CN110628821B - 一种细胞模型及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞模型及其制备方法、应用，提供了利用WS体细胞诱导多能干细胞的制备方法，包括如下步骤：S1、源于WS患者体细胞的获取；S2、将表达人端粒酶逆转录酶和抗性基因的载体转染至获取的体细胞并培养，筛选能够表达人端粒酶逆转录酶的体细胞；S3、向S2中的体细胞中转染携带有诱导iPSCs的重编程基因的载体并培养；本发明通过在WS的体细胞重编程前转入能够表达人端粒酶逆转录酶hTERT的载体，使得WS的体细胞可以重编程为多能干细胞，提高iPSCs诱导效率，解决了现有技术中利用WS患者体细胞不能成功诱导多能干细胞或诱导效率极低的问题。

Description

一种细胞模型及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于生物技术中诱导多能干细胞领域，具体涉及一种细胞模型 及其制备方法、应用。

背景技术

沃纳综合征(Werner Syndrome，WS)也称成人早老症、白内障-硬皮病- 早老综合征，是一种先天性常染色体隐性遗传性疾病，多见于有血缘婚姻 的子代，尤以堂兄妹间结婚者的子代居多，该病基因定位于8p12～p11，主 要临床表现包括老人样面容、身材矮小、青少年白发、青年白内障、四肢 硬皮病样皮肤改变、骨质疏松、组织钙化、糖尿病和性腺发育不全。WS患 者在***后就会提前出现一系列明显的机体衰老特征，包括：①身材矮小、面容皱缩、头发变白脱落、皮肤萎缩硬化和色素沉积；②心力衰竭、 心肌梗塞等心脏疾病；③动脉粥样硬化与高血压；④胰岛素抵抗的高血糖、 高血脂和高尿酸血症；⑤智力衰退与脑萎缩；⑥早发眼部退变；⑦免疫系 统异常，易引发类风湿疾病等自身免疫病；⑧骨质疏松、关节畸形和运动 受限。非常值得注意的是，WS患者易发生各类肿瘤，尤其是中胚层来源的 肿瘤、黑素瘤和星形胶质细胞瘤等，这与老龄化和肿瘤发病率正相关的事 实非常相符。WS患者的平均寿命为50岁，大多死于血管疾病与肿瘤。WS 累及全身的几乎所有组织与器官，而伴随人类自然衰老进程发生的特征都 会在WS个体中加速体现。由于WS能够表现出更多的与人类自然衰老近 似的表型和症状，因而被认为是研究人类生理性衰老的最合适模型。

近年来，诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)技术的出 现为发展针对疾病的模型和家族遗传病的个性化治疗提供了机会，以及非 常适合于WS研究。诱导多能干细胞(iPSCs)是利用4个多能干细胞相关 的转录因子(OCT3/4，SOX2，KLF4，cMYC，称为山中因子)在已分化体 细胞中异位表达产生具备胚胎干细胞特性的细胞，并且在疾病发病机制方 面建模、对新药的筛选以及开发新的治疗方法方面显示了巨大的潜力。对 于遗传病来说尤其如此，由于来自病人细胞的iPSCs具有相同的遗传背景， 提供了前所未有的体外模型可以重现这些疾病。

然而与其他遗传性疾病相比，WS患者的体细胞重编程研究具有更大的 困难和挑战性。已有研究表明，WS患者皮肤成纤维体细胞经体外培养后提 前发生老化并伴随严重的染色体异常，而重编程过程中又会进一步引发活 性氧(ROS)增加、DNA断裂和细胞死亡(Senescence)等细胞事件严重阻碍体 细胞重编程的过程，因此针对WS患者携带致病突变基因的体细胞重编程 研究困难重重，国内外未见成功实施的案例。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于一种细胞模型及其制备方法、应 用。

为此，本发明提供了一种利用WS体细胞诱导多能干细胞的方法，包 括如下步骤：

S1、源于WS患者的体细胞的获取；

S2、将表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)和抗性基因的载体转染至所述的 体细胞中并进行培养，筛选出能够表达人端粒酶逆转录酶的所述的体细胞；

S3、向S2步骤中筛选的所述的体细胞中转染携带有诱导iPSCs的重编 程基因的载体，并进行iPSCs培养。

所述的利用WS体细胞诱导多能干细胞的方法，在S1步骤中，源于 WS患者的体细胞为于WS患者皮肤的成纤维细胞、WS患者的外周血单个 核细胞或WS患者的骨髓间充质细胞。

所述的方法，在S2步骤中，在转染表达人端粒酶逆转录酶的载体的同 时转染可调控外源基因表达的载体。

所述的方法，在S2步骤中，用于所述调控外源基因表达载体的骨架载 体选自pLVX-Tet-on、Tet-pLKO-neo或pTet-IRES-EGFP。

所述的方法，在S2步骤中，所述表达人端粒酶逆转录酶的骨架载体为 慢病毒载体。所述的载体选自pLVX-Tight-Puro、Tet-pLKO-neo或 pTet-IRES-EGFP。

所述的方法，所述重编程基因为OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、 c-MYC、KLF-4和SV40LT中至少4种。

所述的方法，所述重编程基因为OCT4、SOX2、c-MYC和KLF-4。

所述的方法，在S3步骤中，所述载体为仙台病毒。

本发明提供了所述的方法制备得到的诱导多能干细胞在成年早衰、肿 瘤、动脉粥样硬化、糖尿病或骨质疏松症的疾病发病机制、药物筛选以及 治疗方法筛选领域用途。由于早衰症患者人群肿瘤、动脉粥样硬化、糖尿 病、骨质疏松症的发病率明显高于正常人群，鉴于诱导多功能干细胞具有 多向分化潜能，因此，所述的方法制备得到的诱导多能干细胞在肿瘤、动 脉粥样硬化、糖尿病、骨质疏松症也具有应用于以上疾病发病机制、药物 筛选以及治疗方法筛选的潜能。

本发明提供了一种细胞模型，包括所述的方法制备得到的诱导多能干 细胞。

本发明提供了所述的细胞模型在成年早衰、肿瘤、动脉粥样硬化、糖 尿病或骨质疏松症的疾病发病机制研究、药物筛选以及治疗方法筛选领域 用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种利用WS体细胞诱导多能干细胞的方法，包括如 下步骤：S1、源于WS患者的体细胞的获取；S2、将同时表达人端粒酶逆 转录酶和抗性基因的载体转染至所述的体细胞中并进行培养，筛选出能够 表达人端粒酶逆转录酶的所述的体细胞；S3、向S2步骤中培养的所述的 体细胞中转染携带有诱导iPSCs的重编程基因的载体，并进行iPSCs培养； 本发明通过大量的实验研究发现并证实，来源于WS患者的体细胞不能重 编程的原因在于WS患者的体细胞在重编程过程中端粒延长和端粒酶激活 存在异常，并证实了通过在WS的体细胞重编程前向WS的体细胞中转入 能够表达hTERT的载体，以解决WS的体细胞在重编程过程中端粒延长和 端粒酶激活存在异常的问题，使得WS的体细胞可以重编程为多能干细胞。 为此，本发明提出了上述的利用WS体细胞诱导多能干细胞的方法，通过 将同时表达人端粒酶逆转录酶和抗性基因的载体转染至WS患者体细胞中， 筛选出能够表达人端粒酶逆转录酶的体细胞，使得所述成纤维体细胞中具 有基本的端粒酶活性和端粒长度，保证所述体细胞能够正常的重编程，提 高iPSCs诱导效率，解决了现有技术中利用WS患者的体细胞未能成功诱 导多能干细胞的问题。

2.本发明提供的一种利用WS体细胞诱导多能干细胞的方法，在S2步 骤中，在转染表达人端粒酶逆转录酶的载体同时转染可调控外源基因表达 的载体，通过所述可调控外源基因表达的载体可以调控所述WS患者体细 胞如成纤维细胞中外源基因-hTERT的表达，所述调控外源基因表达的载体 由pLVX-Tet-on Advanced、Tet-pLKO-neo或pTet-IRES-EGFP改建而来， pLVX-Tet-on Advanced是一种可调控的慢病毒载体表达***，可以通过四环 素如盐酸多西霉素的增减来调控外源基因的表达，进而可以调控hTERT在 iPSCs细胞中的表达。

3.本发明提供的一种利用WS体细胞诱导多能干细胞的方法，在S3步 骤中，所述载体为仙台病毒，由于仙台病毒导入的外源基因不会整合入宿 主细胞的基因组DNA,也即它介导的外源基因表达不会改变宿主细胞的遗 传背景，仙台病毒自身载体和外源基因序列可以从宿主细胞中被清除，诱 导所得的IPSCs细胞不存在外源基因的***，安全性更高，仙台病毒感染 效率更高，目的基因的表达水平更高，因此可以极大提高iPSCs的诱导效 率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。

图1是本发明实验例1中WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在转染仙 台病毒前和转染后第5天的显微镜图片；

图2是本发明实验例1中WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在转染仙 台病毒第3周后的碱性磷酸酶染色结果；

图3是本发明实验例1中WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在转染仙 台病毒第3周后的碱性磷酸酶染色的阳性克隆率；

图4是本发明实验例2中WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在重编程 期间的端粒酶活性的分析结果；

图5是本发明实验例2中WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在重编程 期间的端粒酶活性的倍数变化；

图6是本发明中质粒pBABE-puro-hTERT的基因图谱；

图7是本发明实验例3中WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒前 和转染后第5天的显微镜图片；

