CN1856570A - 使用经过加工的临床样品通过涂片显微镜检术、培养和聚合酶链式反应诊断结核的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及加工临床样品以便通过涂片显微镜检术、培养或PCR诊断细菌性感染的方法和用于实施该方法的试剂盒。本发明还涉及两组对结核分枝杆菌的DevR基因具有特异性的引物以及使用所述引物通过PCR筛选结核病患者的方法。
Description
技术领域
本申请描述了一种用于细菌性感染(包括结核)的多用途诊断方法学,其包括加工临床样品和将所加工的材料用于涂片显微镜检术(smearmicroscopy)、培养和聚合酶链式反应。该方法学可以应用于所有类型的肺结核和肺外结核(extra pulmonary tuberculosis)。
本发明的背景和现有技术参考
在印度和东南亚,结核比任何其它传染性疾病都造成更多的人死亡——超过HIV、STD、疟疾和热带病的组合。在印度,每天有超过1千人会死于TB——每年超过450,000人,每分钟超过1人。快速诊断结核对于提高治愈率、减少该疾病通过肺部途径扩散的危险、和对抗目前出现的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的抗药性菌株以及该疾病在HIV感染患者中的严重牵连问题,变得日益重要。导致该疾病的生物体是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。该生物的特征为:生长缓慢和存在独特的富含脂质的细胞壁,该细胞壁使得其可以不受到常规抗生素和裂解方法的作用的影响。该细胞壁的耐酸性质被应用于通过涂片显微镜检术快速检测临床样品中结核分枝杆菌和其它分枝杆菌的存在。
至今,涂片显微镜检术由于简单、快速、费用低以及对仪器及技术的要求最少,是目前全世界所用的所有实验室诊断结核的方法中最为流行的方法。然而,该方法缺乏灵敏度——为了通过Ziehl Neelsen染色从浓缩的样品获得阳性报告,要求大约10,000个生物/ml的样品载量(Kent和Kubica,1995)。一种同样简单但更灵敏的涂片显微镜检术对于实验室诊断将是高度有用的。培养被认为是金标准,但是考虑到该病原体缓慢的生长速率,仅仅依赖于培养将总是导致确定诊断结果的获得被延迟4-6周。除了肺结核,肺外结核由于其涉及广泛的器官并且在送至诊断实验室的样品中少菌型(paucibacillary)细菌载量,也是一项巨大的诊断挑战。
核酸扩增技术由于提供了灵敏、特异而快速的替代性结核诊断方法而受到拥护。这些方法在不小的程度上受到其不能够从所有类型的临床材料中分离出足量的PCR可扩增的分枝杆菌DNA的限制。就我们所知,目前尚没有可普遍应用于所有类型的临床材料上的、使用利于环境的试剂进行的DNA分离方法。这为DNA扩增技术在临床材料上的应用构成了一个十分实际而严重的障碍。
与此背景相对,一种通用方法学已经被开发出来,该方法学包括独特的样品加工技术,该技术单独可以和最常用的实验室TB诊断方法——涂片显微镜检术、培养和PCR——相容。在肺结核和肺外结核的情况下,该方法学可以应用于除了粪便物之外的所有临床材料类型。该方法利用分枝杆菌细胞壁的独特性质选择性地除去外来物质、污染性生物及潜在的PCR抑制性物质并同时对结核分枝杆菌的耐酸性、生存力和完整性不造成不利影响。盐酸胍的离液(chaotropic)性质与去污剂和中性pH缓冲液联合用于此目的。
涂片显微镜检术和培养是全球最广泛使用的实验室结核诊断技术。近年来,基于核酸的技术,尤其是PCR,也被用作辅助检验以便在合理的时间期限实现确诊。就我们所知,对于涂片显微镜检术、培养和PCR,已经公开的技术和商业试剂盒及它们的缺点如下:
涂片显微镜检术和培养:用于结核分枝杆菌的涂片显微镜检术和培养的样品的制备方法,涉及使用4%NaOH;0.5%NALC和2%NaOH(3%NaOH被推荐用于具有高度潮湿气候的热带国家);二硫苏糖醇(DTT)和2%NaOH;13%含有或不含有苯扎氯铵(benzalkonium chloride)的磷酸三钠(Zephiran);5%草酸;1%十六烷基氯化吡啶和2%NaCl。(Koneman等,1997)。家庭用漂白剂(NaOCl)也已经用于痰的液化处理和涂片的制备。这需要过夜沉淀和从沉淀物制备涂片。在埃塞俄比亚和印度进行的3项研究中,利用NaOCl方法使耐酸性杆菌阳性的样品数量增加了100%以上(Gebre等,1995)。
但是一些研究证实,尽管漂白沉淀可以增加诊断率,但是这仅仅只达到微小的程度(Van Deun等,2000)。这些方法的基本目的均是旨在对样品进行液化和净化,并已最广泛地应用于痰样品。NALC和DTT是有效的粘液溶解剂但是价格高。净化剂如NaOH和磷酸三钠需要小心地控制暴露时间。Zephiran需要用卵磷脂中和并且与在基于卵的培养基上的接种不相容。(Koneman等,1997)。
近来,描述了一种使用C18-羧基丙基甜菜碱(CB-18TM)——一种兼性离子去污剂——加工呼吸道样品以检测分枝杆菌的方法。该方法涉及弱碱性消化样品和用CB-18TM处理并随后孵育2-24小时、离心和AFB涂片检查。对于结核分枝杆菌的培养,指定一个单独的方案,其中联合使用三种分解酶和CB-18TM,该方案增加了费用。最初的研究显示,与NALC-NaOH方法相比,该方法使总的(aggregate)涂片灵敏度和培养灵敏度分别增加大约58%和43%(Thornton等,1998)。
在近来的一份关于CB-18TM方法与NALC-NaOH法比较的报道中,前一方法显示出59.6%的涂片灵敏度,该灵敏度稍后在对该方案进行改进时增加至71.4%(Scott等,2002)。应当注意,通过该方法加工的样品与在液体培养基中的培养是
不相容的。此产品由Quest DiagnosticsIncorporated,Baltimore,USA以CB-18TM涂片试剂盒及CB-18TMTB培养试剂盒和Lytic Decon II的形式市场销售。
近来已经描述了使用壳多糖消化痰中的粘液的另一方法,该方法涉及在痰中添加壳多糖溶液、通过涡旋或振荡进行匀浆、以单位重力沉淀30分钟和从沉淀物制备涂片。这仅适于从痰实施的涂片显微镜检术。该方法的灵敏度估计为80%,特异性为96.7%(Farnia等,2002)。未评价该方法在培养中的应用。
另一最近出版的方法描述了使用酚和硫酸铵的组合(PhAS)来液化痰。但这需要过夜沉淀,并且因为该方法杀死分枝杆菌故不适用于培养。该方法的灵敏度和特异性分别为85%和97%(Selvakumar等,2002)。
直接的涂片方法(利用ZN和/或金胺染色)的灵敏度在不同的实验室设置下在40%至85%范围变动。浓缩步骤的包括使得该直接涂片方法的灵敏度由54-57%增加至63-80%(Bruchfeld等,2000;Garay等,2000)。此CDC方法显示出大约66至83%的灵敏度水平(Scott等,2002,Farnia等,2002,我们的研究)。据报道,离心步骤(4000g,15分钟)的包括使得可以通过涂片显微镜检术和培养分别检测到≥5000和500个生物体/ml(Perera等,1999)。然而,其它的报道提示,痰的液化和浓缩并未提高涂片显微镜检术的总体诊断灵敏度(Wilkinson等,1997)。已经提议,使用荧光显微镜检术可以极大地提高痰涂片——尤其是在可能被ZN染色涂片遗漏的具有低杆菌密度的样品中——的诊断价值(Githui等,1993)。然而,荧光显微镜检术将造成费用的增加。
目前可获得的培养分枝杆菌的自动和半自动***:诊断TB的最灵敏但是耗时的方法是培养病原体。在国际市场上有几种液体和固体培养基可用于此目的。由于为了获得结论性的结果在诸如Lowenstein-Jensen的培养基或其它固体培养基中的生长需要至少4-6周,故使用放射性材料或氧淬灭和氧化还原剂的液体培养***因其良好的速度和灵敏度已经被推行。这些***均需要已经通过NALC-NaOH处理而净化的呼吸道样品。基于这些原理的、最广泛使用的结核分枝杆菌培养试剂盒是:1)BACTEC460 TB(Becton Dickinson Diagnostic Instruments,Sparks,MD)。其通过放射性测量术检测CO2的消耗。2)MB/BacT(Organon TeknikaCorporation,Durham NC)。其通过比色法检测CO2的消耗。3)ESP Myco***(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)。其检测气压的改变。4)分枝杆菌生长指示管(Mycobacterial Growth Indicator Tube,MGIT):Becton Dickinson,Cockeysville,MD)。其通过氧敏感性荧光传感器检测氧的消耗。5)Septi-Check AFB***(BBL):通过直观观察来检测菌落。所有以上***均使用液体培养基、(除了Septi-Check,其是具有液体和固体培养基的双相***)生长补充物、抗生素,并涉及复杂技术。除了Septi-Check AFB***,其它***均是自动化的,可以早在5-7天获得结果。但是,使用这些自动化***不可以研究生长的细胞的菌落形态,而且污染物的缺乏不得不通过实施阳性培养物的AFB染色来加以验证。这些***非常昂贵,不合适地方病流行的国家,如印度。此外,放射测量检测具有生物学危险性。
DNA分离和内部使用(in-house)PCR——已经描述了多种旨在分离PCR可扩增的结核分枝杆菌DNA的内部使用方法。但是目前还没有单一一个方法(a)与从临床样品进行的涂片显微镜检术、培养和DNA分离均相容并(b)适于所有的肺样品和肺外样品类型。所有这些方法均要求用粘液溶解剂(NALC或DTT)预先处理痰样品以及/或者使用NaOH净化,并且不变地涉及使用有机溶剂和酶。就我们所知,分离DNA的最流行方法如下:
1.酚氯仿法:NALC-NaOH处理的痰样品进一步用分解酶和有机溶剂处理,之后用十六烷基三甲基溴化铵处理和用异丙醇进行DNA沉淀。(Singh等,2000)。
2.去污剂法:用溶菌酶消化NALC-NaOH处理的痰沉淀物。通过55℃加热,利用去污剂和蛋白酶K获得DNA。(Perera等,1994)。
3.Chelex 100树脂和去污剂法:利用DTT液化的痰通过添加15%Chelex、0.1%SDS、1%NP40和1%T20并100℃加热30分钟进行DNA提取(de Lamballerie等,1992)。我们的研究证实,SDS抑制PCR而且TritonX-100比NP40可以提供更高的裂解作用(Chakravorty和Tyagi,2001)。Chelex 100树脂也已经用于从肺外样品分离结核分枝杆菌DNA(Walsh等,1991)。
4.在异硫氰酸胍(GITC)存在下裂解结核分枝杆菌和在二氧化硅上捕获DNA:用NALC-NaOH处理痰、支气管洗液、脓和胸腔积液并离心。CSF和尿直接离心。匀浆组织并用蛋白酶K-SDS处理12-16小时。通过加入GITC二氧化硅悬浮液并80℃加热以诱导裂解,之后混合以结合DNA、洗涤二氧化硅颗粒并在水中洗脱。该方法是麻烦的,涉及毒性GITC,加工组织时花费更长时间并且要求酶促消化,此外仅开发用于分离DNA(Noordhoek等,1995)。
5.本发明的发明人先前已经公开了一种从肺和肺外样品获得PCR可扩增的、无抑制剂的结核分枝杆菌DNA的方法。该方法尽管简单快捷并有效,但是使用毒性试剂GITC、要求NALC处理,且未评价其与涂片显微镜检术和培养的相容性(Chakravorty和Tyagi,2001)。
商业核酸检测试剂盒
就我们所知,在国际市场上,可以获得以下利用结核分枝杆菌DNA或RNA的扩增的诊断试剂盒。这些试剂盒使用不同的扩增技术(PCR、TMA、SDA和LCR)。它们需要用NALC-NaOH(CDC方法)预先处理的呼吸道或非呼吸道样品。
1.AMPLICORMicrowell Plate和COBAS AMPLICORTM分析仪自动PCR试验。(Roche Molecular Systems,USA)。AMPLICORMTB试验是一种基于PCR的***,其检测具有AFB(耐酸性杆菌)阳性涂片结果的未治疗患者中的结核分枝杆菌。快速鉴定:1天,定性试验。
COBAS AMPLICORTM分析仪是实施聚合酶链式反应(PCR)试验过程的扩增和检测步骤的台式自动***。其利用将5种仪器(热循环仪、自动移液器、温育器、洗涤器和读数器)合而为一的单一仪器。
2.Amplified Mt Direct Test(AMTDT I)和AMTDT II(Gen-Probe,USA)。AMTDT以等温扩增16S rRNA基因的582bp片段为基础用于检测结核分枝杆菌。该***使用TMA方法通过DNA中间体扩增rRNA,之后利用吖啶-酯(acridinium-ester)标记的DNA探针通过化学发光检测扩增子。其涉及使用两种酶(逆转录酶和RNA聚合酶)和超声波仪制备样品。它是被FDA批准用于AFB涂片阳性样品的第一个试剂盒。
3.LCx Mtb试验(Abbott Laboratories,USA)。该试验以连接酶链式反应扩增分枝杆菌中编码蛋白质抗原b的染色体基因的片段为基础。样品制备过程为:两次洗涤和离心除去抑制剂、90℃加热10分钟杀死分枝杆菌和超声裂解细胞。使用两种酶(聚合酶、连接酶)扩增后,通过Micro-particle Enzyme Immunoas say(MEIA)自动分析仪检测靶物质。
4.BDProbeTec(Becton Dickinson,USA)。BDProbeTec技术基本上由以下步骤组成:(i)加热NALC-NaOH处理的样品,(ii)净化,(iii)扩增(SDA),(iv)杂交和(v)检测。通过锆珠和二氧化硅加上在Lysolyzer仪(Becton Dickinson)中高温孵育,机械破碎分枝杆菌细胞壁。随后的破碎利用另一仪器,FastPrep仪(Bio 101,Vista,USA)。然后,使用完全自动化的BDProbeTec仪分析样品,即,扩增和杂交。产物通过与BDProbeTec仪一起提供的分光光度计进行检测。
总之,这些商业技术十分复杂、昂贵,包括高的运转费用,一般不适用于发展中国家。这些国家也恰好是最为需要价廉、快速且有效的诊断试验的高发病率国家。
两种最常用的涂片显微镜检术方法是直接涂片检查(Akhtar等,2000)和CDC,Atlanta,U.S.A.推荐的浓缩方法(Koneman等,1997)。这些方法的缺点列举如下:
目前的涂片显微镜检术方法的缺点
直接涂片检查的缺陷:
1.该方法尽管非常快速且相对容易,然而缺乏灵敏度。检测下限为大约10,000个耐酸性杆菌(AFB)/ml痰(Kent和Kubica,1995)。
2.该方法涉及收集痰的含脓部分以便获得最佳结果。这就需要正确地训练技术人员鉴别含脓部分,未成功收集该部分可能导致即使从含有>10,000个AFB/ml的痰样品也会获得假阴性涂片报告。
3.直接涂片方法优选含脓的“理想”痰样品。带有鼻因排出物或唾液的样品尽管可能含有可检测水平的AFB,也不被鼓励使用。
4.由于处理的是痰的含脓部分,故存在涂片可能过厚而不适于涂片显微镜检术的可能性。即使使用适当涂布的载玻片,由于痰中存在的粘液、蛋白质和组织/细胞碎屑而导致的复染也常常妨碍对载玻片的正确阅读。
5.该方法主要用于痰样品。
涂片检查的浓缩方法(NALC-NaOH法)的缺点:
1.该方法尽管处理整个痰样品,但是涉及昂贵试剂NALC。
2.该试剂需要每次在样品处理前新鲜制备。
3.该方法被开发出发仅仅广泛地用于痰样品。
4.对于少菌型(paucibacillary)样品,涂布仅仅一或两环浓缩样品并不总是允许在涂片上存在可检测水平的AFB。
目前培养方法的缺点
在固体和液体培养基上培养前,临床样品常规地进行净化以除去分枝杆菌以外的生物体。由于分枝杆菌生长缓慢而且培养物会被更快速生长的污染性生物淹没,故这是必需的。最普遍使用的净化方法使用2-3%NaOH以及粘液溶解剂NALC。
