(Meth.Enzymol.)218，第一部分；Wu(Ed.)，1979，酶学方法(Meth.Enzymol.)68；Wu等，(Eds.)，1983，酶学方法(Meth.Enzymol.)100和101；Grossman和Moldave(Eds.)，1980，酶学方法(Meth.Enzymol.)65；Miller(ed.)，1972，分子遗传学实验(Experiments inMolecular Genetics)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港，纽约；Old和Primrose，1981，基因操作原理(Principles of Gene Manipulation)，加利福尼亚大学出版社，伯克利；Schleif和Wensink，1982，分子生物学实用方法(Practical Methods in Molecular Biology)；Glover(Ed.)，1985，DNA克隆(DNA Cloning)，卷I和II，IRL出版社，牛津，英国；Hames和Higgins(Eds.)，1985，核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)，IRL出版社，牛津，英国；和Setlow和Hollaender，1979，遗传工程：原理和方法(Genetic Engineering：Principles and Methods)，卷1-4，普莱纳姆出版社(Plenum Press)，纽约中有说明。文中所使用的缩写和命名被认为是在领域内标准且在文中所引用的专业期刊中被广泛使用。
贯穿说明书全文中的术语“患者”和“受试者”表示用本发明提供的细胞组合物进行治疗包括预防性治疗(预防)的动物，通常是指哺乳动物而优选是人。对于特定动物患者例如人类患者所特有的感染，病状和疾病状态的治疗，术语患者指的是该特定的动物。
在文中用的术语“治疗(treat)”，“治疗(treating)”，和“治疗(treatment)”等，是指向具有患病风险或被疾病状态，病状或缺陷所折磨的患者提供益处的任何行为，所述疾病状态，病状或缺陷可通过本发明所述细胞组合物改善。治疗病状包括通过减轻或抑制至少一种症状，延缓疾病状态或病状影响的进展，包括预防或延缓疾病状态或病状的发病等来改善病状。文中使用的治疗包括预防和治疗性处理。
术语“起始多能干细胞”，其中“人类胚胎干细胞”或hESCs和人体诱导多能干细胞或hiPSCs是其子集，其源于受精之后任意时间的前胚胎、胚胎、胎儿组织或成人干细胞(在人体诱导多能干细胞情况中)，且根据标准技术接受检验(standard art-accepted test)，如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，其具有能够在适当条件下产生几种不同细胞类型的后代的特征，这些不同细胞类型是所有三个胚层(内胚层，中胚层，外胚层)的发育产物(derivative)。这个术语包括多种类型的已确立的干细胞系和以所述的方法从多能性的起始组织中得到的细胞。
多能或pPS细胞(pPSCs)的定义包括多种类型的胚胎细胞，特别包括人类胚胎干细胞(hESCs)，由Thomson等所述(科学(Science)282：1145，1998)；以及来自其它灵长类动物的胚胎细胞，如恒河猴干细胞(Thomson等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.USA)92：7844，1995)。其它类型的多能细胞也包括在该术语里。人多能干细胞包括可从人体脐带或胎盘血及人体胎盘组织中获得的干细胞。其包括能够产生作为所有三胚层的发育产物的后代的灵长类源的任何细胞，无论它们是否是来源自胚胎组织，胎儿或其它来源。pPS细胞优选非来源自恶性源。要求(但不总是必须的)细胞是核形正常的。
pPS细胞培养物，如果群中相当比例的干细胞和它们的发育产物表现出未分化细胞的形态特征并明显区别于胚胎或成体来源的分化细胞时，则被称作“未分化的(undifferentiated)”。未分化pPS细胞对于本领域的技术人员来说容易辨认，且通常在二维显微视图中呈现出高的核/细胞质比例和明显核仁的细胞群落。需要理解的是，在群中未分化细胞群落通常会被分化的邻近细胞围绕。
多能干细胞可表达一种或多种阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可利用针对Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测到的标记物(Thomson等，科学(Science)282：1145，1998)。多能干细胞在体外分化导致SSEA-4，Tra-1-60，和Tra-1-81表达(如果有)的缺失和SSEA-1表达的增加。未分化多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，通过用4％的多聚甲醛固定细胞，接着用载体红(Vector Red)做底物使其按照制造商(载体实验室(Vector Laboratories)，加州伯林盖姆)所述进行显色，能够将其检测出来。如RT-PCR所检测的，未分化的多能干细胞通常也表达Oct-4和TERT。
增殖多能干细胞的另一所需的表型为可分化成所有三个胚层：内胚层，中胚层和外胚层组织的潜能。例如，多能干细胞的多能性可通过以下方法证实，将细胞注射进入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，使用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对其进行组织学检查，作为来自三个胚层的细胞类型的证据。可选地，多能性可通过生成胚胎体并检测胚胎体中与三个胚层相关的标记物的存在来确定。
利用标准的G显带技术对增殖多能干细胞系进行核型检测，并与相应灵长类物种的公开核型对比。希望获得具有“正常核型”的细胞，正常核型表示细胞是整倍体，其中存在所有人体染色体且无明显变化。
可使用的多能干细胞类型包括来源自妊娠后形成的组织，包括前胚胎组织(例如囊胚)，胚胎组织，或者在妊娠期间任何时间取出的胎儿组织，通常但不是必须在妊娠前约10-12周的多能细胞的已建立的系。非限制性例子是如人胚胎干细胞的已建立的系或人胚胎胚细胞的已建立的系，例如人胚胎干细胞系WA01、WA07、和WA099(威瑟尔(WiCeI1))。可预期的是，所公开的组合物在这些细胞最初建立或稳定期间的用途，在这种情况中，源细胞是直接从源组织中取得的初始多能细胞。从不存在饲养细胞下培养的多能干细胞群中取得的细胞也是合适的。变异的人胚胎干细胞系，如BG01v(布瑞萨根(BresaGen)，阿森斯，佐治亚州)以及正常人胚胎干细胞系如WA01，WA07，WA09(威瑟尔(WiCeI1))和BG01，BG02(布瑞萨根(BresaGen)，阿森斯，佐治亚州)也是合适的。
外胚层干细胞(EpiScs)和诱导多能干细胞(iPSCs)，尤其是人体诱导多能干细胞(hiPSCs)在概念上落入了广义的多能细胞定义内，本申请中描述的技术应用于如上所述的这些多能细胞和其它多能细胞(如，初始多能细胞)。EpiScs是从早期植床后阶段胚胎中分离的。它们表达Oct4且是多能的。参见，Tesar等，自然(Nature)，VoI 448，p.196，2007年7月12日。通过四个基因(c-myc，Klf4，S10X2，Oct4)的逆转录病毒转导，iPS细胞由成年体细胞去分化回到多能状态。参见，Takahashi和Yamanaka，细胞(Cell)126，663-676，2006年8月25日。
人胚胎干细胞(hESCs)可由本发明所述以及本领域所述的方法制备，例如Thomson等(美国专利号5,843,780；科学(Science)282：1145，1998；发育生物学当前主题(Curr.Top.Dev.Biol.)38：133 ff.，1998；美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)92：7844，1995)。
术语“胚胎干细胞”指的是多能细胞，优选是灵长类，包括人类，其是从囊胚阶段胚胎中分离出来的。人胚胎干细胞指的是来自人类的干细胞，优选用于本发明所涉及人类治疗或诊断的方面。以下表型标记物由人胚胎干细胞表达：
SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD9、碱性磷酸酶、Oct 4、Nanog、Rex 1、Sox2和TERT.参见Ginis等，发育生物学(Dev.Biol)，269(2)，360-380(2004)；Draper等，解剖学杂质(J.Anat.)，200(Pt.3)，249-258，(2002)；Carpenter等，克隆干细胞(Cloning Stem cell)，5(1)，79-88(2003)；Cooper等，解剖学杂质(J.Anat.)，200(Pt.3)，259-265(2002)；Oka等，分子细胞生物学(MoI.Biol.Cell)，13(4)，1274-81(2002)；和Carpenter等，发育生物学动态(Dev.Dyn.)，229(2)，243-258(2004)。虽然任何灵长类多能干细胞(pPSCs)，特别是包括人类胚胎干细胞可用于本方法产生本发明所述的中内胚层细胞，中胚层Isl 1+细胞、多潜能迁移细胞(MMCs)、多潜能CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)或多潜能心外膜祖细胞(EPCs)，本发明优选使用的pPSCs包括人类胚胎干细胞，包括来自BG01和BG02细胞系的，以及许多其他可用的干细胞系，包括人类诱导多能干细胞。
术语“分化(differentiation)”是用来描述非特化(unspecialized)(“不限的(uncommitted)”)或不太特化的细胞获得更特化(specialized)的细胞的特征的过程，例如多潜能迁移细胞，多潜能CXCR4+CD56+细胞，多潜能心外膜祖细胞，神经细胞，肌肉细胞，心肌或其他细胞。术语“分化”包括多潜能干细胞，包括hESC，变成更特化的中间细胞如祖细胞，也包括更特化的中间细胞(MMC，中内胚层细胞，中胚层细胞，C56C或EPC)变成还更特化的细胞的过程。分化的或分化诱导的细胞是在细胞谱系内占有特化(“受限的(commited)”)的位置的细胞。术语“受限的”，当应用于分化过程时，是指在分化途径中进行到了一个点的细胞，其在正常情况下将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的子集，并在正常情况下不能分化成不同细胞类型或恢复到分化程度更低的细胞类型。“去分化”是指细胞恢复到细胞谱系内更少特化(或受限)的位置的过程。如本文所用的，细胞谱系限定了细胞的遗传性(heredity)，即它来自哪个细胞以及可能会产生什么细胞。细胞谱系将细胞置于发育和分化的遗传体系内。谱系特异的标记物是指与感兴趣细胞谱系表型特异性相关的特征，并可用于评估非受限细胞向感兴趣细胞谱系的分化。
可互换使用的术语“多潜能迁移细胞”，“多潜能***”或“MMCs”是指根据本发明所产生的一个细胞或多个细胞。MMCs是动态的多潜能细胞，其特征在于E-cad-Oct4-Nanog-SSEA3-CXCR4+，它们有着低到中等的密度并且是可迁移的。他们是存储稳定的并可传代多个世代并仍然保持有活性。他们具有明显的发育可塑性。基于标记物图谱，它们不是hESCs。
MMCs可在有效量GSK抑制剂和激活素A抑制剂的存在下稳定储存。BMP抑制剂，如头蛋白(Noggin)，也可与GSK抑制剂和激活素A抑制剂联合使用。在多种其它细胞中，这些细胞可分化为中胚层细胞或定型内胚层细胞。在此将公开有关MMCs的更多方法。
本发明所述的多潜能***(MMC)具有一个或多个(至少4个，至少5，至少6，至少10，优选全部)以下特征：
·它可以作为稳定的细胞群培养至少20个传代
·当以低密度铺板时，细胞表现为间质，而在高密度时，会生长成片
·可以由包括BG01，BG02，WA09的一系列hESC细胞系产生
·MMCs可以通过标准方法进行冷冻和低温保存
·MMCs可在低温储存后恢复，恢复和分化
·MMCs能以高铺板效率进行传代(高于50％铺板效率-50％细胞成功传代接种和存活)
·在其细胞表面不出现SSEA3抗原和SSEA4抗原
·不表达hESC标记物如Oct4，Nanog
·MMCs可在其表面表达CXCR4
·MMCs可高水平地表达转录因子Zicl，HoxA9，HoxD4，HoxA5，HoxC10，HoxD3，Pax6，N-CAM，CXCR4
·MMCs不是中内胚层，因为他们不表达T/短尾类(brachyury)或脱中胚蛋白(eomesodermin)
·呈E-钙粘蛋白阴性
·在Q-PCR分析可检测水平上，MMCs不会表达Sox 17，Isl 1，武藏(musashi)，巢蛋白(nestin)
·在传代中保持正常核型
·展示出迁移，间质表型
·具有多潜能分化能力(包括中胚层，内胚层)
·注射进入SCID小鼠时，不形成畸胎瘤
·能够从内细胞群胚胎和胎儿组织中分离
参见微阵列数据，其更完整描述了MMC基因表达谱。
本文中所用的术语“中胚层(Isl 1+)细胞”，中胚层来源的Isl 1+多潜能祖细胞“ISL+多潜能祖细胞”或“IMP”可交替使用，用于描述根据本发明方法由pPSCs(尤其是hESCs)产生的中胚层Isl 1+细胞，中内胚层细胞或MMCs或如本文中另有所述的(见实施例部分)。
中胚层(Isl 1+)细胞(Islet 1+多潜能祖细胞或IMPs)具有以下特征：
·表达Isl 1，Nkx2.5，Fgf10，Gata4，FoxF1，PDGFRα
·任选地表达Tbx3和/或汉德(Hand)1
·核型正常
·不表达Oct4，Nanog，T，脱中胚蛋白
·可在细胞表面表达PDGFRβ和钙粘蛋白11
·能分化成心肌细胞，平滑肌细胞和内皮细胞等等。
IMP的细胞表面标记物PDGFRβ和/或钙粘蛋白11代表免疫原性靶点，其可用于与所述细胞表面标记物特异性的单克隆抗体偶联，从而将IMPs从细胞群中分离。与报告分子(荧光，放射性同位素等)连接的单克隆抗体的用途可用于鉴定细胞样品中细胞的存在和相对数量。在美国专利公开文本US2009/0053241中公开了抗-PDGFRβ单克隆抗体，本文参考纳入其全部内容。除抗-PDGFRβ外可用于本发明的其他单克隆抗体包括IMC-2C5等等。
本文中所使用的术语“多潜能CXCR4+CD56+细胞”，“CXCR4+CD56+细胞”或“C56Cs”是用来描述可根据本文方法由hPSCs以及MMCs产生的前间质多能细胞(pre-mesenchymal pluripotent cells)，本文另有所述。
这些细胞可用于治疗炎症和/或受损的组织，即通过注射有效量细胞进至需要有效量治疗的患者体内。
根据文献中的报告，其中来源自间质干细胞的骨髓已被应用到疾病模型(Phinney和Prockop，2007；干细胞(Stem Cell)25：2896-2902；Uccelli等，2008；自然免疫学综述(Nature Reviews Immunol.)8：726-736)，我们预测MMCs和C56Cs的多种应用。这是基于他们刺激修复的能力，即通过释放刺激其它细胞的因子以修复受损组织的旁分泌作用或，通过直接转分化成参与修复过程的细胞类型(图16)。
这些应用包括但不限于以下的治疗：
●心血管疾病(心肌病，局部缺血)
●视网膜肌病(retinomyopathy)
●神经病变
●糖尿病(I和II型)
●中风
●头部外伤
●自身免疫性疾病(狼疮，关节炎，多发性硬化症)
●免疫抑制
●移植物抗宿主病
●骨修复
●创面修复
●炎症性疾病(关节炎，克隆氏病，囊肿性纤维化)
●帕金森症，亨廷顿症
本发明所述C56Cs具有以下特征：
●它们表达CXCR4和CD56的生物标记物(CXCR4+和CD56+)；
●它们表达比MMCs更高水平的CXCR4；
●它们表达可感知水平的以下生物标记物中的至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，优选所有：
C-kit，CD166，CD105，CD44，CD133，CD90；
●他们不表达CD31；
且在大多数情况下：
●它们低水平地表达PDGFRα；
●它们可表现出归巢至炎症和组织受损位点的特性，通过SDF-1/CXCR4信号轴(参见，例如，Dalton，再生医学(Regen.Med)，3，181-188，2008)；
●这些细胞形状比hESCs和hiPSCs小，使它们可用于静脉给药。
通过在分化培养基中使MMCs接触有效量的骨形态发生蛋白(优选，BMP4)，Wnt蛋白(优选Wnt3a)和丁酸盐(优选丁酸钠)进行大约1到8天以上，优选约2至7天，约3-6天，约4-6天，来制备C56Cs，本文另有所述。在本发明的这个方面，在GSK抑制剂(如BIO)和激活素A抑制剂(如SB431542)不存在的条件下，会发生MMCs向C56Cs的分化。
