JP6885550B2 - 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は:
[1](1)多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、及び
(2)工程(1)で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程
を含む、網膜前駆細胞の製造方法(以下、本発明製造方法1と記すこともある。);
[2](1)多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)工程(1)で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
(3)工程(2)で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程
を含む網膜組織の製造方法(以下、本発明製造方法2と記すこともある。);
[3](1)多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)工程(1)で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
(3)工程(2)で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で、目的とする網膜層特異的神経細胞が出現するまで浮遊培養し、目的とする網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程
を含む網膜層特異的神経細胞の製造方法(以下、本発明製造方法3と記すこともある。);
[4]前記多能性幹細胞が霊長類多能性幹細胞である前記[1]から[3]のいずれかに記載の製造方法;
[5]前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である前記[1]から[4]のいずれかに記載の製造方法;
[6]前記工程(1)及び工程(2)が、血清代替物存在下で行われる前記[1]から[5]のいずれかに記載の製造方法;
[7]浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる前記[1]から[6]のいずれかに記載の製造方法;
[8]前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7からなる群から選ばれる1以上の蛋白質である前記[1]から[7]のいずれかに記載の製造方法;
[9]前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、工程(1)の浮遊培養開始から1日目から15日目までの間に培地に添加される前記[1]から[8]のいずれかに記載の製造方法;
[10]前記[1]から[9]のいずれかに記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を含有してなる、毒性・薬効評価用試薬;
[11]前記[1]から[9]のいずれかに記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞に被検物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法;
[12]前記[1]から[9]のいずれかに記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を含有してなる、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤;
[13]前記[1]から[9]のいずれかに記載の方法により製造される、有効量の網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法;及び
[14]網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための前記[1]から[9]のいずれかに記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞;
等を提供する。
このようなベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」と記すこともある。クローニングベクターとしては、通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含むベクターを挙げることができ、例えば、「Molecular Cloning(3rd edition)」 by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001))に記載されたベクターを挙げることができる。
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理(例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理)されていないものなどを使用できる。
MatrigelTMは、Engelbreth Holm Swarm(EHS)マウス肉腫から抽出された基底膜調製物である。MatrigelTMの主成分はIV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンであり、これらに加えてTGF−β、線維芽細胞増殖因子(FGF)、組織プラスミノゲン活性化因子及びEHS腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。MatrigelTMの「growth factor reduced製品」は、通常のMatrigelTMよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はEGFが<0.5ng/ml、NGFが<0.2ng/ml、PDGFが<5pg/ml、IGF−1が5ng/ml、TGF−βが1.7ng/mlである。
例えば、「BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地」とは、外因性のBMPシグナル伝達経路作用物質が添加された培地または外因性のBMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地である。「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地」とは、外因性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地または外因性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地である。
幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES−1、KhES−2及びKhES−3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は独立行政法人理化学研究所より、D3株はATCCより、入手可能である。
幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、ヒト幹細胞は、KnockoutTM Serum Replacement(Invitrogen社)を添加した培地で培養することにより維持できる。マウス幹細胞は、ウシ胎児血清(FCS)及びLeukemiaInhibitory Factor(LIF)を添加し無フィーダー下に培養することにより維持できる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
「凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させ浮遊培養する際に、「一定数の分散した細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
本発明においては、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させることが好ましい。このように多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。
凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート(96穴プレート)やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