图8是本发明实验例3中WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒 第3周后的碱性磷酸酶染色的阳性克隆率；

图9是本发明实验例3中WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒第 4周后获得的iPSCs的免疫荧光染色结果；

图10是本发明实验例3中WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒 第4周后获得的iPSCs的RT-PCR检测结果；

图11是本发明实验例3中WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒 第4周后获得的iPSCs的核型检测结果；

图12是本发明实验例3中WT-hTERT在转染仙台病毒第4周后获得的 iPSCs的核型检测结果；

图13是本发明实验例3中WS-hTERT在转染仙台病毒第4周后获得的 iPSCs的分化检测结果；

图14是本发明实验例3中WS-hTERT在转染仙台病毒第4周后获得的 iPSCs的分化检测结果；

图15是本发明实验例3中WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒 第4周后获得的iPSCs的WRN表达免疫荧光染色结果；

图16是本发明实验例3中WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒 第4周后获得的iPSCs的WRN表达免疫印迹结果；

图17是本发明实验例3中WS-hTERT和WT-hTERT在重编程期间的 端粒酶活性的分析结果；

图18是本发明实验例3中WS-hTERT和WT-hTERT在重编程期间的 端粒酶活性的倍数变化；

图19是本发明实验例3中WS在转染仙台病毒前和转染仙台病毒后第 6天的细胞中的端粒长度；

图20是本发明实验例3中WT在转染仙台病毒前和转染仙台病毒后第 6天的细胞中的端粒长度；

图21是本发明实验例3中WS-hTERT在转染仙台病毒前和转染仙台病 毒后第6天的细胞中的端粒长度；

图22是本发明实验例3中WT-hTERT在转染仙台病毒前和转染仙台病 毒后第6天的细胞中的端粒长度；

图23是本发明实验例3中WS、WT、WS-hTERT和WT-hTERT在转 染仙台病毒前和转染仙台病毒后第6天的细胞中的端粒长度分布百分比柱 状图；

图24是本发明实验例3中WS、WT、WS-hTERT和WT-hTERT在转 染仙台病毒前和转染仙台病毒后第6天的细胞中的平均端粒长度；

图25是本发明实验例3中WT、WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs不 同代次的相对端粒长度；

图26是本发明实验例4中质粒pLVX-Tet-on和pLVX-Tight-hTERT-Puro 的图谱；

图27是本发明实验例4中WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs在 第10代时的hTERT的表达；

图28是发明实验例4中的WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs加 入BRDU后在含DOX或无DOX的培养基培养得到的BRDU-阳性细胞所 占总细胞数的比例；

图29是发明实验例4中的WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs在 经过诺考达唑处理同步后进行的细胞周期分析；

图30是发明实验例4中的WS-ihTERT iPSCs在经过诺考达唑处理同步 后不同周期的细胞百分比；

图31是发明实验例4中的WT-ihTERT iPSCs在经过诺考达唑处理同步 后不同周期的细胞百分比；

图32是发明实验例5中的经CPT处理后的凋亡的iPSCs的细胞比例；

图33是发明实验例5中的经不同应激源处理后的凋亡的iPSCs的细胞 比例；

图34是发明实验例5中WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在不同时 间点的分析；

图35是发明实验例5中WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在经过诺 考达唑处理同步后在CPT或缺少CPT下的细胞周期分析；

图36是发明实验例5中经过或未经过CPT处理的WS-ihTERT-和 WT-ihTERT-的iPSCs细胞处于S期的比例；

图37是发明实验例5中WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在高剂量 CPT或无CPT处理的DNA双链断裂检测结果；

图38是发明实验例5中WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在高剂量 CPT后细胞中γH2AX foci的比例；

图39是发明实验例5中WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在高剂量 CPT后细胞中γH2AX foci的Western blotting结果；

图40为图39中WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在高剂量CPT后 细胞中γH2AXfoci的Western blotting的定量结果图；

图41是发明实验例5中在WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在经过 CPT处理后细胞中RPA32和Rad51扩散分布图；

图42是发明实验例5中在使用CPT处理后，在WS-ihTERT-和 WT-ihTERT-的iPSCs中具有RPA32+阳性细胞百分比的细胞的百分比；

图43是发明实验例5中在使用CPT处理后，在WS-ihTERT-和 WT-ihTERT-的iPSCs中具有Rad51+阳性细胞的细胞的百分比；

图44是发明实验例5中WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在高剂量 CPT后细胞中RPA32的Western blotting结果；

图45是发明实验例5中WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在高剂量 CPT后细胞中Rad51的Western blotting结果；

图46是本发明实施例2中获得的诱导多能干细胞iPSCs的免疫荧光染 色结果见图；

图47是本发明实施例2中获得的诱导多能干细胞iPSCs的核型检测结 果见图；

图48是本发明实施例2中获得的诱导多能干细胞iPSCs的分化检测结 果见图。

具体实施方式

下述实施例中的沃纳综合征(WS)患者皮肤的成纤维细胞(AG03141) 和野生型(WT)成纤维细胞(AG10803)，上述细胞均由Coriell biorepository 提供，其中WS成纤维细胞(AG03141)的WRN基因的第2476位的核苷酸C 突变为T(2476C>T)，在748位产生了一个终止密码子即[Gln748TER (Q748X)]；

所述能够表达人端粒酶逆转录酶和嘌呤霉素抗性基因的 pBABE-hTERT-Puro质粒、所述能够表达人端粒酶逆转录酶的骨架载体为慢 病毒载体pLVX-Tight-Puro以及由pLVX-Tet-on Advanced(图谱见附图26 右图)改建而来的所述调控外源基因表达的载体均由Clonetech Laboratories Inc.提供；

携带OCT4、SOX2、c-MYC和KLF-4的仙台病毒由Thermo Fisher Scientific公司提供；

转染试剂由Thermo Fisher Scientific公司提供；

包装细胞系293T细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；

包装质粒CMVΔ8.74和pMD.G-2.0购自Addgene公司；

免疫缺陷的SCID小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；

下述实施例中涉及到的能够表达人端粒酶逆转录酶和嘌呤霉素抗性基 因的pLVX-Tight-hTERT-Puro的具体构建方法如下：

1.以含有hTERT编码序列的质粒载体pBABE-puro-hTERT为模板，用 PCR方法扩增出hTERT的编码序列，所述hTERT的编码序列如SEQ ID NO：1所示，将扩增得到的PCR片段5’和3’端加入酶切位点Not I和 EcoRI.

2.将步骤1所得的PCR产物和载体pLVX-Tight-Puro分别用限制性内 切酶Not I和EcoRI进行双酶切，纯化酶切产物。

3.将步骤2纯化的PCR产物和载体以摩尔比10:1混合，用T4 DNA 连接酶进行连接。

4.取5ul步骤3中获得的连接产物转化感受态细胞，抗生素筛选出阳性 菌落，提取质粒进行酶切和测序鉴定，测序所用的正向引物F如SEQ ID NO： 2所示，反向引物R如SEQID NO：3所示。选取测序正确的菌落扩增提取 质粒用于下一步实验，所构建的pLVX-Tight-hTERT-Puro质粒图谱见附图 26中左图，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例1

本实施例提供了一种利用WS体细胞诱导多能干细胞的方法，包括如 下步骤：

S1、源于WS患者的体细胞的获取：取沃纳综合征(WS)患者皮肤的 成纤维细胞(AG03141)，将上述细胞进行体外扩增，步骤如下：将上述的成 纤维细胞以密度2×10⁵个细胞接种在含有15％胎牛血清的DMEM培养基 中，于37℃，5％CO₂，90％湿度条件下培养，当培养的成纤维细胞长成单 层后，用无钙镁离子的PBS漂洗1次，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA 的PBS消化液消化2-3min，然后加入含有15％胎牛血清的DMEM培养基 吹打终止消化，以1:2或1：4的比例传代，于37℃，5％CO₂，90％湿度条 件下培养，在前3次传代时，待细胞刚变圆即终止消化，收集脱壁细胞， 得到扩增的WS成纤维细胞；

S2、将同时表达人端粒酶逆转录酶和嘌呤霉素抗性基因的载体转染至 S1步骤中所述的WS成纤维细胞中并进行培养，筛选出能够稳定表达人端 粒酶逆转录酶的所述的WS成纤维细胞，具体步骤如下：

(1)pBABE-hTERT-Puro病毒包装：复苏包装细胞系293T细胞，于 含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养扩增，质粒转染前一天收集细胞并 计数，取(5-6)×10⁶个293T细胞接种于多聚赖氨酸包被的10cm细胞培 养皿中，37℃、5％CO₂、90％湿度条件下培养过夜,待细胞生长至70-80％ 汇片时进行质粒转染；转染前，准备2个聚苯乙稀管，分别加入0.8mlOPTI-MEM,其中一管加入pBABE-hTERT-Puro质粒6ug、包装质粒CMVΔ 8.74ug和pMD.G-2.02ug，另一管加入32ul转染试剂lipofectamine 3000(由 Thermo Fisher Scientific公司提供)，轻柔混匀后静置5分钟，将两个聚苯 乙稀管中的混合液加入293T细胞培养基中，培养过夜后弃去上清，换成新 鲜293T细胞培养基37℃、5％CO₂培养48h,收集病毒上清用于感染WS成 纤维细胞；