C56Cs的产生途径由图14所示。在本文中公开了由hESCs产生MMCs，且以前描述过(见PCT/US2008/001222，以WO2008/094597公开，2008年8月7日，引入本文作为参考)。hPSCs通常在GSK抑制剂(BIO)和激活素A抑制剂(SB431542)的存在下分化。任选地，对于生产MMCs，也可包括BMP信号抑制剂(头蛋白，化合物C)。产生C56Cs的方法适用于任何人类多能细胞如人类诱导多能干细胞(hiPS细胞)或类似的人类多能干细胞。为了产生MMCs，人类多能性干细胞尤其包括hESCs或hiPSCs与分化培养基接触，所述分化培养基包含有效剂量的GSK3抑制剂如BIO(0.25和10μM之间，约0.5至约5μM，约1至4μM，约1.5至3μM，约2μM)，和激活素A抑制剂如SB431542(约2至50μM，约5至约35μM，约10至30μM，优选约20μM)，本文另有所述。为产生C56Cs，用BMP4(约10-250ng/ml，优选约100ng/ml)，Wnt3a(约5至约50ng/ml，约25ng/ml)，丁酸钠(0.1至约5mM，0.25至约1mM，约0.5mM)的基础培养基[DMEM/F12[50/50]处理MMCs约1至8天(优选3-6天)。基础培养基(分化培养基)优选含有本文所述的有效量的其他组分，包括大约2％前白蛋白(probumin)，抗生素[1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)1×非必需氨基酸(NEAA)]，微量元素A，B，C[1×，来自培养基技术(Mediatech)]，抗坏血酸[约10 to 100μg/ml，～50μg/ml]，转铁蛋白[～10μg/mL]，β-巯基乙醇[约0.1mM]和bFGF[如，约8ng/ml]，LR-IGF[如，约200ng/ml]，激活素A[例如，约1至20ng/ml，10ng/ml]，杂合素(heregulin)[例如，约1至20ng/ml，约10ng/ml])。重要的是，MMCs分化成C56Cs时，GSK抑制剂(与无翅蛋白或Wnt蛋白相反)和激活素A抑制剂不存在。此外，当MMCs用来生产C56Cs时，还应使骨形态发生蛋白抑制剂(头蛋白，化合物C)不存在。
如上所述可用于治疗的组合物，包括用于进行治疗的有效量的C56C细胞。组合物包括约5×105至5×108之间，优选约106和108之间的悬浮于盐溶液中的细胞。盐溶液的量通常在从50μl至约10ml，优选约100μl至2ml的范围。组合物可通过静脉给药直接进入用本发明细胞进行治疗的位点，或通过灌注。治疗所用C56Cs细胞的纯度是在从至少约50％至大于99.5％，约75％或更高，约85％或更高，约90％或更高，约95％或更高，约97.5％或更高，约98％或更高，约99％或更高，约99.5％或更高的范围内。一般来说，分化MMCs生产C56Cs的条件会获得高纯度的C56Cs，从而无需对其进行进一步纯化。这些细胞可以是在生物活性剂不存在或包括生物活性剂下给药。药物组合物代表了本发明的其他方面，其含有有效量的C56Cs以及药物可接受载体，添加剂或辅料和任选地，其他生物活性剂，所述生物活性剂治疗上适用于与C56Cs一起的建议治疗。
术语“心外膜多能细胞”或“EPCs”是用来指由本发明所述的人多能细胞(hPCs)包括hESCs或由Isl 1+多能细胞(IMPs)，产生的多能细胞，通过将hPCs接触生产IMPs的条件，然后将得到IMPs接触生产EPCs的条件。正如所述的，通过将IMPs与存在有效量的GSK抑制剂(例如，在本文另有所述的，Wnt蛋白，诸如Wnt3a，或GSK抑制剂，如BIO)，骨形态发生蛋白(如，BMP4)和视黄酸(优选，全反式视黄酸)的分化培养基接触使IMPs转换成EPCs的足够长的时间(例如，约8至20天或以上，约10至18天，约15-17天或以上)，产生了EPCs。EPCs可以由hPCs直接生产，通过将细胞先与有效量的GSK抑制剂(如WNT3a或BIO)，骨形态发生蛋白(如BMP4)和任选地激活素A抑制剂(如SB431542)接触，然后(通常是经过约2-8天)进一步将生产的中间细胞(这是IMPs)接触上述用于IMPs转换成EPCs的相同条件(如Wnt3a或BIO，BMP4和全反式视黄酸长达约16至20天或以上)。
EPCs(原心外膜/心外膜细胞)特征在于其遍布心肌表面形成外部层的能力以及通过入侵的方式迁移进入心肌的能力(Olivey等，2004心血管医学动态(Trends Cardiovasc Med.)14，247-251；)。评估原心外膜/心外膜迁移特性的标准试验是将细胞铺板在胶原I基质上。
由三个hESC系和人iPSC系产生EPCs的微阵列分析，表明了EPC细胞表达肾母瘤抑制蛋白(Wilm’s tumor suppressor)1(Wt1)，Tcf21(心外膜素)，Raldh2(Aldhla2)。这些转录因子/生物标记物是在培养中由多能细胞产生的EPCs，原心外膜/心外膜细胞类型的初始鉴定手段。
除上述外，EPCs也可表达Tbx18，COL3A1，GATA6，Tbx3和Tbx5中的一种或多种(2，3，4或5)。如图47，表2所示，表中摘录了部分上调最大的基因。
EPCs有许多用途。它们可用于鉴定心外膜生产的分泌因子，其影响心肌细胞增殖，存活，功能和分化；他们提供了可以用于心血管药物筛选的细胞源；他们提供了用于修复缺血性心脏和/或再生冠状动脉脉管***的治疗目的的细胞源；他们可用于获得心脏或冠状动脉血管组分的组织工程目的；以及他们可作为研究心血管发育和疾病的研究工具。
正如本文所述，EPCs可进一步分化成内皮细胞(在有效量VEGF165，或VEGF165和SB431542，或其他激活素A抑制剂的存在下)；平滑肌以及心脏成纤维细胞(在有效量VEGF165，或VEGF165和血小板衍生生长因子β(PDGFβ)，或VEGF165和在10％胎牛血清中的hDkk1)或血管(在FGF2，LR-IGF，杂合素(hetergulin)β和VEGF的存在下)，本文中另有所述。通过对需要治疗的患者给药有效量的EPCs，这些细胞也可用于治疗和/或降低心血管疾病/心脏组织的损伤或血管疾病/损伤的可能性。
本文中所使用的术语“分化培养基”，“细胞分化培养基”，“培养基”，“基础细胞培养基”，“基础细胞培养基”或“基础培养基”或“稳定培养基”是同义的，用于描述细胞生长培养基(取决于所用附加组分)，在其中hESCs，中胚层IS1 1+多能细胞(IMPs)，多潜能迁移细胞(MMCs)，C56Cs，EPC’s或其他细胞的生产，生长/培养或者可选地，分化成更成熟细胞。他们的具体实施例如以下实施例部分所展示的。分化培养基是本领域熟知，其含有至少一种最低必需培养基加一种或多种任选的组分如生长因子，包括成纤维细胞生长因子(FGF)，抗坏血酸，葡萄糖，非必需氨基酸，盐(包括微量元素)，谷氨酰胺，胰岛素(其有说明且不排除)，激活素A，转铁蛋白，β巯基乙醇，和其它在本领域内所熟知的药剂，在本文中另有所述。优选的培养基包括含有1％至20％(优选，约2-10％)之间胎牛血清的基础细胞培养基，或不含有胎牛血清和KSR，并任选包含牛血清白蛋白(约1-5％，优选约2％)的已知成分培养基(优选)。优选的分化培养基是已知成分的且不含血清的。在某些生产MMCs且使用激活素A抑制剂的实施方式中，培养基可消除或基本减少激活素A的量。
根据本发明可任选地添加到分化培养基的其他因子包括，例如，烟酰胺，TGF-β家族成员，包括TGF-β1，2和3，激活素A，诺达尔(nodal)，血清白蛋白，成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员，血小板衍生生长因子-AA，和血小板衍生生长因子-BB，富含血小板的血浆，胰岛素生长因子(IGF-Ⅰ，Ⅱ，LR-IGF)，生长分化因子(GDF-5，-6，-8，-10，-11)，胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)，GLP-Ⅰ和GLP-2模拟体(mimetobody)，艾塞那肽-4(Exendin-4)，甲状旁腺素(parathyroid hormone)，胰岛素，***，抑肽酶，氢化可的松，乙醇胺，表皮生长因子(EGF)，胃泌素I和II，铜螯合剂例如三乙烯五胺，毛喉素(forskolin)，丁酸钠，乙胞素(betacellulin)，ITS，头蛋白，神经突起生长因子，诺达尔(nodal)，丙戊酸(valporic acid)，曲古菌素A(trichostatin A)，丁酸钠，肝细胞生长因子(HGF)，鞘氨醇-1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27补充剂(Gibco，CA)，甾醇生物碱如环巴明(cyclopamine)(EMD，CA)，角质细胞生长因子(KGF)，迪考普夫(Dickkopf)蛋白家族，牛垂体提取物，胰岛新生相关蛋白(INGAP)，印度刺猬蛋白(Indian hedgehog)，音刺猬蛋白(sonic hedgehog)，蛋白酶抑制剂，诺驰(Notch)通路抑制剂，音刺猬蛋白抑制剂(sonic hedgehog inhibitors)，杂合素(heregulin)，或它们的组合。若包含每个组分即包含有效的剂量。
通过进一步举例，适当的培养基可由以下组分制得，例如达氏修正依氏培养基(DMEM)，Gibco #11965-092；敲除的达氏修正依氏培养基(KODMEM)，Gibco #10829-018；汉姆氏(Ham′s)F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco #15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma #M7522；重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco #13256-029。在本发明中使用的培养基优选实施方式在本文另有所述。
本发明中生长/培养pPSCs(尤其是hESCs)和分化细胞所特别优选的分化培养基(取决于所用的组分)是DMEM/F12(50∶50)，其包含约2％前白蛋白(白蛋白；密理博/血清学的(Millipre/Serologicals))，1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)1×非必需氨基酸(NEAA)，1×微量元素A，B，C(培养基技术(Mediatech))，抗坏血酸(10-100ng/ml，约25-65ng/ml，约50ng/ml)，约0.1mM(0.025-0.5mM)β-巯基乙醇(Gibco)，约2-10ng/ml，约5-9ng/ml，约8ng/ml的bFGF(Sigma)，200ng/ml(5-500ng/ml)的LR-IGF(简称IGF-I的；JRH生物科学)，10ng/ml激活素A(约1ng/ml至不超过约20ng/ml，并在某些方面不包含)，和10ng/ml(约1-20ng/ml或以上)的杂合素(heregulin)。所用的各组分都是有效的剂量且单个组分的剂量范围以及优选剂量，都适用于本发明所使用的培养基，不受所产生的细胞的限制。需注意的是激活素A或激活素A信号不是生产多潜能迁移细胞MMCs所必须的，但可含有(若含有，激活素A优选含有低浓度，通常低于约20ng/ml，在某些情况下优选不含有)，尤其是在产生中胚层(Isl+)细胞时。与此相反，约20ng/ml至100ng/ml或更多的激活素A或“高浓度激活素A”可用于生产其他细胞，如本文所述。可选地，根据本发明小鼠胚胎成纤维细胞调节的培养基(MEF-CM)有与DMEM/F12相似的组成，也可用于传代hESC，并产生Isl 1+中胚层细胞(IMPS)和多潜能迁移细胞(MMCs)，以及CXCR4+CD56+(C56Cs)细胞和心外膜多能细胞(EPCs)。
本发明可用的分化培养基是商业可供的，也可以补充商业可供的组分，可从英骏集团(Invitrogen Corp.(GIBCO))，细胞应用有限公司(Cell Applications，Inc.)和生物工业(Biological Industries)，Beth HaEmek，以色列，以及众多的其他商业来源包括剑桥生化(Calbiochem)获得。在优选实施方式中，将至少一种分化因子如成纤维细胞生长因子(FGF)，LR-IGF(***的类似物)，杂合素(heregulin)和任选地VEGF(优选所有三者都是有效量)添加到细胞培养基中，在其中培养干细胞且并分化成多潜能迁移细胞或内皮细胞(血管细胞)。在本领域普通技术人员能够容易地修改细胞培养基以生产任何一种或多种本发明所述的靶细胞。细胞分化培养基本质上等同于用于分化过程，并含有将细胞分化成其它细胞的细胞分化因子的基础细胞培养基。稳定培养基是用于分化步骤之前或之后，为稳定细胞系以做进一步使用的基础细胞培养基。培养培养基本质上等同于稳定培养基，但指的是在分化之前生长或培养多能细胞系或其它细胞系的培养基。一般来说，本文所用的，细胞分化培养基和稳定培养基可包括与基础细胞培养基实质相似的组分，但用在不同情况下且可能会包括略微不同的组分以达到使用培养基的预期结果。在MMCs的情况下，尤其是储存稳定的MMCs，包含如本文所公开的有效量的激活素A信号抑制剂和如本文所述的有效剂量GSK抑制剂的细胞培养基可用于分化和稳定MMCs，即防止其进一步分化，并实现细胞群的储存稳定性。BMP抑制剂可用于偶联为此所用的激活素A抑制剂和GSK抑制剂。
多能干细胞还可以在饲养细胞层上培养，其以本领域所述的多种方式支持多能干细胞。可选地，多能干细胞在基本不含饲养细胞的培养***中培养，但仍然支持多能干细胞的增殖且不发生实质分化。可用通过培养另一细胞类型调节的培养基支持多能干细胞在无分化无饲养细胞培养中的生长。可选地，通过化学已知成分培养基支持在无分化无饲养细胞培养中多能干细胞的生长。这些方法是本领域内所熟知的。在本发明优选方面，细胞在无饲养细胞培养基中生长。
在饲养细胞层上培养细胞的方法是本领域内所熟知的。例如，Reubinoff等(自然生物技术(Nature Biotechnology)18：399-404(2000))和Thompson等(科学(Science)6 Nov.1998：Vol.282.no.5391，pp.1145-1147)公开了使用小鼠胚胎成纤维饲养细胞层由人体囊胚培养多能性干细胞系。Richards等，(干细胞(Stem Cell)21：546-556，2003)评估了一组11个不同的人类成体，胎儿和新生儿的饲养细胞层支持人类多能干细胞培养的能力。Richards等指出：“在成人皮肤成纤维细胞饲养细胞上培养的人类胚胎干细胞系保留了人类胚胎干细胞的形态，并保持多能性”。US20020072117公开生产培养基的细胞系，该培养基支持在无饲养细胞培养中灵长类多能干细胞的生长。所用细胞系是从胚胎组织获得的或由胚胎干细胞分化得到的***系和成纤维样细胞系。US20020072117还公开了将细胞系用作初始饲养细胞层。在另一个实施例中，Wang等(干细胞(Stem Cell)23：1221-1227，2005)公开了在来源自人类胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长人多能干细胞的方法。在另一个实施例中，Stojkovic等(干细胞(Stem Cell)2005 23：306-314，2005)公开了来源自人类胚胎干细胞自发分化的饲养细胞***。在另一个实施例中，Miyamoto等(+22：433-440，2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞源。Amit等(繁殖生物学(Biol.Reprod)68：2150-2156，2003)公开了来源自人***的饲养细胞层。在另一个实施例中，Inzunza等(干细胞(Stem Cell)23：544-549，2005)公开了来自人出生后***成纤维细胞的饲养细胞层。
在培养基培养pPSCs的方法，尤其是无饲养细胞培养基，是本领域所熟知的。美国专利No.6,642,048公开了在无饲养细胞培养中支持灵长类多能干细胞(pPS)生长的培养基，这些细胞系可用于生产这样的培养基。美国专利No.6,642,048指出：“本发明包括间质和成纤维状细胞系，其是从胚胎组织获得或由胚胎干细胞分化得到的。产生出此种细胞系，处理培养基，和使用条件培养基生长干细胞的方法如本文所述和所解释的。”在另一个实施例中，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞的保持，增殖和分化的条件培养基。在另一个实施例，Xu等(干细胞(Stem cell)22：972-980，2004)公开了由人类胚胎干细胞发育产物获得的条件培养基，此发育产物经遗传修饰以过度表达人端粒酶逆转录酶。在另一个实施例中，US20070010011公开了用于维持多能干细胞的化学已知成分培养基。
可选的培养***采用补充了能够促进胚胎干细胞的增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等(繁殖生物学(BioReprod)DOI10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了不含饲养细胞，无血清培养***，其中胚胎干细胞保持在补充了不同的能够触发胚胎干细胞自我更新的生长因子的无条件血清更换(SR)培养基中。在另一个实施例中，Levenstein等(干细胞(Stem cell)24：568-574，2006)公开了使用补充了bFGF的培养基在缺乏成纤维细胞或条件培养基中长期培养人类胚胎干细胞的方法。在另一个实施例中，US20050148070公开了在无血清和无成纤维饲养细胞的已知成分培养基中培养人类胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白，氨基酸，维生素，矿物质，至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代物，至少一种胰岛素或胰岛素的替代物的培养基中培养干细胞，培养基中基本不含哺乳动物的胎儿血清且含有至少约100ng/ml具有激活成纤维细胞生长因子信号受体的能力的成纤维细胞生长因子，其中生长因子是由来源而非成纤维饲养细胞层提供的，培养基支持未分化状态干细胞的增殖且无饲养细胞或条件培养基。
US20050233446公开了用于培养干细胞的已知成分培养基，包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，培养基与所培养的干细胞相比基本是等渗的。在给定的培养中，特定培养基含有基础培养基和支持原始干细胞的基本未分化生长所需的量的bFGF，胰岛素，和必需抗坏血酸。在另一个实施例中，WO2005065354公开了基本无饲养细胞和无血清的已知成分的等渗培养培养基，其含有：a.基础培养基；b.足够支持基本未分化哺乳动物干细胞生长的量的bFGF；c.足够支持基本未分化哺乳动物干细胞的生长的量的胰岛素；和d.足够支持基本未分化哺乳动物干细胞的生长的量的抗坏血酸。