1.CDC方法(NALC/NaOH法)利用NaOH作为净化剂,而NaOH需要完全地被中和。不如此做将使得样品不适于培养。
2.该方法被开发出来广泛地用于痰样品。
3.使用2%NaOH的净化作用不是总是适合具有潮湿气候的热带国家,在这些国家推荐使用3%NaOH,而这会由于毒性作用导致极小化活分枝杆菌回收率(Krasnow和Wayne,1966)。
目前所用的用于分枝杆菌PCR的DNA分离方法的缺点:
1.目前没有可以从所有类型的肺和肺外样品分离分枝杆菌DNA的通用方法。
2.大多数DNA分离方法涉及危险的有机试剂或昂贵的酶。
3.没有保证从所有类型的临床样品分离到无PCR质量抑制剂的分枝杆菌DNA的且有利于环境的方法。
本发明的目的
本发明的主要目的是开发一种经济有效地加工可用于简单、快速、安全、灵敏和准确地诊断结核病及一些***感染的临床样品的方法。
本发明的另一主要目的是开发涂片、培养或聚合酶链式反应(PCR)(使用PCR可扩增的分枝杆菌DNA和RNA)起始材料形式的经加工样品。
本发明的再一目的是开发一组可用于筛选结核病患者的引物。
本发明的再一目的是开发经加工的临床样品。
本发明的再一目的是开发一种单独包括了样品加工和最常见的实验室TB诊断方法(即,涂片显微镜检术、培养和PCR/RT-PCR)的单一方法学。
本发明的再一目的是开发一种对于结核的肺和肺外情况而言可用于所有类型的临床材料而不仅仅是用于痰的方法学。
本发明的再一目的是使得可以从具有极少细菌载量的样品显微镜观察AFB。
本发明的再一目的是开发一种非NaOH处理的净化方法,该方法可以避免样品中和的繁琐过程并且降低毒性。
再一目的是消除对NALC或其它昂贵粘液溶解剂的使用。
本发明的再一目的是可以广泛地应用于从所有分枝杆菌物种(包括机会病原体)鉴定、分离和扩增DNA。
本发明的再一目的是从各种肺和肺外样品分离无抑制剂的PCR可扩增DNA。
本发明的再一目的是在从临床材料分离干净的PCR可扩增DNA时避免使用有机溶剂和酶。
本发明的再一目的是在无毒且可以以有利于环境的方式安全使用的方法中使用离液剂。
本发明的再一目的是开发一种最少依赖于冷冻高速离心和复杂仪器的简单方法学。
本发明的再一目的是开发一种在操作中涉及最少的样品在管间的转移从而防止样品丢失的方法。
本发明的再一目的是开发一种与从临床样品分离分枝杆菌RNA相容的方法。
本发明的再一目的是开发一种用于诊断结核病的模块化技术(modular technology)。
本发明的再一目的是开发一种用于加工临床样品以鉴定疾病状况的高灵敏方法。
发明概述
本发明涉及一种有效且经济的加工临床样品的方法,所述临床样品可以用于简单、快速、安全、灵敏和准确地诊断细菌感染,该方法使用包含由通用样品加工(USP)溶液(由浓度3至6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度为0.1-0.3M的β-巯基乙醇组成)组成的溶液1、由浓度65-70mM且pH 6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2(可选择地,可以由无菌水代替)、和由浓度0.03-0.08%的Tween 80组成的溶液3、及用于分离DNA的包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B和包含浓度0.2-0.4%的Tween20的溶液C的组合物(任选地,可以使用单独溶液3或具有0.03-0.1%Triton X 100的溶液3替代溶液A、B和C从含高杆菌载量或低废料的样品分离DNA),所述方法包括步骤:向样品添加1.5至2体积溶液1并匀浆、向匀浆物添加溶液2或无菌水并离心得到沉淀、用溶液1再次洗涤沉淀(任选地,对于含有高废料(junk)的样品)、用水洗涤经溶液1洗涤后的沉淀、和将水洗后的沉淀重新悬浮在溶液3中获得形式适于通过涂片显微镜检术、培养和PCR实施标准诊断程序的经加工样品;本发明还涉及包含上述溶液和两组引物——第一组:分别是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的devRf2和devRr2以及第二组:分别是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的devRf3和devRr3——的试剂盒、以及使用所述引物通过聚合酶链式反应筛选结核病患者的方法。
发明详述
因此,本发明涉及一种有效且经济的临床样品加工方法,所述临床样品可以用于简单、快速、安全、灵敏和准确地诊断细菌感染,该方法使用包含由通用样品加工(USP)溶液(由浓度为3至6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度为40-60mM且pH为7.3-7.7的Tris-Cl、浓度为20-30mM的EDTA、浓度为0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度为0.1-0.3M的β-巯基乙醇组成)组成的溶液1、由浓度为65-70mM且pH为6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2(可选择地,可以由无菌水代替)、和由浓度0.03-0.08%的Tween80组成的溶液3、及用于分离DNA的包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B和包含浓度0.2-0.4%的Tween 20的溶液C的组合物(任选地,可以使用单独溶液3或具有0.03-0.1% Triton X 100的溶液3替代溶液A、B和C从含高杆菌载量或低废料的样品分离DNA),所述方法包括步骤:向样品添加1.5至2体积溶液1并匀浆、向匀浆物添加溶液2或无菌水并离心得到沉淀、用溶液1再次洗涤沉淀(任选地,对于含有高废料的样品)、用水洗涤经溶液1洗涤后的沉淀、和将水洗后的沉淀重新悬浮在溶液3中获得形式适于通过涂片显微镜检术、培养和PCR实施标准诊断程序的经加工样品;本发明还涉及包含上述溶液和两组引物——第一组:分别是SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的devRf2和devRr2以及第二组:分别是SEQID NO:3和SEQ ID NO:4的devRf3和devRr3——的试剂盒、以及使用所述引物通过聚合酶链式反应筛选结核病患者的方法。
在本发明的一个实施方案中,其中涉及一种有效且经济的临床样品加工方法,所述临床样品可以用于简单、快速、安全、灵敏和准确地诊断细菌感染,所述方法使用包含由通用样品加工(USP)溶液(由浓度为3至6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度为40-60mM且pH为7.3-7.7的Tris-Cl、浓度为20-30mM的EDTA、浓度为0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度为0.1-0.3M的β-巯基乙醇组成)组成的溶液1、由浓度为65-70mM且pH为6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2(可选择地,可以由无菌水代替)、和由浓度0.03-0.08%的Tween 80组成的溶液3、及用于分离DNA的包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B和包含浓度0.2-0.4%的Tween 20的溶液C的组合物(任选地,可以使用单独溶液3或具有0.03-0.1% Triton X 100的溶液3替代溶液A、B和C从含高杆菌载量或低废料的样品分离DNA),所述方法包括步骤:
·获得临床样品,
·将样品与1.5至2体积溶液1混合,
·匀浆混合物同时避免起泡,
·向匀浆物添加溶液2或无菌水并随后离心得到沉淀,
·取决于沉淀体积的减少,任选地用溶液1洗涤沉淀,
·用水洗涤经溶液1洗涤后的沉淀,和
·将水洗后的沉淀重新悬浮在溶液3中获得用于诊断的经加工样品。
在本发明另一实施方案中,其中经加工的样品可以以涂片、培养物或聚合酶链式反应(PCR)起始材料(使用PCR可扩增的分枝杆菌DNA和RNA)的形式使用。
在本发明再一实施方案中,其中所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度3-6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.3M的β-巯基乙醇。
本发明再一实施方案中,其中所述经加工样品可以用于分枝杆菌,包括结核分枝杆菌和革兰氏阳性生物如葡萄球菌属种(Staphylococcussp.)的涂片显微镜检术。
本发明另一实施方案中,其中要求匀浆持续20-120秒。
本发明另一实施方案中,其中溶液1的盐酸胍裂解真核和革兰氏阴性细胞、使蛋白质变性、液化样品和失活内源性酶。
本发明另一实施方案中,其中所述加工在总共1-2小时的持续时间内完成。
本发明再一实施方案中,其中所述方法产生无抑制剂的分枝杆菌DNA,该DNA可用于基于PCR诊断分枝杆菌疾病,包括TB和麻风病。
本发明另一实施方案中,其中用于仅仅加工培养和涂片样品的通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约4M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.1M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中用于加工培养、涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约5M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.2M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中用于仅加工涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.2M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中USP中的盐酸胍(GuHCl)、十二烷基肌氨酸钠和β-巯基乙醇以协同方式作用以实现对所有类型的临床样品的最佳加工。
本发明另一实施方案中,其中β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的存在适于粘液样痰样品的最佳加工。
本发明另一实施方案中,其中GuHCl以及β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的存在对于粘液脓性的痰样品的最佳加工是绝对必需的。
本发明另一实施方案中,其中对于含有血液的样品,GuHCl通过变性血红蛋白和从样品中除去该蛋白质而作为主要的抑制剂去除组分起作用。
本发明另一实施方案中,其中GuHCl作为临床样品的主要净化剂起作用。
本发明另一实施方案中,其中对于含有高杆菌载量和/或较低量废料的样品,PCR可扩增的分枝杆菌DNA可以通过在溶液3和/或0.03-0.1%Triton X 100存在下煮沸、借助简单的裂解作用而获得,而无需使用溶液A、B和C。
本发明另一实施方案中,其中所述经加工的样品无污染生物、蛋白质、酶和干扰性物质。
本发明另一实施方案中,其中在涂片显微镜检术下所述方法可以检测到大约300-400个杆菌/ml的样品。灵敏度(检测限)可以进一步通过将超过所建议的10%的经加工样品用于涂片显微镜检而增加。
本发明另一实施方案中,其中所述方法比常规直接涂片显微镜检方法具有增强大约30倍的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出97-99%的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出83-92%的特异性。
本发明另一实施方案中,其中所述方法显示出比涂片显微镜检术的CDC方法增加大约18%的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中所述方法显示比直接涂片方法增加大约30%的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出80-96%的阳性预测值。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出91-99%的阴性预测值。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出大约91%的诊断准确度。
本发明另一实施方案中,其中所述方法降低复染背景使得可以更好地观察载玻片、提高载玻片的分级(gradation)、并减少阅读载玻片的时间和劳动。
本发明另一实施方案中,其中所述方法比CDC方法更有效地进行样品的净化。
本发明另一实施方案中,其中在培养中,与未处理的微生物相比,所述方法导致微生物菌落延迟大约1周出现。
本发明另一实施方案中,其中在培养中所述方法显示出大约50%的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中所述方法比CDC方法更适于热带区域。
本发明另一实施方案中,其中在培养中所述方法在中性pH下运行。
本发明另一实施方案中,其中在PCR中所述方法显示出测试的任何临床样本类型对PCR试验均无抑制。
本发明另一实施方案中,其中在PCR中所述方法显示出96.5-100%的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中在PCR中所述方法显示出71-100%的特异性。
本发明另一实施方案中,其中在使用所述引物的PCR中所述方法显示出82-100%的阳性预测值。
本发明另一实施方案中,其中在使用所述引物的PCR中所述方法显示出94-100%的阴性预测值。
本发明另一实施方案中,其中在使用所述引物的PCR中所述方法显示出大约90-100%的诊断准确度。
本发明另一实施方案中,其中样品可以获自包含各种类型的痰的来源和其它体液,包括FNAC、脓、胸膜液、心包液、关节吸出物(jointaspirate)、腹膜液、脑脊髓液、子宫内膜吸出物、滑液、胃吸出物、气管内吸出物、尿、经气管吸出物、支气管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子;身体组织,包括血液、胸膜组织、骨髓和活检物;实体器官,包括***、骨、皮肤,和牛(bovine)样品,包括淋巴腺、乳汁和血液。
本发明另一实施方案中,其中可以加工在大约-20℃储存多达2个月的样品用于PCR、涂片显微镜检术和培养。
本发明另一实施方案中,其中在PCR中所述方法可以用于DNA和RNA。
本发明另一实施方案中,其中所述组合物显示出粘液溶解、净化、变性蛋白质、离液剂作用、液化、软化/消化组织以及释放分枝杆菌的作用。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法使得可以将更多的杆菌涂布在载玻片上,由此增加灵敏度和效力。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法一般地将通过直接方法分级为1+或极少的(scanty)载玻片分别转变为2+/3+或2+/1+。
本发明另一实施方案中,其中所述方法有助于加工缺少脓或含有鼻咽排出物和/或唾液和/或血液的痰样品。