(2)将步骤S1中收集的WS成纤维细胞，计数，离心，去上清，将 细胞以密度1×10⁵个细胞接种到6孔板一个孔中，室温，离心5分钟，200g， 去上清；

(3)向上述WS细胞中加入步骤(1)中收集的病毒上清，37℃、5％CO₂培养24小时；

(4)感染病毒后48h，每孔中放置2ml含有嘌呤霉素的培养基，于37℃， 5％CO₂，90％湿度条件下培养7天，筛选出能够表达人端粒酶逆转录酶的所 述的WS成纤维细胞，然后进行体外扩增培养；

S3、向S2步骤中培养的所述的成纤维体细胞中转染携带有用来诱导 iPSCs的重编程基因的载体，并进行iPSCs培养，具体如下：

(1)将步骤S2中收集的WS成纤维细胞，计数，离心，去上清，将 以密度1×10⁵个细胞重悬在5ml PBS中，室温，离心5分钟，200g，去上 清；

(2)取携带有OCT4、SOX2、c-MYC和KLF-4的仙台病毒感染步 骤(1)的细胞，病毒滴度约为1×10⁸IU/ml，感染5天后，将所述细胞转 移到小鼠成纤维细胞制备的滋养层细胞上以人胚胎干细胞培养基包括 Knock-out DMEM(DMEM培养基)，20％KSR,1％NEAA,1％GlutaMAX, 0.1mM beta-mercaptoethnol(巯基乙醇)和10ng/ml bFGF(上述成分均由Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA提供)继续培养，培养两周后， 可见iPSCs克隆出现在培养基体系中，所述iPSCs克隆即为利用WS体细胞 诱导的多能干细胞；

(3)将步骤(2)获得的上述细胞转移至Martigel(基质胶)包被的 24孔板，每孔放置0.5ml的mTesR培养基(由Stemcell,Vancover,BC,Canada 提供)进行扩增培养，一段时间后，融合的iPSCs采用Accutase细胞消化液 消化2min，用PBS洗涤，然后利用2ml的移液管的端部从培养皿中将细胞 刮下来，将细胞收集在离心管中离心，以1：6的比例进行传代，即得。将 上述获得的诱导多能干细胞iPSCs保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 14895。

为了鉴定iPSCs的生物学特性，利用免疫细胞组织染色法检测了其多 能标记OCT4、SOX2、TRA-1-81和SSEA4。iPSCs注入SCID/Beige小鼠 的后肢肌肉检测畸胎瘤。采用RT-PCR检测多能性基因OCT4,SOX2, NANOG,REX-1,ESG1,以及DPPA4的表达。核型分析和执行分析了用传统 方法。对畸胎瘤组织结构进行了分析采用免疫组织化学染色方法。上述鉴定结果见实验例3。

实施例2

本实施例提供了一种利用WS体细胞诱导多能干细胞的方法，包括如 下步骤：

S1、源于WS患者体细胞的获取：取沃纳综合征(WS)患者皮肤的成 纤维细胞(AG03141)，将上述细胞进行体外扩增，步骤如下：将上述的成纤 维细胞以密度2×10⁵个细胞接种在含有15％胎牛血清的DMEM培养基中， 于37℃，5％CO₂，90％湿度条件下培养，当培养的成纤维细胞长成单层后， 用无钙镁离子的PBS漂洗1次，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS 消化液消化2-3min，然后加入含有15％胎牛血清的DMEM培养基吹打终止 消化，以1:2或1：4的比例传代，于37℃，5％CO₂，90％湿度条件下培养， 在前3次传代时，待细胞刚变圆即终止消化，收集脱壁细胞，得到扩增的 WS成纤维细胞；

S2、将同时表达人端粒酶逆转录酶和嘌呤霉素抗性基因的载体以及可 调控外源基因表达的载体转染至S1步骤中所述的WS成纤维细胞中并进行 培养，筛选出能够稳定表达人端粒酶逆转录酶的所述的WS成纤维细胞， 具体步骤如下：

(1)慢病毒包装：复苏包装细胞系293T细胞，于含10％胎牛血清的 DMEM培养基中培养扩增，质粒转染前一天收集细胞并计数，取(5-6)× 10⁶个293T细胞接种于多聚赖氨酸包被的10cm细胞培养皿中，37℃、 5％CO₂、90％湿度条件下培养过夜,待细胞生长至70-80％汇片时进行质粒 转染；转染前，准备2个聚苯乙稀管，分别加入0.8ml OPTI-MEM,其中一 管加入由pLVX-Tet-on Advanced改建而来的所述调控外源基因表达的载体 (或pLVX-Tight-hTERT-Puro)质粒6ug、包装质粒CMVΔ8.74ug和 pMD.G-2.0 2ug，另一管加入32ul转染试剂lipofectamine 3000(由Thermo Fisher Scientific公司提供)，轻柔混匀后静置5分钟，将两个聚苯乙稀管中 的混合液加入293T细胞培养基中，培养过夜后弃去上清，换成新鲜293T 细胞培养基37度、5％CO₂培养48h,收集病毒上清用于感染WS成纤维细 胞；按照上述方法获得两种病毒上清即慢病毒pLVX-Tet-on advanced或慢 病毒pLVX-Tight-hTERT-Puro；

(2)将步骤S1中收集的WS成纤维细胞，计数，离心，去上清，将 细胞以密度1×10⁵个细胞接种到6孔板一个孔中，室温，离心5分钟，200g， 去上清；

(3)向上述WS细胞中同时加入步骤(1)中准备好的两种病毒上清 即慢病毒pLVX-Tet-on advanced和慢病毒pLVX-Tight-hTERT-Puro，37℃、 5％CO₂培养24小时；

(4)感染病毒后48h，每孔中放置2ml含有嘌呤霉素和G418(遗传霉 素)的培养基，于37℃，5％CO₂，90％湿度条件下培养7天，筛选出能够 表达人端粒酶逆转录酶的所述的WS成纤维细胞，然后进行体外扩增培养， 所述体外扩增的培养基中含有盐酸多西霉素(Dox)；

S3、向S2步骤中培养的所述的成纤维体细胞中转染携带有用来诱导 iPSCs的重编程基因的载体，并进行iPSCs培养，具体如下：

(1)将步骤S2中收集的WS成纤维细胞，计数，离心，去上清，将 以密度1×10⁵个细胞重悬在5ml PBS中，室温，离心5分钟，200g，去上 清；

(2)取携带有OCT4、SOX2、c-MYC和KLF-4的仙台病毒感染步 骤(1)的细胞，病毒滴度约为1×10⁸IU/ml，感染5天后，将所述细胞转 移到小鼠成纤维细胞制备的滋养层细胞上以人胚胎干细胞培养基包括 Knock-out DMEM(DMEM培养基)，20％KSR,1％NEAA,1％GlutaMAX, 0.1mM beta-mercaptoethnol(巯基乙醇)和10ng/ml bFGF(上述成分均由Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA提供)继续培养，培养两周后， 可见iPSCs克隆出现在培养基体系中，所述iPSCs克隆即为利用WS体细胞

(3)将上述步骤(2)中获得的细胞转移至Martigel(基质胶)包被的 24孔板，每孔放置0.5ml的mTesR培养基(由Stemcell,Vancover,BC,Canada 提供)进行扩增培养，一段时间后，融合的iPSCs采用Accutase细胞消化液 消化2min，用PBS洗涤，然后利用2ml的移液管的端部从培养皿中将细胞 刮下来，将细胞收集在离心管中离心，以1：6的比例进行传代，即得。

将上述获得的诱导多能干细胞iPSCs进行多能标志物鉴定、核型分析 和分化，多能标志物鉴定方法参照实验例3中1.3步骤，核型分析方法参照 实验例3中1.4步骤，分化检测方法参照实验例3中1.5步骤。上述获得的 诱导多能干细胞iPSCs的免疫荧光染色结果见图46，核型检测结果见图47， 分化检测结果见图48。将上述获得的诱导多能干细胞iPSCs保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101，保藏日期为2017年12月12日，保藏编号 为CGMCC No.14895，分类命名为人诱导多功能干细胞。

在上述的S2步骤中，向所述成纤维体细胞中转染两个载体pLVX-Tet-on Advance和pLVX-Tight-hTERT-Puro,其中pLVX-Tet-on Advance是负责调控 的载体，表达四环素(tetracycline)调控的反式激活蛋白(rtTA-Advanced)； 而pLVX-Tight-hTERT-Puro是反应性载体，用于表达目的基因hTERT,受改 建的具有四环素的pLVX-Tet-on Advance的反应元件启动子驱动表达。要实 现对目的基因hTERT的表达调控，需要将pLVX-Tet-on Advance和 pLVX-Tight-hTERT-Puro同时转入到WS患者成纤维细胞中，pLVX-Tet-on Advance载体表达的rtTA-Advanced结合到反应性载体 pLVX-Tight-hTERT-Puro启动子区的四环素反应元件上，使外源基因hTERT 的表达处于关闭状态，当培养液中加入四环素时，rtTA-Advanced从四环素 反应元件上解离，外源基因hTERT的表达被开启。

实验例1利用山中因子诱导WS患者来源的成纤维细胞

本实验例的目的在于考察仅利用山中因子是否能够诱导WS病人来源 的成纤维细胞制备iPSCs，具体步骤如下：

1、取沃纳综合征(WS)患者皮肤的成纤维细胞(AG03141)和野生型 (WT)成纤维细胞(AG10803)，上述细胞均由Coriell Biorepository提供， 其中WS成纤维细胞(AG03141)的WRN基因的第2476位的核苷酸C突变 为T(2476C>T)，在748位产生了一个终止密码子即[Gln748TER(Q748X)]。