在另一个实施例中，WO2005086845公开了保持未分化干细胞的方法，所述方法包括将干细胞与足够使细胞未分化状态保持足够长时间以实现所需的量的转化生长因子(TGF-β)蛋白家族成员，成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族成员，或烟酰胺(NIC)接触。
这些细胞优选生长在细胞支持或基底上，如附着单层，而不是胚胎体或悬浮液中。在本发明中，优选使用基质胶(Matrigel)作为细胞支持。细胞支持优选含有至少一种分化蛋白。术语“分化蛋白”或“底物蛋白”是用于描述可用于细胞生长和/或促进胚胎干细胞或中内胚层，中胚层或多潜能迁移细胞(MMC)分化(也优选是贴壁)的蛋白。在本发明中优选使用的分化蛋白质包括，例如，细胞外基质蛋白，它是在细胞外基质中发现的蛋白，如层粘连蛋白(laminin)，肌腱蛋白(tenascin)，血小板反应素(thrombospondin)，及其混合物，其表现出促生长和含有与表皮生长因子(EGF)同源的结构域并表现出促生长和分化活性。可用于本发明的其他分化蛋白质包括例如，胶原蛋白，纤连蛋白(fibronectin)，玻连蛋白(vibronectin)，多聚赖氨酸(polylysine)，多聚鸟氨酸(polyornithine)及其混合物。此外，也可使用凝胶和其它材料如其它凝胶的甲基纤维素，其包含有效浓度的一个或多个这些胚胎干细胞分化蛋白。示例的分化蛋白或包含这些分化蛋白的材料包括例如BD Cell-TakTM细胞和组织粘合剂，BDTM FIBROGEN人体重组胶原I，BDTM FIBROGEN人体重组胶原III，BD MatrigelTM基底膜基质，BD MatrigelTM高浓度基底膜基质(HC)，BDTM PuraMatrixTM肽水凝胶，胶原Ⅰ，高浓度(HC)胶原Ⅰ，胶原Ⅱ(牛)，胶原Ⅲ，胶原Ⅳ，胶原V及胶原VI，等等。本发明使用的优选材料包括MatrigelTM和GeltrexTM。
包含一个或多个分化或基底蛋白的优选组合物/材料是BD MatrigelTM基底膜基质。这是溶解的基底膜制品，其是从印格布莱斯-荷蒙-斯沃姆(Engelbreth-Holm-Swarm(EHS))小鼠肉瘤，一种富含ECM蛋白的肿瘤中提取的。其主要组分是层粘连蛋白，之后是胶原IV，硫酸乙酰肝素(heparin sulfate)，蛋白多糖，内功素(entactin)和巢蛋白(nidogen)。
优选将多能干细胞铺板在分化物或基底蛋白上。在促进细胞的存活，繁殖，并保留了期望特性的培养基的存在下，可将多能干细胞按合适分布铺板在基底上。所有这些特点得益于细心注意接种分布且易于为本领域技术人员决定。
本文中所使用的术语“激活”是指标记物表达的增加，如Isl或上调Isl或与血细胞、血管细胞(内皮细胞)、肾细胞、骨骼和肌肉细胞相关的标记物的活性。这些细胞可用于治疗心脏病，肾衰竭，骨骼修复和血管退化。
在本文中若提到细胞，细胞系，细胞培养物或细胞群时，术语“分离”是指从天然细胞源中基本分离以使细胞，细胞系，细胞培养物，或细胞群能够在体外培养。此外，术语“分离”是用来指从两个或更多的细胞集中物理选择一个或多个细胞，其中基于细胞形态和/或表达的各种标记物选择细胞。
本文中所使用的术语“表达”是指细胞中多核苷酸的转录或多肽的翻译(包括标记物)，以使分子水平可检测地在表达分子的细胞中或细胞上高于不表达的细胞。测量分子表达的方法为本领域普通技术人员熟知，包括但不限于RNA印记法(Northern blotting)，RT-PCT，原位杂交，蛋白质印迹法(Western blotting)，和免疫染色。
本文中所使用的术语“标记物”或“生物标记物”是描述在感兴趣细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在此背景下，差异表达是指阳性标记物水平的增加和阴性标记物水平的下降。和其他细胞相比，在感兴趣细胞中可检测到标记物核酸或多肽水平是足够高或低，可使用本领域已知的任意多种方法鉴定感兴趣细胞并同其他细胞区分。
本文中所使用的术语“接触”(即用化合物接触细胞)指包括将化合物和细胞一起在体外温育(例如，将化合物加入培养中的细胞)。术语“接触”是不包括在体内将细胞暴露于在受试者中自然存在的分化剂(“暴露”)(即暴露是由于自然生理过程所引起的)。可用任何适宜方式，如本文中另有所述的，进行将细胞与分化培养基和一个或多个生长因子(BMP或其他)和/或抑制剂(GSK，激活素A(信号)或BMP(信号等)的抑制剂)接触的步骤。例如，在贴壁培养中可作为贴壁层，作为胚胎体或在悬浮培养中进行细胞处理，尽管优选使用贴壁层，因为它们提供了有效的分化过程，通常分化成90％或以上的靶细胞群(中内胚层，中胚层或多潜能迁移细胞)。应理解的是，与分化剂接触的细胞还可用其它细胞分化环境进行进一步处理以稳定细胞，或进一步分化细胞，如产生胰岛细胞。
本文中所使用的术语“分化剂”是指可诱导细胞如hESC′s，多潜能迁移细胞(MMCs)，C56Cs，Isl 1+多潜能祖细胞(IMPs)，EPCs进行部分或完全分化的任何化合物或分子，其中，例如，所述分化为：由于至少部分抑制GSK，至少部分包含骨形态发生蛋白(BMP-2，BMP-4，BMP-6或BMP-7)，hESCs向中胚层Isl 1+细胞(IMPs)的分化；或可选地，抑制GSK和抑制激活素A和/或抑制骨形态发生蛋白，以产生多潜能迁移细胞(MMCs)；或，添加Wnt3a，BMP4和丁酸钠激活素A，以由MMCs产生C56Cs；或，添加Wnt3a，BMP4和全反式视黄酸，以IMPs产生EPCs等。分化剂可以是如下所述，术语不限于此。在本文中使用的术语“分化剂”包括在其范围内的天然或合成的分子，或表现出相似的生物学活性的多个分子。
术语“有效”用来描述组分、化合物或组合物，在相关环境中，其以足以产生预期效果的量和/或时间来使用或包括。举例来说，分化剂的有效量是指，分化剂与其它组分一起，在分化培养基经过适当时间(包括在不同分化剂接触到待分化细胞时的顺序次数)可产生所需分化细胞的分化剂的量。
术语“骨形态发生蛋白”或BMP是用于描述本发明所用的分化剂，其与本文中另有所述的其它成分组合，将hESCs或中内胚层细胞分化成中胚层Isl 1+细胞。使用任一有效量的BMP-2，BMP-4，BMP-6或BMP-7(优选BMP-2或BMP-4)可帮助分化过程。BMP的用量范围从约1ng/ml至约500ng/ml或更多，约25至约500ng/ml，约25至约250ng/ml，约50至约150ng/ml，约约75至约125ng/ml，约100ng/ml。
术语“GSK抑制剂”是用于描述抑制GSK(尤其GSK3，包括GSK3α或GSK3β)的化合物。在本发明优选使用的GSK抑制剂例子包括以下的一个或多个，所有可从剑桥生化(Calbiochem)购买：
BIO(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-肟((2′Z，3′E)-6-Bromoindirubin-3′-oxime)(GSK3抑制剂IX)；
BIO-丙酮肟(Acetoxime)(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟(GSK3抑制X)；
(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯喹唑啉-4-基)胺((5-Methyl-1H-pyrazol-3-yl)-(2-phenylquinazolin-4-yl)amine)(GSK3抑制剂XIII)；
吡啶咔唑-环茂二烯钌复合物(Pyridocarbazole-cyclopenadienylruthenium complex)(GSK3抑制XV)；
TDZD-8 4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻唑啉-3，5-二酮(4-Benzyl-2-methyl-1，2，4-thiadiazolidine-3，5-dione)(GSK3β抑制剂I)
2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-恶二唑(2-Thio(3-iodobenzyl)-5-(1-pyridyl)-[1，3，4]-oxadiazole)(GSK3β抑制剂II)；
OTDZT 2，4-二苄基-5-氧代噻唑林-3-硫酮(2，4-Dibenzyl-5-oxothiadiazolidine-3-thione)(GSK3β抑制剂III)；
α-4-二溴乙酰苯酮(α-4-Dibromoacetophenone)(GSK3β抑制剂VII)；
AR-A014418 N-(4-甲氧基苯)-N′-(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲(N-(4-methoxybenzyl)-N′-(5-nitro-1，3-thiazol-2-yl)urea)(GSK-3β抑制剂VIII)；
3-(1-(3-羟丙基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5-二酮(3-(1-(3-Hydroxypropyl)-1H-pyrrolo[2，3-b]pyridin-3-yl]-4-pyrazin-2-yl-pyrrole-2，5-dione)(GSK-3β抑制剂XI)；
TWSl19吡咯嘧啶化合物(pyrrolopyrimidine compound)(GSK3β抑制剂XII)；
L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其十四酰基形式(Myristoylate form)(GSK3β抑制剂XIII)；和
2-氯-1-(4，5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮(2-Chloro-1-(4，5-dibromo-thiophen-2-基)-乙酮)(GSK3β抑制剂VI)。
此外，许多无翅蛋白或Wnt蛋白功能类似于GSK抑制剂特别是本发明所述的GSK抑制剂。因此，它们归入术语GSK抑制剂，但不包括在本文和上述的GSK抑制剂的情况中，例如，在本文中另有所述的，由MMCs形成C56Cs的情况，可用来表示特指无翅蛋白或Wnt蛋白。本发明可用的示例Wnt蛋白包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt10，Wnt14，Wnt14b，Wnt15和Wnt16等等Wnt蛋白的一个或多个。优选使用Wnt3a。
本发明优选使用的GSK抑制剂包括BIO(GSK-3 IX)和Wnt3a。
GSK抑制剂可用于发明的所有方面，其涉及多潜能细胞(MMCs)和心外膜多能细胞(EPCs)的分化和形成。使用时，它们按有效量使用，浓度为(取决于所用抑制剂的分子量)约0.001至约100μM或更高，约0.05至约75μM，约0.1至约50μM，约0.25至约35μM，约0.5至约25μM。对使用BIO的情况，该GSK抑制剂用于分化培养基中的用量范围为约0.05至约50μM，约0.1至约10μM，约0.5至约5μM，约1-3μM。当使用Wnt蛋白时，Wnt使用量范围从约1至约100ng/ml，约5至约50ng/ml，约10至约35ng/ml，约20至约30ng/ml，约25ng/ml。
术语“激活素A抑制剂”用于描述化合物或组分，其任选地被添加到分化培养基中以在分化过程中抑制激活素A效果(TGFβ信号抑制剂)，在使用时，可由hESCs或内皮细胞EPCs产生多潜能迁移细胞(MMCs)。为了由hESCs产生MMCs，分化剂含有有效量的GSK抑制剂(优选，GSK3抑制剂，如BIO或其他GSK3抑制剂)和激活素A抑制剂加上或减去骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂。
在本发明所用的示例激活素A抑制剂包括例如SB431542(Sigma)，卵泡抑素(follistatin)，卵泡抑素基因相关蛋白(FGRP，可从研发***(R and DSystems)获得)，BMP和激活素膜结合抑制剂(BAMBI)，抗BAMBI(单克隆抗体)，Smad7(母系抗果蝇同源物(Mothers Against Decapentaplegic Homolog)7)及TGF RI抑制剂(剑桥生化(Calbiochem))等等。本发明所用的激活素A抑制剂是有效量的，一般范围是约0.001至约100μM或更多，约0.05至约75μM，约0.1至约50μM，约0.25至约35μM，约0.5至约25μM。
所谓“骨形态发生蛋白抑制剂”或“BMP抑制剂”用来描述化合物或组分，其以有效量添加到分化培养基时，在hESCs分化成多潜能***(MMCs)中，抑制骨形态发生蛋白的作用(抑制BMP信号)。示例的BMP抑制剂包括例如头蛋白，化合物C，硬化蛋白(sclerostin)，格里莫林(Gremlin(Drm/Gremlin))和USAG-I等等。BMP抑制剂的用量为有效量，通常(取决于所用抑制剂的分子量和效率)落入约0.01ng/ml至约500ng/ml或更多，约0.1至约350ng/ml，约0.5至约250ng/ml，约1至约500ng/ml，约5至约250ng/ml，约50至约150ng/ml，约75至约125ng/ml，约100ng/ml的范围内。
术语“PI3激酶途径抑制剂”或“PI3-激酶信号抑制剂”是指在接触抑制剂的细胞中可降低PI3激酶或PI3-激酶下游的至少一个分子的活性的任何分子或化合物。根据本发明这些抑制剂是用于由中内胚层细胞和/或多潜能迁移细胞制备定型内胚层细胞的优选抑制剂。该术语包括，例如，PI3激酶拮抗剂，对PI3-激酶信号转导级联拮抗剂，减少内源性PI3激酶的合成或表达的化合物，减少内源性PI3激酶释放的化合物，和抑制PI3激酶活性激活剂的化合物。在上述某些实施方式中，该抑制剂选自以下组：雷帕霉素(Rapamycin)，LY 294002，渥曼青霉素(wortmannin)，氯化锂，Akt抑制剂I，Akt抑制剂II(SH-5)，Akt抑制剂III(SH-6)，NL-71-101，以及上述的混合物。Akt抑制剂I，II，Akt III，和NL-71-101可从剑桥生化(Calbiochem)购买。在其它实施方式中，抑制剂是选自雷帕霉素和LY 294002组成的组。在进一步的优选实施方式中，这种抑制剂包括LY 294002。在另一个实施方式中，抑制剂包括Akt1-Ⅱ。应理解的是抑制剂的组合可用于得出所需的分化效果。最终的结果是生产大量的定型内胚层细胞，其可用于生产胰腺内胚层细胞和/或肝脏内胚层细胞，如2005年8月15日提交的no.PCT/US2005/028829，公开号WO 2006/020919(2006年2月23日公开)和2008年1月30日提交的PCT/US2008/001222，2008年8月7日公开号WO2008/094597的国际申请中所公开的，将其相关部分引入本文作为参考。
如本文中所用的，若提及细胞，细胞系，细胞培养物或细胞群时，术语“分离”是指从天然细胞源中基本分离，以使细胞，细胞系，细胞培养物，或细胞群能够在体外培养。可选地，取决于文章背景，术语“分离”指的是从分化培养基和培养瓶中分离的细胞群，以便使细胞群可以被保存(低温保存)。此外，术语″分离″是用来指从两个或多个细胞集中物理选择一个或多个细胞，其中基于细胞形态和/或表达的各种标记物选择细胞。
术语“传代”是用来描述细胞***并将其迁移到新的细胞瓶中进一步生长/再生长的过程。根据本发明，优选的贴壁细胞(甚至胚体)可使用酶传代(AccutaseTM或胶原酶)，人工传代(机械的，例如，抹刀(spatula)或其他柔性机械用具或装置)和其它非酶学方法，如细胞扩散缓冲液。
本文中所使用的术语“接触”(即用化合物接触hESC，多潜能迁移细胞，C56Cs，IMPs或EPCs)或“暴露”指的包括将化合物和细胞一起在体外温育(例如，在培养中将化合物加入细胞中)。术语“接触”是不包括在体内将细胞暴露于受试者中自然存在的分化剂或抑制剂(“暴露”)(即暴露是由于自然生理过程所引起的)。可用任何适宜方式，如在本发明所述的，进行将细胞与分化培养基中将生长因子和/或抑制剂的接触步骤。例如，细胞可在贴壁培养中、作为胚胎体或悬浮培养中处理。应理解的是，与分化剂和/或抑制剂接触的细胞还可用其它细胞分化环境进行进一步处理以稳定细胞，或进一步分化细胞，如产生内皮细胞，肌肉细胞，包括心肌细胞和血管细胞，包括血管。这些细胞可用作治疗心脏病，肾衰竭，骨修复和血管退化的恢复用药。
在某些实施方式中，将待进一步分化的hESCs，(Isl 1+)多潜能祖细胞(IMPs)，EPCs或MMCs进行铺板，铺板浓度小于约2.5×106细胞/35mm平皿，至少约2.5×104个细胞/35mm平皿，在约2.5×105至约2×106细胞/35mm平皿之间，在约5×105至2×106细胞/35mm平皿，小于约2×106细胞/35mm平皿，或密度大于4×105细胞/35mm平皿。在某些优选的方面，将要分化的细胞以大约7.5×105细胞/35mm平皿的浓度进行铺板。
在由hESCs生产MMCs(Isl 1+)多潜能祖细胞(IMPs)中，作为本发明的特定实施方式的第一步，本发明还包含了使用组合物培养细胞以生产hESCs的贴壁单层。在已知成分细胞培养基(无血清或KSR)中在细胞支持优选基质胶(Matrigel)上hESC’s生长成为贴壁单层。除了本文另有所述的典型组分之外，细胞培养基也优选含有有效量的一种或多种以下组分：抗坏血酸，转铁蛋白，β-巯基乙醇(Gibco)，成纤维细胞生长因子(FGF)，LR-IGF，激活素A和杂合素(hetergulin)，优选所有这些组分。hESCs贴壁层(或胚体)生长为用作分化的初始细胞群的细胞培养基可在本领域教导的范围内变化。