(1)多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、及び
(2)工程(1)で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程。
工程(1)における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地(例えば、IMDMとF−12の1:1の混合液に10%KSR、450μM1−モノチオグリセロール及び1xChemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地)を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトES細胞の場合は、通常約1%から約20%であり、好ましくは約2%から約20%である。
工程(2)で用いられる無血清培地は、工程(1)で用いた無血清培地がソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない限り、当該培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。工程(1)で用いた、BMPシグナル伝達経路物質を含まない無血清培地をそのまま工程(2)に用いる場合、BMPシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加すればよい。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
BMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばBMP4の場合は、約0.01nMから約1μM、好ましくは約0.1nMから約100nM、より好ましくは約1.5nMの濃度となるように培地に添加する。
BMPシグナル伝達経路作用物質が培地に添加され、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化誘導が開始された後は、BMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する必要は無く、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地を用いて培地交換を行ってよい。これにより、培地に掛かる経費を抑えることができる。網膜細胞への分化誘導が開始された細胞は、例えば、当該細胞におけるRax遺伝子の発現を検出することにより確認することができる。GFP等の蛍光レポータータンパク質遺伝子がRax遺伝子座へノックインされた多能性幹細胞を用いて工程(1)により形成された凝集体を、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、発現した蛍光レポータータンパク質から発せられる蛍光を検出することにより、網膜細胞への分化誘導が開始された時期を確認することもできる。工程(2)の実施態様の一つとして、工程(1)で形成された凝集体を、Rax遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質を含みソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。
得られた網膜前駆細胞を含む凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜前駆細胞を含む凝集体を分散処理(例えば、トリプシン/EDTA処理)し、得られた細胞をFACSを用いて選別することにより、高純度な網膜前駆細胞を得ることも可能である。
(1)多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)工程(1)で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
(3)工程(2)で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも実質的に含まない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが実質的に添加されていない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地(例えば、IMDMとF−12の1:1の混合液に10%KSR、450μM1−モノチオグリセロール及び1xChemically Defined Lipid Concentrateを添加した培地)を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトES細胞の場合は、通常約1%から約20%であり、好ましくは約2%から約20%である。
工程(3)の培養時間は特に限定されないが、通常48時間以上であり、好ましくは7日間以上である。
凝集体の表面に存在する網膜組織をピンセット等を用いて、凝集体から物理的に切り出すことも可能である。この場合、各凝集体の表面には、網膜組織以外の神経組織が形成される場合もあるため、凝集体から切り出した神経組織の一部を切り取り、これを用いて後述の免疫染色法等により確認することにより、その組織が網膜組織であることを確認することが出来る。
網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体では、例えば、上述の凝集体凍結切片の免疫染色像において、RAX陽性の組織が観察され、その外側にRAX陰性の組織が観察されない。
得られた網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を分散処理(例えば、トリプシン/EDTA処理)し、得られた細胞をFACSを用いて選別することにより、高純度な網膜組織構成細胞を得ることも可能である。
(1)多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)工程(1)で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
(3)工程(2)で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で、目的とする網膜層特異的神経細胞が出現するまで浮遊培養し、目的とする網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも実質的に含まない培地、例えば、網膜組織及び網膜層特異的神経細胞への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが実質的に添加されていない培地、例えば、網膜組織及び網膜層特異的神経細胞への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、DMEM−F12培地に10%ウシ胎児血清、N2サプリメント、100μMタウリン、500nM レチノイン酸を添加した血清培地、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地(例えば、IMDMとF−12の1:1の混合液に10%KSR、450μM1−モノチオグリセロール及び1xChemically Defined Lipid Concentrateを添加した培地)等を挙げることができる。
工程(3)の培養時間は、目的とする網膜層特異的神経細胞によって異なり、例えば約7日間から約200日間である。
網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体では、例えば、上述の凝集体凍結切片の免疫染色像において、RAX陽性の組織が観察され、その外側にRAX陰性の組織が観察されない。
得られた網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を分散処理(例えば、トリプシン/EDTA処理)し、得られた細胞をFACSを用いて選別することにより、高純度な網膜層特異的神経細胞を得ることも可能である。
網膜組織又は網膜関連細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症、などが挙げられる。