2、将步骤1中的WS成纤维细胞和WT成纤维细胞进行体外扩增，然 后计数，离心，去上清，将2×10⁶个细胞重悬在5ml的PBS中，室温，离 心5分钟，200g，去上清，分别以相同的密度2×10⁶个细胞铺平板，在显 微镜(TS100,Nikon)下观察并拍照，然后取携带有山中因子(OCT4、SOX2、 c-MYC和KLF-4)的仙台病毒感染上述细胞，病毒滴度为1×10⁸IU/ml， 在第三天转染后，观察细胞的形态，在第5天转染后，观察WS成纤维细 胞和WT成纤维细胞的数量，然后将所述细胞重新培养于小鼠胚胎成纤维 细胞的滋养层细胞上，在转染第3周后，挑取疑似iPSCs单克隆进行碱性 磷酸酶染色并观察，总共有4个培养皿的密度均为4×10⁵个WS成纤维细 胞进行了iPSC的分离以及将所述细胞重新培养于小鼠胚胎成纤维细胞的滋养层细胞上观察了28天。

观察结果如下，WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在转染仙台病毒第3 天后，WS成纤维细胞呈现出衰老的表型，通过显微镜(TS100,Nikon)观 察，WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在转染仙台病毒前和转染后第5天的 显微镜图片如图1所示，左图为WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在转染 仙台病毒前，右图为WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在转染仙台病毒后第5天的显微镜图片，从图中可看出，在转染第5天后，WS成纤维细胞的 存活下来的数量明显低于WT细胞的数量；WS成纤维细胞和WT成纤维细 胞在转染仙台病毒第3周后的碱性磷酸酶染色结果如图2所示，左图为WS 成纤维细胞的碱性磷酸酶染色结果，右图为WT成纤维细胞的碱性磷酸酶 染色结果，从图2中可看出，WS成纤维细胞几乎未产生阳性克隆，WT成 纤维细胞产生了阳性克隆，关于WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在转染 仙台病毒第3周后的碱性磷酸酶染色后的阳性克隆率如图3所示，WT纤维 细胞诱导产生的阳性克隆率为0.25％，而WS成纤维细胞诱导产生的阳性克 隆率为0％，阳性克隆率值表明碱性磷酸酶染色的阳性iPSCs克隆相对培养 的细胞的总数量，N＝3(该实验重复了3次),**P<0.001(P值<0.05被认为具有统计学意义)。综上，在WS成纤维细胞中并没有出现iPSC克隆， 上述实验重复两次产生的结果一致。

由以上得出结论，仅利用山中因子不能够成功诱导WS病人来源的体 细胞如成纤维细胞制备iPSCs。

实验例2WS成纤维细胞重编程期间端粒酶活性和表达的考察

本实验例考察了WS细胞不具有重编程能力是否是由于hTERT诱导或 端粒酶激活的缺损导致的，包括如下步骤：

1、检测WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在重编程期间的端粒酶活性

按照实验例1中的方法对WS成纤维细胞和WT成纤维细胞进行诱导制 备iPSCs(仅利用山中因子诱导WS成纤维细胞和WT成纤维细胞重编程)， 分别检测WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在转染携带重编程因子(山中因 子)的仙台病毒前(第0天)、转染后第6天、14天和21天后的细胞中的端粒 酶活性。端粒酶活性测定采用Telo TAGGG Telomerase PCR ELISAkit(由 Roche Bioscience,Palo Alto,CA,USA提供)。

2、WS成纤维细胞重编程期间端粒酶活性和表达的检测结果

WS成纤维细胞和WT成纤维细胞在重编程期间的端粒酶活性的分析 结果如图4所示，WS成纤维细胞(第0天时端粒酶活性为0.0017，相对活 力，OD/μg蛋白)和WT成纤维细胞(第0天时端粒酶活性为0.0016)在 重编程期间的端粒酶活力相比是微不足道的。WS成纤维细胞和WT成纤维 细胞在重编程期间的端粒酶活性的倍数变化如图5所示，在第6天，在重编程过程中，WT成纤维细胞中端粒酶活力提高了84倍，而在WS细胞中 仅提高了3倍。由上述可知，在重编程期间，WS成纤维细胞中端粒酶活性 较低。由此可得出，WS成纤维细胞不能进行重编程是由于hTERT诱导或 端粒酶激活的缺损导致的。

实验例3在重编程之前将hTERT转入WS和WT成纤维细胞后进行重 编程

本实验例考察了在重编程前向WS成纤维细胞中导入hTERT后是否可 以进行正常的重编程制备iPSCs，具体步骤如下：

1、按照实施例1中的方法分别对WS成纤维细胞(AG03141)和WT成 纤维细胞(AG10803)进行诱导制备iPSCs，所述方法即在重编程之前将表达 hTERT的质粒转入WS和WT成纤维细胞，所使用的表达hTERT的质粒为 pBABE-puro-hTERT(其基因图谱如图6所示)，将转入表达hTERT质粒的 WS成纤维细胞命名为WS-hTERT，转入表达hTERT质粒的WT成纤维细胞命名为WT-hTERT。在所述WS-hTERT和WT-hTERT进行重编程和iPSCs 培养过程中进行以下观察和检测：

1.1、在转染携带有山中因子(OCT4、SOX2、c-MYC和KLF-4)的 仙台病毒5天后，通过显微镜(TS100,Nikon)观察并拍照，观察WS-hTERT 和WT-hTERT的存活率。

1.2、在转染所述仙台病毒第3周后，挑取疑似iPSCs单克隆进行碱性 磷酸酶染色并观察，计算阳性克隆率，并与实验例1中的WS成纤维细胞、 WT成纤维细胞的转染所述病毒5天后的阳性克隆率进行比较。

1.3、在转染所述仙台病毒第3周后，挑选疑似iPSCs单克隆进行培养扩 增，待获得足量的细胞后(因现阶段细胞较少，未进行多能标志物鉴定，实 验中该阶段会挑取多个单克隆进行培养扩增，待获得足够数量细胞后每组 选取3个克隆进行进一步鉴定)，通过免疫荧光检测方法检测WS-hTERT和 WT-hTERT的iPSCs表达的多能标志物(Oct-4，Sox2，Tra-1-81和SSEA-4)， 通过RT-PCR检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific提供)检测WS和WTiPSCs 表达的多能标志物Oct-4，Sox2，NANOG，REX-1，ESG1和DPPA4。所述 免疫荧光检测方法依据文献(Li P,Li M,Tang X,Wang S,Zhang YA,Chen Z. Accelerated generation ofoligodendrocyte progenitor cells from human induced pluripotent stem cells byforced expression of Sox10and Olig2.Science China Life sciences.2016；59(11):1131-1138.DOI:10.1007/s11427-016-0165-3)中公 开的方法实施，在实施过程中所应用的主要抗体见下表1，

表1免疫荧光检测方法中所应用的主要抗体

名称	目录	商家	稀释
				anti-OCT4	2750	CST	400
anti-TRA-1-60	MAB4360	EMD Millipore	300
				anti-SSEA4	MAB4304	EMD Millipore	100
anti-SOX2	MAB4343	EMD Millipore	1000
				anti-TRA-1-81	14-8883	eBioscience	200
anti-AFP	14-6583	eBioscience	200
				anti-Tuj-1	MAB1637	EMD Millipor	500
anti-WRN	AB200	Abcam	200
				anti-γH2AX	9718	CST	200
anti-RPA32	2208	CST	400
				anti-Rad51	SC-8349	Santa Cruz	400

1.4、将1.3中培养扩增后的WS-hTERT和WT-hTERT成纤维细胞iPSCs 进行核型分析，分析方法为：用秋水仙碱(由SIGMA公司提供)处理细胞 使细胞停滞于***期，采用乙醇-冰醋酸(北京亿利化工)固定液固定细胞， 低渗液处理后滴片进行计显带分析。

1.5、将1.3中培养扩增后的WS-hTERT和WT-hTERT成纤维细胞iPSCs， 采用Accutase(Thermo Fisher Scientific公司提供)消化后收集细胞，与100ul 基质胶(BDbioscience公司提供)混合后注射到免疫缺陷的SCID小鼠后肢 肌肉中，每周定时观察，待肿瘤形成后取出肿瘤，采用4％多聚甲醛溶液固 定后进行石蜡切片，进行HE染色分析组织结构。

1.6、取1.3中培养扩增后的WS-hTERT和WT-hTERT成纤维细胞iPSCs， 检测WS-hTERT和WT-hTERT成纤维细胞的iPSCs中的WRN表达，采用免疫 荧光检测方法检测和免疫印迹检测，所述免疫荧光检测方法依据文献(Li P, Li M,Tang X,Wang S,Zhang YA,ChenZ.Accelerated generation ofoligodendrocyte progenitor cells from humaninduced pluripotent stem cells by forced expression of Sox10and Olig2.ScienceChina Life sciences.2016；59(11):1131-1138.DOI:10.1007/s11427-016-0165-3)。免疫印迹 分析(Western blot analysis)方法依据现有的标准方法，主要的抗体包括 anti-WRN(由ab200,Abcam,Cambridge,MA,USA提供)。