然后将以上生产的hESCs涂布在细胞支持上并在分化培养基(另有说明)中在有效量的分化剂和/或抑制剂下进行分化。细胞优选生长为贴壁单层。在ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)的情况下，hESCs与含有本文另有说明的有效量GSK抑制剂(优选是BIO或Wnt3a)的分化培养基接触合适时间以生产稳定的IMP群。在生产IMPs的情况下，hESCs与含有本文另有说明的有效量GSK抑制剂(优选是BIO或Wnt3a)与骨形态发生蛋白(BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7)组合的分化培养基接触合适时间以生产(Isl 1+)多潜能祖细胞群(IMPs)。
IMPs可以在存在GSK抑制剂(如BIO，在0.5-10μM，2μM)和BMP4的已知成分培养基中克隆和/或扩增并传代(Accutase，其它)。接着可将这些细胞以低密度(20-200细胞/mm2)铺板在甲基纤维素(0.9％终浓度)或其他增稠剂(例如纤维素类)中的基质蛋白(Metrigel)上维持若干天(3)，其后，每天更换培养基。大约两个星期后(14天)，可分离和亚培养个别群落以产生稳定的，可克隆的IMP细胞系。
IMPs可用于在不存在激动素A+/-IGF，存在有效量的BMP(1-25ng/ml，约10ng/ml)；BMP(1-25ng/ml，约10ng/ml)+DKK1(25-500ng/ml，150ng/ml)；BMP(1-25ng/ml，约10ng/ml)+DKK1(25-500ng/ml，150ng/ml)+VEGF(1-25ng/ml，10ng/ml)；DKK1(25-500ng/ml，150ng/ml)和VEGF(1-25ng/ml，10ng/ml)的条件下，持续约两周时间(约10-20+天)，直接生产心肌细胞。
IMPs可用于在体外和体内产生平滑肌细胞，心肌细胞和内皮细胞，如本文所述。IMPs可直接注射/应用于心肌组织受损位点，并可通过分化成功能性心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞参与修复过程。此外，当用心肌细胞培养时，IMPs可分化成心肌细胞。
在本文另有所述的已知成分培养基中，可利用有效剂量的无翅蛋白(Wnt3a)，骨形态发生蛋白(BMP4)和全反式视黄酸将IMPs分化成EPCs。根据本发明的方法所生产的内皮细胞可用于生成内皮细胞，平滑肌细胞和心肌成纤维细胞。
IMPs可直接注射/应用于心肌组织受损位点，并可通过分化成功能性心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞参与修复过程。此外，IMPs可分化成心肌细胞。
EPCs，如IMPs，可用于在体外和体内产生平滑肌细胞、心肌细胞和内皮细胞，如本文另有所述。IMPs可注射/直接应用于心肌组织受损位点，并可通过分化成功能性心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞参与修复过程。EPCs还被认为能够并入内胚层血管组织(小鸡胚胎移植物)。因此，EPCs被认为能够再生与内胚层相关的器官，如肠，其具有来源自浆膜间皮(serosal mesothelium)(原心外膜的来源处)的内层。因此，EPCs被认为具有修复体内内胚层来源器官的用途。根据本发明，EPCs因此具有造就肠血管的能力并具有在需要再生血管的多种组织范围内的心脏外修复的作用(中风，糖尿病并发症等)。参见WiIm，等，发育(Development)，132(23)5317-28，2005。
在进一步的实施方式中，细胞培养基可以是条件培养基(MEF-CM)。条件培养基可从饲养细胞层获得。可预计的是，饲养细胞层可含有成纤维细胞，且在一个实施方式中，含有胚胎成纤维细胞。优选的培养基是无饲养细胞的。
在一个特别优选的实施方式中，用于产生中胚层(Isl 1+)细胞(IMPs)或MMCs的分化培养基含有DMEM/F12(50/50)，约2％原蛋白(probumin)(白蛋白)，抗生素(1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)1×非必需氨基酸(NEAA))，微量元素A，B，C(例如，1×，来自培养基技术(Mediatech))，抗坏血酸(例如，约为50μg/ml)，转铁蛋白(例如约10μg/毫升)，β-巯基乙醇(约0.1mM)，bFGF(如约8ng/ml)，LR-IGF(例如，约200ng/ml)，激活素A(例如，约10ng/ml)和神经杂合素(Heregulin)(例如，约10ng/ml)。需要注意的是，在多潜能迁移细胞(MMCs)的生产中可以去除激活素A和神经生长因子。当然，可按照本领域的教导在分化培养基中省略以上组分中的一种或更多，但是本发明优选使用所列出的全部组分。
本细胞也提供了鉴定影响(促进，抑制或影响)细胞分化的分子的生物试验的潜在用途。在本细胞分化的第一步提供了很好的研究上皮向间质转化的机会，特别是在癌症进展中，上皮向间质转化作为肿瘤转移的一部分。因此，本发明所述的方法和细胞群提供特殊的***，其既可在分子水平上了解EMT和鉴定新药物靶点，也可筛选在促进EMT条件下可阻断EMT的小分子(BIO)。由于可以很容易地实现干细胞在96/384孔板上生长，快速药物筛选可用于鉴定可阻断或抑制EMT并代表具有潜在价值的抗癌剂的潜在分子。
关于MMCs，其是在已知成分培养基中生长的具有多潜能分化能力的稳定细胞群。这些细胞尤其可用于筛选可促进或抑制分化或促进并特定分化成一种或另一种谱系的分子。
治疗
在本文中所描述的细胞群和/或方法可为细胞相关的疾病和/或病状的处理提供有效治疗。
在第一个方面，本发明提供了用于治疗患有心血管疾病的患者的方法。这种方法包括培养多能干细胞，在体外将多能干细胞分化为心血管肌肉细胞(心肌细胞)，并对有需要的患者植入有效量的心血管肌肉细胞。可选地，一种治疗心血管疾病，包括梗塞，患者的方法包括，对需要治疗的患者心脏组织给药有效量的心外膜祖细胞(EPCs)或Isl 1+多潜能祖细胞(IMPs)，可全身给药，或直接给药至心肌组织或给药进入心肌组织。这些细胞也可用于治疗中风和糖尿病并发症，尤其是血管并发症并可修复患者的内胚层器官(肝脏，胰腺，消化道等)。
在另一个方面，本发明提供一种治疗有需要的患者受损或缺血血管组织(血管)的方法，包括对待修复血管给药有效量的EPCs或IMPs。在一个可选实施方式中，在含有有效量的GSK抑制剂(优选Wnt3a)和BMP(BMP4)组合的细胞分化培养基中，通过进行至少大约5-6天时间的细胞传代使EPCs分化成平滑肌细胞，并将所获得的平滑肌细胞给药至(植入)患者体内结构血管受损位点以对其进行治疗/修复。
治疗方法可利用MMCs或优选利用如本文所述生产的C56Cs来归巢向受损/发炎组织位点。在这方面，将有效量的C56Cs给药至有需要的患者体内以治疗选自以下组的疾病状态或病状：心血管疾病(心肌病，局部缺血)，视网膜肌病(retinomyopathy)，神经病变，糖尿病(I和II型)，中风，头部外伤，自身免疫性疾病(狼疮，关节炎，多发性硬化症)，免疫抑制，移植物抗宿主病，骨修复，创面修复，炎症性疾病(关节炎，克隆氏病，囊肿性纤维化)和帕金森症，亨廷顿症等等。MMCs或C56Cs的全身给药可通过直接静脉给药或通过注射至受损或疾病所在的位点，包括心血管组织(特别是缺血心脏)和骨骼组织。因为MMCs和更重要的C56Cs的归巢特性，这些细胞可给药至远离受损/炎症的位点而细胞会“归巢”向患者体内那些位点实施治疗。
如果合适的话，患者可以用利于移植细胞的生存和功能的药剂或生物活性剂作进一步治疗。这些药剂可包括，例如，胰岛素，TGF-β族成员(TGF-β1，2和3)，骨形态发生蛋白(BMP-2，-3，-4，-5，-6，-7，-11，-12和-13)，成纤维细胞生长因子1和-2，血小板衍生生长因子-AA，和-BB，富含血小板的血浆，胰岛素生长因子(IGF-Ⅰ，Ⅱ)，生长分化因子(GDF-5，-6，-7，-8，-10，-15)，血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)，多效蛋白(pleiotrophin)，内皮素(endothelin)，等等。其他药物组合物可包括例如烟酰胺，胰高血糖素样肽-I(GLP-I)和II，GLP-1和2模拟体(mimetibody)，艾塞那肽-4(Exendin-4)，视黄酸，甲状旁腺激素，MAPK抑制剂，例如，公开的美国申请2004/0209901和公开的美国申请2004/0132729公开的化合物。
本发明所述的心外膜多能细胞(EPCs)，可用于在患者体内产生内皮细胞，平滑肌细胞和心肌成纤维细胞，或产生血管细胞。这些细胞可用于治疗心血管疾病及修复或治疗受损组织，包括肝脏、胰腺和胃肠道组织。这种方法包括对患者全身给药有效量的EPCs，以影响和增强心肌细胞增殖，存活功能和分化。此外，EPCs可通过再生冠状组织尤其包括冠状脉管***起到对缺血或受损心脏治疗的作用。
为了进一步加强植入细胞的分化、生存或治疗活性，在细胞给药之前、同时或之后给药附加因子，如生长因子、抗氧化剂、免疫抑制剂或抗炎剂。在某些实施方式中，生长因子用于使给药的细胞在体内分化。这些因子可以由内源细胞分泌并与给药细胞原位接触。植入的细胞可以由本领域已知的内源和外源给予的生长因子的任何组合进行诱导分化。
用于植入细胞的数量取决于许多因素，包括患者的病状和对治疗的反应，可以由本领域技术人员决定。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有血管疾病，或具有患病风险，或患有局部缺血的患者的方法。此方法涉及培养多能干细胞，在体外将培养的细胞分化成心外膜多能干细胞(EPCs)群，并将这些细胞注射进有需要的患者体内，或可选地，将这些细胞并入三维支持物内以产生内皮组织、心肌细胞和平滑肌组织。在植入患者体内之前，可将这些细胞在体外维持在该支持物上。可选地，可将含有细胞的支持物直接植入患者体内而无需额外的体外培养。支持物可任选地与至少一种药剂合并，该药剂有利于移植细胞生存和功能，或可另外用来治疗糖尿病，或心血管疾病，或功能障碍。
适用于本发明目的的支持物材料包括用于组织修复的组织模板(templates)、导管(conduits)、屏障(barriers)和储液囊(reservoirs)。特别地，以泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织品和非编织结构的形式的，已在体外和体内用于重建或再生的生物组织，以及递送诱导组织生长的趋化因子的，合成材料和天然材料，适用于实现本发明的方法。参见，例如，在美国专利No.5,770,417，美国专利No.6,022,743，美国专利No.5,567,612，美国专利No.5,759,830，美国专利No.6,626,950，美国专利No.6,534,084，美国专利No.6,306,424，美国专利No.6,365,149，美国专利No.6,599,323，美国专利No.6,656,488，公开的美国申请2004/0062753A1，美国专利No.4,557,264和美国专利No.6,333,029中公开的材料。
为了形成并入了药剂的支持物，可在支持物形成之前，将药剂和多聚物溶液混合。可选地，药剂可包被在预制的支持物上面，优选存在药物载体。药剂可呈现为液体、固体细末(finely divided solid)或任何其他适当的物理形态。可选地，可在支持中添加辅料来改变药剂释放速率。在一个可选实施例中，支持物可与至少一种抗炎症化合物的药物化合物合并，例如美国专利No.6,509,369公开的化合物。
支持物可与至少一种抗凋亡化合物的药物化合物合并，如美国专利No.6,793,945公开的化合物。支持物也可与至少一种纤维化抑制剂药物化合物合并，例如美国专利No.6,331,298公开的化合物。支持物也可与至少一种能增加血管生成的药物化合物合并，例如公开的美国申请2004/0220393和美国公开申请2004/0209901公开的化合物。支持物也可与至少一种免疫抑制化合物的药物化合物合并，例如公开的美国申请2004/0171623公开的化合物。
支持物也可与至少一种生长因子药物化合物合并，例如TGF-β族成员，包括TGF-β1，2和3，骨形态发生蛋白(BMP-2，-3，-4，-5，-6，-7，-11，-12和-13)，成纤维细胞生长因子-1和-2，血小板衍生生长因子-AA，和-BB，富含血小板的血浆，胰岛素生长因子(IGF-Ⅰ，Ⅱ)，生长分化因子(GDF-5，-6，-8，-10，-15)，血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)，LDkk1，血小板衍生生长因子β(PDGFβ)，多效蛋白，内皮素，等等。其他药物化合物可以包括，例如，烟酰胺，缺氧诱导因子1-α，胰高血糖素样肽I(GLP-I)，GLP-1和GLP-2模拟物，和II，艾塞那肽-4(Exendin-4)，诺达尔(nodal)，头蛋白，NGF，视黄酸，甲状旁腺激素，肌糖蛋白-C，弹性蛋白原，凝血酶衍生肽，抗菌肽(cathelicidins)，防御素(defensins)，层粘连蛋白，含有粘性细胞外基质蛋白的细胞和肝素结合结构域的生物多肽，如纤连蛋白(fibronectin)和玻连蛋白(vitronectin)，MAPK制剂，例如，公开申请2004/0209901和公开的美国申请2004/0132729公开的化合物。
本发明的细胞并入支架(scaffold)可通过将细胞简单沉积在支架上面来完成。细胞可通过简单的扩散作用进入支架(儿科手术杂志(J.Pediatr.Surg.)23(1Pt 2)：3-9(1988))。已经发展了其它几种方法以提高细胞接种的效率。例如，旋转瓶已用于将软骨细胞(chondrocytes)接种于聚乙醇酸(polyglycolicacid)支架上(生物技术进展(Biotechnol.Prog.)14(2)：193-202(1998))。另一种接种细胞的方法是使用离心，此法对接种细胞产生最小胁迫且提高接种效率。例如，Yang等开发了一种细胞接种方法(生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)55(3)：379-86(2001))，称为离心细胞固定(CCI)。
参照以下本文包括的，本发明优选实施方式和实施例的详细说明，可以更容易理解本发明。但是，在公开和描述本文中组合物和方法之前，需了解的是，本发明不仅限于特定的核酸，特定的多肽，特定的细胞类型，特定的宿主细胞，特定的条件，或特定的方法等，因为这些必然可以变化，对其进行多种修改和变化对本领域的技术人员是显而易见的。
实施例
所有组分均以有效量使用
1.产生和维持中胚层来源的IsL1+多潜能祖细胞(IMPs)的方法
该实施例描述了产生和维持多传代中胚层来源的Isl 1+多潜能祖细胞(IMPs)细胞类型的方法，该细胞类型具有分化成心肌细胞、平滑肌细胞或内皮细胞的能力(图1)。
a)IMP’s的产生和维持
由WA09hESCs产生IMP’s如实施例3所示(PCT/US2008/001222，公开号WO2008/094597)。见下文。
实施例3(PCT/US2008/001222，公开号WO2008/094597)：产生中胚层来源的Isl 1+多潜能祖细胞(IMPs)的方法
该实施例描述了产生中胚层来源的Isl 1+多潜能祖细胞(IMPs)细胞类型的方法，该细胞类型具有分成化心肌细胞、平滑肌细胞或内皮细胞的能力。该细胞类型沿着通过中内胚层状态然后中胚层的途径分化。
(a)通过将Wnt3a和BMP4添加入hESC培养物，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。
生长在StemPro
Figure BPA00001332374800501
已知成分培养基中的BG02hESCs用AccutaseTM进行传代，并如实施例1所述地，铺板在基质胶(Matrigel)涂敷平皿(每60mm平皿1.0×106细胞)上，此外培养基补充了BMP4(100ng/ml，研发***(R&D Systems))和人Wnt3a(研发***(R&D Systems))。每天更换一次培养基。在240小时(10天)内，进行Q-PCR分析以评估分化。该分析表明中内胚层标记物如T在处理后24小时升高，但随后下降(图11)。处理24小时后，指示中胚层分化的转录标记物显著上调(Isl 1，PDGFRα，KDR，Tbx20，GATA4)(图11)。免疫染色显示处理后24-96小时期间，大多数细胞对T染色阳性，但这一指标在144小时下降。用BMP4和Wnt3a处理6天(144小时)之后，＞90％的细胞对Nkx2.5、Isl 1和Tbx20染色阳性。该基因的表达谱是次级心脏区域的多潜能Isl 1+祖细胞的指标(Laugwitz等，发育(Development)135：193-205)。伴随着独特的细胞形态变化，Isl 1+细胞分化完成。
(b)通过添加Wnt3a经过由1-3天之后再添加BMP4，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。
通过在最初添加Wnt3a维持1-3天之后添加BMP4维持2-4天来处理生长在MEF-CM或已知成分培养基中的hESCs可以产生Isl 1+中胚层细胞。
(c)通过将BMP4和GSK抑制剂例如BIO添加至MEF-CM中的hESCs，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。