本发明另一实施方案中,其中所述方法从组织活检样品产生适于非常灵敏的AFB涂片显微镜检术的高质量涂片。
本发明另一主要实施方案中,其中涉及一种有效且经济的加工临床样品的方法,所述临床样品可以用于简单、快速、安全、灵敏和准确地诊断分枝杆菌感染(尤其是由结核分枝杆菌引起的结核病),所述方法使用包含由通用样品加工(USP)溶液(由浓度为3至6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度为40-60mM且pH为7.3-7.7的Tris-Cl、浓度为20-30mM的EDTA、浓度为0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度为0.1-0.3M的β-巯基乙醇组成)组成的溶液1、由浓度为65-70mM且pH为6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2(可选择地,可以由无菌水代替)、和由浓度0.03-0.08%的Tween80组成的溶液3、以及用于分离DNA的包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B和包含浓度0.2-0.4%的Tween 20的溶液C(任选地,可以使用单独溶液3或具有0.03-0.1% Triton X 100的溶液3替代溶液A、B和C从含高杆菌载量或低废料的样品分离DNA)的组合物,所述方法包括步骤:
·获得临床样品,
·将样品与1.5至2体积溶液1混合,
·匀浆混合物同时避免起泡,
·向匀浆物添加溶液2并离心得到沉淀,任选地溶液2可以由无菌水替代,
·用溶液1洗涤沉淀,
·用水洗涤经溶液1洗涤后的沉淀,和
·将水洗后的沉淀重新悬浮在溶液3中获得用于诊断的经加工样品。
本发明另一实施方案中,其中所述经加工样品可以以涂片、培养物或聚合酶链式反应(PCR)起始材料(使用PCR可扩增的分枝杆菌DNA和RNA)的形式使用。
本发明另一实施方案中,其中所述经加工样品可以以涂片、培养物或聚合酶链式反应(PCR)起始材料的形式使用,其中可以通过煮沸的简单裂解作用获得PCR可扩增的分枝杆菌DNA。
本发明另一实施方案中,其中所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度为3-6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度为40-60mM且pH为7.3-7.7的Tris-Cl、浓度为20-30mM的EDTA、浓度为0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度为0.1-0.3M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中所述方法维持分枝杆菌和某些***的生存力。
本发明另一实施方案中,其中要求匀浆持续20-120秒。
本发明另一实施方案中,其中溶液1的盐酸胍裂解真核和革兰氏阴性细胞、使蛋白质变性、液化样品和失活内源性酶。
本发明另一实施方案中,其中所述加工在总共1-2小时的持续时间内完成。
本发明再一实施方案中,其中所述方法产生可用于基于PCR的诊断的、无抑制剂的分枝杆菌DNA。
本发明另一实施方案中,其中用于加工培养和涂片样品的通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约4M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.1M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中用于加工培养、涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含大约5M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.2M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中用于加工涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.2M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中所述组合物包含由通用样品加工(USP)溶液组成的溶液1、由浓度为65-70mM且pH为6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2、由浓度0.03-0.08%的Tween 80组成的溶液3、以及任选地,包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、和/或由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B、和/或浓度0.2-0.4%的Tween 20。
本发明另一实施方案中,其中溶液A、溶液B和溶液C的应用可以限于仅从低杆菌载量的样品中分离DNA。
本发明另一实施方案中,其中USP中的盐酸胍(GuHCl)、十二烷基肌氨酸钠和β-巯基乙醇以协同方式作用以便实现对所有类型的临床样品的最佳加工。
本发明另一实施方案中,其中β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的存在适于粘液样痰样品的最佳加工。
本发明另一实施方案中,其中GuHCl以及β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的存在对于粘液脓性痰样品的最佳加工是绝对必需的。
本发明另一实施方案中,其中对于含有血液的样品,GuHCl通过变性血红蛋白和从样品中除去该蛋白质而作为主要的抑制剂去除组分起作用。
本发明另一实施方案中,其中GuHCl作为临床样品的主要净化剂起作用。
本发明另一实施方案中,其中对于含有高杆菌载量和/或较低的废料含量的样品,PCR可扩增的分枝杆菌DNA可以通过在溶液3存在下煮沸和/或通过添加0.03-0.1% Triton X 100,经简单裂解而获得,而无需使用溶液A、B和C。
本发明另一实施方案中,其中所述经加工的样品无污染生物、蛋白质、酶和干扰性物质。
本发明另一实施方案中,其中在涂片显微镜检术下所述方法可以检测到300-400个杆菌/ml样品。灵敏度(检测限)可以进一步通过将超过所建议的10%的经加工样品用于涂片显微镜检而增加。
本发明另一实施方案中,其中所述方法比常规直接涂片显微镜检方法具有增强大约30倍的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出97-99%的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出83-92%的特异性。
本发明另一实施方案中,其中所述方法显示出比涂片显微镜检术的CDC方法增加大约18%的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中所述方法显示出比直接涂片法增加大约30%的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出80-96%的阳性预测值。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出91-99%的阴性预测值。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法显示出大约91%的诊断准确度。
本发明另一实施方案中,其中所述方法降低复染背景使得可以更好地观察载玻片、提高载玻片的分级(gradation)、并减少阅读载玻片的时间和劳动。
本发明另一实施方案中,其中所述方法比CDC方法更有效地进行样品的净化。
本发明另一实施方案中,其中在培养中所述方法显示出微生物的生存力是CDC方法的两倍。
本发明另一实施方案中,其中在培养中,与未处理的微生物相比,所述方法导致微生物菌落延迟大约1周出现。
本发明另一实施方案中,其中在培养中所述方法显示出大约50%的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中所述方法比CDC方法更适于热带区域。
本发明另一实施方案中,其中在培养中所述方法在中性pH下运行。
本发明另一实施方案中,其中在PCR中所述方法显示出测试的任何样本类型对PCR试验均无抑制。
本发明另一实施方案中,其中在PCR中所述方法显示微生物结核分枝杆菌的devR基因的两组引物,即,devRf2 & devRr2、和devRf3 &devRr3。
本发明另一实施方案中,其中引物devRf2和devRr2扩增微生物结核分枝杆菌devR基因的308bp片段。
本发明另一实施方案中,其中引物devRf3和devRr3扩增微生物结核分枝杆菌devR基因的164bp片段。
本发明另一实施方案中,其中在使用引物devRf2和devRr2的PCR中所述方法显示出比devRf和devRr增加2-4倍的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中在使用引物devRf3和devRr3的PCR中所述方法显示出比devRf和devRr增加至少10倍的灵敏度。
本发明另一实施方案中,其中样品可以获自包含各种类型的痰的来源和其它体液,包括FNAC、脓、胸膜液、心包液、关节吸出物(jointaspirate)、腹膜液、脑脊髓液、子宫内膜吸出物、滑液、胃吸出物、气管内吸出物、尿、经气管吸出物、支气管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子;身体组织,包括血液、胸膜组织、骨髓和活检物;实体器官,包括***、骨、皮肤,和牛样品,包括淋巴腺、乳汁和血液。
本发明另一实施方案中,其中可以加工在大约-20℃储存多达2个月的样品用于PCR、涂片显微镜检术和培养。
本发明另一实施方案中,其中在PCR中所述方法可以用于DNA和RNA。
本发明另一实施方案中,其中所述组合物显示出粘液溶解、净化、变性蛋白质、离液作用、液化、软化/消化组织以及释放分枝杆菌的作用。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法使得可以将更多的杆菌涂在载玻片上,由此增加灵敏度和功效。
本发明另一实施方案中,其中在涂片中所述方法一般地将通过直接方法分级为1+或极少的载玻片分别转变为2+/3+或2+/1+。
本发明另一实施方案中,其中可以加工缺少脓或含有鼻咽排出物或唾液的样品。
本发明另一实施方案中,其中所述方法从组织活检样品产生适于非常灵敏的AFB涂片显微镜检术的高质量涂片。
本发明另一实施方案中,其中所述方法对结核分枝杆菌的耐酸性质、生存力、和完整性未显示出不利影响。
本发明另一实施方案中,其中所述方法适于诊断肺结核和肺外结核且功效相同。
本发明另一实施方案中,其中所述方法与在固体和液体培养基中培养来自临床样品的分枝杆菌相容。
本发明另一实施方案中,其中对于通过涂片显微镜检术的直接方法和CDC方法已经检测为阴性的样品,所述方法可以将其检测为阳性。
本发明另一实施方案中,其中涉及可用于加工临床样品的试剂盒,所述临床样品可以用于简单、快速、安全、灵敏和准确地诊断微生物疾病状态,所述试剂盒包含由通用样品加工(USP)溶液组成的溶液1、由浓度为65-70mM且pH为6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2(可选择地,可以由无菌水代替)、由浓度0.03-0.08%的Tween 80组成的溶液3、包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、由浓度0.02-0.04%的TritonX-100组成的溶液B和由浓度0.2-0.4%的Tween 20组成的溶液C,任选地两组引物——分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的devRf2和devRr2引物和分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的devRf3和devRr3引物。
本发明另一实施方案中,其中所述试剂盒用于加工可以用于检测细菌感染的临床样品。
本发明另一实施方案中,其中所述试剂盒用于加工可以用于检测结核病的临床样品。
本发明另一实施方案中,其中所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度为3-6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度为40-60mM且pH为7.3-7.7的Tris-Cl、浓度为20-30mM的EDTA、浓度为0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度为0.1-0.3M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中用于加工培养和涂片样品的通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约4M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.1M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中用于加工培养、涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约5M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.2M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中用于加工涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH 7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.2M的β-巯基乙醇。
本发明另一实施方案中,其中所述组合物包含由通用样品加工(USP)溶液组成的溶液1、由浓度为65-70mM且pH为6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2(任选地,可以用无菌水代替)、由浓度0.03-0.08%的Tween 80组成的溶液3、以及任选地,包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、和/或由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B、和/或浓度0.2-0.4%的Tween 20。
本发明另一实施方案中,其中涉及一组分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的devRf2和devRr2引物。
本发明另一实施方案中,其中涉及一组分别具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的devRf3和devRr3引物。
本发明另一实施方案中,其中涉及使用基因devR的SEQ ID NO:1和2或SEQ ID NO:3和4的引物筛选结核病患者的方法,所述方法包括步骤:使用从受试者的经加工样品获得的结核分枝杆菌DNA或RNA实施聚合酶链式反应(PCR),鉴定患有结核的受试者。
本发明另一实施方案中,其中经加工的临床样品通过使用本文描述的方法加工临床样品而获得。