1.7、分别在转染所述仙台病毒前(第0天)、转染后第6天、14天和 21天，进行细胞中的端粒酶活性检测。端粒酶活性测定采用Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA kit(由Roche Bioscience,Palo Alto,CA,USA提供)。

1.8、分别在转染所述仙台病毒前(第0天)、转染后第6天，检测细胞 中hTERT的表达是否可以延长端粒，同时检测未转入hTERT质粒的WS 细胞和WT细胞在转染所述仙台病毒前(第0天)、转染后第6天的细胞中 端粒长度。利用Q-FISH(定量荧光原位杂交)在病毒转染前和病毒转染后 第6天端粒的长度，测定iPSCs中的端粒酶Q-FISH方法依据文献(Zhang X,Li B,de Jonge N,Bjorkholm M,Xu D.The DNA methylation inhibitorinducestelomere dysfunction and apoptosis of leukemia cells that is attenuatedbytelomerase over-expression.Oncotarget.2015；6(7):4888-4900. DOI:10.18632/oncotarget.2917)中公开的方法操作。简单地，收集不同代次 的iPSCs转到冷冻的玻璃片上，这些玻璃片经过液态氮的循环冻融，然后 在0.1N(0.1N相当于0.1mol/L)的HCL溶液中孵育10min，PNA-端粒探针(由 ANAGENE Inc.,Daejeon,Korea提供)加入上述孵育液中，然后利用Leica Confocal TCS SP5在488nm下进行连续的激光扫描获得高分辨率的图像， 并进行收集和分析。

1.9、为了检测在iPSC时期端粒是否继续延长，取WS-hTERT、 WT-hTERT以及WT的iPSCs(取转染所述病毒后第4周的iPSCs)进行传 代培养，利用Flow-FISH则定在不同的传代数(P5，P10，P20，P30，P40) 的端粒长度，iPSC传代方法参见文献(Wang S,Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functionalPurkinje neurons.SciRep.2015Mar 18；5:9232.)。Flow-FISH测定iPSCs中的端粒酶Q-FISH方 法依据文献(Roos G,Hultdin M.Flow cytometric determination of telomerelength.Cytometry.2001；45(1):79-80.)中公开的方法操作，实验中所使用的流 式细胞仪由BD Bioscience提供,机器型号为Calibur II，分析用FlowJo.软 件。

2、观察和检测结果

2.1、WS-hTERT和WT-hTERT转染前和转染后第5天的细胞存活率

WS-hTERT和WT-hTERT转染前和转染后第5天的细胞存活率如图7 所示，图中的左图为在转染仙台病毒前的存活率，右图为在转染仙台病毒 后第5天的存活率，由图中比较可知，随着hTERT的表达，WS-hTERT成 纤维细胞在转染后第5天表现出更好的存活率。

2.2、WS-hTERT和WT-hTERT转染后第3周的碱性磷酸酶染色的阳性 克隆率

WS-hTERT和WT-hTERT转染后第3周的碱性磷酸酶染色的阳性克隆 率如图8所示，尽管WS-hTERT的阳性克隆率低于WT-hTERT，但从中还 可以看到，WS-hTERT细胞的碱性磷酸酶染色的阳性iPSC克隆高于WS成 纤维细胞的，WT-hTERT细胞的碱性磷酸酶染色的阳性iPSC克隆显著高于 WT成纤维细胞的，所述阳性克隆率值表明碱性磷酸酶染色的阳性iPSCs克隆相对培养的细胞的总数量，N＝3(实验重复3次),**P<0.001(P值 <0.05被认为具有统计学意义)。

2.3、WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs表达的多能标志物

通过免疫荧光检测方法检测WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs表达的 多能标志物Oct-4，Sox2，Tra-1-81和SSEA-4，结果如图9所示，结果表明 WS-hTERT的iPSCs中表达了多能标志物Oct-4，Sox2，Tra-1-81和SSEA-4。 通过RT-PCR检测WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs表达的多能标志物 Oct-4，Sox2，NANOG，REX-1，ESG1和DPPA4，结果如图10所示，结 果表明WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs均能表达多能标志物Oct-4， Sox2，NANOG，REX-1，ESG1和DPPA4。

2.4、WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs的核型

WS-hTERT和WT-hTERT成纤维细胞的iPSC系核型检测结果如图11- 图12所示，图11为WS-hTERT的iPSC系核型检测结果，图12为WT-hTERT 的iPSC系核型检测结果，比较可知，WS-hTERT和WT-hTERT成纤维细 胞的iPSC系均表现出正常的核型。

2.5、WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs的分化

WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs的分化结果如图13-14所示，由图 中可知，两种WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs细胞注射到免疫缺陷的 SCID小鼠中时，WS-hTERT和WT-hTERT成纤维细胞的iPSCs可以形成畸 胎瘤，均可分化成3种胚层细胞包括内胚层(AFP阳性)，中胚层(α-SMA- 阳性)和外胚层(Tuj-1-阳性)细胞。

2.6、WS-hTERT和WT-hTERT的iPSCs的WRN表达

WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒第4周后获得的iPSCs的 WRN表达免疫荧光染色结果如图15所示，WS-hTERT和WT-hTERT在转 染仙台病毒第4周后获得的iPSCs的WRN表达免疫印迹结果如图16所示， 由上述结果可知，WS-iPSCs保持了消极的WRN表达。

2.7、WS-hTERT和WT-hTERT的重编程过程中的不同时间点的端粒酶 活性检测

WS-hTERT和WT-hTERT的重编程过程中的不同时间点的端粒酶活性 的分析结果如图17所示(图17中WS-hTERT和WT-hTERT两者的柱形图 均是从左至右依次为第0天、6天、14天和21天)，WS-hTERT和WT-hTERT 的重编程过程中的不同时间点的端粒酶活性的倍数变化结果如图18所示 (图18中WS-hTERT和WT-hTERT两者的柱形图均是从左至右依次为第0 天、6天、14天和21天)，由图17-18可知，在重编程期间，在WS-hTERT 和WT-hTERT成纤维细胞中的端粒酶活性均维持在高水平。

2.8、WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒前和转染仙台病毒后第 6天的细胞中的端粒长度

WS、WT、WS-hTERT和WT-hTERT在转染仙台病毒前和转染仙台病 毒后第6天的细胞中的端粒长度分别如图19、20、21和22所示(图19至 图22中的横坐标为相对荧光度)，上述4个附图中的左图均为细胞在转染 仙台病毒前的端粒长度，右图均为细胞在转染仙台病毒后第6天的端粒长 度，由图19-20可知，在第0天(在感染前)，0.25％的WS成纤维细胞表 现出端粒的长度长于1000单位(所述单位为横坐标的相对荧光强度，在本 试验中将相对荧光强度作为端粒相对长度的指标)，2.88％的WS成纤维细 胞表现出端粒的长度介于500-1000单位，低于WT成纤维细胞(0.38％的 WT端粒的长度>1000单位；4.51％的WT端粒的长度介于500-1000单位之 间)。hTERT的稳定表达能够提高端粒较长的成纤维细胞的比例，如在 WS-hTERT细胞(0.98％，>1000；7.94％，500-1000；如图23和图21所示) 和WT-hTERT细胞(2.56％，>1000；14.63％，500-1000；如图23和图22 所示)。在总的细胞中由于hTERT的表达使得端粒的平均长度也得到增强， 如图24所示，WS，从79-92.4；WS-hTERT，从103.2-161.9；WT，768.-116.6； WT-hTERT，从123.5-179。

在6天的重编程过程中，端粒长度较长的细胞的比例也增加，如图19-22 所示，然而，在6天中，在WS细胞中端粒较长的比例(2.45％，>1000； 4.92％，500-1000；图19所示)均低于其他3组的(WT：4.5％，>1000； 15.97％，500-1000；WS-hTERT；5.42％，>1000；17.47％，500-1000； WT-hTERT：5.55％，>1000；19.48％，500-1000。WS、WS-hTERT、WT 和WT-hTERT端粒的平均长度在六天的重编程中分别延长17％，56％，51％ 和44％，如图24所示。

2.9、WS-hTERT、WT-hTERT以及WT的iPSCs不同代次的相对端粒 长度

WS-hTERT、WT-hTERT以及WT的iPSCs不同代次的相对端粒长度如 图25所示(图25中Fib指成纤维细胞，柱形图从左至右依次为WS-hTERT、 WT-hTERT和WT，P5代和P40代没有WT的相对端粒长度)，相对端粒长 度的值代表端粒DNA特异性探针的荧光强度，每次分析4×10⁴个iPSCs， 重复4次，由图中可知，尽管成纤维细胞系的端粒长度存在差异，端粒的 相对长度是在iPSCs的第5代被延长到类似的水平，iPSCs的端粒的相对长 度直到第40代保持稳定。

3、由以上结果可得出，端粒酶的活性可以使得WS成纤维细胞能够进 行正常的重编程，即在重编程前向WS成纤维细胞中导入表达hTERT质粒 后可以进行正常的重编程制备iPSCs。上述结果同时表明了本发明通过在重 编程前向WS成纤维细胞中导入表达hTERT质粒后进行正常的重编程制备 的iPSCs(WS-hTERT iPSCs)具有多潜能特性，表达多能标志物和分化能 力可与WT-iPSCs或WT-hTERT iPSCs(在重编程前向WT成纤维细胞中导 入表达hTERT质粒后进行正常的重编程制备的iPSCs)相当。