生长在MEF-CM中的基质胶(Matrigel)上的BG02 hESCs用胰蛋白酶进行传代，并按每60mm平皿1.5×106细胞接种回补充了BIO(2μM)和BMP4(100ng/ml)的MEF-CM中的基质胶(Matrigel)上。每天更换一次培养基。在240小时(10天)内，进行Q-PCR分析以评估分化。相比hESCs，处理的细胞在分化的形态指标上发生了变化。由Q-PCR分析的转录水平显示，hESC标记物Nanog，Oct4，LeftyA在48小时时下降，而中内胚层标记物(T，MixL1)于48小时时达到高峰但在96小时时下降。随着中内胚层标记物水平下降，早期中胚层标记物(FoxF1，GATA4，Isl 1，Tbx20，PDGFRα，PDGFRβ)从24-48小时时开始升高。这些标记物是IMPs形成的指标。
(d)通过将BMP4和GSK抑制剂如BIO添加至在已知成分培养基中培养的hESCs，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。
通过将BMP4和BIO添加至在已知成分培养基中培养的hESCs，hESCs可分化成Isl 1+祖细胞。用BMP4和BIO处理6天。
(d)通过添加GSK抑制剂如BIO经过1-3天后，添加BMP4，Isl 1+多潜能祖细胞的产生
通过添加GSK抑制剂如BIO维持1-3天之后，添加BMP4再维持2-4天，可由生长于MEF-CM或已知成分培养基中的hESCs产生Isl 1+中胚层细胞。
(e)通过将Wnt3a和BMP4和TGFβ信号抑制剂(如SB431542)添加到hESC培养物中，产生Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)
通过添加Wnt3a、BMP4和TGFβ抑制剂(如SB431542)维持1-4天之后通过去除TGFβ且用Wnt3a和BMP4继续培养2-4天，可由生长于MEF-CM或已知成分培养基中的hESCs产生Isl 1+中胚层细胞。
(f)通过添加Wnt3a和TGFβ信号抑制剂(如SB431542)维持1-4天之后添加BMP4，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。
通过添加Wnt3a和TGFβ抑制剂(如SB431542)维持1-4天之后添加BMP4再维持2-4天，可由生长在MEF-CM或已知成分培养基中的hESCs产生Isl 1+中胚层细胞。
(g)通过添加Wnt3a维持1-3天之后添加BMP4和SB431542，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。
通过添加Wnt3a和SB431542维持1-3天之后添加BMP4再维持2-4天，由生长在MEF-CM或已知成分培养基中的hESCs产生Isl 1+中胚层细胞。
根据本发明的方法，在第3-6天将以上方法所述获得的细胞按1∶6分至含有BIO(2μM)和BMP4(100ng/ml)的已知成分培养基中。这些细胞被无限期地维持在该培养基中，并每4-6天按1∶4-1∶6的比例分出。由此产生的细胞在后续传代中保持Isl 1+和Nkx2.5的表达(图2A-B)。这些细胞失去了hESC多能标记物Nanog和上皮细胞标记物E-钙粘蛋白，而发现β-连环蛋白在整个细胞中，包括在核内的定位消失(图2C-D)。
2.自我更新ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)的克隆扩增。
本发明还包括中胚层(Isl 1+多潜能祖细胞，IMP)细胞在含有GSK抑制剂和BMP的自我更新条件下克隆繁殖的方法，包括：(a)中胚层细胞(Isl 1+多潜能祖细胞)，(b)在甲基纤维素(最终浓度为0.9％，从干细胞技术(Stem Cell Technologies)购买)和自我更新的培养基中生长1-5天，(c)在自我更新的培养基中进一步生长3-20天形成单个集落。收集并扩增单个集落，并使其进一步分化(图3)。参考PCT/US2008/001222(WO2008/094597)的实施例3中有关由hESCs产生IMP细胞的信息。
IMPs在克隆密度下传代和扩增的能力允许对这些细胞的潜能进行严格检验，也允许这些细胞用于高密度/高通量的筛选试验。例如，由于Isl 1+细胞处于成人心脏中，它对于鉴定影响IMP细胞增殖/扩增并分化成功能性细胞类型的小分子有重要作用。IMP细胞代表鉴定可用于控制心脏内Isl 1+细胞行为的药物/化合物的模型。预计的结果是，这会刺激Isl 1+细胞参与心肌修复/再生。
产生可克隆的IMP(Isl 1+多潜能祖细胞)细胞系的方法
此实施例描述了产生可克隆的IMP细胞系(即由单个细胞衍生出细胞系)和对其低密度铺板的步骤，适用于高通量药物筛选。IMP细胞可在添加GSK抑制剂(例如，BIO在2μM)和BMP4(例如，100ng/ml)的已知成分培养基中维持(自我更新)，并通过AccutaseTM传代(图3)。这些细胞以“低密度”(10-500，优选20-200细胞/mm2)铺板在MatrigelTM包被的平板上的生物相容增稠剂中，优选是纤维素增稠剂，优选甲基纤维素(终浓度0.9％)维持3天。3天后，每天更换培养基。14天后，分离单个集落并亚培养成稳定的，可克隆的细胞系。可选地，克隆扩增的IMP细胞可利用酶如胶原酶以结块(clumps)进行传代。
3.由自我更新ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)产生内皮、平滑肌和心肌细胞的方法
a)来自自我更新的IMP’s的心肌细胞的产生
涉及由自我更新的IMP细胞产生心肌细胞的方法(见以上和PCT/US2008/001222，WO2008/094597)。原则上，这些细胞可以由直接来源自hESCs的Isl 1+细胞产生。
以下描述几种产生心肌细胞的方法：
将自我更新IMP’s分开，按25-250×103细胞/cm2接种，并生长于已知成分培养基中，培养基去除了激活素A和+/-IGF，并存在以下任一组物质：
i)BMP(10ng/ml)
ii)BMP(10ng/ml)+DKK1(150ng/ml)
iii)BMP(10ng/ml)+DKK1(150ng/ml)+VEGF(10ng/ml)(图4)
iv)DKK1(150ng/ml)+VEGF(10ng/ml)
细胞在这些培养基中再生长14天。通过cTNT，SM-肌动蛋白和肌节肌动蛋白的表达确定，得到的培养物含有10-30％的心肌细胞(图4)。
作为可选策略，Isl 1+IMP细胞通过：
v)在RPMI培养基中的B27补充剂(1×；英骏(Invitrogen))
的处理可转化为心肌细胞。
此外上述(i-v)单个条件可补充全反式视黄酸(0.1-5μm)以增强心肌细胞分化。
b)来自自我更新IMPs的内皮细胞的产生
涉及由自我更新IMP细胞产生内皮细胞的方法。原则上，这些细胞可以由直接来源自hESCs的Isl 1+细胞产生。
以下描述几种产生内皮细胞的方法：
将自我更新IMP’s分开，按25-250×103细胞/cm2接种，并生长于已知成分培养基中，培养基去除了激活素A和+/-IGF，并存在以下任一组物质：
v)BMP(10ng/ml)
vi)BMP(10ng/ml)+DKK1(150ng/ml)
vii)BMP(10ng/ml)+DKK1(150ng/ml)+VEGF(10ng/ml)
viii)DKK1(150ng/ml)+VEGF(10ng/ml)
细胞在这些培养基中再生长14天。
c)来自自我更新IMPs的平滑肌细胞的产生
自我更新IMPs可以在存在Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(100ng/ml)的已知成分培养基中生长21天。
4.来自hESCs通过IMP祖细胞中间体的内皮细胞，平滑肌和心肌细胞的形成
(i)来自IMPs的平滑肌细胞的产生。
hESCs在存在Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(100ng/ml)的已知成分培养基生长6天。将细胞按1∶4-1∶6分至相同培养基再维持4天。固定细胞并对平滑肌标记物，平滑肌肌动蛋白，钙调理蛋白(calponin)，钙介导蛋白(caldesmin)和SM-MHC染色。大多数细胞对这些平滑肌标记物着色。
(ii)来自IMPs的心肌细胞和内皮细胞的产生。
通过三种处理制备IMPs。处理一；hESCs在存在激活素A(100ng/ml)的已知成分培养基中生长第一个24小时，存在Wnt3a(25ng/ml)下生长第1-4天，和存在BMP4(100ng/ml)下生长第2-6天。处理二；hESCs(BG02)在去除IGF-I，杂合素(Heregulin)和FGF2并存在Wnt3a(25ng/ml)的已知成分培养基中生长第1-2天，存在BMP4(100ng/ml)下生长第2-6天。处理三；hESCs在存在激活素A(100ng/ml)的已知成分培养基中生长第一个24小时，存在Wnt3a(25ng/ml)下生长第1-2天，存在BMP4(10ng/ml)下生长第2-6天。在第6天结束时，将细胞置于已知成分培养基再生长14天。收集细胞，Q-PCR分析表明，处理2生产了内皮细胞标记物(CD31/皮卡姆尔(Pecaml)和CDH5/VE-钙粘蛋白)和处理3生产了心肌细胞标记(ACTC1/心脏α肌动蛋白和cTNT)(图21)。这些结果表明，IMP细胞能够分化成心肌细胞和内皮细胞。
a)来自IMPs的内皮细胞的产生。
hESCs在存在Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(100ng/ml)的已知成分培养基中生长4-6天。以25-250×103细胞/cm2将细胞分开，并生长于已知成分培养基中，培养基去除了激活素A和+/-IGF，并存在以下任一组物质：
ix)BMP(10ng/ml)
x)BMP(10ng/ml)+DKK1(150ng/ml)(图5)
xi)BMP(10ng/ml)+DKK1(150ng/ml)+VEGF(10ng/ml)
xii)DKK1(150ng/ml)+VEGF(10ng/ml)
细胞在这些培养基中再生长14天。所得到细胞有20-40％是内皮细胞来源的(图5)。
可选地，不分开初始IMP培养物，将它们维持并进行(ix-xii)所述处理而不传代。
b)来自IMPs的平滑肌细胞的产生。
hESCs在存在Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(100ng/ml)的已知成分培养基中生长21天。将细胞分成1∶4-1∶8并在相同培养基中再生长24小时。所得的培养物是＞90％的平滑肌(图6A-C)。
c)来自自我更新IMP’s的心肌细胞的产生。
涉及由直接来源自hESCs的IMP细胞产生心肌细胞的方法(又见PCT/US2008/001222，WO2008/094597)。
以下描述几种产生心肌细胞的方法：
将IMP’s分开，按25-250×103细胞/cm2接种，并生长于已知成分培养基中，培养基去除了激活素A和+/-IGF，并存在以下任一组物质：
i)BMP(10ng/ml)
ii)BMP(10ng/ml)+DKK1(150ng/ml)
iii)BMP(10ng/ml)+DKK1(150ng/ml)+VEGF(10ng/ml)
iv)DKK1(150ng/ml)+VEGF(10ng/ml)
细胞在这些培养基再生长14天。通过cTNT、SM-肌动蛋白和肌节肌动蛋白的表达确定，所得的培养物含有10-30％或更多心肌细胞。
作为可选策略，Isl1+IMP细胞通过：
v)在RPMI培养基中的B27补充剂(1×；英骏(Invitrogen))
处理可转化为心肌细胞。
此外上述(i-v)单个条件可补充全反式视黄酸(0.1-5μm)以增强心肌细胞分化。
5.通过细胞表面标记物分析进一步确定IMP细胞
根据我们在实验室中的观察，PDGFRα转录因子的增加与IMP形成有关，我们现在指出，这也与通过流式细胞术在细胞表面检测PDGFRα有关(图7)。当hESCs在Wnt3a和BMP4存在下向IMPs细胞分化时，它们下调hESCs标记物SSEA3并上调PDGFRα。
6.MMCs向c-KIT+心血管祖细胞的分化
MMCs是来源自hESCs的自我更新，多潜能的类群，hESCs是具有分化成多种细胞类型的潜能的中胚层来源的祖细胞，所述细胞类型包括，尤其是，心血管系如心肌细胞、平滑肌和内皮细胞(PCT/US2008/001222，公开号WO2008/094597，引入本文作为参考)。MMCs可被冻结，恢复，然后再长时间生长，同时保留其多潜能分化的潜能。在这里，描述了MMCs向c-kit+CXCR4+细胞类型的分化(见图8)。这种细胞类型可用于，但并不限于，修复受损心肌和心血管组织。细胞可以作为细胞治疗剂，通过直接注射进入受损组织位点或通过全身给药，其中，细胞可“归巢“向的受损组织位点。图15。由于这些细胞多潜能性质，这些细胞的修复功能不限于心血管应用，并可用于控制炎症疾病及修复其它受损组织/器官。
人类胚胎干细胞的培养(如WO2008/094597所描述)
生长hESC的方法。
方法：表达标记物如POU结构域转录因子Oct4的hESCs优选生长在鼠胚胎饲养条件培养基MEF-CM或已知成分培养基中，并用基质胶(Matrigel)作为生长基质(例如)。细胞通常按1-1.5×106每60mm平皿进行铺板。细胞每4-5天以约1∶4至1∶10分开传代。
(i)小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基(MEF-CM)
hESCs可以优选1∶20-1∶200稀释度，在存在Fgf2的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基(MEF-CM)中，支持hESC维持的基质胶上(Matrigel)(BD生物科学(BD Biosciences))，或其它基质上生长(McLean等，干细胞(Stem cell)25：29)。细胞可通过利用酶(胰蛋白酶，AccutaseTM，胶原酶)，人工传代(机械)和非酶方法的多种方法传代。细胞以每60mm平皿1.5×106的密度铺板，且每4-5天以1∶4-1∶10分开传代。
(ii)确定条件(DC)
(a)常规培养hESCs的已知成分培养基是以StemPro
Figure BPA00001332374800581
购自英骏(Invitrogen)(Wang等，血液(Blood)110：4111)。除了AccutaseTM用于细胞传代作单细胞悬浮液，根据制造商的建议使用培养基。下面的配方能够将hESCs保持在多能状态。以下已知成分的无血清培养基条件效果良好，但不限于此特定配方，并包括无饲养培养：DMEM：F12(Gibco)，2％BSA(血清级，#82-047-3)，1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)(Gibco)，1×非必需氨基酸(Gibco)，1×微量元素A，B和C((Sigma，#A4034)，10μg/ml转铁蛋白(Gibco，#11107-018)，0.1nM β-巯基乙醇，8ng/ml Fgf2(Sigma，#F0291)，200ng/mlLR-IGF(JRH生物科学(JRH Biosciences)，#85580)，10ng/ml激活素A(研发***(R&D Systems)，#338-AC)，10ng/ml杂合素(Heregulin)β(派普若技术(Peprotech)；#100-03)。
(b)根据制造商的建议，hESCs也可以在商业可供的已知成分培养基配方中培养，如mTeSR1(BD/干细胞技术(Stem Cell Technologies)；Ludwig等，自然生物技术(Nat Biotechnol.)24：185)。AccutaseTM传代也可与此培养基组合使用。
多潜能***的产生(MMCs)
基于PCT/US2008/001222，WO2008/094597的实施例8
如上所述的，生长在StemPro
Figure BPA00001332374800591
已知成分培养基中的BG02hESCs利用AccutaseTM传代并铺板在基质胶(Matrigel)包被平皿上(1.0×106细胞每60mm平皿)，此外培养基补充了BIO(2μm)和SB431542(20μM；Sigma)。每天更换培养基且细胞用AccutaseTM每5-6天传代，在每个传代中以1∶5-1∶10分开。当在这些条件下培养时，多能标记物Nanog在第一传代(P0)中减少和T转录水平提高，而Sox17，FoxF1，CXCR4和PDGFRα仍然很低。用BIO和SB431542处理后四天，90％的细胞对T染色呈阳性，这表明它们在某一时间通过中内胚层状态转化。在此期间，Nanog、Oct4和E-cad明显下调，如免疫染色所示。E-钙粘蛋白的消失指示了细胞经历由上皮向间质的转变，与分化成中内胚层过程一致。持续传代时，在P1-P10，T表达降低(如用Q-PCR确定的)且多能标记物Nanog没有再出现。这可通过免疫染色证实，其中和hESCs相反，P7细胞未表达Nanog，Oct4或E-钙粘蛋白。中胚层和内胚层标记物在这段时间内没有增加。细胞在相同条件下连续传代和它们保持超过20个传代的强大增殖活性且保持形态(使用以上所述相同的含BIO和SB431542的培养基)。产生的MMCs使用标准的方法低温保存，并以＞10％的铺板效率复苏。低温恢复(cryorecoverd)的MMCs的生长和形态特征与前低温保存(precryopreserved)的MMCs没有区别。
利用GSK3的抑制剂，激活素/诺达尔(Nodal)信号抑制剂和BMP信号抑制剂(GABi细胞)的组合，中胚层源的附加的自我更新祖细胞的产生。
作为在本申请和之前提交的PCT申请(PCT/US2008/001222，WO2008/094597)中已确定原理的延伸，将其全文引入本文参考，它可能由hESCs产生中胚层源自我更新祖细胞，其在培养中可保持很长时间(＞10代)且其表现出多潜能分化的潜能。这些祖细胞可由生长在本文所述条件下的hESCs发育得到(上述实施例和PCT/US2008/001222，WO2008/094597)。