RAX::GFPノックインヒトES細胞(KhES-1由来;Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785)を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地(Sigma)に20%KSR(KnockoutTM Serum Replacement;Invitrogen)、0.1mM 2−メルカプトエタノール、2mM L−グルタミン、1x 非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、TrypLE Express(Invitrogen)を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の96穴培養プレート(スミロン スフェロイド プレート,住友ベークライト社)の1ウェルあたり1.2×104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5%CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地には、F−12培地とIMDM培地の1:1混合液に10%KSR、450μM 1−モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrate、20μM Y27632を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始3日目に終濃度1.5nMのヒト組み換えBMP4(R&D)、終濃度100ng/mlのBMP2(R&D)、終濃度100ng/mlのBMP7(R&D)、終濃度100ng/mlのGDF7(R&D)のうちの何れかを添加して浮遊培養した。前記BMPシグナル伝達経路作用物質をいずれも添加していない条件でも同様に培養した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質をいずれも添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始18日目に蛍光顕微鏡観察を実施した。BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件で培養した場合では網膜前駆細胞が誘導されたことを示すGFP発現細胞がほとんど認められなかった(図1A,B)。それと比べて、BMP2(図1C,D)、BMP4(図1E,F)、BMP7(図1G,H)、GDF7(図1I,J)のいずれかを添加して培養した条件ではGFP発現細胞が明らかに増加した。
RAX::GFPノックインヒトES細胞(KhES-1由来;Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785)を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地(Sigma)に20%KSR(KnockoutTM Serum Replacement;Invitrogen)、0.1mM 2−メルカプトエタノール、2mM L−グルタミン、1x 非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、TrypLE Express(Invitrogen)を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の96穴培養プレート(スミロン スフェロイド プレート,住友ベークライト社)の1ウェルあたり1.2×104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5%CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地には、F−12培地とIMDM培地の1:1混合液に10%KSR、450μM 1−モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrate、20μM Y27632を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始と同時、浮遊培養開始1日目、浮遊培養開始2日目、浮遊培養開始3日目のいずれかの時点で終濃度1.5nMのヒト組み換えBMP4(R&D)を添加して浮遊培養した。BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件でも同様に培養した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始18日目に96wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、引き続きF−12培地とIMDM培地の1:1混合液に10%KSR、450μM 1−モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地中で浮遊培養を行った。浮遊培養開始26日目に蛍光顕微鏡による観察およびFACSによるGFP陽性細胞の割合の測定を行った。
BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件(図2A,B,C)および浮遊培養開始と同時にBMP4を添加した条件(図2D,E,F)では網膜前駆細胞が誘導されたことを示すGFP発現細胞は認められなかった。それと比べて、浮遊培養開始1日目(図2G,H,I)、浮遊培養開始2日目(図2J,K,L)、浮遊培養開始3日目(図2M,N,O)のいずれかの時点でBMP4を添加した条件では、GFP発現細胞が明らかに増加した。いずれの条件においても、形成されたRAX::GFP陽性の組織の外側にRAX::GFP陰性の組織は観察されなかった。FACSによる測定の結果では、浮遊培養開始3日目にBMP4を添加した条件では85%以上の細胞がGFP陽性であった(図2O)。以上の結果から、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体の製造には、BMPシグナル伝達経路作用物質を浮遊培養開始1日目以降、好ましくは3日目に添加することが有効であることが示された。
RAX::GFPノックインヒトES細胞(KhES-1由来;Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785)を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地(Sigma)に20%KSR(KnockoutTM Serum Replacement;Invitrogen)、0.1mM 2−メルカプトエタノール、2mM L−グルタミン、1x 非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、TrypLE Express(Invitrogen)を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の96穴培養プレート(スミロン スフェロイド プレート,住友ベークライト社)の1ウェルあたり1.2×104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5%CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地には、F−12培地とIMDM培地の1:1混合液に10%KSR、450μM 1−モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrate、20μM Y27632を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始6日目、浮遊培養開始9日目、浮遊培養開始12日目、浮遊培養開始15日目のいずれかの時点で終濃度1.5nMのヒト組み換えBMP4(R&D)を添加して浮遊培養した。BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件でも同様に培養した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始18日目に、96wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、引き続きF−12培地とIMDM培地の1:1混合液に10%KSR、450μM 1−モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地で浮遊培養を行った。浮遊培養開始24日目に、蛍光顕微鏡観察を実施した。
