JP5390772B2 - 核酸を安定化試薬から精製するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本特許出願は2004年11月5日出願の米国出願第60/625,513号明細書、および2005年9月13日出願の米国出願第60/716,451号明細書の優先権を主張する。
生物科学、医学および薬学における発展は、遺伝子を研究することへの関心を高めており、およびさまざまな試料から核酸を得るための洗練された方法の必要性を強めている。たとえば、リボ核酸は細胞の遺伝的期限および機能的活動の幅広い情報を提供する。そのような情報は、たとえば、臨床で、感染症の診断、発がん遺伝子を発現している細胞の検出、遺伝疾患の検出、宿主防御機構の状態監視、患者における遺伝子発現に対する薬物の影響の検討、および薬物の副作用および毒性作用の検討に使用されうる。
生物試料といった試料は、さまざまな手段によって回収されうる。たとえば、試料を回収しおよび保存するために試料回収容器が用いられる。一部の実施形態では、回収容器は弾力性のある停止具を有するガラスまたはプラスチック製チューブである。別の実施形態では採血チューブが用いられ、チューブは真空にされて大量の血液をチューブへ回収する。一部の実施形態では、特定の試験のための血液試料を調製するために、回収チューブは、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)といったさまざまな添加物を有しうる。別の実施形態では、添加物は抗血液凝固剤である。一部の場合では、抗血液凝固添加物は水溶液中で緩衝されたクエン酸塩またはヘパリンである。別の場合では、水性クエン酸塩は指定された量の血液試料と組み合わされて、特定の試験を実施するために必要な抗凝固剤の量を決定する。しかし、添加物は試料中の核酸を安定化しないため、こういった処理された回収チューブは主として血清学的試験のために用いられる。
試薬
本発明は、いくつかの分類の試薬:希釈溶液、可溶化溶液、溶解溶液、プロテイナーゼK溶液、結合溶液、洗浄溶液、および溶出溶液を扱う。
さまざまな固相担体が、本発明において使用されうる。適切な固相担体は、たとえば、グラスファイバー、または、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンのような他の物質、およびそれらの組み合わせといったシリカ系の担体を含む。一部の実施形態では、固相担体は、プラグ−フローまたは連続流れDNA単離方法を可能にするために、容器中に包まれうるかまたは固定されうる。一部の実施形態では、固相担体は、栓流または連続流のDNA単離方法を可能にするために容器に包まれるかまたは固定されうる。別の実施形態では、チューブまたはプレートのような適切な容器中に固定されまたは包まれうる膜、ディスクまたはシリンダーといった自立固相担体を作製するべく、固相担体の材料が充填されうる。一部の実施形態では、固相担体は、生物材料との最適な接触を可能にするために繊維性であるか微粒子でありうる。本発明の試薬とともに使用するため適した固相担体の大きさは、材料(たとえば生物材料)の量にしたがって変化しうる。たとえば、グラスファイバー膜は、異なる量のDNAの結合、精製および溶出を可能にするために異なる大きさへと切断されうる。
本発明は、パックスジーン(Paxgene)(商標)、RNAセーファー(RNAsafer)(商標)、RNAレーター(RNAlater)(商標)、およびテンパス(Tempus)(商標)溶液の商品名の下で採用された試薬を含む安定化試薬中に保存された材料(たとえば生物材料)(「安定化試料」)から、DNA、またはRNA、または両方を精製するための方法を提供する。本発明で教示される試薬および固相担体は、単離方法を代替するのに役に立つ。
