CN108251414A - 骨髓细胞基因组dna的提取方法及提取试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种骨髓细胞基因组DNA的提取方法和提取试剂盒，提取方法包括：采用蛋白酶K和裂解液处理骨髓细胞样品，然后采用核糖核酸酶消化，与无水乙醇混合后放入硅胶吸附柱中吸附，依次采用第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液处理，得到纯化后的骨髓细胞基因组DNA。本发明的骨髓细胞基因组DNA的提取方法通过控制配方、调节pH值和离子浓度等，能够在低成本的情况下，提取出来质量高、纯度高的gDNA，提取效果稳定可靠。

Description

骨髓细胞基因组DNA的提取方法及提取试剂盒

技术领域

本发明属于DNA提取领域，涉及一种骨髓细胞基因组DNA的提取方法及提取试剂盒。

背景技术

骨髓细胞是人体内重要的细胞之一，了解骨髓细胞的基因组DNA(Genomic DNA，gDNA)有助于了解人体的健康情况，因此，就很有必要先提取骨髓细胞gDNA。

人们常用骨髓细胞gDNA提取试剂盒来提取骨髓细胞gDNA。目前市面上销售的骨髓细胞gDNA提取试剂盒要么为了提高gDNA的浓度而牺牲其纯度，要么为了提高其纯度而牺牲其浓度。gDNA的浓度和纯度均会对后继的建库和测序数据产生影响，因此，在提取gDNA时同时获得较高浓度和较大纯度的gDNA就非常有意义。

发明内容

本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷而提供一种骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其能够在低成本的情况下同时获得较高浓度和较大纯度的gDNA。

本发明的第二个目的在于提供一种能够实现上述方法的骨髓细胞基因组DNA提取试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其包括以下步骤：

(1)、将骨髓细胞样品、蛋白酶K溶液和裂解液混合，裂解后得到裂解悬浮液；

(2)、将裂解悬浮液冷却至室温，与核糖核酸酶混合并消化后，得到消化液；

(3)、将消化液与无水乙醇混合，待溶液澄清后作为上样液加入硅胶吸附柱中进行吸附，依次采用第一洗涤液和第二洗涤液清洗硅胶吸附柱并弃去废液；

(4)、采用洗脱液洗脱步骤(3)得到的硅胶吸附柱，分离得到骨髓细胞基因组DNA。

其中，在上述的提取方法中，骨髓细胞样品与蛋白酶K溶液的体积比可以为(5‐20):1，可以为(8‐15):1，也可以为10:1。蛋白酶K溶液中蛋白酶K的浓度可以为20±10mg/ml，还可以为20±5mg/ml，也可以为20mg/ml。骨髓细胞样品与裂解液的体积比可以为1:(0.5‐2)，可以为1:1。

上述的裂解液的溶剂为双蒸水，溶质包括：盐酸胍、脱氧胆酸钠、离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。裂解液中的盐酸胍的浓度可以为3‐10M，可以为3.5‐9.5M，还可以为5‐9M，进一步可以为5.5‐7.5M。裂解液中脱氧胆酸钠的质量体积百分比可以为0.1‐0.5％，可以为0.2‐0.4％，更可以为0.25‐0.3％。离子型表面活性剂为月桂酰基肌氨酸钠，在裂解液中的质量体积百分比为0.8％‐1.2％。非离子型表面活性剂为聚氧乙烯醚，在裂解液中的质量体积百分比浓度为0.4％‐0.5％。

第一洗涤液为盐酸胍和无水乙醇的混合液，pH值为9.0‐10.0。可选地，第一洗涤液中盐酸胍的摩尔浓度大于裂解液中盐酸胍的摩尔浓度，可选地，第一洗涤液中盐酸胍的浓度是裂解液中盐酸胍的浓度1.4倍至2倍。第一洗涤液中盐酸胍与无水乙醇的体积比为1:(0.9‐1)。

第二洗涤液为Tris‐HCl缓冲液和无水乙醇的混合液，pH值为7.5‐8.5。Tris‐HCl缓冲液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度可以为100±10mM。Tris‐HCl缓冲液和无水乙醇的体积比为1:(3‐7)，也可以为1:(4‐5)。

洗脱液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液。可选地，洗脱液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10±1mM。洗脱液中EDTA的浓度为0.8‐1mM。