实验例4过表达hTERT表达是源于WS的iPSCs细胞周期顺利进行 的必要条件

本实验例考察了外源的hTERT表达是否是源于WS的iPSCs细胞周期 进程的必要条件，由于hTERT的外源表达可能会掩盖WS成纤维细胞中由 WRN突变引起的缺陷，为此，进行了以下实验：

1.1、本实验例采取盐酸多西霉素(Dox)-诱导***(由Clontech提供) 来产生iPSCs。取沃纳综合征(WS)患者皮肤的成纤维细胞(AG03141)和野 生型(WT)成纤维细胞(AG10803)分别按照实施例2的方法制备获得 WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs。将上述获得的WS-ihTERT iPSCs 和WT-ihTERT iPSCs分别按照实施例2中扩增培养步骤进行扩增培养，以 1：6的比例进行传代培养，待培养到第10代(P10)时测定WS-ihTERT iPSCs 和WT-ihTERT iPSCs所表达的端粒酶活性，其中在培养第10代时，培养基 中不添加DOX，端粒酶活性测定采用Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA kit(由Roche Bioscience,PaloAlto,CA,USA提供)。

1.2、为了进一步检测WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs增殖能力， 将1.1中获得的所述WS-ihTERT iPSCs、WT-ihTERT iPSCs和所述WT iPSCs (实验例1中制备)(上述iPSCs均为传代培养第10带左右的细胞)，BRDU (溴脱氧尿苷)脉冲释药2或4h，WS-ihTERTiPSCs和WT-ihTERT iPSCs 分别在含有DOX和不含DOX的培养基中培养，对呈BRDU-阳性的细胞进 行计数，并计算所述BRDU-阳性的细胞所占总细胞数的比例。

1.3、将1.1中获得的WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs(上述iPSCs 是传代后第10带左右的细胞)在第一天以相同的密度培养，培养至第3天， 上述的细胞通过200ng/mlnocodazole(诺考达唑)(由Sigma-Aldrich,St.Louis, MO,USA提供)处理16h，使得所述细胞在G2/M阶段保持同步，然后将所述 细胞转换至iPSCs培养基中培养5小时(在此培养阶段，iPSCs开始进入S- 期)，细胞每隔2小时进行收集和采用70％乙醇固定，为了诱导在S期DNA复 制应激，细胞被250nM CPT(Sigma-Aldrich)处理,然后采用碘化铵(PI)染 色和采用流式细胞仪(BD bioscience)分析。

2、观察和检测结果

2.1、WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs在第10代时的hTERT的 表达

WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs在第10代时的hTERT的表达 如图27所示(图27中横坐标的+、－分别表示DOX+(在含有DOX培养 基培养)、DOX-(在不含DOX培养基培养)，纵坐标为hTERT表达)，由 图中可知，当在培养到10代时不含DOX的培养基中进行培养，WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs内部表达的hTERT显著降低，WS-ihTERT iPSCs 表达了更低的内源性的hTERT mRNA，相对于WT-ihTERT iPSCs低了1/3。 在第10代培养过程中，观察到WS-ihTERT iPSCs相比于WT-ihTERT iPSCs 表现出了更低的贴壁率和更长的增殖复制时间。WT-ihTERT iPSCs通常是 以1:6的比例传代，然后在4-5天内变融合，与须以1:3-4比例传代培养并 在平均7天内增长双倍的WS-ihTERT iPSCs相反。

2.2、WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs的增殖能力

WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs的增殖能力如图28所示(图28 中横坐标的DOX+表示在含有DOX培养基培养，DOX-表示在不含DOX培 养基培养，纵坐标为BRDU-阳性细胞的比例％)，无论DOX添加， WT-ihTERT iPSCs与WT-iPSCs(来源于不表达异常的hTERT的成纤维细胞) 和采用Dox处理的WS-ihTERT iPSCs获得的BRDU-阳性细胞的比例相当。 然而，缺少Dox的WS-ihTERT iPSCs获得的BRDU-阳性细胞的比例显著低 于其他组。

2.3、WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs的细胞周期进程

WS-ihTERT iPSCs和WT-ihTERT iPSCs的细胞周期进程分析如图 29-31所示，当5小时后转换到正常的iPSC培养基中时，在WT-ihTERT iPSCs 组中处于G2/M期的细胞比例(23±6％)高于WS-ihTERT iPSCs组中的(17 ±7％)，在7h，有62±5％的WT-ihTERT iPSCs进入S期，然而WS-ihTERT iPSCs仅40±4％进入S期，由以上可得出，WS-ihTERT iPSCs以较慢的速 度进入S期。

3、由以上结果可得出，当外源hTERT表达被关闭后，WS组iPSCs细 胞传代周期明显延长，细胞增殖速度减慢。进一步实验发现当细胞周期被 Nocodozal同步在G2/M期后，Werner's组iPSCs(WS-ihTERT)细胞进入S期 的速度明显滞后于野生型(WT-ihTERT)细胞。由以上实验结果可以得出 如下结论，WS-iPSCs存在细胞周期异常，在G2/M期同步后，其相同时间 点进入S期的细胞比例明显低于WT-iPSCs,提示其WS-iPSCs的细胞增殖 与外源性hTERT的表达具有相关性。

实验例5WS iPSCs对于DNA损伤药物的敏感性

本实验例考察了WS-iPSCs和WT-iPSCs对不同应激源的反应。采用了4 种应激源应用于WS-iPSCs和WT-iPSCs细胞。4种应激源分别为喜树碱 (CPT)、博来霉素、蛋白转运抑制剂(Brefeldin A)和过氧化氢。喜树碱 (CPT)是一种细胞毒性喹啉生物碱能抑制DNA拓扑异构酶I。CPT诱发复 制停滞和以依赖于浓度的方式破裂DNA。低剂量(25-100nM)的CPT诱发复制叉放缓和逆转使得双链DNA断裂不能达到可检测水平，较高浓度(＞ 100nM)的CPT诱导DNA破裂(Ray Chaudhuri A,Hashimoto Y,Herrador R,et al.Topoisomerase Ipoisoning results in PARP-mediated replication fork reversal.Nat Struct MolBiol.2012；19(4):417-423.DOI:10.1038/nsmb.2258； Berti M,Ray Chaudhuri A,Thangavel S,et al.Human RECQ1promotes restart of replication forks reversedby DNA topoisomerase I inhibition.Nat Struct Mol Biol.2013；20(3):347-354.DOI:10.1038/nsmb.2501)。博来霉素是另一种抗癌 药物可以诱发DNA链断裂。蛋白转运抑制剂(Brefeldin A)抑制蛋白从内质 网运输到高尔基体内同时对某些癌症细胞系表现出细胞毒性。过氧化氢是 一种活性氧能够很容易的参与反应并破坏重要的细胞进程或组成，如DNA 合成和线粒体功能。

设置不同的iPSCs组，依次为WS-ihTERT+，WS-ihTERT-，WT-ihTERT+， WT-ihTERT-，WT(成纤维细胞AG10803，作为对照组)，上述WS-ihTERT+， WS-ihTERT-，WT-ihTERT+，WT-ihTERT-作为实验组并来自于实验例4中 制备获得，WS-ihTERT+和WT-ihTERT+为经DOX处理过，WS-ihTERT-和 WT-ihTERT-为未经DOX处理。上述不同的iPSCs组经受个别的应激源和凋亡(膜联蛋白V+)细胞的比例通过流式细胞仪检测得到。上述4组细胞培 养在无饲养层***-人胚胎干细胞培养基mTeSR中培养。

1.1、上述4组细胞分别经上述4种应激源处理：当采用CPT处理时， 按照如下方法：250nM的CPT处理(待iPSCs生长至70-80％汇片时加药处 理，实验组培养基中加入250nM的CPT，对照组加入PBS)，于37℃，5％CO₂， 培养1小时；当采用博来霉素处理时，按照如下方法：待iPSCs生长至70-80％ 汇片时加药处理，实验组培养基中加入50μM博莱霉素，对照组加入PBS， 于37℃，5％CO₂，培养1小时；当采用Brefeldin A处理时，按照如下方法： 50μM的Brefeldin A处理(待iPSCs生长至70-80％汇片时加药处理，实验 组培养基中加入50μM的Brefeldin A，对照组加入PBS)，于37℃，5％CO₂， 培养5min；当采用H₂O₂处理时，按照如下方法：500μM的H₂O₂处理(待 iPSCs生长至70-80％汇片时加药处理，实验组培养基中加入500μM的 H₂O₂，对照组加入PBS)，于37℃，5％CO₂，培养5min。同时设置生理盐 水组，生理盐水组的细胞为未经上述4种应激源处理，细胞的***过程达 到了细胞凋亡的基准形态。上述各组的细胞经过异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和PI染色根据Annexin V-FITC/PIApoptosis Detection Kit).标记的 细胞采用流式细胞仪分析(BD,Callibur II)。

1.2、将WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在第一天以相同的密度培 养，培养至第3天，上述的细胞通过200ng/ml nocodazole(诺考达唑)(由 Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA提供)处理(待iPSCs生长至70-80％汇片 时加药处理，向培养基中加入200ng/mlnocodazole)于37℃，5％CO₂，培 养16h，使得所述细胞在G2/M阶段保持同步，然后将所述细胞转换至iPSCs 培养基中培养5小时(在此培养阶段，iPSCs开始进入S-期)，细胞每隔2 小时进行收集和采用70％乙醇固定，为了诱导在S期DNA复制应激，一部 分细胞被250nM CPT(Sigma-Aldrich)处理，在13小时后去除nocodazole即 更换正常的培养基，不加入nocodazole。采用碘化铵(PI)染色和采用流式 细胞仪((BD,Callibur II))分析。