本発明で扱われる試薬、方法およびキットは、相対的に少ない不純物しか含まない実質的に純粋なおよび未分解の核酸を提供するため、その核酸は当業者に公知である下流の工程に使用されうる。本発明は、特に、本明細書に記載の試薬および随意的に固相担体と組み合わせて、本発明の方法にしたがってDNA、RNA、またはDNAおよびRNAの両方を試料から精製するために使用されうる、特定の手順を含むキットを扱う。実質的に純粋な、未分解の核酸とは、核酸定量、制限酵素消化、DNA配列決定、サザンブロッティングなどといったハイブリダイゼーション技術、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列準拠増幅(NASBA)、自己維持的配列複製(SSRまたは3SR)、鎖置換増幅(SDA)、および転写媒介増幅(TMA)、定量的PCR(qPCR)、または他のDNA分析、およびRT−PCR、in vitro翻訳、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ分析および他のRNA分析といった増幅法を含むがそれらに限定されない、以降の分析での使用に適した核酸である。
血液試料はドナーからパックスジーン(PAXgene)(商標)回収チューブ(プレアナリティクス社(PreAnalytiX)(商標)、カリフォルニア州バレンシア)へ採取された。試料は本質的に取扱説明書にしたがって処理された。試料は3000xgにて10分間遠心分離された。パックスジーン(PAXgene)(商標)RNA回収チューブの遠心分離に際して得られた、結果として生じる試料沈澱は、総核酸、負に荷電したタンパク質、および陽イオン性界面活性剤カトリモックス(Catrimox)(商標)の非水溶性沈澱であった。沈澱は総血液製剤夾雑物を洗浄された。沈澱に水5mLを添加し、および試料を迅速にボルテックスした。チューブを次いで3000xgにて10分間再び遠心分離し、および上清をデカントして、よりきれいな沈澱を得た。
血液試料はドナーからパックスジーン(PAXgene)(商標)回収チューブ(プレアナリティクス社(PreAnalytiX)(商標)、カリフォルニア州バレンシア)へ採取された。試料は本質的に取扱説明書にしたがって処理された。試料は3000xgにて10分間遠心分離された。パックスジーン(PAXgene)(商標)RNA回収チューブの遠心分離に際して得られた、結果として生じる試料沈澱は、総核酸、負に荷電したタンパク質、および陽イオン性界面活性剤カトリモックス(Catrimox)(商標)の非水溶性沈澱であった。沈澱は総血液製剤夾雑物を洗浄された。沈澱に水5mLを添加し、および試料を迅速にボルテックスした。チューブを次いで3000xgにて10分間再び遠心分離し、および上清をデカントして、よりきれいな沈澱を得た。
血液3mLがドナーからテンパス(Tempus)(商標)チューブへ採取され、<25℃で混合した。製造元の指示にしたがった。試料を50mLチューブにデカントし、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)3mLで希釈し、およびボルテックスして混合し、次いで2000xgにて30分間4℃にて遠心分離した。
血液3mLがドナーから、テンパス(Tempus)(商標)安定化剤約6mLを含むテンパス(Tempus)(商標)チューブへ採取され、<25℃で混合した。試料を約2時間室温にてインキュベートした。試料を次いで50mLチューブへとデカントし、および95%エタノール3mLを添加して総体積約12mLを得た。試料を約120秒間ボルテックスし、および次いで6000xgにて30〜60分間遠心分離した。上清をデカントし、およびチューブを約120秒間上下逆にして細胞沈殿を乾燥させた。
全血 3mL
テンパス(Tempus)(商標)チューブ安定化剤 6mL
希釈剤 3mL
Claims (54)
- (a)陽イオン性界面活性剤を用いて安定化されている被験試料から得られる沈殿をpH7ないし9の緩衝剤、塩基、及び両親媒性試薬を含む可溶化溶液を用いて可溶化し、混合物を得ること;
(b)溶解溶液が3〜10Mの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、7より大きいpHに緩衝された溶解溶液と前記混合物を接触させて単離試料を作製すること;
(c)単離試料中のRNAを含む核酸が固相担体へ結合するように、単離試料を固相担体と接触させること;
(d)固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、RNAを含む結合した核酸以外の物質を除去すること;および