上述的各种试剂的浓度为工作浓度。

一种骨髓细胞基因组DNA提取试剂盒，其包括以下试剂：蛋白酶K试剂、裂解液、核糖核酸酶试剂、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液和硅胶吸附柱。

其中，蛋白酶试剂含有20±10mg/mL的蛋白酶K。

裂解液的溶剂为双蒸水，溶质包括盐酸胍、脱氧胆酸钠、离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。裂解液中的盐酸胍的浓度可以为3‐10M，也可以为3.5‐9.5M，还可以为5‐9M，进一步可以为5.5‐7.5M。裂解液中脱氧胆酸钠的质量体积百分比可以为0.1‐0.5％，也可以为0.2‐0.4％，更可以为0.25‐0.3％。离子型表面活性剂为月桂酰基肌氨酸钠，其在裂解液中的质量体积百分比可以为0.8％‐1.2％。非离子型表面活性剂为聚氧乙烯醚，其在裂解液中的质量体积百分比可以为0.4％‐0.5％。

第一洗涤液为盐酸胍和无水乙醇的混合液，pH值为9.0‐10.0。第一洗涤液中盐酸胍的浓度大于裂解液中盐酸胍的浓度。

第二洗涤液为Tris‐HCl缓冲液和无水乙醇的混合液，pH值为7.5‐8.5。Tris‐HCl缓冲液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为100±10mM。

洗脱液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液。洗脱液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10±1mM，EDTA的浓度为0.8‐1mM。

本发明具有以下有益效果：

第一、本发明使用高浓度的GuHCl使蛋白质变性，破坏膜结构同时解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解液体系中，并利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促使核酸与蛋白质的分开。为了获得更纯的核酸，选择去垢剂、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂相配合使用，并进一步裂解细胞、溶解蛋白，特别是能够使一些难溶于水的蛋白溶解。

第二、本发明采用硅胶模柱式法纯化核酸，在高盐高PH洗液(第一洗涤液)下，核酸特异性的结合到硅胶膜上，破碎的细胞碎片和蛋白却无法结合到膜上，以此把核酸分离出来。在低盐低PH洗液(第二洗涤液)下，可以进一步除去上一步没有洗去的杂质和残留的盐离子。

第三、本发明采用了优化的洗脱液，在该洗脱液的孵育下，核酸从硅胶膜上释放到洗脱液里，在高速离心下得到高纯度高浓度的基因组DNA.

总之，本发明的骨髓细胞基因组DNA的提取方法通过控制配方、调节pH值和离子浓度等，能够在低成本的情况下，提取出来质量高、纯度高的gDNA，提取效果稳定可靠。

附图说明

图1为本发明实施例1和现有技术所提起DNA的琼脂糖凝胶电泳对比图。

具体实施方式

本发明提供了一种骨髓细胞基因组DNA的提取方法及提取试剂盒，用于对骨髓细胞基因组DNA进行提取，并获得具有高浓度和高纯度的骨髓细胞基因组DNA(gDNA)。

<骨髓细胞基因组DNA的提取方法>

一种骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其包括以下步骤：

(1)、将骨髓细胞样品、蛋白酶K和裂解液混合并裂解后得到裂解悬浮液；

(2)、将裂解悬浮液冷却至室温，与核糖核酸酶混合并消化后，得到消化液；

(3)、将消化液与无水乙醇混合，待溶液澄清后作为上样液加入硅胶吸附柱中进行吸附；

(4)、依次采用第一洗涤液和第二洗涤液清洗步骤(3)得到的硅胶吸附柱并弃去废液；

(5)、采用洗脱液洗脱步骤(4)得到的硅胶吸附柱，分离得到骨髓细胞基因组DNA。

其中，步骤(1)的目的是裂解骨髓细胞，使其中的核酸游离到裂解悬浮液中。

在步骤(1)中，用于裂解骨髓细胞的裂解体系中含有蛋白酶K溶液。蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的降解，其能将蛋白质消化为小的片段，促使核酸与蛋白质的分开。蛋白酶K溶液中蛋白酶K的浓度可以为20±10mg/ml，还可以为20±5mg/ml，也可以为20mg/ml。此时，骨髓细胞样品与蛋白酶K溶液的体积比可以为(5‐20):1，优选为(8‐15):1，更优选为10:1。例如，在检测时，若骨髓细胞样品的体积为200μl，则蛋白酶K溶液的浓度可以为20mg/ml，其体积可以为20μl。