1.3、在WS iPSCs的S期中高剂量的CPT导致DNA双链断裂。为了 检测DNA双链断裂，对细胞的γH2AX foci(DNA双链断裂分子标志物) 进行了染色。方法按照1.2步骤中的实施，将所述WS-ihTERT-和WT-ihTERT- 的iPSCs细胞转换至iPSCs培养基中培养5小时(在此培养阶段，iPSCs开 始进入S-期)后，一部分细胞采用1μM的CPT(Sigma-Aldrich)处理1小时，一部分不采用CPT处理，然后对细胞的γH2AX foci(DNA双链断裂 分子标志物)进行了染色采用碘化铵(PI)染色，并利用显微镜观察并拍照， 同时使用Western blotting方法检测γH2AX foci，通过免疫染色法和Western blotting方法检测细胞中的RPA32和RAD51。

2检测结果如下

2.1、经上述4种应激源处理的检测结果

经CPT处理后的凋亡的iPSCs的细胞比例如图32所示(图32中横坐 标中分别表示生理盐水组(Saline)和采用CPT处理组，两组中的柱形图分 别从左至右依次表示WSihTERT+，WS ihTERT-，WT ihTERT+， WT-ihTERT-，WT，经不同应激源处理后的凋亡的iPSCs的细胞比例如图 33所示(图33中横坐标分别表示生理盐水组(Saline)、CPT处理组、博来霉素(Bleomycin)处理组、Brefeldin A处理组、H₂O₂处理组，5组中的柱 形图分别从左至右依次表示WS ihTERT+，WS ihTERT-，WT ihTERT+， WS-ihTERT-，WT)，在4种应激源中，只有CPT对WS iPSCs和WT iPSCs 表现出了不同的影响，CPT处理后，42.9±3.7％WS-ihTERT+(含有Dox) 和32.9±4.8％WS-ihTERT－(不含有Dox)iPSCs对膜联蛋白表现出阳性， 显著高于其他组(14.7±2.5％WT-ihTERT+，18.0±2.1％WT-ihTERT－，10.2 ±0.7％WT。

上述的数据表明WRN功能缺失的iPSCs对于CPT诱导的凋亡更加敏 感。

2.2、WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs的细胞周期分析

WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs的细胞在或不在CPT处理下的细 胞周期结果如图34-35所示，图34为WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs 在不同时间点的分析，图35为WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在经过 诺考达唑处理同步后在CPT或缺少CPT下的细胞周期分析，图35中 nocodozal+表示经过nocodozal处理，CPT+表示经过CPT处理，CPT-表示 未经过CPT处理，图35(a)为WS-ihTERT-的iPSCs在经过诺考达唑处理同 步后在未经CPT处理下的细胞周期分析，图35(b)为WS-ihTERT-的iPSCs 在经过诺考达唑处理同步后在经CPT处理下的细胞周期分析，图35(c)为 WT-ihTERT-的iPSCs在经过诺考达唑处理同步后在未经CPT处理下的细 胞周期分析，图35(d)为WT-ihTERT-的iPSCs在经过诺考达唑处理同步后 在经CPT处理下的细胞周期分析，图35中的横坐标的单位是细胞数量，纵 坐标为单位是荧光强度。经过或未经过CPT处理的WS-ihTERT-和 WT-ihTERT-的iPSCs细胞处于S期的比例如图36所示(图36中WS表示 未经CPT处理的WS-ihTERT-，WS-CPT表示经CPT处理的WS-ihTERT-， 同样的WT表示未经CPT处理的WT-ihTERT-，WT-CPT表示经CPT处理 的WT-ihTERT-)，在13小时后，去除nocodozal，超出60％的采用CPT处 理的WS-ihTERT-的iPSCs处于S期，远远高于其他3组，由此得出CPT 可能是在WS-ihTERT-的iPSCs的S期捕获。

2.3、WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs经高剂量CPT处理后的DNA 双链断裂检测

WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在高剂量CPT或无CPT处理的 DNA双链断裂检测结果如图37所示(图37中左图为未经过CPT处理的 WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs的DNA双链断裂检测结果，右图为经 过1μM的CPT处理的WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs的DNA双链 断裂检测结果)，WS-ihTERT-和WT-ihTERT-的iPSCs在高剂量CPT后细胞 中γH2AXfoci的比例如图38所示，由图中可知，经CPT处理过的 WS-ihTERT-的iPSCs相对于CPT处理过的WT-ihTERT-的iPSCs具有更高 比例的γH2AX foci。通过使用Western blotting检测，也产生了近似的结果 如图39和40所示。综上，γH2AX表达在WS细胞中高于在WT中。

本实验例通过检测了RPA32和Rad51，两个单链DNA(ssDNA)在 DSBs(DNA双链断裂)和停滞的分支中重组机制结合蛋白。在WS-ihTERT- 和WT-ihTERT-的iPSCs在经过CPT处理后，细胞中RPA32和Rad51扩散 分布图如图41所示(图41中的WS代表WS-ihTERT-，WT代表WT-ihTERT-)；与此相反，在CPT处理后的WS-ihTERT的iPSCs中的RPA32 和Rad51在细胞核内DNA损伤区发生磷酸化，免疫荧光染色表现为细胞核 内高曝光焦点(Distinctive foci)，如图42和43所示。RPA32抗体可以表现 出内源性的RPA32总水平，这与WS和WS-ihTERT-iPSCs没有什么不同。 然而，在CPT处理后，western blot显示出两个不同的RPA32条带在WS-ihTERT-iPSCs中，但是在WT-ihTERT的iPSCs中没有显示两个不同的 RPA32条带(如图44所示)，造成这种现象的原因还不清楚。之前的报告 显示，Rad51(DNA双链断裂修复蛋白)的开裂成31-kDa的蛋白发生在凋 亡的细胞中，在WS-ihTERT的iPSCs中检测到两个Rad51条带，但是 WT-ihTERT的iPSCs并没有，如图45所示。

由以上结果可知，WRN突变导致iPSCs对DNA损伤药物CPT的敏感 性增高，DNA修复能力受损。说明本发明制备的诱导多能干细胞可以用于 药物筛选。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。

序列表

<110> 首都医科大学宣武医院

<120> 一种细胞模型及其制备方法、应用

<130> HA201501044

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3399

<212> DNA

<213> 人工合成(hTERT)

<400> 1

atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60

gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120

cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240

gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300

ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360

agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480

ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540

gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600

cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660

gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720

ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780

aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840

gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900

cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960

tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020

ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080

gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140

cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200

gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260

ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320

gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380

gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440

aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500

gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560

cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620

ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680

ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740

tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800

ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860

ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920

ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980

ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040

ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100

gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160

ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220

gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280

agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340

caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400

gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460

aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520

ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580

gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640

aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700

cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760

cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820

gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880

aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940

aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000

atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060

tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120

tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180

gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240

aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300

acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360

ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactga 3399

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(F)

<400> 2

gcatacagct ccatccgcac atg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(R)

<400> 3

cgacccgtga accgcgatgt gtt 23

<210> 4

<211> 11165

<212> DNA

<213> 质粒pLVX-Tight-hTERT-Puro(pLVX-Tight-hTERT-Puro)

<400> 4

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840

aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900

caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960

gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020

cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080

ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140

aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200

tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260

aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320

gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380

cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440

gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040

gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100

aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160

acagcagaga tccagtttat cgatgaggcc ctttcgtctt cactcgagtt tactccctat 2220

cagtgataga gaacgtatgt cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gatgtcgagt 2280

ttactcccta tcagtgatag agaacgtatg tcgagtttac tccctatcag tgatagagaa 2340

cgtatgtcga gtttactccc tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt atccctatca 2400

gtgatagaga acgtatgtcg agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt atgtcgaggt 2460

aggcgtgtac ggtgggaggc ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc 2520