(e)RNAを得るために、結合したRNAを固相担体から溶出すること
を含む、RNAを含む被験試料からRNAを単離するための方法。 - (a)陽イオン性界面活性剤を用いて安定化されている被験試料から得られる沈殿をpH7ないし9の緩衝剤、塩基、及び両親媒性試薬を含む可溶化溶液を用いて可溶化し、混合物を得ること;
(b)溶解溶液が3〜10Mの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、7より大きいpHに緩衝された溶解溶液と前記混合物を接触させて単離試料を作製すること;
(c)単離試料を、(1)緩衝剤、リチウム塩、および両親媒性試薬を含む結合溶液、または(2)リチウム塩およびアルコールを含む洗浄溶液のどちらかと接触させて結合試料を作製すること;
(d)結合試料中のDNAを含む核酸が固相担体へ結合するように、結合試料を固相担体と接触させること;
(e)固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、DNAを含む結合した核酸以外の物質を除去すること;および
(f)DNAを得るために、結合したDNAを固相担体から溶出すること
を含む、DNAを含む被験試料からDNAを単離するための方法。 - 可溶化溶液中の緩衝剤がトリスHClである、請求項1または2の方法。
- 可溶化溶液中のトリスHClが10から20mMの濃度で存在する、請求項3の方法。
- 可溶化溶液中の塩基が、20から50mMの濃度で存在するトリス塩基である、請求項1または2の方法。
- 可溶化溶液中の両親媒性試薬が洗浄剤である、但し、前記洗浄剤は、ツイーン(Tween)類、トリトン(Triton)類、テルジトール(Tergitol)、ノニデット(Nonidet)及びイゲパール(Igepal)からなる群から選択される、請求項1から5の何れか1項に記載の方法。
- 可溶化溶液がさらにキレート剤を含む、請求項1または2の方法。
- 可溶化溶液中のキレート剤がエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)である、請求項7の方法。
- 可溶化溶液中のEDTAが1から20mMの濃度で存在する、請求項8の方法。
- (a)被験試料を、グアニジウム化合物と、およびアルコールと接触させ、混合物を得ること;
(b)前記混合物を遠心分離して、粗溶解物沈澱および上清を生じること;
(c)上清を除去すること;
(d)溶解溶液が3〜10Mの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、7より大きいpHに緩衝された溶解溶液と粗溶解物沈殿を接触させて単離試料を作製すること;
(e)単離試料中のRNAを含む核酸が固相担体へ結合するように、単離試料を固相担体と接触させること;
(f)固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、RNAを含む結合した核酸以外の物質を除去すること;および
(g)RNAを得るために、結合したRNAを固相担体から溶出すること
を含む、RNAを含む被験試料からRNAを単離するための方法。 - 前記被験試料が血液試料である、請求項10に記載の方法。
- 溶解溶液中の緩衝剤がトリス−HClであり、溶解溶液のpHが少なくとも8であり、溶解溶液中の緩衝剤のpKaが少なくとも8であり、溶解溶液中の緩衝剤が50から150mMの濃度で存在し、並びに/または溶解溶液中の両親媒性試薬が洗浄剤および/もしくは界面活性剤である、但し、前記洗浄剤は、ツイーン(Tween)類、トリトン(Triton)類、テルジトール(Tergitol)、ノニデット(Nonidet)及びイゲパール(Igepal)からなる群から選択される、請求項1から11の何れか1項に記載の方法。
- 溶解溶液が塩基をさらに含む、請求項1から12の何れか1項に記載の方法。
- 溶解溶液中のリチウム塩が塩化リチウムまたは臭化リチウムである、請求項1から13の何れか1項に記載の方法。