在步骤(1)中，裂解体系中还含有裂解液。骨髓细胞样品与裂解液的体积比可以为1:(0.5‐2)，还可以为1:1。例如，若骨髓细胞样品的体积为200μl，则裂解液的体积可以为200μl。裂解液是一种由多种物质组合的复合溶液，其溶质包括：盐酸胍、脱氧胆酸钠、离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂，溶剂为双蒸水。所有的溶质溶于双蒸水后，需用0.22μm的水性滤膜过滤后方可作为裂解液使用。

其中，裂解液中的盐酸胍(Guanidine hydrochloride，GuHcl)的浓度较高，可以为3‐10M，也可以为3.5‐9.5M，还可以为5‐9M，还可以进一步为5.5‐7.5M。高浓度的盐酸胍起到使裂解体系中的蛋白质变性的作用，在破坏膜结构的同时也解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解悬浮液中。

离子型表面活性剂为月桂酰基肌氨酸钠(Sodium lauroyl sarcosine)，其属于阴离子型表面活性剂。在一些实施例中，其在裂解液中的质量体积百分比一般可以为0.8％‐1.2％，但在另一些实施例中，其裂解时的工作浓度也可以为1.6mg/μl‐2.4mg/μl。此处的质量体积百分比浓度指的是100ml的裂解液中含有0.8‐1.2mg的离子型表面活性剂。

非离子型表面活性剂为聚氧乙烯醚(Brij‐58)，在一些实施例中，其在裂解液中的质量体积百分比一般可以为0.8％‐1.2％，但在另一些实施例中，其裂解时的工作浓度也可以为0.8mg/μl‐1.0mg/μl。此处的质量体积百分比浓度指的是100ml的裂解液中含有0.8‐1.2mg的非离子型表面活性剂。以下同理。

离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂能够使变性后的蛋白质与脱氧胆酸钠结合后溶解于裂解液中。

在一些实施例中，脱氧胆酸钠(Deoxycholate)作为离子型去垢剂在裂解液中的质量体积百分比可以为0.1‐0.5％，还可以为0.2‐0.4％，也可以为0.25‐0.3％。合适浓度的脱氧胆酸钠既能够保证了变性蛋白质的去除，又能够防止加入过多的离子型和非离子型表面活性剂，从而防止这些表面活性剂对后继纯化过程产生不利的影响。

实验证明：离子型、非离子型表面活性剂和去垢剂的联合使用能够进一步裂解细胞和溶解蛋白，特别是能够溶解一些难溶于水的蛋白。

裂解液可以在实际使用之前临时配置，只要各种组分的工作浓度满足上述条件即可。

在步骤(1)中，将骨髓细胞样品、蛋白酶K和裂解液充分混合，得到混合液，之后需要进行裂解过程，具体为：将上述混合液在65℃的条件下水浴大约15分钟。推荐每隔5分钟后拿出来颠倒震荡混匀，并短暂瞬离后继续水浴，待水浴完毕后得到裂解悬浮液。短暂瞬离的条件为：离心转速低于4000rpm，离心时间小于或等于5s。短暂瞬离可以使颠倒混匀时黏在盖子上的混合液重新回到管中。低速和短时间可以保证混合液中的物质不至于因为离心力的作用而沉积到管底，作用是能够使样品裂解地更加充分。

在步骤(1)中，由于骨髓细胞样本的粘稠和保存不当等特殊情况存在，若裂解时间过短，可能造成样本的裂解不充分，核酸得率低；若裂解时间过长，可能造成核酸分子的降解、断裂的不适情况。因此，推荐的裂解时间为15至20分钟。水浴裂解前务必保证骨髓细胞样本与裂解液的充分混匀，裂解期间观察该骨髓细胞样本在裂解时颜色的变化。若骨髓细胞样本较裂解前没有发生明显的颜色变化，可适当延长裂解时间5分钟。对于特殊样本(骨髓保存不当、质量不佳等情况下的样本)，给予最多20分钟的裂解时间，否则DNA非常容易降解，从而影响结果的准确性。