その結果、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件では網膜前駆細胞が誘導されたことを示すGFP発現細胞は認められなかった(図3A,B)。それと比べて、浮遊培養開始6日目(図3C,D)、浮遊培養開始9日目(図3E,F)、浮遊培養開始12日目(図3G,H)のいずれかの時点でBMP4を添加した条件では明らかにGFP発現細胞が増加した。浮遊培養開始15日目にBMP4を添加した条件でもGFP発現細胞が誘導されたものの、効率は低かった(図3I,J)。いずれの条件においても、形成されたRAX::GFP陽性の組織の外側にRAX::GFP陰性の組織は観察されなかった。以上の結果から、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体の製造には、BMPシグナル伝達経路作用物質を浮遊培養開始15日目以前に添加することが有効であることが示された。
実施例1で得られたGFP発現細胞を含む凝集体を、浮遊培養開始18日目に96wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、引き続きF−12培地とIMDM培地の1:1混合液に10%KSR、450μM 1−モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrateを添加した培地で浮遊培養を実施した。浮遊培養開始26日目に凝集体を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、凍結切片を作製した後、免疫染色法により組織構造の確認を行った。
浮遊培養開始26日目において、全層がRAX::GFP陽性であり、外層が網膜幹細胞のマーカーであるChx10陽性であった(図4A, B, C)。RAX::GFP陽性の上皮の外側には非神経外胚葉等のいかなる組織も存在しなかった。本発明製造方法により、ヒトES細胞から高効率に網膜組織が製造可能であることが示された。
RAX::GFPノックインヒトES細胞(KhES-1由来;Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785)を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地(Sigma)に20%KSR(KnockoutTM Serum Replacement;Invitrogen)、0.1mM 2−メルカプトエタノール、2mM L−グルタミン、1x 非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、TrypLE Express(Invitrogen)を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の96穴培養プレート(スミロン スフェロイド プレート,住友ベークライト社)の1ウェルあたり1.2×104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5%CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地には、F−12培地とIMDM培地の1:1混合液に10%KSR、450μM 1−モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrate、20μM Y27632を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始3日目に終濃度1.5nMのヒト組み換えBMP4(R&D)を添加した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始18日目に96wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、DMEM−F12培地に10%ウシ胎児血清、N2サプリメント、100μMタウリン、500nM レチノイン酸を添加した培地を用いて浮遊培養を継続した。浮遊培養開始18日目以降の培養は40%O2下で実施した。浮遊培養開始117日目に凝集体を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、凍結切片を作製した後、免疫染色法により組織構造の確認を行った。浮遊培養開始117日目において、全層がRAX::GFP陽性であり、視細胞マーカーであるRecoverinが陽性の細胞が存在した(図5A)。くわえて、網膜組織外層に、棹体視細胞マーカーであるNrlが陽性の細胞(図5B)と、錐体視細胞マーカーであるRXR−gammaが陽性の細胞(図5C)が存在し、棹体、錐体視細胞への分化が生じていることが示された。さらに、網膜前駆細胞及び双極細胞のマーカーであるChx10が陽性の細胞(図5D)、アマクリン細胞マーカーであるCalretininが陽性の細胞(図5 E)、水平細胞マーカーであるCalbindinが陽性の細胞(図5F)が存在していた。この結果から、本発明製造方法により、各種の分化した網膜層特異的神経細胞から構成される網膜組織を、ヒトES細胞から高効率に製造可能であることが示された。
RAX::GFPノックインヒトES細胞(KhES-1由来;Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785)を、「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地(Sigma)に20%KSR(KnockoutTM Serum Replacement;Invitrogen)、0.1mM 2−メルカプトエタノール、2mM L−グルタミン、1x 非必須アミノ酸、8ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、TrypLE Express(Invitrogen)を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の96穴培養プレート(スミロン スフェロイド プレート,住友ベークライト社)の1ウェルあたり1.2×104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5%CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地には、F−12培地とIMDM培地の1:1混合液に10%KSR、450μM 1−モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrate、20μM Y27632を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始3日目に、前記無血清培地を50μl加えた(合計150μl)。浮遊培養開始6日目に終濃度1.5nMのヒト組み換えBMP4(R&D)を添加した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始18日目に96wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、DMEM−F12培地に10%ウシ胎児血清、N2サプリメント、100μMタウリン、500nM レチノイン酸を添加した培地を用いて浮遊培養を継続した。浮遊培養開始18日目以降の培養は40%O2下で実施した。浮遊培養開始50日目に凝集体を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、凍結切片を作製した後、免疫染色法により組織構造の確認を行った。浮遊培養開始50日目において、全層がRAX::GFP陽性であり、網膜前駆細胞及び双極細胞のマーカーであるChx10が陽性の細胞(図6A)、神経節細胞及び神経細胞のマーカーであるPax6陽性の細胞(図6B)が存在し、多層の網膜神経組織が形成されていることが示された。くわえて、視細胞マーカーであるCrxが陽性の細胞(図6C)、及び、神経節細胞のマーカーであるBrn3b陽性の細胞(図6D)が存在した。この結果から、本発明製造方法により、各種の分化した網膜層特異的神経細胞から構成される網膜組織を、ヒトES細胞から高効率に製造可能であることが示された。