- 溶解溶液中の両親媒性試薬が、一つ以上の洗浄剤および/または一つ以上の界面活性剤の組み合わせである、但し、前記洗浄剤は、ツイーン(Tween)類、トリトン(Triton)類、テルジトール(Tergitol)、ノニデット(Nonidet)及びイゲパール(Igepal)からなる群から選択される、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 溶解溶液がさらに、キレート剤を含む、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 溶解溶液中のキレート剤が1から100mMの濃度で存在する、請求項16に記載の方法。
- 溶解溶液中のキレート剤がEDTAまたはCDTAである、請求項16または17に記載の方法。
- 試料を、プロテイナーゼKを含むプロテイナーゼK溶液と接触させることをさらに含む、請求項1から18の何れか1項に記載の方法。
- プロテイナーゼKが10から25mg/mlの濃度で存在する、請求項19に記載の方法。
- 結合溶液中の緩衝剤が、pH少なくとも7のトリス緩衝剤である、請求項2に記載の方法。
- 結合溶液中のトリス緩衝剤が50から150mMの濃度で存在する、請求項21に記載の方法。
- 結合溶液がさらに、結合溶液のpHを7以上に調整するための塩基を含む、請求項22に記載の方法。
- 塩基がアルカリ金属水酸化物である、請求項13又は23に記載の方法。
- アルカリ金属水酸化物が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムである、請求項24に記載の方法。
- 結合溶液中のリチウム塩が、塩化リチウムまたは臭化リチウムである、請求項2及び21から25の何れか1項に記載の方法。
- 結合溶液中のリチウム塩が5から15Mの間の濃度で存在する、請求項2及び21から26の何れか1項に記載の方法。
- 結合溶液中の両親媒性試薬が洗浄剤および/または界面活性剤である、但し、前記洗浄剤は、ツイーン(Tween)類、トリトン(Triton)類、テルジトール(Tergitol)、ノニデット(Nonidet)及びイゲパール(Igepal)からなる群から選択される、請求項2及び21から27の何れか1項に記載の方法。
- 界面活性剤がジエチレングリコールモノエチルエーテル(DGME)である、請求項12又は28に記載の方法。
- 洗浄剤および/または界面活性剤が5から15%の濃度で存在する、請求項6、12、28及び29のいずれか1項に記載の方法。
- 結合溶液中の両親媒性試薬が、一つ以上の洗浄剤および/または一つ以上の界面活性剤の組み合わせである、但し、前記洗浄剤は、ツイーン(Tween)類、トリトン(Triton)類、テルジトール(Tergitol)、ノニデット(Nonidet)及びイゲパール(Igepal)からなる群から選択される、請求項2及び21から30の何れか1項に記載の方法。
- 一つ以上の洗浄溶液が50%より大きい濃度でアルコールを含む、請求項1から31の何れか1項に記載の方法。
- 一つ以上の洗浄溶液中のアルコールがエタノールまたはメタノールである、請求項32に記載の方法。
- 第一の洗浄溶液(洗浄溶液I)が濃度4から10Mのアルカリ金属塩を含む、請求項1から33の何れか1項に記載の方法。
- 洗浄溶液I中のアルカリ金属塩がナトリウムまたはリチウム塩である、請求項34に記載の方法。
- 洗浄溶液Iがさらに濃度25から80%のアルコールを含む、請求項34又は35に記載の方法。
- 第二の洗浄溶液(洗浄溶液II)が、6ないし8のpHでの緩衝剤および濃度50から90%のアルコールを含む、請求項1から36の何れか1項に記載の方法。
- 洗浄溶液II中の緩衝剤が濃度50から150mMのトリス−HClである、請求項37に記載の方法。
- 洗浄溶液IIがキレート剤をさらに含む、請求項37又は38に記載の方法。
- 洗浄溶液II中のキレート剤が濃度1から20mMのEDTAまたはCDTAである、請求項39に記載の方法
- 一つ以上の洗浄溶液が、濃度10から50%でアルコールを、濃度2から5Mでアルカリ金属塩を、および濃度25から100mMでキレート剤を含むDNA分解酵素洗浄溶液である、請求項1または10に記載の方法。
- アルコールがエタノールまたはメタノールである、請求項36、37又は41に記載の方法。
- DNA分解酵素洗浄溶液中のキレート剤がEDTA、CDTAまたはクエン酸塩である、請求項41又は42に記載の方法。