在步骤(2)中，将步骤(1)得到的裂解悬浮液取出后颠倒震荡混匀，短暂瞬离，于室温放置2‐3分钟，待该裂解悬浮液降至室温后，即加入核糖核酸酶溶液(Ribonuclease，RNase)。核糖核酸酶溶液的浓度可以为100‐500mg/ml，还可以为200‐300mg/ml。核糖核酸酶的添加量根据骨髓细胞的添加量而定。核糖核酸酶的体积与骨髓细胞样品的体积比可以为1:(50‐250)，也可以为1:(100‐200)。例如，当骨髓细胞样品的体积为200μl时，核糖核酸酶的体积为2μl。核糖核酸酶用于降解裂解悬浮液中存在的RNA，以避免其对DNA造成干扰。

在步骤(2)中，核糖核酸酶的消化过程包括如下步骤：将冷却至室温的裂解悬浮液与核糖核酸酶溶液混合后，颠倒震荡混匀，短暂瞬离，室温消化5至10分钟，即得到消化液。

在步骤(3)中，无水乙醇的体积大于骨髓细胞样品的体积，可以为骨髓细胞样品的体积的110‐120％。例如，若骨髓细胞样品的体积为200μl，则无水乙醇的体积可以为220μl。在加入无水乙醇后，充分颠倒混匀，直至无沉淀或明显絮状物存在后，短暂瞬离。短暂瞬离的目的都是为了使盖子上的液体回到管中，既是对裂解样品的充分利用，也是预防实验样品的污染和交叉污染。该步中不会产生沉淀但不排除可能会产生明显的透明絮状物，此时须得充分震荡混匀直至透明絮状物消失，再将得到的混合液加到硅胶膜柱上。无水乙醇不能溶解核酸，用来溶解并去除破碎的细胞杂质、蛋白等。

在步骤(3)中，当在消化液中加入无水乙醇后，会明显出现絮状物，此时应当颠倒混匀或用移液器反复吹打直至没有明显絮状物出现，此步骤在室温下进行，不必在4℃孵育。现有技术采用沉淀法，其用乙醇/异丙醇沉淀核酸，为得到核酸而需要将乙醇/异丙醇同样本裂解混合液于4℃孵育10‐30分钟，此步骤是考虑到所提样本核酸量低而需进行的步骤。本发明考虑到骨髓样本的特殊性，质量较佳，且实验室条件下抽提样本量少(如：最少200μl提取)，得率符合实验要求，故室温孵育即可，比现有技术更方便快捷。

步骤(4)的主要目的是清洗掉未吸附到硅胶吸附柱上的变性蛋白质和其它杂质。清洗过程分为两步，第一步采用第一洗涤液洗涤，第二步采用第二洗涤液洗涤。

其中，第一洗涤液为盐酸胍和无水乙醇的混合液，pH值为9.0‐10.0，例如为9.0±0.1，盐酸胍与无水乙醇的体积比为1:(0.9‐1)。第一洗涤液中盐酸胍的摩尔浓度大于裂解液中盐酸胍的摩尔浓度，优选为是裂解液中盐酸胍的浓度1.4倍至2倍。例如，如果裂解液中的盐酸胍的浓度为3.5M，则第一洗涤液中盐酸胍的浓度可以为5M。第一洗涤液为高盐高pH值洗液，其目的是为了除去变性蛋白质及杂质，因为在高盐和高pH值的条件下，核酸分子能够特异性地结合到硅胶吸附膜上，而破碎的细胞碎片和蛋白质却无法结合到膜上，因此，可以把核酸特异性地分离出来。为了保证不误洗下核酸，提高核酸得率，故采用无水乙醇与盐酸胍相混合。实践中可以根据具体情况，多次加入第一洗涤液进行洗涤，并且可以使上样液多次经过硅胶吸附膜。若骨髓细胞样品的体积为200μl，第一洗涤液的加入体积可以为500μl。

第二洗涤液为Tris‐HCl缓冲液和无水乙醇的混合液，pH值为7.5‐8.5，例如为7.5±0.1。Tris‐HCl缓冲液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为100±10mM。Tris‐HCl缓冲液和无水乙醇的体积比为1:(3‐7)，优选为1:(4‐5)。第二洗涤液为低盐低pH值洗液，其目的是为了洗去盐酸胍和未洗去的杂质，使得盐酸胍和杂质与硅胶吸附柱的吸附膜分离，同时配合调整pH值，能够使得核酸不被误洗下吸附膜，提高核酸的得率。DNA能溶解的保存pH在9.0左右，将第二洗涤液的pH值调节在7.5‐8.5，特别是7.5±0.1之间，保证不误洗下结合在吸附膜上的DNA。也可以根据实际情况，多次添加第二洗涤液进行洗涤。若骨髓细胞样品的体积为200μl，则第二洗涤液的加入体积可以是500μl。