本发明另一实施方案中,其中样品可以获自包含各种类型的痰的来源和其它体液,包括FNAC、脓、胸膜液、心包液、关节吸出物(jointaspirate)、腹膜液、脑脊髓液、子宫内膜吸出物、滑液、胃吸出物、气管内吸出物、尿、经气管吸出物、支气管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子;身体组织,包括血液、胸膜组织、骨髓和活检物;实体器官,包括***、骨、皮肤,和牛样品,包括淋巴腺、乳汁和血液。
本发明另一实施方案中,其中所述方法包括新的通用样品加工(USP)溶液的应用。简单的说,USP方法包括在通过使用USP溶液处理的临床样品上实施的匀浆、液化和净化步骤、离心浓缩分枝杆菌的步骤和洗涤步骤。盐酸胍与还原剂和缓冲溶液中的试剂一起构成USP的活性成分。该离液剂盐酸胍有效地裂解真核细胞以及除了分枝杆菌外的大多数细菌,使蛋白质(包括粘蛋白)变性和由此造成痰的液化,以及失活内源性酶(包括DNase和RNase)。蛋白质、碎屑和其它污染物在随后的快速洗涤步骤中除去。分枝杆菌的独特细胞壁特性使得其可以选择性抵抗离液剂的作用,所得细菌适用于涂片显微镜检术、培养、PCR、RNA分离和利用由此分离的DNA和RNA的操作。整个样品加工过程可以在
至2小时内完成。该过程不涉及酚:氯仿抽提、蛋白质消化和沉淀步骤,使得该过程对于一次加工多个样品是理想的。该方法可应用于所有类型的体液、血液、组织活检物、来自脊椎骨和其它骨关节的活检物和CSF。也适用于加工牛来源的组织活检物和乳汁。对于痰以外的体液,离心浓缩后的USP溶液和水洗就足以满足涂片显微镜检术、培养、核酸分离和扩增的要求。组织样品需要在USP溶液中匀浆后才可以以正常方式继续加工。
经加工的样品直接用于涂片显微镜检术、固体培养基(例如Lowenstein Jensen(LJ)斜面培养基或Middlebrook 7H10琼脂培养基)或液体培养基(例如在MGIT***中使用的Middlebrook 7H9培养基)上的培养和提取DNA和RNA用于扩增分枝杆菌的DNA和RNA。
[此处描述的USP方法预期在结核病的快速诊断上具有极大的用途,因为其具有高灵敏度并且可应用于所有的临床材料类型上。该方法将使得可以正确地鉴定在利用较不灵敏的直接涂片方法时逃过鉴定的颇为可观的患者个体群,因此该方法可以在全球使用。此处描述的该方法学也与培养和PCR/RT-PCR检验相容。就我们所知,尚没有描述过或可以获得在所有类型的临床材料上使用单一技术用于涂片显微镜检术、培养和PCR/RT-PCR以实验室诊断结核病的方法学。
因此,明显地,本文描述的方法将可以用于要求从临床样品高灵敏地涂片显微镜检耐酸性杆菌、有效地净化用于培养的临床样品和分离用于PCR扩增的分枝杆菌和结核分枝杆菌的DNA的任何实验室。故其具有包括在TB/分枝杆菌诊断试剂盒中的潜力。所要求保护的该技术可以用于各种临床环境和实验室。它可以在具有最少仪器(光学显微镜和可以达到3000rpm速度的室温离心机)的实验室中用于涂片显微镜检术。它可以在具有用于分枝杆菌培养的附加设备的实验室中用于涂片显微镜检术和培养。最后,可以在高级实验室实施PCR和RT-PCR检验。]
本发明是一种通用样品加工和诊断方法学,可以应用于各种临床环境中针对任何临床样品类型实验室诊断结核病。其快速、价廉且容易,并与涂片显微镜检术、培养、DNA-RNA分离和PCR/RT-PCR相容。其达到四重目的:(i)为涂片显微镜检术检测结核分枝杆菌提供了一种极为灵敏的方法;(ii)制备用于固体或液体实验室培养基上培养的样品;(iii)分离无PCR抑制剂的DNA模板;和(iv)提供基于PCR的灵敏特异诊断试验。这些方法已经在临床样品上进行过评价。与直接涂片法的68.6%灵敏度和CDC方法的80%灵敏度相比,USP涂片显微镜检术显示出97-99%灵敏度。使用培养作为金标准时,‘短靶’PCR试验产生98.5%灵敏度而‘长靶’PCR试验显示73.2%灵敏度。就对于培养的有用性而言,USP方法与常规方法无显著性区别;对于USP和常规的培养方法,分别注意到50.1%和53.6%的阳性。因此,明显地,本文描述的方法可以用于操作含有结核分枝杆菌和MOTT杆菌的样品并要求从临床样品高灵敏地涂片显微镜检耐酸性杆菌、有效地净化用于培养的临床样品和分离用于PCR扩增的分枝杆菌和结核分枝杆菌DNA的任何实验室。故,其具有包括在TB/分枝杆菌诊断试剂盒中的潜力。
表的简述:
表1:与直接和CDC涂片方法相比,USP涂片显微镜检术对涂片状态的改善。
表2:与直接涂片方法相比,USP涂片显微镜检术对涂片状态的改善。
表3:USP溶液对结核分枝杆菌生存力的影响。
表4:使用不同引物对和结核分枝杆菌DNA比较devR PCR试验的灵敏度。
附图简述
图1显示USP溶液组成改变对痰样品加工的影响。
图2显示USP溶液组成改变对痰样品的涂片显微镜检的影响。
图3a显示在使用具有不同组成的USP溶液加工痰样品后获得的用于PCR的沉淀。
图3b显示从利用不同组成的USP溶液加工的痰样品获得的结核分枝杆菌DNA的IS6110 PCR扩增图。
图4显示USP溶液组成改变对痰中分枝杆菌的培养的影响。
图5a显示USP溶液对不同物理特征的痰的作用。
图5b显示USP溶液对代表性的组织活检样品的作用。
图6比较从分别利用USP、直接涂片法和CDC法加工的相同痰样品制备的涂片。
图7显示涂片显微镜检术的USP方法的耐酸性杆菌检测限。
图8显示涂片显微镜检术的USP方法将阴性样品转化为阳性。
图9显示与涂片显微镜检术的直接方法和CDC方法相比,涂片显微镜检术的USP方法增强了涂片状态。
图10显示USP溶液处理对结核分枝杆菌的生存力的影响。
图11显示用于扩增devR基因的引物。
图12显示利用从不同分枝杆菌提取的DNA和devRf3及devRr3引物获得的PCR扩增产物。
图13显示利用从不同分枝杆菌提取的DNA和devRf2及devRr2引物获得的PCR扩增产物。
图14显示使用靶向devR基因的三对不同引物PCR扩增分枝杆菌DNA的系列稀释物得到的扩增图谱。
图15比较使用溶液3、具有0.01% Triton X-100的溶液3和裂解剂(溶液A、B和C)裂解从痰分离的PCR可扩增的结核分枝杆菌DNA。
图16显示USP处理的非结核分枝杆菌的分枝杆菌(MOTT)的涂片显微镜检。
图17显示USP处理后对MOTT杆菌的培养。
图18显示从USP处理的MOTT杆菌分离的DNA的扩增。
图19显示利用从痰分离的结核分枝杆菌RNA进行的RT-PCR反应。
图20显示USP处理的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的涂片显微镜检。
数据集的简述:
数据集1:相对于直接涂片法,评价USP涂片法。
数据集2:相对于涂片显微镜检术的CDC方法,评价USP方法。
数据集3:使用‘短靶’和‘长靶’devR PCR的PCR灵敏度和特异性以及与基于IS6110的PCR试验的比较。
数据集4:通过USP法加工的肺外样品的涂片显微镜检和培养状态。
数据集5:devR-短靶PCR对于肺外样品的灵敏度和特异性值(%)。
数据集6:IS6110 PCR对于肺外样品的灵敏度和特异性值(%)。
发明详述:
开发了一种多用途方法用于通过涂片显微镜检术、培养和PCR实验室诊断结核。该方法十分突出地适于制备用于高灵敏显微镜检术的涂片。其可以有效地净化样品从而使样品适于培养,并可以产生无抑制剂的高质量分枝杆菌DNA用于基于PCR的诊断试验中。该方法还使得可以从临床样品利用普通RNA分离程序分离出高质量的分枝杆菌RNA。
所述加工痰样品以用于涂片显微镜检术、培养和PCR的方法如下:
试剂:
(i)溶液1:通用样品加工溶液(USP):4-6M盐酸胍(GuHCl)、50mMTris-Cl,pH7.5、25mM EDTA、0.5%N-十二烷酰基肌氨酸(之后称作十二烷基肌氨酸钠)溶液、0.1-0.2M β-巯基乙醇。(当仅实施培养/培养和涂片时优选4M GuHCl和0.1M β-巯基乙醇;在实施培养以及涂片显微镜检术和PCR的情况下优选5M GuHCl和0.1-0.2M β-巯基乙醇;当仅实施涂片显微镜检术、PCR和RT-PCR时优选6M GuHCl和0.2M β-巯基乙醇)。
(ii)溶液2:68mM磷酸钠缓冲液,pH 6.8(任选的)。
(iii)无菌水(优选地双蒸或三蒸);(在分离RNA的情况下为DEPC处理的无菌水)。
(iv)溶液3:重悬浮溶液(无菌水中0.05% Tween 80)。
对于从低杆菌载量的样品分离DNA,需要如下另外的试剂:
(i)溶液A:10%树脂悬浮液,所述树脂为与苯乙烯二乙烯基苯基质偶联的成对亚氨基二乙酸根离子的钠盐(以下称作Chelex 100)。
(ii)溶液B:0.03% Triton X-100。
(iii)溶液C:0.3% Tween-20。
注意:对于从涂片阳性样品和无菌流体分离DNA,无需溶液A、B和C;可以通过直接地在溶液3中90-100℃加热样品30-40分钟以分离可扩增的DNA(或者可以在溶液3中补加Triton X-100至终浓度0.01%)(见图11)。
方法学:
样品加工
加工痰:
1)在50ml带螺帽的小瓶中向痰样品中加入1.5至2体积的溶液1。
2)如果可以,使用5ml容积的一次性塑料Pasteur移液管将痰重悬浮在USP溶液中。
3)充分涡旋并避免起泡(尽可能地),直到痰获得充分匀浆(这一般在30-40秒内完成)。完全匀浆对于获得最佳结果时必需的(对于高脓性大体积、粘性很强的、含有血块的咯血痰,涡旋后室温孵育10分钟可能是必需的)。
4)室温放置5-10分钟,向匀浆物中加入10-15ml溶液2。该步骤帮助形成适当的沉淀。轻柔地混合并在实验室离心机中室温以4000-5000rpm离心10-15分钟。
5)弃上清液,小心不要除去沉淀。如果沉淀体积没有发生可观的减少(至原痰体积的1/10至1/20),则使用大约2-5ml溶液1进行再次洗涤。
6)用无菌三蒸水洗涤(当在水中重悬浮沉淀时,应当仅仅通过涡旋来实现。如果不按此进行可能得不到最佳的结果)。目前沉淀已可用于涂片显微镜检术、培养、DNA/RNA分离和PCR检验。
加工未凝结的血液(含有EDTA):
1)向血液样品中加入等体积的溶液1并混合。如果血液部分凝结,则在37℃与溶液1一起温育半小时。
2)以中速(4000-5000rpm,对于>1.3ml的样品体积,使用15ml或50ml管)或高速(12,000-15,000rpm,对于<1.3ml的样品体积,使用1.5ml管)沉淀样品。
3)如果必需,用溶液1洗涤沉淀一次或两次,直到获得浅黄色沉淀。
4)用无菌三蒸水洗涤沉淀。通过涡旋但不抽吸液体,将沉淀重悬浮在水中。(如果不按此进行可能得不到最佳结果)。
5)沉淀现可用于涂片显微镜检术、培养、DNA/RNA分离和PCR检验。
加工其它体液(除了痰和储存的胸膜液样品外):
1)对于体积>1.3ml的样品:在15ml或50ml带螺帽的小瓶中以中速(4000-5000rpm)沉淀样品。
2)对于体积<1.3ml的样品:在1.5ml聚丙烯小瓶中以高速(12,000-15,000rpm)沉淀样品。
4)用1.5至2倍沉淀体积的溶液1洗涤沉淀一次或两次,之后用无菌三蒸水洗涤。通过涡旋但不抽吸液体,将沉淀重悬浮在水中。(如果不按此进行可能得不到最佳结果)。沉淀现可用于涂片显微镜检术、培养、DNA/RNA分离和PCR检验。
加工胸膜液:
如果胸膜液在收集后1小时内进行加工,则加工可以如“加工其它体液”中所述进行。如果胸腔积液储存超过1小时,蛋白质将以凝结物形式析出。这样的样品应当按如下方式加工:
1)单独地用USP溶液在37℃或室温处理凝结的蛋白质(通过将上清液倾析至另一管获得)30分钟,直到蛋白溶解。
2)与上清液混合,并再加入一些溶液1和大约10ml溶液2,在15ml或50ml带螺帽的小瓶中以中速(4000-5000rpm)离心。
3)如果未恰当地形成沉淀,再加入一些溶液2并再次沉淀。
4)用溶液1再次洗涤沉淀之后水(10-15ml)洗。
5)沉淀现可用于涂片显微镜检术、培养、DNA/RNA分离和PCR检验。
注意:从加工该样品的液体部分获得的沉淀应当与从凝结物获得加工沉淀合并。如果在EDTA(防止凝结物形成)小瓶中收集胸膜液,可以按照“加工其它体液”中所述进行加工。
加工组织活检物(新鲜的和石蜡包埋的):
1)在除去容纳活检物的生理盐水或液体后,将溶液1加入含有活检物的小瓶,15-20分钟后将活检物转移至无菌培养皿。这帮助软化组织材料,对于后续步骤是必需的。
2)活检材料***后,用无菌解剖刀尽可能细地切碎活检材料。为了得到最佳结果,应当细细地切碎。
(注意:使用细针吸活检时,无需切碎)
3)将切碎的活检材料转移至小型珠-搅拌器小瓶(1.5ml容积),其中在该小瓶中含有至少一半体积的无菌1mm玻璃珠。该体积不应超过1ml。
4)在小型珠搅拌器(Mini-BeadbeaterTM,Biospec Products,USA)中搅拌30-60秒。如果材料未彻底匀浆,再一次重复珠搅拌30秒。
5)2000rpm离心小瓶2分钟,将匀浆物收集到新的小瓶中,其间避免收集任何玻璃珠。
6)25℃下12000-15000rpm离心匀浆物10分钟,弃上清液。
7)再一次用溶液1(最大1ml体积)洗涤沉淀,之后用无菌水洗涤。
8)现沉淀可用于涂片显微镜检术、培养、DNA/RNA分离和PCR检验。
注意:对于石蜡包埋的组织样品,加工之前必需用二甲苯脱石蜡。
涂片显微镜检术、培养和PCR技术:
向无菌水洗涤后获得沉淀添加500μl溶液3,并彻底重悬浮沉淀。可以注意到,离心后沉淀具有沿着管壁以及在底部沉积的趋势。小心地将沉淀完全地重悬以得到均质溶液。这对于获得最佳结果是重要的。将其转移至1.5ml聚丙烯小瓶。该材料目前可用于三项检查,即,显微镜检术、培养和PCR。
A)涂片检查(使用10%的重悬浮液)
在干净的载玻片上在尽可能最小区域中涂布50μl。如果涂片中存在任何颗粒物,在涂片时应当小心地用接种环将其均匀地铺开。涂片面积优选应当不超过1cm×1cm。
简化的USP涂片制备方法:将2-3体积USP溶液加入收集在McCartney瓶中的痰(样品体积小于或等于2ml)内。用手混合30-60秒以充分匀化。放置5-10分钟。对于高粘性的脓性痰样品,加入至少3体积的溶液1,用手混合并37℃温育20-30分钟。向瓶中补充无菌水至不超过2/3水平,并颠倒混合。在室温临床离心机中3,000g离心20分钟。弃上清液并小心不倒出/丢失沉淀。将沉淀重悬在2-5ml溶液1中,如前述进行离心。小心弃去上清液,用大约10ml无菌水洗涤沉淀。小心弃去上清液,用滴管/Pasteur吸管将大约10滴溶液2加至沉淀,并在接种环的帮助下将沉淀彻底重悬。小心地将离心时沿着瓶壁沉积的沉淀包括在最终得重悬浮液中。将3-4滴重悬浮液倒在干净载玻片上,使用接种环通过连续地转动将之铺开以产生大约20mm×10mm的涂片。空气干燥涂片大约30-45分钟,火焰上固定,使用ZN染色法染色AFB,并使用光学显微镜在油镜下检查载玻片。
B).培养(使用50%重悬浮液)
将200μl接种在LJ培养基上。37℃温育。
C).分离用于PCR的DNA(使用40%重悬浮液)
对于DNA分离,在微量离心管中以12,000-13,000rpm沉淀‘溶液3重悬浮液’。向沉淀加入大约5倍体积的溶液A以及各1/10溶液A体积的溶液B和溶液C。充分混合,同时避免起泡。90℃加热40分钟。室温12,000rpm离心5-10分钟。用上清液实施PCR。小心不要将任何来自溶液A的碎屑和树脂加入PCR反应。
注意:如果沉淀体积剧烈地减少以至于根本看不见或沉淀体积十分微小或样品为高杆菌载量的样品,可以通过直接地或在加入TritonX-100(终浓度0.01%)后于90-100℃加热‘溶液3重悬浮液’30-40分钟,进行裂解。可以直接使用上清液实施PCR。在这些情况下可以避免添加裂解试剂(即,溶液A、B和C);但是为了得到最佳结果,推荐使用裂解试剂(溶液A、B和C)分离PCR可扩增DNA(见以下详述)。