ヒトiPS細胞株201B7(独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター又はiPSアカデミアジャパン株式会社から入手可能)を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養する。培地にはDMEM/F12 培地(Sigma)に20%KSR(KnockoutTM Serum Replacement;Invitrogen)、0.1mM 2−メルカプトエタノール、2mM L−グルタミン、1x 非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いる。培養された前記iPS細胞を、TrypLE Express(Invitrogen)を用いて単一分散した後、非細胞接着性の96穴培養プレート(スミロン スフェロイド プレート,住友ベークライト社)の1ウェルあたり1.2×104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5%CO2で浮遊培養する。その際の無血清培地には、F−12培地とIMDM培地の1:1混合液に10%KSR、450μM 1−モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrate、20μM Y27632を添加した無血清培地を用いる。浮遊培養開始1日目から15日目の何れかの時点に、終濃度1.5nMのヒト組み換えBMP4(R&D)、終濃度100ng/mlのBMP2(R&D)、終濃度100ng/mlのBMP7(R&D)、終濃度100ng/mlのGDF7(R&D)のうちの何れかを添加して浮遊培養を行う。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質をいずれも添加していない上記培地に3日おきに交換する。浮遊培養開始18日目に凝集体を一部回収し、4%パラホルムアルデヒドで固定処理を実施し凍結切片を作製した後、免疫染色法により網膜前駆細胞マーカー(Rax、Chx10)の発現を確認する。残りの凝集体を96wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと移し、DMEM−F12培地に10%ウシ胎児血清、N2サプリメント、100μMタウリン、500nM レチノイン酸を添加した培地を用いて浮遊培養を継続する。浮遊培養開始18日目以降の培養は40%O2下で実施する。浮遊培養開始117日目に凝集体を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、凍結切片を作製した後、免疫染色法により組織構造と網膜層特異的神経細胞のマーカー(Nrl、RXR−gamma、Recoverin、Chx10、Calretinin、Calbindin)の発現の確認を行う。
このようにして、網膜前駆細胞、更には、各種の分化した網膜層特異的神経細胞から構成される網膜組織を、ヒトiPS細胞から製造可能である。
Claims (21)
- (1)霊長類多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、及び
(2)工程(1)で形成された凝集体を、Rax遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む、無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程を含む、網膜前駆細胞の製造方法。 - (1)霊長類多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)工程(1)で形成された凝集体を、Rax遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む、無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
(3)工程(2)で得られた凝集体を、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない、無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程を含む網膜組織の製造方法。 - (1)霊長類多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
(2)工程(1)で形成された凝集体を、Rax遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む、無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
(3)工程(2)で得られた凝集体を、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない、無血清培地又は血清培地中で、目的とする網膜層特異的神経細胞が出現するまで浮遊培養し、目的とする網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程を含む網膜層特異的神経細胞の製造方法。 - 前記第二工程において、Rax遺伝子を発現する細胞が出現し始めた後、BMPシグナル伝達経路作用物質の培地中の濃度を段階的に低減させて浮遊培養する、請求項1から3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記BMPシグナル伝達経路作用物質の培地中の濃度の低減が、培地の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まない、無血清培地又は血清培地に培地交換することによって為される、請求項4に記載の方法。
- 前記培地交換が、1〜4回実施される、請求項5に記載の方法。
- Rax遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間のBMPシグナル伝達経路作用物質の培地中の濃度が約1.5nMである、請求項1から6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記霊長類多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である請求項1から7のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)及び工程(2)が、血清代替物存在下で行われる請求項1から8のいずれか1項に記載の製造方法。
- 浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる請求項1から9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7からなる群から選ばれる1以上の蛋白質である請求項1から10のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP4である請求項1から11のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、工程(1)の浮遊培養開始から1日目から15日目までの間に培地に添加される請求項1から12のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、工程(1)の浮遊培養開始から1日目から9日目までの間に培地に添加される請求項1から13のいずれか1項に記載の製造方法。
- 第三工程において得られる凝集体が、網膜前駆細胞、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、杆体細胞、及び錐体細胞からなる群から選択される1又は複数の細胞を含む凝集体である、請求項2から14のいずれか1項に記載の製造方法。
- 網膜前駆細胞が、Rax及びPAX6からなる群から選択される1又は複数のマーカーを発現する細胞である、請求項1から15のいずれか1項に記載の製造方法。
- 視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、杆体細胞、及び錐体細胞が、それぞれ以下のマーカーからなる群から選択される1又は複数のマーカーを発現する細胞である、請求項15に記載の製造方法。
視細胞:Rhodopsin及びRecoverin
水平細胞:Calbindin
双極細胞:Chx10及びL7
アマクリン細胞:Calretinin
網膜節細胞:Tuj1及びBrn3
杆体細胞:Nrl
錐体細胞:Rxr-gamma - 請求項2から17のいずれか1項に記載の製造方法により製造される細胞凝集体から、網膜組織の一部を物理的に切り出す工程を含む、網膜組織の製造方法。
- 請求項2から17のいずれか1項に記載の製造方法により製造される細胞凝集体から、網膜組織の一部を物理的に切り出す工程、又は特定の細胞を単離する工程を含む、細胞治療用移植用材料の製造方法。
- 細胞治療が、網膜組織又は網膜関連細胞の障害に基づく疾患に対する細胞治療である、請求項19に記載の製造方法。
- 網膜組織又は網膜関連細胞の障害に基づく疾患が、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、又は新生児網膜症である、請求項20に記載の製造方法。
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