在经过第(4)步的清洗过程后，吸附膜上特异性地吸附着核酸分子，而变性蛋白质和杂质都被洗掉，因此，第(5)步的目的是采用洗脱液将吸附的核酸分子洗脱下来并释放到洗脱液中。洗脱液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液，洗脱液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10±1mM，洗脱液中EDTA的浓度为0.8‐1mM。三羟甲基氨基甲烷(Tris)的目的是使核酸分子从吸附膜上脱离下来，为核酸分子提供一个稳定的保存环境。乙二胺四乙酸(EDTA)的浓度较低，可以抑制核酸酶的活性，使得核酸分子不被降解。洗脱后的洗脱液经过高速离心后取沉淀，该沉淀即为具有高纯度和高浓度的骨髓细胞基因组DNA。根据骨髓细胞样品的体积，洗脱液的加入体积可以为骨髓细胞样品体积的1/4至1/2。例如，骨髓细胞样品的体积为200μl，则洗脱液的体积可以为50‐100μl。

<骨髓细胞基因组DNA提取试剂盒>

一种骨髓细胞基因组DNA提取试剂盒，其适用于上述的骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其包括以下试剂：蛋白酶K试剂、裂解液、核糖核酸酶试剂、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液、硅胶吸附柱和废液收集管。硅胶吸附柱可拆卸地嵌套在废液收集管内。其中，蛋白酶K试剂含有蛋白酶K。蛋白酶K试剂中蛋白酶K的浓度可以为20±10mg/mL，优选为20±5mg/mL，更优选为20mg/mL。在实际使用时，蛋白酶K试剂的添加量为：骨髓细胞样品与蛋白酶K试剂的体积比可以为(5‐20):1，优选为(8‐15):1，更优选为10:1。

裂解液用于裂解骨髓细胞样品，使核酸、蛋白质等物质从细胞中逸出，包括盐酸胍、脱氧胆酸钠、离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。裂解液中的盐酸胍的浓度为3‐10M，优选为3.5‐9.5M，更优选为5‐9M，进一步优选为5.5‐7.5M。裂解液中脱氧胆酸钠的质量体积百分比为0.1‐0.5％，优选为0.2‐0.4％，更优选为0.25‐0.3％。离子型表面活性剂为月桂酰基肌氨酸钠，其在裂解液中的浓度可以为0.8％‐1.2％，还可以为0.9％‐1.1％，也可以为1.0％。非离子型表面活性剂为聚氧乙烯醚，其在裂解液中的浓度为0.4％‐0.5％，也可以为0.45％。

第一洗涤液为盐酸胍和无水乙醇的混合液，pH值可以为9.0±0.1。第一洗涤液中盐酸胍的浓度大于裂解液中盐酸胍的浓度。

第二洗涤液为Tris‐HCl缓冲液和无水乙醇的混合液，pH值可以为7.5±0.1。Tris‐HCl缓冲液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为100±10mM。

洗脱液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液。洗脱液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10±1mM。洗脱液中EDTA的浓度为0.8‐1mM。

上述各个试剂的浓度均可以是工作浓度，并非储存浓度。对于储存浓度并没有什么要求，只要在工作时配成工作浓度即可。

骨髓细胞基因组DNA提取试剂盒的成分如下表1所示：

表1骨髓细胞基因组DNA提取试剂盒的成分表

在上表中，Y为云健康基因科技(上海)有限公司的拼音简称，L为lysis的首字母，W为WASH洗液的英文首字母，1表示第一洗涤液，2表示第二洗涤液，E表示elution洗脱液的英文首字母。

裂解液在使用前需观察是否有沉淀，如有沉淀，于37℃水浴直至沉淀消失，摇晃均匀后使用。第一洗涤液和第二洗涤液可以在使用之前临时配制。

上述试剂既可以事先配制好作为成品出售，又可以在使用时临时配制。只要各种物质的浓度满足上述要求即可。

<实施例1>

以下结合实施例进一步说明本发明。

本实施例提供了一种骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其包括以下步骤：

(1)、向一干净的1.5ml离心管中加入200μl骨髓细胞样品，然后依次加入20u l浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液和200μl裂解液，充分颠倒震荡混匀，短暂瞬离，获得混合液；