D).RNA分离:可以使用任何标准RNA分离程序或试剂盒从获得的沉淀分离分枝杆菌RNA。
PCR技术
该PCR试验靶向结核分枝杆菌的devR基因(Rv3133c),对于结核分枝杆菌复合群的生物具有特异性[Singh等,1999]。在我们实验室公布的研究中,devRf和devRr引物对被用于‘长靶’PCR试验中,从devR基因扩增513bp片段[Singh等,1999;2000]。在题为“评估基于PCR的结核病检验”的DBT资助计划下的多中心研究中,[持续时间从1997年2月至2000年2月,财政支援至1999年2月28日],对编码的痰样品使用了相同PCR试验。涂片显微镜检术和培养的结果与PCR结果相关。对于阳性培养物的灵敏度为100%(14/14培养物阳性),对于涂片阳性样品的灵敏度为94%(17/18涂片阳性样品)[参见:关于就地开发的不同PCR结核诊断试验的评估结果分析的DBT报道,DBT,Govt.of India]。
据推论,对于少菌型的涂片阴性样品,devR基因更小区域的扩增可能提供相等/更好的灵敏度。在此想法下,设计了两对新引物以扩增devR基因中的更短片段。首先在纯化的结核分枝杆菌DNA上评价了该‘短靶’PCR试验,接着在临床样品上验证了该试验。‘短靶’引物对是:(i)devRf2,5’TGGCAACGGCATTGAACTGT 3’和devRr2,5’TAAGCAGGCCCAGTAGCGT 3’和(ii)devRf3,5’ATCTGTTGTCCCGCATGCC 3’和devRr3,5’GTCCAGC GCCCACATCTTT 3’。
使用以下PCR参数:
‘短靶’试验:94℃起始变性10分钟;45个循环,各为94℃变性1分钟、52℃退火1分钟和72℃延伸30秒;最后72℃延伸10分钟。
‘长靶’试验:除了以65℃90秒实施退火和延伸外,使用与‘短靶’试验中相同的参数。
IS6110试验:公布的由Eisenach等(1990)提出的引物用于如下PCR反应参数:94℃起始变性10分钟;之后45个循环,各为94℃1分钟、60℃1分钟30秒;之后,72℃最后延伸5分钟。
反应成分:
混合物成分 | 储藏浓度 | 工作浓度 |
1.)PCR反应缓冲液 | 10X | 1X |
2.)MgCl2 | 25mM/50mM | 1.5mM |
3.)引物 | 20μM* | 0.5μM |
4.)dNTP | 10mM | 0.2mM |
5.)Taq聚合酶 | 5U/μl | 1U |
*在PCR级水中重构得到20μM浓度。
总反应体积是40μl(30μl混合物和10μl模板)。在无DNA罩中将30μl混合物分配到无菌0.2或0.5ml小瓶中。在远离PCR准备区的指定区域添加10μl模板。简短离心管子30秒,放入热循环仪。完成反应(以上给出的参数)后,在1.5-2.3%琼脂糖凝胶上于0.5×TBE缓冲液中80伏特电泳扩增产物20-30分钟。通过溴化乙锭染色在UV光下观察产物(加样量至少35μl)。
8.实施例:
(A)USP溶液成分的功能:为了检查USP溶液的各成分的功能,选择性地从USP溶液中去除单个成分,并用所得溶液处理样品。USP溶液由如下5种成分组成:
1.盐酸胍(GuHCl)
2.十二烷基肌氨酸钠
3.β-巯基乙醇
4.Tris-Cl
5.EDTA
明显地,USP的主要功能——粘液溶解、净化、蛋白质变性、离液作用、液化作用、组织软化/消化作用、释放分枝杆菌的作用——通过前3个成分,即,GuHCl、十二烷基肌氨酸钠和β-巯基乙醇,实现。为了确立此点,从USP中选择性地将这三个成分分别地或联合地去除,并保持Tris-Cl和EDTA组成不变。评价经过选择性去除组分后的溶液对于样品加工、涂片显微镜检术、PCR和培养的影响(图1至4)。痰样品(通过合并3至4个AFB阳性痰获得,以便得到就污染物而言的大体积非均质组合物)通过用3mm玻璃珠涡旋3-5分钟匀浆。匀浆后痰的各5ml等分试样被分配用于以不同组成的溶液进行加工。使用USP溶液作为对照。准备了具有不同组成的以下溶液用于加工样品:
1.含有所有成分的USP溶液(称作USP);
2.无GuHCl的USP溶液(称作USP-1);
3.无十二烷基肌氨酸钠的USP溶液(称作USP-2);
4.无β-巯基乙醇的USP溶液(称作USP-3);
5.无GuHCl和十二烷基肌氨酸钠的USP溶液(称作USP-1,2);
6.无GuHCl和β-巯基乙醇的USP溶液(称作USP-1,3);
7.无GuHCl、十二烷基肌氨酸钠和β-巯基乙醇的USP溶液(称作USP-1,2,3);
8.无十二烷基肌氨酸钠和β-巯基乙醇的USP溶液(称作USP-2,3)。
所有这些溶液均用于加工所述的痰样品并进行涂片显微镜检、PCR和培养。针对具有不同物理特征的样品,重复实验两次。
主要观察结果:
1.当用缺乏三个主要成分的USP溶液(USP-1,2,3,图1)加工痰样品时,沉淀体积没有减少。当将最终加工的沉淀的10%涂在载玻片上时,得到具有大量背景的过厚涂片,十分难于读取信息。在接种在LJ培养基上两天内出现培养污染,且PCR表现出抑制作用。
2.无论组成改变可能是怎样的,USP溶液总是最佳地从样品中除去废物和PCR抑制剂,从痰样品产生最干净的沉淀(图1,图3)。
3.对于含有血液的痰样品,GuHCl通过使血红蛋白变性并从样品中将之除去,作为样品的主要抑制剂除去成分起作用。对于具有高脓性和血液的样品,在使用不含GuHCl的USP溶液加工的样品的DNA制备物中注意到PCR抑制。
4.观察到,对于粘液样痰样品,仅含有十二烷基肌氨酸钠和β-巯基乙醇(即,不含GuHCl(USP-1))的USP溶液以值得称赞的效率有效地加工样品,而且就涂片显微镜检和PCR而言比仅含有GuHCl的USP(USP-2,3)好(图1,2和3)。然而,USP-1不能充分地加工具有高脓性性质的痰样品(就去除废物和抑制剂的效力而言)。在这些情况中,仅含有GuHCl的USP溶液(USP-2,3)或仅含有GuHCl与十二烷基肌氨酸钠的USP(USP-3)表现更好。因此,显然USP中GuHCl和十二烷基肌氨酸钠的存在更适于脓性样品,而β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的存在更适于粘液样样品。可是甚至对于粘液样样品,GuHCl的存在也是有效地除去PCR抑制所必须的。但是对于粘液脓性样品,为了最佳的加工,GuHCl与β-巯基乙醇和/或十二烷基肌氨酸钠一起存在是绝对必须的。
5.无论何时从USP溶液中扣除GuHCl,在LJ培养基上接种时所得的培养物都表现出污染(图4A)。在该溶液中存在GuHCl对于样品的彻底净化是必须的。
6.去除这些主要成分之任一个都导致在使用最终加工的沉淀的10%制备涂片时涂片中背景增加(图2),这干扰了读取载玻片的容易度,而容易地读取载玻片是USP方法的一个主要优点(见下节)。
7.因此,明显地,USP溶液中的这三个主要成分以协同方式发挥作用在加工样品时产生最佳效果,而且这些成分中任一个成分的缺乏都导致次最佳的结果。USP溶液以等同效力加工各种物理特征和生物化学性质的样品的通用性可以归因于USP溶液中所有成分的协同作用。Tris-Cl帮助维持USP溶液的中性pH,这样在培养之前无需对USP溶液处理过的样品进行中和。
EDTA作为阳离子的螯合剂起作用,由此失活DNase。GuHCl是有效的离液剂,由此帮助变性样品中的所有宿主蛋白质,包括粘蛋白和血红蛋白,借此从临床样品中除去潜在的PCR抑制剂和对染的物质。GuHCl杀死样品中存在的革兰氏阴性细菌,由此净化该细菌(见以下)。其还变性DNase和RNase,由此保存核酸和使得该方法适于DNA和RNA分离。十二烷基肌氨酸钠溶解脂质、破坏真核细胞和革兰氏阴性细菌的细胞膜,帮助净化样品和从巨嗜细胞释放分枝杆菌。还原剂β-巯基乙醇作为粘液溶解成分起作用将粘蛋白的S-S键还原为-SH基团并释放陷在粘液中的分枝杆菌。分枝杆菌坚固的细胞壁特征使其完全地不受USP溶液造成的任何不利作用的影响,因此该方法极为突出地适用于加工样品,作为通过涂片显微镜检术、培养、PCR和RT-PCR(对于RNA)诊断分枝杆菌的序曲(prelude)。
(B)USP的快速液化性质:图5a和图5b显示用USP处理的代表性痰和组织样品。在加工结束时,去除了样品中的污染生物、蛋白质、酶和干扰物质,并且样品体积发生相当大的减少。
(C)涂片显微镜检术:通过USP、CDC、直接涂片法制备的代表性载玻片涂片显示在图6中。值得注意的,USP载玻片中背景染色物质的明显减少。
(i)涂片显微镜检术的USP法的灵敏度:在含有ADC和0.05%Tween 80的Middlebrook 7H9培养基中培养结核分枝杆菌H37Rv至对数期。以一式两份的设置,按如下系列稀释培养物:1∶10,1∶100,1∶1000等等至1∶100000。将每个稀释物的10%接种在LJ斜面(固体培养基)上,在另一设置中将每个稀释物的100%搀入(spike into)来自患有慢性阻塞性肺病(COPD)但无任何TB病史或症状的患者的1ml痰等分试验中。搀入稀释物后的样品通过USP方法加工,将各样品的10%分别涂在载玻片上,对AFB进行染色,并在油镜下显微镜检。使用搀有耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)——一种非致病性快速生长的分枝杆菌——的COPD痰样品进行相似实验。从两个实验确立,涂片显微镜检术的USP方法能够将含有每ml样品300-400个AFB的样品检测为阳性。对结果再进行两次验证。代表性的实验显示在图7中。这些结果清楚地说明涂片显微镜检术的USP方法的优异灵敏度。注意到超过常规直接涂片显微镜检术方法大约30倍的灵敏度增加。直接方法的检测灵敏度为大约10,000个杆菌/ml样品(Kent和Kubica,1995)。
(ii)在临床环境中评价USP涂片显微镜检术:在一组571份痰上评价USP涂片显微镜检术的性能,这些痰收集自在New DelhiTuberculosis Centre,New Delhi的DOTS中心;Sunderlal JainCharitable Trust Hospital,Delhi和Tuberculosis Research Centre,Chennai就医以诊断肺结核的患者(n=571)。针对该研究中选用的患者评价了以下临床症状中的任一种,即,发烧、咳嗽、吐痰、咳血、疼痛、呼吸困难和其它症状,如体重减轻、盗汗和全身无力、胸部X光片、Mantoux状况和任何结核病的过往病史。从研究中排除来自在样品收集时已经在ATT上的个体的样品。在LJ培养基上的培养结果被用作金标准。编码所有样品,并实施盲检。
(iii)相对应直接涂片和NALC-NaOH浓缩法——两者均为最普遍使用的涂片显微镜检术方法,评价USP方法的性能。通过直接方法和USP方法加工所有571份样品用于显微镜检术(数据集1)。其中325份样品(数据集2)还使用NALC-NaOH浓缩法(在CDC,Atlanta研发的,称作CDC方法)加工。在被认为大约相同的痰样品等分式样上实施USP和CDC方法。直接涂片独立地制备并在两个不同地点由不同的所训人员读取信息。通过USP和CDC方法制备的涂片在一个实验室由至少两名所训人员读取信息。USP涂片法相对于直接涂片法和CDC方法存在的改进有:
a).在USP涂片中阴性样品转阳:在该组571个痰样品上,直接涂片法和USP涂片法的灵敏度分别为68.6%和98.2%,特异性分别为92.6%和91.4%(数据集1)。通过直接方法诊断为阳性的所有样品通过USP和CDC涂片显微镜检术方法也检查为阳性。在325个直接涂片阴性样品中,USP方法检测到另外97个样品为涂片阳性,这些样品通过培养也检测为阳性,由此记录29.6%的灵敏度增加。代表性实例显示在图8中。这97份USP涂片阳性样品中,14份分级为极少的,29份分级为1+,23份分级为2+,31份分级为3+。
同时在这571份样品中的325份上,还将USP涂片方法与涂片显微镜检术的CDC方法作了比较(数据集2)。通过CDC方法检测为涂片阴性的29份样品被涂片显微镜检术的USP方法检测为阳性,所有这些样品也均是培养阳性的。因此,USP方法也比流行使用的涂片显微镜检术浓缩方法(CDC方法)在检测灵敏度上更好(对于USP和CDC涂片显微镜检术,分别为97.1%和80%)。
数据集1
相对于直接涂片法评价USP涂片法
金标准:培养(在LJ培养基上),样品强度,n=571
涂片法和结果 | 培养 | |
阳性 | 阴性 | |
USP | ||
任何阳性 | 322 | 21 |
阴性 | 6 | 222 |
总计 | 328 | 243 |
直接 | ||
任何阳性 | 225 | 18 |
阴性 | 103 | 225 |
总计 | 328 | 243 |
在95%置信区间测量相关性
USP涂片显微镜检术(ZN)
灵敏度:98.2% (95.9%-99.3%)
特异性:91.4% (86.9%-94.4%)
PPV:93.9% (90.7%-96.1%)
NPV:97.4% (94.1%-98.9%)
诊断准确度:90.5%
直接涂片显微镜检术(ZN)
灵敏度:68.6% (63.2%-73.5%)
特异性:92.6% (88.4%-95.4%)
PPV:92.6% (88.4%-95.4%)
NPV:68.3% (62.9%-73.3%)
诊断准确度:78.3%
数据集2
相对应涂片显微镜检术的CDC法评价USP法(ZN)
金标准:培养(在LJ培养基上)
样品强度,n=325。
在95%置信区间测量相关性。
培养 | ||
涂片法和结果 | 阳性 | 阴性 |
USP | ||
任何阳性 | 165 | 26 |
阴性 | 5 | 129 |
总计 | 170 | 155 |
CDC | ||
任何阳性 | 136 | 16 |
阴性 | 34 | 139 |
总计 | 170 | 155 |
USP涂片显微镜检术(ZN)
灵敏度:97.1% (92.9%-98.9%)
特异性:83.3% (76.2%-88.6%)
PPV:86.4% (80.5%-90.8%)
NPV:96.3% (91.1%-98.6%)
诊断准确度:90.5%
CDC涂片显微镜检术(ZN)
灵敏度:80.0% (73.0%-85.6%)
特异性:89.67% (83.5%-93.8%)
PPV:89.47% (83.2%-93.7%)
NPV:80.35% (73.5%-85.8%)
诊断准确度:84.6%
b).涂片状况的提升:USP方法增强了载玻片的分级,使得更容易在更短的时间读取载玻片的信息。通过涂片显微镜检术的直接方法分级为极少、1+或2+的载玻片一般通过USP方法转化为1+、2+或3+。
在将该组571个样品通过涂片显微镜检术的USP法得到的结果与通过直接方法得到的结果比较时,观察到该趋势(表1)。当USP溶液方法与CDC方法比较时,也观察到涂片状况的提升(表2)。代表性载玻片显示在图9中。因此,就每个视野观察到的杆菌数而言,USP方法也比CDC方法表现好。这利于快速且有效的读取载玻片信息,最终导致技术人员的时间和劳动力的节约。
表1:相对于直接涂片方法,USP涂片显微镜检术对涂片状况的提升(总样品强度=571;通过直接方法得到阳性的样品,n=243)
直接涂片检查(n=243) | USP涂片检查 | |
级别 | 样品数 | |
极少 | 29 | 1+(4)2+(15)3+(10) |
1+ | 97 | 2+(40)3+(57) |
2+ | 70 | 3+(70) |
3+ | 47 | 3+(47) |
(括号中的值指示样品强度)
表2:相对于CDC涂片法,USP涂片显微镜检术对涂片状况的提升(总样品强度=326;通过CDC方法为阳性的样品,n=152)
CDC涂片检查(n=152) | USP涂片检查 | |
级别 | 样品数 | |