tggagaagga tccgcggccg catgccgcgc gctccccgct gccgagccgt gcgctccctg 2580

ctgcgcagcc actaccgcga ggtgctgccg ctggccacgt tcgtgcggcg cctggggccc 2640

cagggctggc ggctggtgca gcgcggggac ccggcggctt tccgcgcgct ggtggcccag 2700

tgcctggtgt gcgtgccctg ggacgcacgg ccgccccccg ccgccccctc cttccgccag 2760

gtgtcctgcc tgaaggagct ggtggcccga gtgctgcaga ggctgtgcga gcgcggcgcg 2820

aagaacgtgc tggccttcgg cttcgcgctg ctggacgggg cccgcggggg cccccccgag 2880

gccttcacca ccagcgtgcg cagctacctg cccaacacgg tgaccgacgc actgcggggg 2940

agcggggcgt gggggctgct gctgcgccgc gtgggcgacg acgtgctggt tcacctgctg 3000

gcacgctgcg cgctctttgt gctggtggct cccagctgcg cctaccaggt gtgcgggccg 3060

ccgctgtacc agctcggcgc tgccactcag gcccggcccc cgccacacgc tagtggaccc 3120

cgaaggcgtc tgggatgcga acgggcctgg aaccatagcg tcagggaggc cggggtcccc 3180

ctgggcctgc cagccccggg tgcgaggagg cgcgggggca gtgccagccg aagtctgccg 3240

ttgcccaaga ggcccaggcg tggcgctgcc cctgagccgg agcggacgcc cgttgggcag 3300

gggtcctggg cccacccggg caggacgcgt ggaccgagtg accgtggttt ctgtgtggtg 3360

tcacctgcca gacccgccga agaagccacc tctttggagg gtgcgctctc tggcacgcgc 3420

cactcccacc catccgtggg ccgccagcac cacgcgggcc ccccatccac atcgcggcca 3480

ccacgtccct gggacacgcc ttgtcccccg gtgtacgccg agaccaagca cttcctctac 3540

tcctcaggcg acaaggagca gctgcggccc tccttcctac tcagctctct gaggcccagc 3600

ctgactggcg ctcggaggct cgtggagacc atctttctgg gttccaggcc ctggatgcca 3660

gggactcccc gcaggttgcc ccgcctgccc cagcgctact ggcaaatgcg gcccctgttt 3720

ctggagctgc ttgggaacca cgcgcagtgc ccctacgggg tgctcctcaa gacgcactgc 3780

ccgctgcgag ctgcggtcac cccagcagcc ggtgtctgtg cccgggagaa gccccagggc 3840

tctgtggcgg cccccgagga ggaggacaca gacccccgtc gcctggtgca gctgctccgc 3900

cagcacagca gcccctggca ggtgtacggc ttcgtgcggg cctgcctgcg ccggctggtg 3960

cccccaggcc tctggggctc caggcacaac gaacgccgct tcctcaggaa caccaagaag 4020

ttcatctccc tggggaagca tgccaagctc tcgctgcagg agctgacgtg gaagatgagc 4080

gtgcgggact gcgcttggct gcgcaggagc ccaggggttg gctgtgttcc ggccgcagag 4140

caccgtctgc gtgaggagat cctggccaag ttcctgcact ggctgatgag tgtgtacgtc 4200

gtcgagctgc tcaggtcttt cttttatgtc acggagacca cgtttcaaaa gaacaggctc 4260

tttttctacc ggaagagtgt ctggagcaag ttgcaaagca ttggaatcag acagcacttg 4320

aagagggtgc agctgcggga gctgtcggaa gcagaggtca ggcagcatcg ggaagccagg 4380

cccgccctgc tgacgtccag actccgcttc atccccaagc ctgacgggct gcggccgatt 4440

gtgaacatgg actacgtcgt gggagccaga acgttccgca gagaaaagag ggccgagcgt 4500

ctcacctcga gggtgaaggc actgttcagc gtgctcaact acgagcgggc gcggcgcccc 4560

ggcctcctgg gcgcctctgt gctgggcctg gacgatatcc acagggcctg gcgcaccttc 4620

gtgctgcgtg tgcgggccca ggacccgccg cctgagctgt actttgtcaa ggtggatgtg 4680

acgggcgcgt acgacaccat cccccaggac aggctcacgg aggtcatcgc cagcatcatc 4740

aaaccccaga acacgtactg cgtgcgtcgg tatgccgtgg tccagaaggc cgcccatggg 4800

cacgtccgca aggccttcaa gagccacgtc tctaccttga cagacctcca gccgtacatg 4860

cgacagttcg tggctcacct gcaggagacc agcccgctga gggatgccgt cgtcatcgag 4920

cagagctcct ccctgaatga ggccagcagt ggcctcttcg acgtcttcct acgcttcatg 4980

tgccaccacg ccgtgcgcat caggggcaag tcctacgtcc agtgccaggg gatcccgcag 5040

ggctccatcc tctccacgct gctctgcagc ctgtgctacg gcgacatgga gaacaagctg 5100

tttgcgggga ttcggcggga cgggctgctc ctgcgtttgg tggatgattt cttgttggtg 5160

acacctcacc tcacccacgc gaaaaccttc ctcaggaccc tggtccgagg tgtccctgag 5220

tatggctgcg tggtgaactt gcggaagaca gtggtgaact tccctgtaga agacgaggcc 5280

ctgggtggca cggcttttgt tcagatgccg gcccacggcc tattcccctg gtgcggcctg 5340

ctgctggata cccggaccct ggaggtgcag agcgactact ccagctatgc ccggacctcc 5400

atcagagcca gtctcacctt caaccgcggc ttcaaggctg ggaggaacat gcgtcgcaaa 5460

ctctttgggg tcttgcggct gaagtgtcac agcctgtttc tggatttgca ggtgaacagc 5520

ctccagacgg tgtgcaccaa catctacaag atcctcctgc tgcaggcgta caggtttcac 5580

gcatgtgtgc tgcagctccc atttcatcag caagtttgga agaaccccac atttttcctg 5640

cgcgtcatct ctgacacggc ctccctctgc tactccatcc tgaaagccaa gaacgcaggg 5700

atgtcgctgg gggccaaggg cgccgccggc cctctgccct ccgaggccgt gcagtggctg 5760

tgccaccaag cattcctgct caagctgact cgacaccgtg tcacctacgt gccactcctg 5820

gggtcactca ggacagccca gacgcagctg agtcggaagc tcccggggac gacgctgact 5880

gccctggagg ccgcagccaa cccggcactg ccctcagact tcaagaccat cctggactga 5940

gaattctacc gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca 6000

gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc 6060

accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct 6120

cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg 6180

gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg 6240

gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg 6300

ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc 6360

cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg 6420

ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg acctgcagcc caagcttacc atgaccgagt 6480

acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg 6540

ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg 6600

agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg 6660

tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag 6720

cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg 6780

ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt 6840

tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg 6900

tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg 6960

cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg 7020

tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga cgggcgcgtc 7080

tggaacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 7140

gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 7200

tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 7260

gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 7320

cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 7380

ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 7440

cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg 7500

ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 7560

gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 7620

cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctgga 7680

attaattctg cagtcgagac ctagaaaaac atggagcaat cacaagtagc aatacagcag 7740

ctaccaatgc tgattgtgcc tggctagaag cacaagagga ggaggaggtg ggttttccag 7800

tcacacctca ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact 7860

ttttaaaaga aaagagggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatatcc 7920

ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct acttccctga ttagcagaac tacacaccag 7980

ggccaggggt cagatatcca ctgacctttg gatggtgcta caagctagta ccagttgagc 8040

cagataaggt agaagaggcc aataaaggag agaacaccag cttgttacac cctgtgagcc 8100

tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag tgttagagtg gaggtttgac agccgcctag 8160

catttcatca cgtggcccga gagctgcatc cggagtactt caagaactgc tgatatcgag 8220

cttgctacaa gggactttcc gctggggact ttccagggag gcgtggcctg ggcgggactg 8280

gggagtggcg agccctcaga tcctgcatat aagcagctgc tttttgcctg tactgggtct 8340

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 8400

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 8460

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt 8520

agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt 8580

gagaggcctt gacattgcta gcgtttaccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca 8640

tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 8700

gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 8760

gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 8820

atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 8880

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 8940

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 9000

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 9060

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 9120

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 9180

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 9240

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 9300

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 9360

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 9420

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 9480

agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 9540

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 9600

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 9660

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 9720

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 9780

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 9840

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 9900

cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 9960

gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 10020

gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 10080

tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 10140

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 10200

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 10260

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 10320

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 10380

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 10440

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 10500

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 10560

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 10620

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 10680

tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 10740

tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 10800

gacggatcgg gagatcaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 10860

catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 10920

actcatcaat gtatcttatc atgtctggat caactggata actcaagcta accaaaatca 10980

tcccaaactt cccaccccat accctattac cactgccaat tacctgtggt ttcatttact 11040

ctaaacctgt gattcctctg aattattttc attttaaaga aattgtattt gttaaatatg 11100

tactacaaac ttagtagttt ttaaagaaat tgtatttgtt aaatatgtac tacaaactta 11160

gtagt 11165

Claims (7)

1.一种利用沃纳综合征（WS）患者的体细胞诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、源于WS患者的体细胞的获取；获取的WS体细胞为成纤维细胞AG03141；

S2、将同时表达人端粒酶逆转录酶和抗性基因的载体转染至所述体细胞中并进行培养，筛选出能够表达人端粒酶逆转录酶的所述体细胞；所述表达人端粒酶逆转录酶的骨架载体为慢病毒载体；所述的慢病毒载体为pLVX-Tight-Puro；

S3、向S2步骤中筛选的所述体细胞中转染携带有诱导iPSCs的重编程基因的载体，并进行iPSCs培养；所述重编程基因为OCT4、 SOX2、c-MYC和 KLF-4；所述载体为仙台病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2步骤中，在转染表达人端粒酶逆转录酶的载体的同时转染可调控外源基因表达的载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S2步骤中，用于所述调控外源基因表达载体的骨架载体为pLVX-Tet-on Advanced。

4.权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的诱导多能干细胞，其命名为人诱导多功能干细胞，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.14895。

5.权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的诱导多能干细胞或权利要求4所述的诱导多能干细胞在成年早衰症、肿瘤、动脉粥样硬化、糖尿病或骨质疏松症的疾病发病机制研究或药物筛选领域用途。

6.一种细胞模型，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的诱导多能干细胞或权利要求4所述的诱导多能干细胞。

7.权利要求6所述的细胞模型在成年早衰、肿瘤、动脉粥样硬化、糖尿病或骨质疏松症的疾病发病机制研究或药物筛选领域用途。

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