(2)、将步骤(1)获得的混合液于65℃水浴15分钟，水浴加热期间每隔5分钟取出来颠倒震荡混匀，短暂瞬离后继续水浴裂解，待水浴结束后得到裂解悬浮液；

(3)将步骤(2)所得的裂解悬浮液取出后颠倒震荡混匀，短暂瞬离，室温放置2‐3分钟，待冷却至室温后，加入2μl浓度为200mg/ml的RNase A，颠倒震荡混匀，短暂瞬离，室温消化5分钟，得到消化液；

(4)、向离心管中加入220μl的无水乙醇，与消化液充分颠倒混匀，直至无沉淀或明显絮状物存在后，短暂瞬离，将所得液体作为上样液全部加入硅胶吸附柱内，套上废液收集管，室温放置1‐2分钟，于7000×g(9000rpm)室温离心90秒，弃掉废液收集管中的废液；

(5)、将硅胶吸附柱放回废液收集管中，向硅胶吸附柱中加入500μl第一洗涤液，7000×g(9000rpm)室温离心60秒，倒掉废液收集管中的废液；

(6)、将硅胶吸附柱放回废液收集管中，向硅胶吸附柱中加入500μl第二洗涤液，7000×g(9000rpm)室温离心60秒，倒掉废液收集管中的废液；

(7)、将硅胶吸附柱放回废液收集管中，13500×g(12000rpm)室温离心120秒，弃掉废液收集管，将硅胶吸附柱放入干净的新的1.5ml离心管中；将套在1.5ml离心管中的硅胶吸附柱放置于25℃金属加热器上，打开硅胶吸附柱的盖子，干燥至少2分钟至残留的乙醇完全挥发；

(8)、向硅胶吸附柱的硅胶吸附膜中央悬空加入50至100μl已预热到65℃的洗脱液，室温放置1分钟，于13500×g(12000rpm)室温离心120秒，收集沉淀记得到骨髓细胞基因组DNA，于‐20℃保存。

<实验>

对实施例1的骨髓细胞基因组DNA分别进行Qubit和琼脂糖凝胶电泳检测，获得实验结果。其中，Qubit和琼脂糖凝胶电泳检测方法均为公知常识，本领域技术人员能够获得具体的检测方法，故不再赘述。

实验条件如下：骨髓细胞的体积为200μl，洗脱液的体积为50μl，琼脂糖凝胶电泳检测的条件为：220V、1％的琼脂糖凝胶电泳、电泳30min。

实验结果如下表2和图1所示。

表2实验结果对比表

Sample ID	Qubit	Unit	Sample Type	Vol(ul)	Total(ug)	20ng QC	1.2*Loading
								Test B	53.0	ng/μl	DNA	32	1.70	0.38	5.0
Test T	71.4	ng/μl	DNA	45	3.21	0.28	5.0

在表2中，Vol指的是50μl洗脱液加入吸附柱离心后得到的含有DNA的液体的体积(因为吸附膜会残留洗脱液以及最终液体测量时的损失和误差，最终得到的含有DNA的液体会小于加入时洗脱的50μl)。20ng QC指的是吸取20ng的DNA+5ul 1.2*Loading Buffer，来用1％琼脂糖220v 30min电泳。1.2*Loading Buffer是TaKaRa的6*Loading Buffer(Cat.﹟:9156)用Nuclease‐Free Water稀释得到的。

在表2中，Test B为市售的组织抽提试剂盒，Test T为本发明的骨髓细胞基因组DNA抽提试剂盒。

经过Qubit测定可知，Test B的DNA浓度为53.0ng/μl，而Test T的DNA浓度为71.4ng/μl。由此可知，本发明的骨髓细胞基因组DNA抽提方法获得了高纯度的DNA。在同一样品条件下更换不同的条件(如改变裂解液、两种洗涤液和洗脱液的浓度等)并在相同的条件下进行检测也得到了同样的结果。

如图1可知，Test T的条带明显比Test B窄，条带清楚、明亮，不出现杂带，DNA比较纯，说明Test T的提取质量和纯度明显优于Test B。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其特征在于：其包括以下步骤：