通过用GSK3抑制剂和激活素/诺达尔(Nodal)信号(如SB431542)和/或BMP信号抑制剂(如头蛋白或化合物C)组合处理hESCs可以产生这些祖细胞。由于GSK3抑制剂的作用，在以上特定化学抑制剂的存在下，hESCs通过EMT分化变成中内胚层，并且随后的培养物转换成的祖细胞表型。(图11)。
由hESCs产生祖细胞的附加实施例包括：
(i)GSK3抑制剂，如BIO(2μM)加激活素/诺达尔(Nodal)信号抑制剂(例如，SB431542)-这些被称作MMCs(如PCT/US2008/001222描述，本文参考其全部内容)
(ii)GSK3抑制剂，如BIO加BMP信号抑制剂(例如，头蛋白，化合物C)-预知实施例
将hESCs细胞以2.0×106/60mm平皿的密度铺板在基质胶(Matrigel)平皿上。分化培养基含有DMEM/F12(50/50)，大约2％前白蛋白(probumin)(白蛋白)，抗生素(1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)1×非必需氨基酸(NEAA))，微量元素A，B，C(例如，1×，来自培养基技术(Mediatech))，抗坏血酸(例如，约50μg/ml)，转铁蛋白(例如，约10μg/ml)，β-巯基乙醇(约0.1mM)，bFGF(例如，约8ng/ml)，LR-IGF(例如，约200ng/ml)，杂合素(heregulin)(例如，约10ng/ml)，BIO(例如，约2μM)和化合物C(例如，约1μM)。也可用头蛋白替换化合物C。
细胞持续生长，用AccutaseTM(Innovative Cell Technologies)每5-7天以1∶5分开传代。这些细胞可被冷冻，以高复苏程度解冻，并分化成多种谱系。细胞也可用其它分散试剂(酶和非酶)作为单细胞悬浮液或结块传代。
(iii)GSK3抑制如BIO加BMP信号抑制剂加激活素/诺达尔(Nodal)信号抑制剂(预知的实施例)
hESCs细胞以2.0×106/60mm平皿的密度铺板在Matrigel平皿上。分化培养基含有DMEM/F12(50/50)，约2％probumin(白蛋白)，抗生素(1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)1×非必需氨基酸(NEAA))，微量元素A，B，C(例如，来自培养基技术(Mediatech))，抗坏血酸(约50μg/ml)，转铁蛋白(例如约10μg/ml)，β-巯基乙醇(约0.1mM)，bFGF(例如，约88ng/ml)，LR-IGF(例如，约200ng/ml)，杂合素(heregulin)(例如，约10ng/ml)，BIO(例如，约2μM)，化合物C(例如，约1μM)和SB431542(例如)。
细胞持续生长，用AccutaseTM(Innovative Cell Technologies)每5-7天以1∶5分开传代。这些细胞可被冷冻，以高复苏程度解冻，并分化成多种谱系。细胞也可用其它分散试剂(酶和非酶)作为单细胞悬浮液或结块传代。
本文已对实施例(i)进行了广泛描述，由此产生的多潜能谱系称为多潜能***(MMCs)。
实施例(ii)所述的祖细胞原则上可以由几种hESC系产生，包括BG02，WA09，WA07，并可维持自我更新群落超过10个传代。
实施例(iii)所述的祖细胞原则上可以由几种hESC系产生，包括BG02，WA09，WA07，并可维持自我更新群超过10个传代。
MMCs向c-kit+CXCR4+祖细胞群(C56Cs)的分化
为了进一步分化MMCs，根据以上所述获得的MMC细胞以2.5×106/60mm平皿密度涂布在基质胶(Matrigel)平皿上。分化包括去除GSK3抑制剂(即BIO)和SB431542，其用于维持MMCs。分化培养基含有DMEM/F12(50/50)，约2％前白蛋白(probumin)(白蛋白)，抗生素(1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)1×非必需氨基酸(NEAA))，微量元素A，B，C(例如，1×，来自培养基技术(Mediatech))，抗坏血酸(例如，约50μg/ml)，转铁蛋白(例如，约10μg/ml)，β-巯基乙醇(约0.1mM)，bFGF(例如，约8ng/ml)，LR-IGF(例如，约200ng/ml)，激活素A(例如，约10ng/ml)，杂合素(heregulin)(例如，约10ng/ml)，BMP4(例如，约100ng/ml)，Wnt3a(例如，25ng/ml)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor)丁酸钠(例如，约0.5mM)。重要的是，从分化步骤里去除GSK3(即BIO)抑制剂和SB431542，并添加BMP4(或其他BMP，如有相似活性的BMP2)和Wnt3a(或其他有类似活性的Wnt)(和丁酸钠一同)，维持约1天至8天或更长，2至7天，2至6天的时间。在第2，4和6天通过定量RT-PCR(图9)和流式细胞术(图10A-C)测试细胞。
如转录水平的实时定量PCR分析和流式细胞术分析(图9，10)所判断的，经过4-6天的分化时间阶段，发现CXCR4，c-Kit，CD56(N-CAM)增加。流式细胞术分析显示未检测到CD31，KDR(Flk1)和SSEA3，但在分化4-6天期间PDGFRα略有增加(图10)。在这些实验中Isl1转录水平也增加了(图9)。通过BMP4、Wnt3a和丁酸钠处理2-6天，由MMCs产生c-kit+CXCR4+细胞的亮视野图片如图10D所示。
可选地，通过首先将多能干细胞尤其是hESCs接触于产生MMC’s的条件，一旦获得MMCs，将其接触于分化条件，C56Cs可由多能干细胞获得。
CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)
产生C56Cs的方法
产生C56Cs的途径如图14中所示。由hESCs产生MMCs已如前所述。提供MMCs的方法适用于任何人多能干细胞如诱导多能干细胞(iPS细胞)或类似的人多能干细胞。描述hESCs产生MMCs的一般方法适用于多能干细胞，本文另有所述。为了产生C56Cs，在基础培养基中用BMP4(100ng/ml)，Wnt3a(25ng/ml)，丁酸钠(0.5mM)处理MMCs约1至8天(优选是3-6天)，该基础培养基含有DMEM/F12(50/50)，约前白蛋白(probumin)(白蛋白)，抗生素(1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)1×非必需氨基酸(NEAA))，微量元素A，B，C(例如，1×，来自培养基技术(Mediatech))，抗坏血酸(～50μg/ml)，转铁蛋白(～10μg/ml)，β-巯基乙醇(约0.1mM)，bFGF(例如，约8ng/ml)，LR-IGF(例如，约200ng/ml)，激活素A(例如，约10ng/ml)，杂合素(Heregulin)(例如，约10ng/ml)。之后C56Cs进行传代。由此产生的C56Cs是高纯度的可用于治疗而无需进一步纯化。
可以想象，MMCs也可以用于本文所述的治疗应用，但由于在C56Cs中CXCR4水平普遍较高，实验在此种细胞类型中进行。
CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)生物标记物
以下展示了对与C56Cs相关的细胞表面标记物的更详细研究。这些细胞的细胞表面上表现出较高水平的CXCR4和CD56。因此，这些细胞已被命名为C56Cs，即CXCR4+CD56+细胞。这细胞群也可存在c-kit，CD56，CD166，CD105，CD44，CD133和CD90生物标记物。代表性的流式细胞术图谱如图17，18所示，这些结果总结在图19中。简单来说，虽然MMCs也是CXCR4+，通过流式细胞术的判断，CXCR4的表达量在C56Cs中增加。MMCs和C56C对CD56，CD133均呈阳性。和CD105一样，当MMCs转换成C56C时，c-kit水平增加——但是，在全部时间内，整个群对这2个标记物不是完全阳性。随着MMCs向C56Cs转变，CD105、CD166和CD104也具有增加的趋势。尽管有些转录被检测出来(数据未显示)，在MMCs或C56C细胞中未显示Flk1/KDR阳性。MMCs和C56Cs也呈现出低水平的PDGFRα且对CD31阴性。基于他们的特性，C56Cs和间质干细胞相似但不相同，并认为是代表前间质干细胞样的状态。
CXCR4+CD56+的细胞(C56Cs)向缺血组织和骨的归巢
由于C56Cs表达CXCR4，我们提出它们可以通过SDF-1/CXCR4信号轴(如Dalton，2008；再生医学(Regen Med.)，3：181-188中综述)，向炎症和组织受损位点归巢。这类似于前面所述的骨髓来源的间质干细胞移动到外周血中(Kucia等2005，干细胞(Stem cell)23：879-894)。MMCs与C56Cs如何作为全身细胞治疗剂给药的方法的示意图如在图20所述。细胞也可以与其它化合物或细胞类型(即Isl 1+多能心血管祖细胞，例如)一同全身给药，或直接给药至组织受损位点。图21和图23-26表示图像，其中[111In]肟放射性标记的细胞(Caveliers等，2007核医学和分子影像季刊(Q J Nucl Med Mol)51：61-66)通过之前接受冠状动脉结扎的史-道二氏(Sprague Dawley)大鼠尾部静脉进行全身给药。股静脉注射也可达到效果。在3天内，通过伽玛摄像机捕获整个动物“活体”图像。在这段时间细胞表现为向器官如肝和肺，骨和重要的是缺血性心脏的定位(图21，23-16)。在要求的2小时内，注射的细胞在肺中即刻保留然后部分迁移至肝。起初，肺的背景积累使心脏区域的标记不明显，在10-24小时之后其变清晰，这揭示了心脏中细胞的显著积累。之后，将来自已被灌注标记细胞的大鼠的心脏组织进行固定并轴向切片，放射自显影证实了C56Cs“归巢”已经发生(图22)。
啮齿动物模型中利用C56Cs对心肌缺血的功能恢复为确定啮齿动物心肌缺血模型中，C56Cs是否能促进功能恢复，通过外科方法诱导心肌缺血后，将C56Cs注射入裸大鼠尾静脉。在雄性无胸腺史-道二氏(Sprague Dawley)大鼠(rh，rnu-rnu，240-300g，哈隆(Harlon))中，胸廓切开(thoracotomy)并用缝合线将左冠状动脉前降支闭合(occlusion)30-60分钟，再灌注24小时(Laflamme等，2007，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)25：1015-1024)，产生急性心肌梗塞。
从梗塞后24小时开始，在3-4天内，每天将细胞(通常1-3×106在0.1ml)注射入尾静脉。细胞输注前24小时和其后的最初7天里，动物接受作为免疫抑制剂的环孢菌素A(0.75mg/天)。然后用经胸超声波心动描记检查(trans-thoracic echocardiography)(图16，17；Zhu等，2008，核医学快讯(Nucl.Med.Commun.)29：764-769)和使用布鲁克生物观测(Bruker Biospec)94/309.4T扫描仪的高分辨率磁共振成像(MRI)，在注射后不同的时间对动物成像(Laflamme等，2007，自然生技术(Nat.Biotechnol.)25：1015-1024；图18，19)。由公开方法计算左心室喷射分数(left ventricular eection fraction)(LVEF)(Laflamme等，2007，自然生技术(Nat.Biotechnol.)25：1015-1024)。
C56C给药结果的概述：
如LaFlamme等(2007，自然生技术(Nat.Biotechnol.)25：1015-1024)所述，计算急性心肌梗塞的大鼠的注射分数(injection fraction)(EFs)。对单独接受盐水细胞梗塞后(n＝3)的平均注射分数在注射后2和4周分别为56.33+/-7.4和59.7+/-16.4。对接受C56Cs的梗塞大鼠(n＝4)的EFs在注射后2和4周分别为80.8+/-5.9和82.8+/-4.4。
超声心动图(图27，28)和MRI分析(图29，30)显示在所有接受C56Cs输注的动物(n＝4)中有明显和可重复的功能恢复。MRI分析证明，在灌注C56Css2周后发生了缺血心肌组织的肌肉再生(图29，30)。通过超声心动图和MRI成像容易地观察到梗塞区的心壁增厚和跳动心肌肌肉的恢复。
在所有使用的措施中，给药C56Cs对急性心肌梗塞的心脏再生有主要治疗效果。
啮齿动物模型中C56Cs向中风损害的归巢
除了缺血心脏模型，MMCs和C56Cs的另一应用是对脑卒中的恢复/修复。为了研究GFP+C56Cs向脑卒中归巢的能力，使用了啮齿动物模型。C57B1小鼠接受了开颅手术和光血栓形成的中风。每个动物在光血栓形成的脑卒中～24小时之后通过尾静脉注射接受～3-4×106细胞。细胞重新悬浮在德克萨斯红溶液中并注射。在注射后立即而不是48小时后，在循环中观察GFP+细胞。利用2-光子显微镜鉴定在缺血边缘区(penumbra)和脉络丛(图31，32)中的GFP+细胞。
进一步的实施例
由hiPSCs产生IMPs
由hiPSCs产生IMPs细胞类似于由hESCs产生IMPs细胞的方法，如上所列和如本文所述的。
(a)生长hESCs和hiPSCs的方法
表达标记物如Oct4和Nanog的hESCs和hiPSCs优选生长在使用基质胶(Matrigel)作为生长基质的小鼠胚胎饲养条件培养基(MEF-CM)或已知成分培养基(DM)中。细胞通常以1-1.5×106每60mm平皿铺板。细胞每4-5天以1∶4-1∶10分开传代。
(i)小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基(MEF-CM)
hESCs和hiPSCs(如hFib2-iPS4)可以在，存在Fgf2的，小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基(MEF-CM)中的，支持多能细胞维持的，基质胶(Matrigel)(BD生物科学(BD Biosciences)；优选1∶20-1∶200稀释度)或其它基质上(McLean等，2007；干细胞(Stem Cells)25，29-38；Park等，2008；自然(Nature)451，141-146)，生长。细胞可通过利用酶(胰蛋白酶，阿科尤斯酶(Accutase)、胶原酶)、人工传代(机械)和非酶方法的多种方法传代。细胞以每60mm平皿1.5×106的密度涂布，且每4-5天以1∶4-1∶10分开传代。
(ii)已知成分培养基条件
(a)常规培养hESCs和hiPSCs的已知成分培养基作为StemPro
Figure BPA00001332374800671
购自英骏(Invitrogen)(Wang等，血液(Blood)110：4111-4119)。除了将阿科尤斯酶(Accutase)(化学人(Chemicon))用于细胞传代作单细胞悬浮液，根据制造商的建议使用培养基。下面的配方能够将hESCs和hiPSCs保持在多能状态。以下已知成分的，示例的无血清培养基条件效果良好，但不限于此特定配方，并包括无饲养培养：DMEM：F12(Gibco)，2％BSA(血清级，#82-047-3)，1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)(Gibco)，1×非必需氨基酸(Gibco)，1×微量元素A，B和C(Cellgro；#99-182-C1，#99-176-C1，#99-175-C1)，50μg/ml抗坏血酸((Sigma，#A4034)，10μg/ml转铁蛋白(Gibco，#11107-018)，0.1nM β-巯基乙醇，8ng/ml Fgf2(Sigma，#F0291)，200ng/ml LR-IGF(JRH生物科学(JRHBiosciences)，#85580)，10ng/ml激活素A(研发***(R&D Systems)，#338-AC)，10ng/ml杂合素(heregulin)β((派普若技术(Peprotech)；#100-03)。
(b)根据制造商的建议，hESCs和hiPSCs也可以在其他商业可供的已知成分培养基配方中培养，如mTeSR1(BD/干细胞技术(Stem Cell Technologies)；Ludwig等，自然生物技术(Nat Biotechnol.).24：185)。阿科尤斯酶(Accutase)传代也可与此培养基组合使用。
(a)通过将Wnt3a和BMP4添加至hiPSC培养物中，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生
如以上所述的，生长在上述StemPro已知成分培养基的hFib2-iPS4hiPSCs使用阿科尤斯酶(Accutase)传代且铺板在基质胶(Matrigel)包被平皿上(1.0×106细胞，每60mm平皿)，不同的是，培养基补充了BMP4(100ng/ml，研发***(R&D Systems))加人Wnt3a(25ng/ml，研发***(R&D Systems))。每天更换培养基。4天(96小时)后进行免疫染色。如免疫染色的判断，在hiPSCs中，两种多能干细胞的标记物，Oct4和Nanog，呈阳性(图37)。用BMP4和Wnt3a处理4天后，免疫染色显示这些标记物大幅下调(图37)。此外，E-钙粘蛋白表达消失且斯奈尔(Snail)表达开始上升(图37)。这表明BMP-Wnt处理之后，hiPSCs已经失去其上皮结构且经过上皮向间质的转变。当Nanog和Oct4消失时，Isl 1经过4天的分化，其转录水平几乎增加约400倍，汉德(Hand)2，GATA4，mRNAs在此期间也分别增加～7500和175倍。