- DNA分解酵素洗浄溶液中のアルカリ金属塩がリチウム塩である、請求項41から43の何れか1項に記載の方法。
- リチウム塩が塩化リチウムまたは臭化リチウムである、請求項35又は44に記載の方法。
- 固相担体が、シリカ、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、またはポリフッ化ビニリデン、またはその組み合わせの成分を含む、請求項1から45の何れか1項に記載の方法。
- 生物材料を固相担体と接触させる前に、固相担体がRNA分解酵素溶液で前処理される、請求項2に記載の方法。
- 段階(a)におけるアルコールが、エタノールまたはメタノール、もしくはメタノールおよびエタノールの組み合わせである、請求項10又は11に記載の方法。
- 段階(a)におけるアルコールが、30%ないし100%の濃度で存在する、請求項10に記載の方法。
- 段階(a)におけるアルコールが、70%ないし95%の濃度で存在する、請求項10に記載の方法。
- グアニジウム化合物が塩酸グアニジンを含む処方である、請求項10に記載の方法。
- (a)試料を第一および第二のチューブに分けること;
(b)請求項1の方法にしたがって、第一のチューブ中の試料からRNAを単離すること;および
(c)請求項2の方法にしたがって、第二のチューブ中の試料からDNAを単離すること
を含む、DNAおよびRNAの両方を試料から単離するための方法。 - (a)陽イオン性界面活性剤を用いて安定化されている試料から得られる沈殿をpH7ないし9の緩衝剤、塩基、及び両親媒性試薬を含む可溶化溶液で可溶化し、混合物を得ること;
(b)混合物を第一および第二のチューブに分けること;
(c)下記を含む方法にしたがって、第一のチューブ中の混合物からRNAを単離すること
(i)溶解溶液が3〜10Mの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、7より大きいpHに緩衝された溶解溶液と試料を接触させて単離試料を作製すること;
(ii)単離試料中のRNAを含む核酸が固相担体へ結合するように、単離試料を固相担体と接触させること;
(iii)固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、RNAを含む結合した核酸以外の物質を除去すること;および
(iv)RNAを得るために、結合したRNAを固相担体から溶出すること;および
(d)下記を含む方法にしたがって、第二のチューブ中の混合物からDNAを単離すること
(i)溶解溶液が3〜10Mの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、7より大きいpHに緩衝された溶解溶液と混合物を接触させて単離試料を作製すること;
(ii)単離試料を、(1)緩衝剤、リチウム塩、および両親媒性試薬を含む結合溶液、または(2)リチウム塩およびアルコールを含む洗浄溶液のどちらかと接触させて結合試料を作製すること;
(iii)結合試料中のDNAを含む核酸が固相担体へ結合するように、結合試料を固相担体と接触させること;
(iv)固相担体を一つ以上の洗浄溶液で洗浄して、DNAを含む結合した核酸以外の物質を除去すること;および
(v)DNAを得るために、結合したDNAを固相担体から溶出すること
を含む、DNAおよびRNAの両方を試料から単離するための方法。 - 別々に包装された
(a)pH7〜9の緩衝剤、塩基、及び両親媒性試薬を含む可溶化溶液;
(b)3〜10Mの濃度のリチウム塩、緩衝剤及び両親媒性試薬を含むが、グアニジウム塩および尿素を含まない、7より大きいpHに緩衝された溶解溶液;
(c)4〜10Mの濃度のアルカリ金属塩を含む洗浄I溶液または緩衝剤、リチウム塩及び両親媒性試薬を含む結合溶液;
(d)pH6ないし8の緩衝剤及50〜90%の濃度のアルコールを含む洗浄II溶液;および
(e)RNA、DNA、または両方の試料からの単離のための手順書
を含むパッケージを含む、RNA、DNAまたは両方を単離するためのキットであって、請求項1から55の何れか1項に記載の方法に用いるためのキット。
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