(1)、将骨髓细胞样品、蛋白酶K和裂解液混合，裂解后得到裂解悬浮液；

(2)、将所述裂解悬浮液冷却至室温，与核糖核酸酶混合并消化后，得到消化液；

(3)、将消化液与无水乙醇混合，待溶液澄清后作为上样液加入硅胶吸附柱中进行吸附，依次采用第一洗涤液和第二洗涤液清洗所述硅胶吸附柱并弃去废液；

(4)、采用洗脱液洗脱步骤(3)得到的硅胶吸附柱，分离得到骨髓细胞基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述骨髓细胞样品与所述蛋白酶K的体积比可以为(5‐20):1，可以为(8‐15):1，也可以为10:1；和/或，

所述骨髓细胞样品与所述裂解液的体积比可以为1:(0.5‐2)，可以为1:1。

3.根据权利要求1所述的骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述裂解液包括：盐酸胍、脱氧胆酸钠、离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。

4.根据权利要求3所述的骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述裂解液中的所述盐酸胍的可以为3‐10M，可以为3.5‐9.5M，还可以为5‐9M；进一步可以为5.5‐7.5M；和/或，

所述裂解液中脱氧胆酸钠的质量体积百分比可以为0.1‐0.5％，可以为0.2‐0.4％，更可以为0.25‐0.3％；和/或，

所述离子型表面活性剂为月桂酰基肌氨酸钠，在所述裂解液中的质量体积百分比为0.8％‐1.2％；和/或，

所述非离子型表面活性剂为聚氧乙烯醚，在所述裂解液中的质量体积百分比浓度为0.4％‐0.5％。

5.根据权利要求3所述的骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述第一洗涤液为盐酸胍和无水乙醇的混合液，pH值为9.0‐10.0；

可选地，所述第一洗涤液中盐酸胍的摩尔浓度大于所述裂解液中盐酸胍的摩尔浓度；和/或，所述第一洗涤液中盐酸胍与所述无水乙醇的体积比为1:(0.9‐1)；

可选地，所述第一洗涤液中盐酸胍的浓度是所述裂解液中盐酸胍的浓度1.4倍至2倍。

6.根据权利要求3所述的骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述第二洗涤液为Tris‐HCl缓冲液和无水乙醇的混合液，pH值为7.5‐8.5；

优选地，所述Tris‐HCl缓冲液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为100±10mM；和/或，所述Tris‐HCl缓冲液和无水乙醇的体积比为1:(3‐7)，也可以为1:(4‐5)。

7.根据权利要求1所述的骨髓细胞基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述洗脱液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液；

优选地，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10±1mM；和/或，所述洗脱液中EDTA的浓度为0.8‐1mM。

8.一种骨髓细胞基因组DNA提取试剂盒，其特征在于：其包括以下试剂：蛋白酶K试剂、裂解液、核糖核酸酶试剂、第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液和硅胶吸附柱。

9.根据权利要求8所述的骨髓细胞基因组DNA提取试剂盒，其特征在于：所述蛋白酶试剂含有20±10mg/mL的蛋白酶K；和/或，

所述裂解液包括盐酸胍、脱氧胆酸钠、离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂；和/或，

所述第一洗涤液为盐酸胍和无水乙醇的混合液，pH值为9.0‐10.0；和/或，

所述第二洗涤液为Tris‐HCl缓冲液和无水乙醇的混合液，pH值为7.5‐8.5；和/或，

所述洗脱液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液。

10.根据权利要求9所述的骨髓细胞基因组DNA提取试剂盒，其特征在于：所述裂解液中的所述盐酸胍的浓度为3‐10M，优选为3.5‐9.5M，更优选为5‐9M，进一步优选为5.5‐7.5M；和/或，

所述裂解液中脱氧胆酸钠的质量体积百分比为0.1‐0.5％，优选为0.2‐0.4％，更优选为0.25‐0.3％；和/或，

所述离子型表面活性剂为月桂酰基肌氨酸钠，其在所述裂解液中的质量体积百分比为0.8％‐1.2％；和/或，

所述非离子型表面活性剂为聚氧乙烯醚，其在所述裂解液中的质量体积百分比为0.4％‐0.5％；和/或，

所述第一洗涤液为盐酸胍和无水乙醇的混合液，所述第一洗涤液中盐酸胍的浓度大于所述裂解液中盐酸胍的浓度；和/或，

所述Tris‐HCl缓冲液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为100±10mM；和/或，

所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10±1mM,；和/或，所述洗脱液中EDTA的浓度为0.8‐1mM。