总的来说，如前面所述，此表达谱是来源自hESCs的IMPs细胞的特征(见上文，也见PCT/US2008/001222，公开号WO2008/094597)。总之，hiPSCs通过有效量BMP4和Wnt3a的组合处理，产生可与Isl 1+多潜能祖细胞(IMPs)相区分的细胞类型。
(b)通过添加Wnt3a维持1-3天之后，添加BNP4维持1-3天，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。(预知的实施例)
可通过最初Wnt3a维持1-3天之后添加BMP4再维持1-5天优选2-4天来处理生长在MEF-CM或已知成分培养基中的hiPSCs，产生Isl 1+中胚层细胞。
(c)通过将BMP4和GSK3抑制剂例如BIO添加至MEF-CM中的hiPSCs，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。(预知的示例)
和(b)中相同，不同的是，GSK3抑制剂可用于置换Wnt3a或与其相组合。
(d)通过添加BMP4和GSK3抑制剂例如BIO到在已知成分培养基中培养的hiPSCs，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。
通过添加BMP4和BIO到在已知成分培养基中培养的hiPSCs，用BMP4和BIO处理6天，hiPSCs可分化成Isl 1+祖细胞。
(d)通过添加GSK3抑制剂例如BIO1-3天之后添加BMP4产生Isl 1+多潜能祖细胞。
生长在MEF-CM或已知成分培养基中的hiPSCs通过添加GSK3抑制剂例如BIO进行1-3天之后添加BMP4再进行2-4天，hiPSCs可产生Isl 1+中胚层细胞。
(e)通过将Wnt3a和BMP4及TGFβ信号抑制剂(如SB431542)添加到hiPSC培养物来产生Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)。
生长于MEF-CM或已知成分培养基中的hiPSCs，通过添加Wnt3a，BMP4和TGFβ抑制剂(如SB431542)进行1-4天之后去除TGFβ抑制剂且用Wnt3a，BMP4再进行2-4天可产生Isl 1+中胚层细胞。
(f)通过添加Wnt3a及TGFβ信号抑制剂(如SB431542)维持1-4天之后，添加BMP4，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。
生长在MEF-CM或已知成分培养基的hiPSCs，通过添加Wnt3a和TGFβ抑制剂(如SB431542)维持1-4天之后，添加BMP4再维持2-4天，可产生Isl1+中胚层细胞。
(g)通过添加Wnt3a维持1-3天之后，添加BMP4和SB431542，Isl 1+多潜能祖细胞(IMP)的产生。
生长在MEF-CM或已知成分培养基的hiPSCs，通过添加Wnt3a和SB431542维持1-3天之后添加BMP4再维持2-4天，可产生Isl 1+中胚层细胞。
来自(ISL 1+)IMPs的EPCs的产生
下面描述了由hESCs或hiPSCs产生的IMP细胞分化成多潜能原心外膜/心外膜祖细胞(EPCs)的方法。此细胞类型由于其产生构成冠状动脉脉管***的谱系而具有重要作用。图34，35，43。
(a)通过添加有效量的Wnt3a、BMP4和全反式视黄酸，来自Isl 1+多潜能祖细胞(IMPs)的原心外膜/心外膜(EPCs)的产生
生长在StemPro已知成分培养基/已知成分培养基的hESC/hFib2-iPS4hiPSCs可分化成IMPs(如以上和其它处所述)。第4天时，IMP细胞阶段，已知成分培养基补充BMP4(50ng/ml，范围约2-100ng/ml，研发***(R&DSystems))，Wnt3a(25ng/ml，范围约1-100+ng/ml，研发***(R&D Systems))和全反式视黄酸(4μM，范围约0.25-25μM Sigma)，每两天(1-4天)更换一次培养基，维持约10-16天(约7-25天)(图39)。通过Q-PCR证实Wt-1，Tbx18，Raldh2和Tcf21(心外膜素)的表达(图40，42)，并通过免疫荧光证实Wt-1的表达(图41)。这种方法通常产生＞80％ WT1呈阳性的培养物。
通过添加有效量Wnt模拟体，如GSK3α/β抑制剂(即BIO)、BMP4/其它BMP和全反式视黄酸，来自IMPs的原心外膜/心外膜的生成。
通过将BIO(GSK3α/β抑制剂)、BMP4和全反式视黄酸添加到已知成分培养基维持至～16天或更久，可由IMPs产生原心外膜/心外膜。
来自EpCs的内皮细胞、平滑肌和心肌成纤维细胞的产生
a)来自EpCs内皮细胞的产生
IMPs在存在Wnt3a(25ng/ml)、BMP4(50ng/ml)和全反式视黄酸(Sigma；4μM)的已知成分培养基中生长16天。细胞传代并按125 000细胞/cm2接种，且生长于已知成分培养基+/-激活素A(研发***(R&D Systems))中，该培养基存在以下任一组物质：
v)VEGF165(研发***(R&D Systems))#293-VE；10ng/ml)
vi)VEGF165(10ng/ml)+SB431542(托克瑞斯生物科学(TocrisBiosciences)；20μM)
细胞在这些培养基中再生长～10-14天。如通过对CD31和VE-钙粘蛋白的免疫染色来判断，由此产生的培养物的20-30％是内皮细胞源。(图44a)。
(b)由心外膜产生平滑肌和心肌成纤维细胞。
IMPs在存在Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(100ng/ml)的已知成分培养基中生长16天。细胞传代并按125 000细胞/cm2接种，且生长于10％ FBS，DMEM，1×青霉素/链霉素(Pen/Strep)(Gibco)，1×丁酸钠(培养基技术(Mediatech))和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(培养基技术(Mediatech))。如对平滑肌肌动蛋白免疫染色确定的，由此产生的培养物＞90％是平滑肌(图45)。心肌成纤维细胞用抗原胶原抗体染色来检测(图44b，45)。这些细胞组成了培养物的5-10％。
平滑肌也利用补充了以下物质的已知成分培养基来制备：
i)VEGF165(10ng/ml)
ii)VEGF165(10ng/ml)+PDGFB(研发***(R&D Systems)；5ng/ml)
Ui)VEGF165(10ng/ml)+hDKK1(研发***(R&D Systems)；150ng/ml)
iv)10％胎牛血清FBS
用于来源自人体IPSCS和HESCS的IMPS的物质组合物
由hiPSCs产生的IMP细胞的微阵分析表明；
来源自hiPSCs的IMP细胞总是表达Isl 1
来源自hiPSCs的IMP细胞表达Pdgfrα，FoxF 1，Nkx2.5，Gata4
来源自hiPSCs的IMP细胞还任选地表达Tbx3和汉德(Hand)1
总结一些上调最多的基因的表格如图46，表1所示。
用于来源自人多能细胞的EPCS的物质组合物
由三个hESC系和人体iPSC系产生的EPCs的微阵分析表明EPC细胞表达；
肾母瘤抑制蛋白1(Wt1)，Tcf21(心外膜素)，Raldh2(Aldhla2)
这些转录物是EPCs，由培养的多能干细胞产生的原心外膜/心外膜细胞类型的主要鉴定物。
EPCs也能表达；
Tbx18，COL3A1，GATA6，Tbx3，Tbx5中的一个或多个(两个，三个，四个或五个)
总结一些上调最多的基因的表格如图47所示，表2。
EPCs的用途：
1.EPCs可用于由心外膜生产的分泌因子的鉴定，所述分泌因子影响心肌细胞增殖、存活、功能和分化。
2.EPCs可作为一种细胞源，所述细胞源可用于心血管应用的药物筛选。
3.EPCs可作为一种细胞源，所述细胞源可用于修复缺血心脏，再生冠状动脉血管的治疗目的。
4.EPCs可用于组织工程目的，所述组织工程获得心脏或冠状血管组分。
5.EPCs可作为研究心血管发育和疾病的研究工具。
由EPCs产生血管状管的方法
我们附上了产生含有内皮细胞和平滑肌细胞的血管的一种策略，如图48所示。这涉由hESCs产生IMP细胞(Isl 1+)。然后IMP细胞被转化为EPCs(Wt1+)，然后转化为含有平滑肌和内皮细胞的血管结构。
如前所述，在～20天内，WA09细胞分化为Wt1+心外膜祖细胞(EPCs)。然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA收集细胞形成单细胞悬浮液。然后将这些细胞以～1.25×105细胞/cm2的密度铺板在含有8ng/mL FGF2(英骏(Invitrogen))、200ng/mL LR-IGF(Sigma)、10ng/mL杂合素(hetergulin)β(派普若技术(Peprotech))和10ng/ml VEGF(研发***(R&D Systems))的已知成分条件培养基中。在37℃，5％ CO2中，细胞再生长10-14天，每2天更换培养基。从培养基中去除VEGF，且培养物允许在37℃，5％ CO2中再维持5-7天，不更换培养基，以形成管(图49)。然后用4％多聚甲醛固定该管，并用CD31和CDH5(研发***(R&D Systems))染色。根据可见管腔(lumen)和由Z堆叠构成的三维结构存在的证据，由此产生的免疫荧光图像显示管的形成(图50)。图像在蔡司(Zeiss)共聚焦显微镜上获得。
EPCs在体外和体内的迁移特性的表征
原心外膜/心外膜具有遍布心肌表面形成外部层的能力以及通过入侵的方式迁移进入心肌的能力(Olivey等，2004，心血管医学动态(Trends Cardiovasc Med.)14，247-251；)。评估原心外膜/心外膜迁移特性的标准试验是将细胞铺板在胶原I基质上。
(i)EPCs的体外迁移：从心肌组织外植体中分离的原心外膜/心外膜具有变成间质并迁移远离附着位点的能力(Gaudix等，2006发育动态(Dev Dyn.)235，1014-1026；Olivey等，2006发育动态(Dev Dyn.).235，50-59；Dettman等，1998发育生物学(Dev Biol.)193，169-181)。这是真正的原心外膜/心外膜的典型特征，并包括上皮向间质的转换。
评估原心外膜/心外膜迁移特性的标准试验是将细胞铺板在胶原基质上。为了评估EPCs在胶原凝胶上的迁移能力，实施以下步骤。用视黄酸，BMP4和Wnt3a处理IMP细胞6天以产生Wt1+EPCs。将单细胞悬浮液(1×106个细胞)在包被PHEMA(聚羟基乙基丙烯酸甲酯(polyhydroxyethylmethacrylate))的60mm的组织培养皿上铺板，放置24小时以产生球体。然后铺板在已知成分培养基中的吉尔垂科斯(Geltrex)或胶原I(10μg/ml)包被的平皿(HAIF)上，并在多个时间点成像(见图51)。为进行免疫荧光分析，细胞用4％多聚甲醛固定和0.25％Triton X100透化(permeabilized)。然后固定hESCs(图52-54)或EPC球体(图53，54)，并用抗体探测细胞角蛋白或波形蛋白，以细胞的上皮建立状态和间质状态的对比。此分析表明EPC球体在铺板于胶原基基质上，如Geltrex或胶原1上之后，经历了从上皮到间质的转化。这和从组织外植体分离的原心外膜/心外膜的行为是非常相似的(Gaudix等，2006发育动态(Dev Dyn.)235，1014-1026；Olivey等，2006发育动态(Dev Dyn.).235，50-59；Dettman等，1998发育生物学(Dev Biol.)193，169-181)。
(ii)EPCs在体内的迁移
移植到发育中的鸡心肌管上的原心外膜/心外膜组织外植体显示出非常独特的性质。移植的原心外膜/心外膜经历了从上皮到间质的转换形成并侵入心肌(Guadix，等，发育动态(Developmental Dynamics)，235，1014-1026(2006)。进行了移植实验，以确定EPC球体也能以组织外植体来源的原心外膜/心外膜的记忆(reminiscent)方式侵入发育的鸡心脏。
为了评估HES来源的原心外膜细胞的发育潜能，将PE聚集体立即移植到HH阶段14-16的鸡胚胎中的临近心脏的内源原心外膜附近。将胚胎孵育3至6天，并通过用GFP抗体免疫检测使hESC/EPC来源的移植细胞可视化(图55-57)。此分析表明移植的EPC球体在鸡的组织植入并侵入鸡的心肌。EPC细胞因此表现出在体内的，与真正原心外膜/心外膜一致的行为。
3.当与啮齿动物心脏组织共同培养时，(Isl 1+)IMPs可以整合并分化成肌球蛋白重链+(MHC+)心肌细胞的证实
一些报告记录了心外膜细胞分化为心肌细胞的能力(参见Zhou等，2008自然(Nature)454，109-113)。为了确定EPCs分化成心肌细胞的能力，进行了将心脏组织外植体与EPC球体温育的共同培养试验。
将8月龄CD1雄性小鼠的心脏右心室和左心室切分成小块(～2mm见方×1mm厚)并在明胶涂覆的96孔板的DMEM/M199/FBS/PSF中培养24小时。然后添加EPC球体并温育不同时间。组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片并用针对人体β-肌球蛋白重链的抗体探测以检测人体心肌细胞的存在。大的β-MHC+细胞在接受Isl 1+细胞的组织切片中检测到，但在未接受Isl1+IMP细胞的切片中未检测到(图58)。
移植到鸡胚之后IMP细胞可整合到含有中胚层和血管结构的组织中的证实
为了研究GFP+IMP的发育潜能，将单个的细胞移植进入原肠胚期鸡胚的中胚层。这是通过将哈姆勃格(Hamburger)和哈密尔顿(Hamilton)(HH)阶段4-5的胚胎的内胚层揭开，并将50-100个IMP细胞的单细胞悬浮液覆在中胚层上而完成的。然后将内胚层置回，并将胚胎再温育20-28小时。通过GFP免疫检测鉴定IMP细胞。
完整的胚胎和胚胎切片的分析表明，HES细胞广泛并入胚胎结构，获得了内源鸡细胞的形态(图59)。IMP细胞衍化进入几种中胚层发育产物，包括躯体的上皮层和内脏中胚层，血管内皮，围绕新形成的内皮管的血管周中胚层(图59A-F)，并偶尔在体节(somites)中(未表示)。IMP细胞也大量进入中胚层。遍布横向和内侧中胚层和在前肠和肝原基中都观察到IMP细胞(图59A-D，F)。这些数据表明，IMP在移植到体内时有血管潜能。
IMP细胞物质组合物的进一步确定
在IMP细胞表面，之前没有确定的细胞表面标记物。虽然KDR(Flk1)可在IMP细胞表面表达，但因为它在干细胞和祖细胞类型被广泛表达，它不是严格确定的细胞表面标记物。我们现在提供附加的特征。转录微阵列分析表明，在由几种hESC系和hiPSCs衍生的IMP细胞中，血小板衍生生长因子β受体和钙粘蛋白11显著上调(数据未显示)。为了将这些确定为IMP细胞的细胞表面标记物，我们进行了流式细胞术，表明了IMPs在其细胞表面可以表达PDGFRβ和钙粘蛋白11(图60)。与此相反，hESCs(WA09)对这些标记物不呈阳性。
在CS6C细胞中运转的迁移机制的确定
为研究C56Cs向局部缺血/受损的组织迁移的机制，我们在保易登(Boyden)小室试验中测试了这些细胞。将300,000 C56C细胞接种到在保易登(Boyden)小室的上室。在下室这些数据表明证实C56C细胞对SDFI细胞因子有反应并向其迁移(图61)。迁移可用抗拮剂AMD3100阻断，说明迁移通过CXCR4受体传导介导。
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所有标题是为方便读者，不应该被用来限制标题下面原文的意思，除非特指。现在时态或将来时态描述的实施例通常都是预知实施例。

Claims (107)

1.一种维持或自我更新Islet 1+多潜能祖细胞(IMPs)群的方法，该方法包括：提供IMPs群；并任选地在增稠剂存在下，将细胞培养基与有效量的GSK抑制剂和骨形态发生蛋白的组合，与所述群在基底蛋白上接触；在所述接触步骤之后分离所述细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为BIO。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述骨形态发生蛋白为BMP4。
4.根据权利要求书中的1-3任意一项所述的方法，其中，所述基底蛋白选自由层粘连蛋白、肌腱蛋白、血小板反应素、胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸或它们的混合物组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述基底蛋白为层粘连蛋白。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述增稠剂为纤维素增稠剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述增稠剂为甲基纤维素。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述接触的步骤进行大约两周时间。
9.一种扩增Islet 1+多潜能祖细胞(IMPs)群的方法，该方法包括：提供IMPs群；并任选地在增稠剂存在下，将细胞培养基与有效量的GSK抑制剂和骨形态发生蛋白的组合，与所述群在基底蛋白上以低密度接触，所述接触的时间能有效增加所述群；并在所述接触步骤之后分离所述细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为BIO(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-肟(抑制剂IX)。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述骨形态发生蛋白为BMP4。