极少 | 13 | 1+(9)2+(4) |
1+ | 35 | 1+(7)2+(20)3+(8) |
2+ | 37 | 3+(26)2+(11) |
3+ | 67 | 3+(67) |
(括号中的值指示样品强度)
因此,涂片的USP溶液方法显示比测试的另两种方法好得多的97%-98%的非常高灵敏度,特异性范围为83%-91%。USP涂片显微镜检术在培养阳性样品中显示97-98%的阳性,而CDC方法显示80%阳性,直接涂片法显示68.6%阳性,由此记录分别比直接和CDC涂片显微镜检术方法在灵敏度上增加大约30%和18%。该灵敏度增加是显著的,因为所有三种方法的灵敏度值在95%置信区间完全不重叠。没有一个通过直接涂片方法或CDC方法检测到的样品被USP涂片法遗漏。USP涂片显微镜检术方法与直接涂片方法相比,特异性为91.3%,而与CDC方法相比为83.3%。两个值在95%置信区间重叠。(数据集1和2)。
(D)培养
(i)USP溶液对搀入痰中的结核分枝杆菌的致死性:将对数期结核分枝杆菌系列稀释高达10000倍,且一式两份。一组稀释物的10%被接种在LJ斜面上,将副本组的每一个稀释物的100%分别搀入来自COPD患者的1ml痰等分试样中。搀入稀释物的样品利用USP方法加工,加工后的物质的10%接种在LJ斜面上。8周后就未处理细胞获得的活细胞计数为720/ml,就搀入稀释物的经USP溶液处理的细胞获得的活细胞计数为400/ml(在10000倍稀释下)(表3;图10)。大约55%分枝杆菌在USP处理下存活。CDC方法作为目前最流行使用的临床样品净化方法使用NaOH,利用该方法,已经报道了从28%至70%的生存力丧失(Krasnow和Wayne,1966)。
表3.USP对搀入COPD痰中的结核分枝杆菌的生存力的影响
稀释 | 未处理的细胞(cfu) | USP溶液处理的细胞(cfu) |
纯的 | 汇合 | 汇合 |
1∶10 | 汇合 | 汇合 |
1∶100 | 汇合 | 大约500 |
1∶1000 | 大约300 | 134 |
1∶10000 | 72 | 40 |
然而,发现含有4M GuHCl(代替5M GuHCl)的USP溶液对分枝杆菌较不苛刻。当用含有4M GuHCl的USP而非用具有6M GuHCl的USP处理结核分枝杆菌时获得更多的存活细菌菌落;4周后,对于用含有4M GuHCl的USP处理的细胞为142个细胞/ml,而对于用6M GuHCl处理的细胞为72个细胞/ml(100倍稀释)。相同稀释度的未处理细胞相应于277个细胞/ml。但是其净化临床样品中的效力相同。因此,当首要的是培养来自临床样品的结核分枝杆菌时,含有4M GuHCl的USP将增加培养阳性的几率。
(ii)USP对结核分枝杆菌生长速率的影响:熟知用净化剂例如NaOH处理将减缓来自临床材料的结核分枝杆菌的生长速率。使用USP溶液处理的细菌也进行了相似观察。在固体培养基(Middlebrook 7H10或LJ)上,与未处理的细胞相比,USP处理后的结核分枝杆菌菌落在延迟至少1至
周后出现。在固体培养基上与USP处理的细菌相比NALC-NaOH处理的结核分枝杆菌(CDC方法)生长也稍更快(至少早4-5天得到可见的菌落),但是当细菌在液体***BC BACTECTM MGITTM 960***(BectonDickinson,USA)中培养时两份处理之间未观察到明显差异[见下文]。
从以上实验估计37℃以USP溶液(含5M GuHCl)处理20分钟后使得56-62%的结核分枝杆菌细胞无法存活。因此,USP溶液并不完全致死结核分枝杆菌。
(iii)在液体培养中用USP溶液和NALC-NaOH处理后结核分枝杆菌的生长速率相等(分枝杆菌生长指示管):熟知用净化剂处理会不利地影响分枝杆菌的生存力并减缓其生长速率。比较NALC-NaOH处理(CDC方法)与USP溶液处理对结核分枝杆菌生长速率的影响。将Middlebrook 7H9液体培养基(具有ADC补充物和0.05% Tween 80)中生长的对数期结核分枝杆菌培养物分成3组。一组用USP溶液处理,另一组用NALC-NaOH处理之后用磷酸缓冲液中和(CDC方案)。将三组(即,USP溶液处理的、NALC-NaOH处理的和未处理的)均接种至具有PANTA试剂和OADC补充物(Becton Dickinson,USA)的MGIT管,并使用BD BACTECTM MGITTM 960***监测阳性信号。未处理的细胞在两天内给出生长的阳性信号,而USP溶液处理的细胞和NALC-NaOH处理的细胞在5天内给出生长的阳性信号。重复该实验,得到相同结果。这提示,USP和CDC方法以相同程度减慢液体培养基(MGIT)中结核分枝杆菌的生长。
(iv)在临床环境中评价USP培养:在一组571个样品上比较培养的USP方法与其它常规培养方法(CDC方法、改良的Pettrof方法和Nassua方法)。
值得注意的发现有:
(a)USP和常规方法均表现出相当的阳性百分数。常规方法的阳性率(53.6%)未显著地高于USP方法的阳性率(50.1%),它们在95%置信区间重叠。
(b)USP方法被证明对于净化非常有效,而且与常规方法(n=21)相比表现出较少的污染培养物数目(n=5),由此证明其更适于热带国家。
(c)由于USP溶液是中性pH溶液,因此在培养前无需中和使用USP溶液净化的样品。
因此就灵敏度、对存活力的影响和对生长速率的影响而言,培养的USP方法与目前接受的培养来自临床样品的结核分枝杆菌的方法相当。
(E)PCR
在>700份肺和肺外来源的样品上实施PCR检查。样品或是新鲜的或是在-20℃冷冻多达2个月。通过USP方法分离用于此目的的分枝杆菌DNA。没有一个样品在PCR试验中显示抑制作用,说明从临床样品通过USP法分离的DNA不含抑制剂。该PCR试验靶向结核分枝杆菌的devR基因(Rv 3133c),并且对结核分枝杆菌复合群的生物具有特异性[Singh等,1999]。在公布的研究中,PCR引物对devRf和devRr从该靶基因扩增513bp片段[Singh等,1999;2000]。据推论,扩增该同一基因的更小区域可能为少菌型的和涂片阴性样品提供等同的/更好的灵敏度。在该思想下,使用作图定位在devR基因中的两组新引物扩增devR基因的更短片段。所用的新引物对是分别(i)从devR基因扩增308bp片段的devRf2和devRr2(图11)和(ii)扩增164bp的devRf和devRr3(图11)。将这些结果与最初的513bp devR试验和在全球大量实验室中使用的IS6110为基础的试验比较。
(i)试验特异性:试验的特异性通过向PCR反应中添加来自不同分枝杆菌物种的DNA进行评价。devRf2和devRr2引物显示出优异的特异性,仅仅在使用来自属于结核分枝杆菌复合群的生物的DNA时获得了预期大小的条带(308bp)而在使用来自其它分枝杆菌物种的DNA时则未获得该条带(图13)。然而,使用devRf3和devRr3引物,除了从来自非洲分枝杆菌(M.africanum)、牛分枝杆菌(M.bovis)和结核分枝杆菌的DNA还从来自堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)和蟾分枝杆菌(M.xenopi)物种的DNA获得了扩增(164bp产物)。而且,使用来自属于结核分枝杆菌复合群的田鼠分枝杆菌(M.microti)的DNA未获得扩增(图12)。
(ii)使用纯化的DNA的试验灵敏度:在PCR试验中使用纯结核分枝杆菌DNA的系列稀释物评价通过溴化乙锭检测扩增产物的检测限(表4,图14)。与产生513bp扩增产物的PCR试验相比,引物对devRf2-devRr2和devRf3-devRr3显示出明显增加的灵敏度。与devRf和devRr引物(产物大小,513bp)相比,devRf2和devRr2引物[产物大小308bp]显示出高2至4倍的灵敏度,devRf3和devRr3引物(产物大小,164bp)显示出高至少10倍的灵敏度[表4]。
表4:在系列稀释的结核分枝杆菌基因组DNA上比较使用不同引物对的devR PCR试验的灵敏度
PCR试验中DNA的投入量 | 300ng | 50ng | 10ng | 1ng | 100pg | 10pg | 5pg | 2.5pg | 1pg | 100fg | |
杆菌的相当量 | 3×107 | 5×106 | 106 | 105 | 104 | 103 | 500 | 250 | 100 | 10 | |
引物 | 产物大小(bp) | ||||||||||
devRf/devRr | 513 | + | + | + | + | + | + | - | - | - | - |
devRf2/devRr2 | 308 | + | + | + | + | + | + | + | +/? | - | - |
devRf3/devRr3 | 164 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | - |
(iii)在临床环境中评价‘短靶’和‘长靶’PCR试验:
针对收集自怀疑患有结核病的患者(n=571)的571份样品,将PCR试验的结果与培养和涂片显微镜检术的结果进行比较,其中所述患者来自New Delhi Tuberculosis Center的DOTS中心,Sunderlal Jain Hospital,Delhi and Tuberculosis research center,Chennai。所用试验如下:
1.使用引物对devRf2 & devRr2(产物大小,308bp)和devRf3 &devRr3(产物大小,164bp)的组合的‘短靶’devR PCR试验(在571份痰样品上进行)。
2.使用先前公布的并得到验证的引物对devRf和devRr(产物大小,513bp)[Singh等,1998,2000]的‘长靶’devR PCR试验(在该571份样品中的506份上进行)。
3.使用公开的引物[Eisenach等,1990]在571份样品上实施的IS6110 PCR试验。由于该试验是全世界最广泛使用的PCR试验,故用作对照。
‘短靶’试验的灵敏度为98.5%。这充分好于灵敏度为73.2%的‘长靶’试验。例如,在分析的571份痰样品中,322份痰样品通过USP涂片方法为阳性,并且也是培养阳性的。这些培养阳性和USP涂片阳性样品中,长靶试验未能检出65份样品,而这些样品被短靶试验检出,从而证实后一试验为更灵敏。因此,在使用培养阳性作为金标准时引入‘短靶’引物使devR试验的灵敏度增加了25.3%(数据集3),并且当使用结核分枝杆菌基因组DNA的系列稀释物进行比较时该灵敏度增加了2-10倍(表4)。短靶试验的总体诊断准确性比长靶试验的高大约7%(数据集3)。
然而,‘短靶’试验增加的灵敏度伴随着与‘长靶’试验91.9%的特异性相比77%的较低特异性(数据集3)。‘短靶’试验特异性的明显降低可能是试验灵敏度增加的一个反映,而不可能是由于假阳性/较低的特异性导致的。这得到如下证据的支持:
(i)328份培养阳性样品中,‘短靶’PCR检测到323份样品。通过IS6110 PCR试验,也有相同数目的样品为阳性。然而,在包括571份样品的该研究中,6份样品通过IS6110试验检测为阴性,而对于devR‘短靶’试验为阳性,这可能是由于IS6110基因的缺乏所致。IS6110 PCR还检测到另外2份培养阳性样品(数据集3)。用于扩增123bp产物的基于IS6110的PCR试验对于结核分枝杆菌复合群的生物具有特异性,并且由于所述基因组中存在IS6110的多个拷贝(与每个基因组仅存在一个拷贝的devR不同)而显示出高灵敏度。但是,devR短靶试验显示出与IS6110试验相当的灵敏度(数据集3)。devR的值也在于与IS6110相比其普遍地存在于所有的结核分枝杆菌分离物中,而据报道IS6110在印度菌株中有时完全不存在或者存在1个拷贝或几乎没有拷贝(Narayanan等,2001)。这通过在使用肺外样品的研究(见下文详述)中针对胸膜组织和***样品IS6110试验具有的较低灵敏度得以反映(数据集5 & 6)。
(ii)非结核对照:在一组来自69名患有经临床证实非结核病的其它疾病的患者的78份痰上进行涂片显微镜检、培养和PCR。所有样品通过涂片显微镜检、PCR和培养均为阴性,从而证明了这些试验***的特异性。
数据集3
使用‘长靶’和‘短靶’devR PCR的PCR的灵敏度和特异性
使用培养阳性作为金标准;样品强度,对于devR-长PCR为n=506,对于devR-短PCR为n=571。
培养 | ||
PCR靶和结果 | 阳性 | 阴性 |
DevR-长(513bp) | ||
阳性 | 199 | 19 |
阴性 | 73 | 215 |
总计 | 272 | 234 |
devR-短(308/164bp) | ||
阳性 | 323 | 56 |
阴性 | 5 | 187 |
总计 | 328 | 243 |
IS6110(123bp) | ||
阳性 | 325 | 70 |
阴性 | 3 | 173 |
总计 | 328 | 243 |
在95%置信区间测量相关性。
devR-长:
灵敏度:73.2% (67.4%-78.2%)
特异性:91.9% (87.4%-94.9%)
PPV:91.3% (86.5%-94.5%)
NPV:77.1% (69.1%-79.5%)
诊断准确度:81.8%
devR-短:
灵敏度:98.5% (96.3%-99.4%)
特异性:77% (71.0%-82.0%)
PPV:85.2% (81.8%-88.5%)
NPV:97.4% (93.7%-99.0%)
诊断准确度:89.32%
IS6110:
灵敏度:99.1% (97.1%-99.8%)
特异性:71.2% (65%-76.7%)
PPV:82.28% (78.1%-85.8%)
NPV:98.3% (94.7%-99.6%)
诊断准确度:87.22%
肺外样品:在盲检试验中使用从来自Safdarjung Hospital,NewDelhi,印度的患者收集的编码的胸膜液、胸膜组织和***活检样品,评价USP方法在诊断结核性胸腔积液和***病方面的性能。样品由来自88名患者的100份样品组成,其中包括来自TB患者的77份样品和来自患有诸如恶性肿瘤、阿米巴病、CHF、结节病和反应性性***病(非特异性炎症)的疾病的对照个体的23份样品。入选标准基于以下任一个或多个参数:
a)组织病理/细胞病理与TB一致;(b)AFB阳性涂片;(c)结核分枝杆菌培养阳性;(d)对ATT具有临床反应。使用USP方法加工样品,并实施涂片显微镜检、培养和PCR。在此研究中,比较基于devR和IS6110的PCR。devR PCR使用引物对devRf3/devRr3进行。
从这些样品分离的结核分枝杆菌DNA具有良好质量并且没有明显的PCR抑制作用。涂片显微镜检术的USP方法检测到8份样品(6份胸膜液以及***和胸膜组织活检物各一份)(数据集4)为阳性,而涂片显微镜检术的常规方法检测到3份样品为阳性。在该组肺外样品中USP涂片显微镜检术的灵敏度为10.4%,而常规方法的灵敏度仅为3.9%。因此,与常规诊断方法相比,USP方法使得从组织活检样品和其它肺外样品进行的结论性AFB涂片显微镜检术得到改进。通过培养的USP方法,5份样品为阳性(灵敏度6.5%)(数据集4)。devR PCR显示出比IS6110对胸膜组织和***(分别为75%和50%)样品具有更好的灵敏度(分别为100%和75%),原因可能是在这些菌株中不存在任何IS6110拷贝(数据集5 & 6)。因此,样品加工的USP方法和devR PCR作为一个有用的模式起到确定性地诊断结核性胸腔积液和***病的作用。
数据集4:
USP方法加工的肺外样品的涂片显微镜检和培养状况
样品类型 | 总数 | 涂片阳性 | 培养阳性 |
胸膜液 | 69 | 6 | 4 |