12.根据权利要求9-11中任意一项所述的方法，其中，所述基底蛋白选由层粘连蛋白、肌腱蛋白、血小板反应素、胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸或它们的混合物组成的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述基底蛋白为层粘连蛋白。
14.根据权利要求9-13中任意一项所述的方法，其中，所述增稠剂为纤维素增稠剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述增稠剂为甲基纤维素。
16.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述接触的步骤进行约两周时间，其中，所述接触的步骤分两部分进行：在第一部分期间，细胞生长三天且不更换培养基；而在第二部分期间，每天更换培养基。
17.一种由IMPs产生心肌细胞和/或者内皮细胞的方法，该方法包括：提供IMP细胞群；在存在有效量的至少一种选自由BMP、DKK1、VEGF以及它们的混合物组成的组中的分化剂的情况下，将所述IMP细胞群置于分化培养基中生长，所述分化培养基不含有激活素A并任选地含有胰岛素生长因子(IIGF)；并任选地分离所述细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，在所述生长的步骤之前，将所述IMPs群以25-250×103细胞/cm2的浓度接种在所述细胞培养基中。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述IMPs为自我更新的。
20.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述IMPs来源自人诱导多能细胞(hiPSCs)。
21.一种由IMPs产生平滑肌细胞的方法，该方法包括：提供IMP细胞群；在存在有效量的无翅蛋白和骨形态发生蛋白的情况下，将所述IMP细胞群置于细胞培养基中生长，所述培养基不含有激活素A并任选地含有胰岛素生长因子(IIGF)；并任选地分离所述细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述无翅蛋白为Wnt3a。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述骨形态发生蛋白为BMP4。
24.根据权利要求21-23中任意一项所述的方法，其中，所述IMPs是由人胚胎干细胞制备的。
25.根据权利要求21-23中任意一项所述的方法，其中，所述IMPs是由人诱导多能干细胞(hiPSCs)制备的。
26.一种ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)群，其具有以下特征：
i)这些细胞表达Isl 1，Nkx2.5，Fgf10，Gata4，FoxF1，PDGFRα；
ii)这些细胞任选地表达Tbx3和/或汉德(Hand)1；
iii)这些细胞是核型正常的；
iv)这些细胞不表达Oct4，Nanog，T或脱中胚蛋白；
v)这些细胞可以在细胞表面表达PDGFRβ和/或钙粘蛋白11；和
vi)这些细胞能够分化成心肌细胞、平滑肌细胞和/或内皮细胞。
27.根据权利要求26所述的细胞群，所述细胞群由人胚胎干细胞(hESCs)产生。
28.根据权利要求26所述的细胞群，所述细胞群由人诱导多能干细胞(hiPSCs)产生。
29.根据权利要求26-28中任意一项所述的细胞群，所述细胞群是通过将分化培养基中的人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞与有效剂量的GSK抑制剂和骨形态发生蛋白，以及，任选地，激活素A抑制剂接触。
30.根据权利要求29所述的细胞群，其中，所述GSK抑制剂为BIO(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-肟(抑制剂IX)。
31.根据权利要求29或30所述的细胞群，其中，所述骨形态发生蛋白为BMP4。
32.根据权利要求29-31中任意一项所述的细胞群，其中，所述激活素A抑制剂为SB431542。
33.一种多潜能CXCR4+CD56+细胞群(C56Cs)，其具有以下特征：
i)这些细胞表达CXCR4生物标记物和CD56生物标记物；
ii)这些细胞表达以下生物标记物中的至少3种：c-kit、CD166、CD105、CD44、CD133和CD90；
iii)这些细胞低水平表达PDGRFα；和
iv)这些细胞不表达CD31。
34.根据权利要求33所述的细胞群，其中，所述细胞表达CXCR4的水平比多潜能***(MMCs)高。
35.根据权利要求33或34所述的细胞群，所述细胞群展示出通过SDF-1/CSCR4的信号轴向炎症和组织损伤位点归巢的特征。
36.根据权利要求33或34所述的细胞群，所述细胞群也表达c-kit和以下生物标记物中的至少3种：CD166、CD105、CD44、CD133和CD90。
37.根据权利要求33-35中任意一项所述的细胞群，所述细胞群也表达c-kit和以下生物标记物中的至少4种：CD166、CD105、CD44、CD133和CD90。
38.根据权利要求33-36中任意一项所述的细胞群，所述细胞群表达以下每种生物标记物：c-kit、CD166、CD105、CD44、CD133和CD90。
39.根据权利要求38所述的细胞群，所述细胞群在形态上比hPSCs小。
40.由多潜能***群(MMCs)制备多潜能CXCR4+CD56+细胞群(C56Cs)的方法，该方法包括：将在缺乏激动素A抑制剂和GSK3抑制剂的分化培养基中的所述MMCs接触有效量的无翅蛋白、骨形态发生蛋白和丁酸盐。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述无翅蛋白为Wnt3a。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中，所述骨形态发生蛋白为BMP4。
43.根据权利要求40-42中任意一项所述的方法，其中，所述丁酸盐为丁酸钠。
44.根据权利要求40-43中任意一项所述的方法，其中，所述MMCs群由在分化培养基中的hPSCs产生，所述分化培养基含有有效量的GSK3抑制剂和有效量的激活素A抑制剂，以及，任选地，BMP抑制剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述hPSCs为hESCs或hiPSCs。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中，所述GSK3抑制剂为BIO(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-肟(抑制剂IX)。
47.根据权利要求44-46中任意一项所述的方法，其中，所述激活素A抑制剂为SB431542。
48.根据权利要求44-47中任意一项所述的方法，其中，所述BMP抑制剂为头蛋白或者化合物C。
49.根据权利要求40-47中任意一项所述的方法，其中，所述MMCs或者hPSCs生长在基底蛋白上。
50.根据权利要求49的方法，其中，所述基底蛋白选自由层粘连蛋白、肌腱蛋白、血小板反应素或它们的混合物组成的组。
51.一种将多潜能CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)靶向患者受损和/或炎症组织的方法，该方法包括对所述患者给药有效量的所述细胞。
52.一种治疗患者受损和/或炎症组织的方法，该方法包括对所述患者给药有效量的CXCR4+CD56+细胞群，并使所述细胞治疗所述受损和/或炎症组织。
53.一种治疗有需要患者的疾病状态或病症的方法，所述疾病状态或病状选自由心血管疾病、视网膜肌病、神经病变、I型糖尿病、II型糖尿病、中风、头部外伤、自身免疫性疾病、免疫抑制、移植物抗宿主病、骨修复、创面修复、炎症疾病、神经退行性疾病组成的组，该方法包括对所述患者给药有效量的CXCR4+CD56+细胞群或多潜能***(MMCs)，并使所述细胞治疗所述疾病状态或病症。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述心血管病为心肌病或局部缺血。
55.根据权利要求53所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病为狼疮、关节炎，所述关节炎包括类风湿关节炎或多发性硬化症。
56.根据权利要求53所述的方法，其中，所述神经退行性疾病为帕金森症或亨廷顿症。
57.根据权利要求53所述的方法，其中，所述炎症性疾病为关节炎、克隆氏病或囊肿性纤维化。
58.一种心外膜多能细胞群(EPCs)，其具有以下特征：
i)这些细胞表达肾母瘤抑制蛋白(Wt1)，Tcf21(心包膜素)和Raldh2(Aldhla2)；
ii)这些细胞也表达Tbx18，COL3A1，GATA6，Tbx3和Tbx5的一种或多种。
59.根据权利要求58所述的细胞群，其中，所述细胞也表达Tbx18、COL3A1、GATA6、Tbx3和Tbx5中的至少两种。
60.根据权利要求58所述的细胞群，其中，所述细胞也表达Tbx18、COL3A1、GATA6、Tbx3和Tbx5中的至少三种。
61.根据权利要求58所述的细胞群，其中，所述细胞也表达Tbx18、COL3A1、GATA6、Tbx3和Tbx5中的至少四种。
62.根据权利要求58所述的细胞群，其中，所述细胞也表达Tbx18、COL3A1、GATA6、Tbx3和Tbx5中的全部五种。
63.根据权利要求58-63中任意一项所述的细胞群，该细胞群由人多能干细胞(hPSCs)或ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)产生。
64.根据权利要求63所述的细胞群，其中，所述hPSCs为人胚胎干细胞(hESCs)或人诱导多能干细胞(hiPSCs)。
65.一种由ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)产生心外膜多能细胞(EPCs)的方法，该方法包括提供IMPs群；将在分化培养基中的所述IMPs群与有效量的GSK抑制剂、骨形态发生蛋白和视黄酸接触，以产生EPCs群；并任选地分离所述EPCs。
66.根据权利要求65所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为BIO(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-肟(抑制剂IX)。
67.根据权利要求65所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为无翅蛋白。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述无翅蛋白为Wnt3a。
69.根据权利要求65-68中任意一项所述的方法，其中，所述骨形态发生蛋白为BMP4。
70.根据权利要求65-69中任意一项所述的方法，其中，所述视黄酸为全反式视黄酸。
71.根据权利要求65-70中任意一项所述的方法，其中，所述IMPs由人胚胎干细胞(hESCs)产生。
72.根据权利要求65-70中任意一项所述的方法，其中，所述IMPs由人体诱导多能干细胞(hiPSCs)产生。
73.一种由人多能干细胞(hPSCs)产生心外膜多能细胞(EPCs)群的方法，该方法包括：提供hPSCs群；将在分化培养基的支持蛋白上的所述hPSCs与有效剂量的GSK抑制剂和骨形态发生蛋白，以及，任选地，激活素A抑制剂接触，以产生ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)，并在此之后，将分化培养基中的所述IMPs群与有效量的GSK抑制剂、骨形态发生蛋白和视黄酸接触，以产生EPCs群；并任选地，分离所述EPCs。
74.根据权利要求73所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为BIO(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-肟(抑制剂IX)。
75.根据权利要求73所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为无翅蛋白。
76.根据权利要求75所述的方法，其中，所述无翅蛋白为Wnt3a。
77.根据权利要求73-76中任意一项所述的方法，其中，所述骨形态发生蛋白为BMP4。
78.根据权利要求73-77中任意一项所述的方法，其中，所述激活素A抑制剂为SB431542。
79.根据权利要求73-78中任意一项所述的方法，其中，所述视黄酸为全反式视黄酸。
80.一种由心外膜多能细胞(EPCs)产生内皮细胞群的方法，该方法包括：提供EPCs群；将分化培养基中的EPCs群与有效量的VEGF和，任选地，激活素A抑制剂接触。
81.根据权利要求80所述的方法，其中，所述VEGF为VEGF165。
82.根据权利要求80或81所述的方法，其中，所述激活素A抑制剂为SB431542。
83.根据权利要求80-82中任意一项所述的方法，其中，所述EPCs在所述培养基中生长大约10天至2周的时间，以产生所述内皮细胞。
84.根据权利要求80-83中任意一项所述的方法，其中，所述EPCs通过将分化培养基中的IMPs与有效量的无翅蛋白、有效量的骨形态发生蛋白和有效量的视黄酸接触，由ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)产生。
85.根据权利要求84所述的方法，其中，所述无翅蛋白为Wnt3a，所述骨形态发生蛋白为BMP4，且所述视黄酸为全反式视黄酸。
86.一种由心外膜多能细胞(EPCs)产生平滑肌细胞群和/或心脏成纤维细胞群的方法，该方法包括：提供EPCs群；将分化培养基中的EPCs群与有效量的胎牛血清(FBS)和丙酮酸盐接触；和任选地分离所述平滑肌细胞或所述心脏成纤维细胞。
87.根据权利要求86所述的方法，其中，所述EPCs通过将在分化培养基中的所述IMPs与有效量的无翅蛋白和有效量的骨形态发生蛋白接触，由ISL 1+多潜能祖细胞产生。
88.根据权利要求87所述的方法，其中，所述无翅蛋白质为Wnt3a，所述骨形态发生蛋白为BMP4。
89.一种由心外膜多能细胞(EPCs)产生平滑肌细胞群的方法，该方法包括：提供EPCs群；将分化培养基中的EPCs群与有效量的以下物质接触：
i)VEGF；
ii)VEGF和PDGFβ；
iii)VEGF和HDKK1；
iv)胎牛血清(FBS)；和
任选地，分离所述平滑肌细胞。
90.根据权利要求89所述的方法，其中，所述VEGF为VEGF165。
91.根据权利要求89或90所述的方法，其中，所述胎牛血清构成所述培养基的大约10％。
92.一种治疗或修复有需要的患者的受损心肌和/或血管组织的方法，该方法包括对所述患者给药有效量的ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)或心外膜祖细胞(EPCs)。
93.根据权利要求92所述的方法，其中，所述细胞用于修复所述患者的心脏组织。
94.根据权利要求92所述的方法，其中，所述细胞群用于修复所述患者的血管组织。
95.根据权利要求92-94中任意一项所述的方法，其中，所述细胞群为IMPs群。
96.根据权利要求92-94中任意一项所述的方法，其中，所述细胞群为EPCs群。
97.根据权利要求92-96中任意一项所述的方法，其中，将所述细胞给药至受损组织。
98.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求26-39和58-64中任意一项所述的细胞群，以及药物可接受载体、添加剂或辅料。
99.根据权利要求98所述的组合物，其中，所述载体为盐溶液。
100.根据权利要求98或99所述的组合物，其中，所述组合物还含有生物活性剂。
101.一种修复有修复需要的患者体内内胚层器官的方法，该方法包括对所述患者给药有效量的ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)群或心外膜祖细胞(EPCs)群。
102.根据权利要求101所述的方法，其中，将所述细胞群给药至待修复器官。
103.根据权利要求101或102所述的方法，其中，所述器官为所述患者的肝脏、胰腺或胃肠道。
104.一种生产心肌细胞的方法，该方法包括：将ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)或心外膜多能细胞(EPCs)群在细胞培养基中培养，所述培养基添加了有效量的心脏组织，以产生心肌细胞群，并任选地，分离产生的所述心肌细胞。
105.一种从细胞的群中分离ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)的方法，该方法包括：将所述细胞的群接触抗-PDGFRβ的抗体，使所述抗体与所述群中的IMP细胞结合以形成抗体-IMP复合物，并从所述细胞群中分离所述抗体-IMP复合物。
106.根据权利要求105所述的方法，其中，对所述抗体-IMP复合物进行处理以将所述复合物中的抗体与IMP分离，以提供纯化的IMPs群。
107.一种鉴定在细胞的群中是否存在ISL 1+多潜能祖细胞(IMPs)的方法，该方法包括：将所述细胞的群与连接报告分子的抗-PDGFRβ抗体接触，使所述抗体与所述群中的IMP细胞结合，以形成抗体-IMP-报告复合物，并测量所述复合物，以确定在所述群中IMP细胞的存在和/或数量。
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