胸膜组织 | 11 | 1 | 0 |
*** | 20 | 1 | 1 |
数据集5:
devR-短靶PCR对于肺外样品的灵敏度和特异性值(%)
胸膜液 | 胸膜组织 | *** | |
灵敏度(%) | 80.9 | 100 | 75 |
特异性(%) | 93.3 | 100 | 66.7 |
PPV(%) | 97.1 | 100 | 90 |
NPV(%) | 63.6 | 100 | 40 |
效率(%) | 84.2 | 100 | 73.3 |
数据集6:
IS6110 PCR对于肺外样品的灵敏度和特异性值(%)
胸膜液 | 胸膜组织 | *** | |
灵敏度(%) | 93 | 75 | 50 |
特异性(%) | 96.15 | 100 | 75 |
PPV(%) | 97.6 | 100 | 88.9 |
NPV(%) | 89.3 | 60 | 27.3 |
效率(%) | 94.2 | 81.9 | 55 |
使用SAS 8.0软件(SAS Institute Inc.Cary,NC,USA)进行统计学分析。计算了变量的描述性统计(descriptive statistics)、频率分布和百分数。为了评价这些试验相对于金标准的诊断准确度和可靠性,计算了灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值以及它们的95%置信区间。
(F)在分离DNA用于PCR之前裂解加工的样品中存在的分枝杆菌的简化方案:在USP加工后,如果沉淀体积剧烈减少以致于几乎看不见或十分微小,或者如果样品为高杆菌载量样品,则可以通过直接在溶液3中或在加入Triton X-100(终浓度0.01%)后90-100℃加热重悬浮液30-40分钟,实现裂解。利用USP方法加工了三份AFB阳性痰样品。加工后的沉淀重悬浮在重悬浮溶液(溶液3)中,对于每个样品均分成三个相同的等分试样。一份等分试样进行沉淀,并向沉淀物中加入裂解试剂(即,溶液A、B和C),向第二等分试样加入Triton X-100至终浓度0.01%,另一等分试验保持原样。所有三个等分试样在90℃煮沸40分钟,使用上清液实施PCR。当通过琼脂糖凝胶电泳分析时,三份样品每一个的所有三个裂解物都产生了具有几乎相同强度的扩增子(图15)。这些结果说明,对于加工后获得的非常干净的沉淀或者对于具有高杆菌载量的样品,可以不用添加裂解试剂(即,溶液A、B和C);但是对于最佳结果,推荐使用裂解试剂(溶液A、B和C)分离PCR可扩增的DNA。
(G)USP方方法可应用于诊断由结核病类型以外的分枝杆菌造成的分枝杆菌病(MOTT),因为USP方法对于这些分枝杆菌不具有任何有害作用:室温下USP处理MOTT杆菌10-15分钟,之后用无菌三蒸水洗涤。然后针对每种物种进行涂片显微镜检、LJ斜面上的培养和PCR,以检查USP溶液的有害作用(如果有的话)。所用MOTT物种是:鸟分枝杆菌(M.avium)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、戈特氏分枝杆菌(M.gordonae)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasi)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulacem)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、草分枝杆菌(M.phlei)和牝牛分枝杆菌(M.vaccae)。属于结核分枝杆菌复合群的生物,如非洲结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)、田鼠分枝杆菌也包括在此研究中。所有生物保持了它们的AFB状况(图16)和生存力。然而,耻垢分枝杆菌尽管维持了其完整性和AFB性质但是丧失了生存力。图17显示两种经USP处理的快速生长者。从所有的USP处理的分枝杆菌均分离了良好质量的PCR可扩增DNA(图18)。
(H)USP方法加工的样品与从结核分枝杆菌分离RNA的程序相容:
USP方法也与从痰样品分离高质量的结核分枝杆菌RNA相容。为此目的,使用具有如下组成的USP溶液:6M盐酸胍、50mM Tris-Cl,pH 7.5、25mM EDTA、0.5%十二烷基肌氨酸钠和0.2M β-巯基乙醇。所用痰样品通过涂片显微镜检术的直接方法分为3+级。向该样品(5-7ml)加入1.5倍体积的USP溶液,匀浆该混合物。向其中加入10ml无菌DEPC水并混合。然后室温5,000rpm离心10分钟。再次用2-3ml USP溶液洗涤沉淀,之后用无菌DEPC水洗涤。此最终的加工沉淀可以用作通过适当方法分离RNA的起始材料。例如,使用Qiagen Rneasy Mini试剂盒按照厂商方案分离RNA。分离的结核分枝杆菌RNA使用Stratrascript逆转录酶(RT)(Stratagene,USA)进行逆转录反应,得到cDNA。使用结核分枝杆菌rRNA-(23S rRNA)和mRNA(Rv 3134c基因)特异性引物扩增cDNA,以检测结核分枝杆菌RNA的存在。RT阴性对照——其中,分离的RNA进行不含逆转录酶的逆转录反应——也进行PCR运行以监测制备物中存在的任何污染性基因组DNA。获得了相应于核糖体和信使cDNA的扩增(图19),证明两种结核分枝杆菌RNA均从痰样品获得分离。
(I)USP溶液对革兰氏染色细菌的生存力和染色性质的影响:评价了USP溶液对痰样品中最通常存在的三种微生物区系,即,大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属种(Pseudomanas sp.)和葡萄球菌属种(Staphylococcus sp.)的生存力和染色性质的影响。细菌用溶液1于室温处理10-15分钟,之后离心并用无菌水洗涤沉淀(如所述的)。然后,将沉淀重悬浮在溶液3中,取10%涂在载玻片上(一式两份),取40%接种在营养琼脂培养基中并37℃孵育以监测任何生长。这之后革兰氏染色载玻片。也对未处理的细菌进行了革兰氏染色。
观察到假单胞菌属种和大肠杆菌均被USP溶液的处理所裂解,这由通过革兰氏染色观察到的全部形态丧失(图20)和甚至在1周以后在营养琼脂培养基中的无任何生长所证实。然而,葡萄球菌属种在USP处理后保持了其形态和生存力(通过营养琼脂培养基上的生长检查)。然而,当利用USP方法加工含有结核分枝杆菌和葡萄球菌属种的痰样品并在LJ培养基上培养时,葡萄球菌属种不在LJ培养基上生长(未显示),这可能是由于培养基的选择性所致。
因此,USP溶液裂解并杀死革兰氏阴性细菌,但是对***如葡萄球菌属种不具有任何有害作用,因此,也可以用于诊断葡萄球菌疾病。
8.本发明的主要优点:
(i)开发了一个涉及最优化的样品加工的方法学,该方法学使用离液剂的新用途以实现对结核病的快速、灵敏和准确诊断。分枝杆菌细胞壁的独特性质使得分枝杆菌选择性地抵抗盐酸胍的作用。
(ii)除了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,含有其它分枝杆菌的样品在用于诊断试验之前也可以有效地利用USP方法进行加工。
(iii)所要求保护的技术是模块化的(modular);它十分突出地适于高灵敏的涂片显微镜检术、培养和用于基于核酸的诊断试验的良好质量的无抑制剂的分枝杆菌DNA和RNA的分离。而且,描述了可以灵敏且特异地诊断结核病的灵敏PCR试验。
(iv)由于相对简单且用户容易使用,该方法学可以由具有最少科学背景和训练的技术人员来实施。
USP涂片显微镜检术的优点:
1.此USP方法相较于现有涂片显微镜检术方法存在的主要优点是其非常高的灵敏度。已经证实,该方法可以重现性地检测含有可达300-400个杆菌/ml痰的样品。这比涂片检查的直接方法灵敏大约30倍。此灵敏度(检测限)可以进一步通过将超过所建议的10%的加工样品用于涂片显微镜检而增加。
2.由于此方法处理整个痰样品,故缺少脓或含有鼻烟排出物或唾液的样品也可以容易地利用该方法加工。
3.由于痰中的组织和细胞碎屑及蛋白质性废物可以被有效地除去,故可以在极小的区域(1cm×1cm)中制备涂片。可以使用多达10%的样品,而不会出现得到过厚涂片或获得干扰载玻片的显微镜检的高背景的机会(见图2)。
4.在不实施培养和PCR检查的情况下,可以在多个载玻片上检查>10%的样品。预期该方法可以进一步提供通过USP方法实施的涂片显微镜检术的灵敏度。
5.在从组织活检样品制备涂片时,此方法尤其有利。它可以绕过从实体活检物样品制备用于AFB涂片显微镜检术的涂片时常规的组织病理学步骤。此方法从组织活检样品产生适于AFB染色的高质量涂片,而这通过涂片的直接或浓缩(CDC)方法均是不可能的。
6.此方法也与结核分枝杆菌之外的分枝杆菌相容。
USP培养的优点:
1.该方法不涉及使用昂贵试剂,例如NALC。
2.USP溶液是具有中性pH的缓冲的溶液。因此在培养前无需对样品进行中和。
3.该方法具有通用性质,可以用于从痰以及各种各样的肺和肺外样品培养结核分枝杆菌。
4.USP溶液是非常有效的净化剂,并适于在具有潮湿气候的热带国家使用。
5.该方法还与结核分枝杆菌之外的分枝杆菌和革兰氏阳性生物如葡萄球菌属种的培养相容。
USP核酸分离方法的优点:
1.由于该方法是一种多用途方法,故无需一个单独的方法用于从加工用于涂片显微镜检和培养的样品分离DNA/RNA。
2.该方法可以从各种各样的肺和肺外来源样品分离无抑制剂的PCR可扩增DNA,实际上可以将该方法称为一种通用加工方法。它有效地从临床样品(例如,血液、咳血痰(hemoptyic sputum)样品)除去已知是有力的PCR抑制剂(Mahony等,1998;Al-Soud和Radstrom P 2001;Kang等,2002)的血红蛋白。
3.该方法不涉及使用危险有机溶剂如酚或氯仿或昂贵的酶如溶菌酶等。
4.由于该方法含有离液剂GuHCl——一种有效的RNase变性剂,故该方法与从临床样品分离高质量的分枝杆菌RNA相容。
基于devR的PCR的优点:
1.和基于***序列IS6110的流行试验大不相同,devR基因在结核分枝杆菌复合群的所有物种和分离菌(包括,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌)中保守。IS6110序列据报道在印度和全球的一定比例的临床分离物中缺失。[Dale等,1997,Barlow等,2001,Narayanan等,2001]。
模块化的技术的优点:
该技术适于任何类型的体液和组织活检物(除了未检查的粪便物)。本发明技术可以用于各种临床环境和实验室。(1)它可以在具有最少设备(仅涡旋振荡器、光学显微镜和可以达到4000rpm速度的室温离心机)的实验室中用于涂片显微镜检。(2)它可以在具有培养分枝杆菌的额外设施的实验室中用于涂片显微镜检和培养。(3)最后,可以在完善的实验室中应用PCR和RT-PCR检查。
因此,该技术可以按如下进行市场销售以配合个体需要:
试剂盒1:通用样品加工(USP)试剂盒[含有4-6M GuHCl和0.1-0.2β-巯基乙醇;细节见“详述”]。
试剂盒2:USP、涂片和培养试剂盒。
试剂盒3:USP、涂片、培养和DNA分离试剂盒。
试剂盒4:完全试剂盒(USP、涂片、培养、DNA分离和PCR)
试剂盒5:作为从临床样品分离分枝杆菌RNA的试剂盒的一部分。
9.本发明的多个有意义的方面:
1.本发明方法单独可以服务于通过分子和微生物学方法诊断TB的所有三个重要方面,即,涂片显微镜检术、培养和PCR/RT-PCR。实际上,该方法可以声称为一种通用加工方法。
2.该方法学是通用的,可以应用于所有类型的人类临床材料,包括呼吸道样品(自发咳出的痰、生理盐水喷雾诱导的痰、经气管的吸出物、支气管肺泡灌洗物、喉拭子、鼻烟拭子)、体液(胸膜液、心包液、关节吸出物、胃吸出物、腹膜液、脑脊髓液、尿、脓、子宫内膜吸出物、滑液)、身体组织(血液、骨髓活检物)和实体器官(***、骨、皮肤)和牛样品(淋巴腺、奶和血液)。
3.该方法快速;其需要最多2小时来完成样品加工。
4.该方法也适于从冰冻的痰样品(-20℃储存多达2个月)和冰冻的肺外样品进行的涂片显微镜检术、培养和PCR。
5.该方法在经某些修改后适用于分离宿主(人类)DNA。
与USP溶液有关的其它方面:
1.安全:(i)USP溶液含有盐酸胍(GuHCl)而非异硫氰酸胍(GuSCN)作为主要成分。由于GuSCN与酸接触时产生潜在的有害气体HCN,因此在处置掉含有该化学品的溶液时需要极为小心。因此,其不适于非专门化的常规微生物学实验室。但是,在该试剂中使用GuHCl使得可以安全地操作和处置该试剂。(ii)USP溶液不使用任何危险有机溶剂。
2.稳定性和操作:无需特殊操作。
3.节省成本:USP方法与IRS方法不同,其不涉及使用昂贵试剂NALC。此外,GuHCl也比GuSCN(抑制剂除去溶液的一部分)便宜。
4.USP溶液是中性pH溶液:USP溶液是缓冲的中性pH溶液。因此,在从净化后的样品培养结核分枝杆菌和其它分枝杆菌之前无需额外的涉及中和作用的步骤。USP溶液也与RNA分离方案相容。
5.粘液溶解、净化、蛋白质变性、离液作用、液化、组织软化/消化、释放分枝杆菌的作用。
6.USP的三种主要成分(包括离液剂GuHCl、去污剂十二烷基肌氨酸钠和还原剂β-巯基乙醇)协同作用。
与涂片显微镜检术相关的方面:
1.本发明方法十分适于制备用于高灵敏度显微镜检术的涂片。该方法已经证实可以重现性地检测含有可达300-400个杆菌/ml痰的样品。这比涂片检查的直接方法灵敏大约30倍。该灵敏度(检测限)还可以进一步通过将超过所建议的10%的经加工样品用于涂片显微镜检而增加。
2.由于该方法处理整个痰样品,因此,缺乏脓或含有鼻咽排出物或唾液的痰也可以容易地使用该方法加工。
3.由于该方法有效地除去痰中的组织和细胞碎屑及蛋白质性废料(复染物质(counterstaining material)),故可以取样品的至少10%在极小区域(1cm×1cm)制备涂片,而不会有得到过厚涂片或获得干扰载玻片显微镜检的高背景的机会(见图9B)。这使得可以将更多杆菌涂在载玻片上,由此相当程度地增加该显微镜检方法的灵敏度,并最小化在检查每个载玻片时花费的时间。因此,此USP方法一般将按照直接方法分级为1+或极少的载玻片分别转变为2+/3+或2+/1+。根据相同的原则,利用直接方法被读为阴性的载玻片可以通过此USP方法变为阳性。在此必须提及的是,对于涂片的各方法,针对阴性样品所扫描的视野数是300-500个,并且为了确信样品的状况,该视野数不限于100个视野。就我们所知,此方法是迄今所报道的最灵敏的方法,具有每ml样品300-400个杆菌的检测限。(图3)。
4.该灵敏度(检测限)可以进一步地通过将超过所建议的10%的经加工的样品用于涂片显微镜检术而增加。
5.在不实施培养和PCR检查的情况下,可以在多个载玻片上检查>10%的样品。预期该方法可以进一步提高通过USP方法实施的涂片显微镜检术的灵敏度。
6.此方法也与结核分枝杆菌之外的分枝杆菌相容。
7.此涂片显微镜检术方法可应用于所有的分枝杆菌,包括缓慢生长的物种如属于结核分枝杆菌复合群的生物、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、蟾分枝杆菌等,快速生长的物种如耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、草分枝杆菌、牝牛分枝杆菌、戈特氏分枝杆菌等,和不可培养的物种如麻风分枝杆菌(M.leprae)。
8.USP涂片显微镜检方法与革兰氏阳性生物例如葡萄球菌属种相容,并预期可以应用于其它耐酸性杆菌(例如,Cryptosporidium sp.,诺卡氏菌属种(Nocardia sp.),Isospora belli和Rhodococcus equi.)
9.高度灵敏:该方法有效地从样品中去除背景复染物,使得可以在载玻片上涂至少10%的样品,否则这将是不可能的。由于复染废料的如此有效的去除,涂多达10%的样品也不会产生厚涂片并且该涂片可以非常容易地热固定和染色(图9b)。
10.可以直接地加工组织活检样品用于涂片显微镜检,而避开固定、石蜡包埋和切片的常规组织学程序。
与培养有关的方面:
1.USP溶液起到非常有效的净化剂的作用,并适于在具有潮湿气候的热带国家使用。
2.该方法不涉及使用昂贵试剂,如NALC。
3.USP溶液是具有中性pH的缓冲的溶液,且不涉及使用NaOH。因此,在培养之前,无需中和样品。样品中和在涉及用NaOH净化的方法(例如CDC方法)中是首先的要求。不适当的中和常常不利地影响培养结果。
4.该方法是通用的,可以用于培养来自痰以及各种各样肺和肺外样品的结核分枝杆菌。
5.该方法也与MOTT杆菌的培养相容。
与DNA分离和基于devR的PCR有关的方面:
1.由于此方法是一个多用途方法,故无需单独的方法用于从加工用于涂片显微镜检术和培养的样品分离DNA。
2.此方法有效地除去PCR抑制剂。可以从所有类型的肺和肺外样品可重现地分离无抑制剂的PCR可扩增DNA。
3.此方法不涉及使用危险有机溶剂,如酚或氯仿或昂贵的酶如溶菌酶等。
4.此DNA分离方法将与PCR之外的其它核酸扩增方法,例如连接酶链式反应、链置换试验等相容。
5.描述了一个能够灵敏、特异地诊断结核的特异性灵敏PCR试验。
6.与分离DNA的IRS方法[Chakravorty和Tyagi 2001;抑制剂去除溶液(IRS)包括在题为“用于从临床样品分离PCR可扩增的结核分枝杆菌DNA的快速、有效单管提取方法”的专利申请中,其中所述申请在NewDelhi专利局提出,申请号497/DEL/2000。]相比,USP方法被很大简化并且涉及更少的技术。首先,可以在最大速度可达4000rpm的台式离心机上室温进行离心,由此避开对高速冷冻离心机的需要。其二,消除了NALC作为粘液溶解剂的使用,由此节约成本。其三,USP方法对环境有利,因为其不涉及使用异硫氰酸胍。其四,USP方法不需要使用溶菌酶。
7.该DNA分离方法也与用于检测其它分枝杆菌的核酸扩增方法相容。
8.由于此USP加工方法不涉及用碱进行处理,因此,其也与从临床样品分离RNA的程序以及RNA扩增程序如转录介导的扩增相容。
与RNA分离和扩增技术相关的方面:
1.经USP处理的分枝杆菌适用于标准RNA-分离方案。
2.由此分离的RNA适于使用酶如逆转录酶、Taq DNA聚合酶等通过扩增技术实施的进一步分析。
3.mRNA和rRNA均可以成功地从经USP处理的结核分枝杆菌分离。
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序列表
<110>All India Institute of Medical Science
<120>使用经过加工的临床样品通过涂片显微镜检术、培养和聚合酶链式反应诊断结核的方法及其试剂盒。
<130>PCT-351
<160>4
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tggcaacggc attgaactgt 20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
taagcaggcc cagtagcgt 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atctgttgtc ccgcatgcc 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gtccagcgcc cacatcttt 19
Claims (116)
1.一种有效且经济的加工可用于简单、快速、安全、灵敏且准确地诊断细菌感染的临床样品的方法,该方法使用包含由通用样品加工(USP)溶液(由浓度3至6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.3M的β-巯基乙醇组成)组成的溶液1、由浓度65-70mM且pH6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2(可选择地,可以由无菌水替代)、和由浓度0.03-0.08%的Tween 80组成的溶液3、及用于分离DNA的包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B和包含浓度0.2-0.4%的Tween 20的溶液C(任选地,可以使用单独溶液3或具有0.03-0.1% Triton X 100的溶液3代替溶液A、B和C从含高杆菌载量或低废料的样品分离DNA)的组合物,所述方法包括步骤:
a.获得临床样品,
b.将1.5至2体积的溶液1与样品混合,
c.匀浆混合物并避免起泡,
d.向匀浆物添加溶液2或无菌水,之后离心获得沉淀,
e.任选地取决于沉淀体积的减少,用溶液1洗涤沉淀,
f.用水洗涤经溶液1洗涤的沉淀,和
g.将水洗涤后的沉淀重悬在溶液3中,以得到用于诊断的经加工样品。
2.权利要求1的方法,其中,所述经加工的样品可以以涂片、培养物或使用PCR可扩增的分枝杆菌DNA和RNA的聚合酶链式反应(PCR)起始材料的形式使用。
3.权利要求1的方法,其中所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度3-6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.3M的β-巯基乙醇。
4.权利要求1的方法,其中所述经加工样品可以用于包括结核分枝杆菌的分枝杆菌,和革兰氏阳性生物如葡萄球菌属种的涂片显微镜检术。
5.权利要求1的方法,其中匀浆持续时间20-120秒。
6.权利要求3的方法,其中溶液1的盐酸胍裂解真核和革兰氏阴性细胞、使蛋白质变性、液化样品并灭活内源性酶。
7.权利要求1的方法,其中所述加工在总共1-2小时的持续时间内完成。
8.权利要求1的方法,其中所述方法产生无抑制剂的、用于基于PCR诊断分枝杆菌疾病,包括TB和麻风病的分枝杆菌DNA。
9.权利要求1的方法,其中用于仅仅加工培养和涂片样品的通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约4M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.1M的β-巯基乙醇。
10.权利要求1的方法,其中用于加工培养、涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约5M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.2M的β-巯基乙醇。
11.权利要求1的方法,其中用于仅加工涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.2M的β-巯基乙醇。
12.权利要求1的方法,其中USP中的盐酸胍(GuHCl)、十二烷基肌氨酸钠和β-巯基乙醇以协同方式作用以实现对所有类型的临床样品的最佳加工。
13.权利要求12的方法,其中β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的存在适于粘液样痰样品的最佳加工。
14.权利要求12的方法,其中GuHCl以及β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的存在对于粘液脓性的痰样品的最佳加工是绝对必需的。
15.权利要求12的方法,其中对于含有血液的标本,GuHCl通过变性血红蛋白和将其从标本中除去而作为主要的抑制剂去除组分起作用。
16.权利要求12的方法,其中GuHCl作为临床标本的主要净化剂起作用。
17.权利要求1的方法,其中对于含有高杆菌载量和/或较低量废料的样品,PCR可扩增的分枝杆菌DNA可以通过在溶液3存在下煮沸或通过添加0.03-0.1% Triton X 100来简单裂解而获得,而无需使用溶液A、B和C。
18.权利要求1的方法,其中所述经加工的样品无污染性生物、蛋白质、酶和干扰性物质。
19.权利要求2的方法,其中在涂片显微镜检术下所述方法可以检测大约300-400个杆菌/ml样品。
20.权利要求2的方法,其中所述方法比常规直接涂片显微镜检方法具有增强大约30倍的灵敏度。
21.权利要求2的方法,其中在涂片中所述方法显示出97-99%的灵敏度。
22.权利要求2的方法,其中在涂片中所述方法显示出83-92%的特异性。
23.权利要求2的方法,其中所述方法显示出比涂片显微镜检术的CDC方法增加大约18%的灵敏度。
24.权利要求2的方法,其中所述方法显示出比直接涂片方法增加大约30%的灵敏度。
25.权利要求2的方法,其中在涂片中所述方法显示出80-96%的阳性预测值。
26.权利要求2的方法,其中在涂片中所述方法显示出91-99%的阴性预测值。
27.权利要求2的方法,其中在涂片中所述方法显示出大约91%的诊断准确度。
28.权利要求2的方法,其中所述方法降低复染背景使得可以更好地观察载玻片、提高载玻片的分级、并减少阅读载玻片的时间和劳动。
29.权利要求2的方法,其中所述方法比CDC方法更有效地净化样品。
30.权利要求2的方法,其中在培养中,与未处理的微生物相比,所述方法导致微生物菌落延迟大约1周出现。
31.权利要求2的方法,其中在培养中所述方法显示出大约50%的灵敏度。
32.权利要求2的方法,其中所述方法比CDC方法更适于热带地区。
33.权利要求2的方法,其中在培养中所述方法在中性pH下运行。
34.权利要求2的方法,其中在PCR中所述方法显示出测试的任何临床标本类型对PCR试验均无抑制。
35.权利要求2的方法,其中在PCR中所述方法显示出96.5-100%的灵敏度。
36.权利要求2的方法,其中在PCR中所述方法显示出71-100%的特异性。
37.权利要求2的方法,其中在使用所述引物的PCR中所述方法显示出82-100%的阳性预测值。
38.权利要求2的方法,其中在使用所述引物的PCR中所述方法显示出94-100%的阴性预测值。
39.权利要求2的方法,其中在使用所述引物的PCR中所述方法显示出大约90-100%的诊断准确度。
40.权利要求1的方法,其中样品可以获自包含各种类型的痰的来源和其它体液,包括FNAC、脓、胸膜液、心包液、关节吸出物、腹膜液、脑脊髓液、子宫内膜吸出物、滑液、胃吸出物、气管内吸出物、尿、经气管吸出物、支气管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子;身体组织,包括血液、胸膜组织、骨髓和活检物;实体器官,包括***、骨、皮肤;和牛样品,包括淋巴腺、乳汁和血液。
41.权利要求1的方法,其中可以加工在大约-20℃储存长达2个月的样品用于PCR、涂片显微镜检术和培养。
42.权利要求2的方法,其中在PCR中所述方法可以用于DNA和RNA。
43.权利要求1的方法,其中所述组合物显示出粘液溶解、净化、变性蛋白质、离液作用、液化、组织软化/消化以及释放分枝杆菌的作用。
44.权利要求2的方法,其中在涂片中所述方法使得可以将更多的杆菌涂布在载玻片上,由此增加灵敏度和效率。
45.权利要求2的方法,其中在涂片中所述方法一般将通过直接方法分级为1+或极少的载玻片分别转变为2+/3+或2+/1+。
46.权利要求1的方法,其中所述方法有助于加工缺少脓或含有鼻咽排出物和/或唾液和/或血液的痰样品。
47.权利要求1的方法,其中所述方法从组织活检样品产生适于非常灵敏的AFB涂片显微镜检术的高质量涂片。
48.一种加工可用于简单、快速、安全、灵敏和准确地诊断分枝杆菌感染,尤其是由结核分枝杆菌引起的结核病的临床样品的、经济有效的方法,该方法使用包含由通用样品加工(USP)溶液(由浓度3至6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.3M的β-巯基乙醇组成)组成的溶液1、由浓度65-70mM且pH6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2(可选择地,可以由无菌水代替)、和由浓度0.03-0.08%的Tween80组成的溶液3、以及用于分离DNA的包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B和包含浓度0.2-0.4%的Tween 20的溶液C(任选地,可以使用单独溶液3或具有0.03-0.1%Triton X 100的溶液3替代溶液A、B和C从含高杆菌载量或低废料的样品分离DNA)的组合物,所述方法包括步骤:
a.获得临床样品,
b.将样品与1.5至2体积溶液1混合,
c.匀浆混合物同时避免起泡,
d.向匀浆物添加溶液2以得到沉淀,任选地溶液2可以由无菌水替代,
e.用溶液1洗涤沉淀,
f.用水洗涤经溶液1洗涤后的沉淀,和
g.将水洗后的沉淀重新悬浮在溶液3中获得用于诊断的经加工样品。
49.权利要求47的方法,其中所述经加工样品可以以涂片、培养物或使用PCR可扩增的分枝杆菌DNA和RNA的聚合酶链式反应(PCR)起始材料的形式使用。
50.权利要求47的方法,其中所述经加工样品可以以涂片、培养物或聚合酶链式反应(PCR)起始材料的形式使用,其中可以通过煮沸的简单裂解作用获得PCR可扩增的分枝杆菌DNA。
51.权利要求47的方法,其中所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度3-6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.3M的β-巯基乙醇。
52.权利要求47的方法,其中所述方法维持活样品的生存力。
53.权利要求47的方法,其中匀浆持续时间20-120秒。
54.权利要求47的方法,其中溶液1的盐酸胍裂解真核和革兰氏阴性细胞、使蛋白质变性、液化样品和灭活内源性酶。
55.权利要求47的方法,其中所述加工在总共1-2小时的持续时间内完成。
56.权利要求47的方法,其中所述方法产生无抑制剂的、用于基于PCR的诊断的分枝杆菌DNA。
57.权利要求48的方法,其中用于加工培养和涂片样品的通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约4M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.1M的β-巯基乙醇。
58.权利要求48的方法,其中用于加工培养、涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含大约5M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.2M的β-巯基乙醇。
59.权利要求48的方法,其中用于加工涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.2M的β-巯基乙醇。
60.权利要求48的方法,其中所述组合物包含由通用样品加工(USP)溶液组成的溶液1、由浓度为65-70mM且pH为6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2、由浓度0.03-0.08%的Tween 80组成的溶液3、以及任选地,包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、和/或由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B、和/或浓度0.2-0.4%的Tween 20。
61.权利要求48的方法,其中溶液A、溶液B和溶液C的应用可以限于仅从低杆菌载量的样品中分离DNA。
62.权利要求48的方法,其中USP中的盐酸胍(GuHCl)、十二烷基肌氨酸钠和β-巯基乙醇以协同方式作用以实现对所有类型的临床样品的最佳加工。
63.权利要求48的方法,其中β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的存在适于粘液样痰样品的最佳加工。
64.权利要求48的方法,其中GuHCl以及β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的一起存在对于粘液脓性痰样品的最佳加工是绝对必需的。
65.权利要求48的方法,其中对于含有血液的样品,GuHCl通过变性血红蛋白和从标本中除去该蛋白质而作为主要的抑制剂去除组分起作用。
66.权利要求48的方法,其中GuHCl作为临床标本的主要净化剂起作用。
67.权利要求48的方法,其中对于含有高杆菌载量和/或较低的废料含量的样品,PCR可扩增的分枝杆菌DNA可以通过在0.04%-0.06%Tween 80存在下煮沸或通过添加0.03-0.1%Triton X 100,经简单裂解而获得,而无需使用溶液A、B和C。
68.权利要求47的方法,其中所述经加工的样品无污染性生物、蛋白质、酶和干扰性物质。
69.权利要求48的方法,其中在涂片显微镜检术下所述方法可以检测到300-400个杆菌/ml的样品。
70.权利要求48的方法,其中通过使用10%以上的经加工样品用于涂片制备,涂片显微镜检术可以检测到少于300-400个杆菌/ml的样品。
71.权利要求48的方法,其中所述方法比常规直接涂片显微镜检方法具有增强大约30倍的灵敏度。
72.权利要求48的方法,其中在涂片中所述方法显示出97-99%的灵敏度。
73.权利要求48的方法,其中在涂片中所述方法显示出83-92%的特异性。
74.权利要求48的方法,其中所述方法显示出比涂片显微镜检术的CDC方法增加大约18%的灵敏度。
75.权利要求48的方法,其中所述方法显示出比直接涂片法增加大约30%的灵敏度。
76.权利要求48的方法,其中在涂片中所述方法显示出80-96%的阳性预测值。
77.权利要求48的方法,其中在涂片中所述方法显示出91-99%的阴性预测值。
78.权利要求48的方法,其中在涂片中所述方法显示出大约91%的诊断准确度。
79.权利要求48的方法,其中所述方法降低复染背景使得可以更好地观察载玻片、提高载玻片的分级、并减少阅读载玻片的时间和劳动。
80.权利要求48的方法,其中所述方法比CDC方法更有效地进行样品的净化。
81.权利要求48的方法,其中在培养中,与CDC方法相比,所述方法显示出两倍的微生物生存力。
82.权利要求48的方法,其中在培养中,与未处理的微生物相比,所述方法导致微生物菌落延迟大约1周出现。
83.权利要求48的方法,其中在培养中所述方法显示出大约50%的灵敏度。
84.权利要求48的方法,其中所述方法比CDC方法更适于热带地区。
85.权利要求48的方法,其中在培养中所述方法在中性pH下运行。
86.权利要求48的方法,其中在PCR中所述方法显示出对PCR试验无抑制。
87.权利要求48的方法,其中在PCR中所述方法显示微生物结核分枝杆菌的devR基因的两组引物,即,devRf2 & devRr2和devRf3 &devRr3。
88.权利要求79的方法,其中引物devRf2和devRr2扩增微生物结核分枝杆菌devR基因的308bp片段。
89.权利要求79的方法,其中引物devRf3和devRr3扩增微生物结核分枝杆菌devR基因的164bp片段。
90.权利要求79的方法,其中在使用引物devRf2和devRr2的PCR中所述方法显示出比devRf和devRr增加2-4倍的灵敏度。
91.权利要求79的方法,其中在使用引物devRf3和devRr3的PCR中所述方法显示出比引物devRf和devRr增加至少10倍的灵敏度。
92.权利要求48的方法,其中样品可以获自包含各种类型的痰的来源和其它体液,包括FNAC、脓、胸膜液、心包液、关节吸出物、腹膜液、脑脊髓液、子宫内膜吸出物、滑液、胃吸出物、气管内吸出物、尿、经气管吸出物、支气管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子;身体组织,包括血液、胸膜组织、骨髓和活检物;实体器官,包括***、骨、皮肤;和牛样品,包括淋巴腺、乳汁和血液。
93.权利要求48的方法,其中可以加工在大约-20℃储存多达2个月的样品用于PCR、涂片显微镜检术和培养。
94.权利要求48的方法,其中在PCR中所述方法可以用于DNA和RNA。
95.权利要求48的方法,其中所述组合物显示出粘液溶解、净化、变性蛋白质、离液作用、液化、软化/消化组织以及释放分枝杆菌的作用。
96.权利要求48的方法,其中在涂片中所述方法使得可以将更多的杆菌涂在载玻片上,由此增加灵敏度和效率。
97.权利要求48的方法,其中在涂片中所述方法一般将通过直接方法分级为1+或极少的载玻片分别转变为2+/3+或2+/1+。
98.权利要求48的方法,其中可以加工缺少脓或含有鼻咽排出物或唾液的样品。
99.权利要求48的方法,其中所述方法从组织活检样品产生适于非常灵敏的AFB涂片显微镜检术的高质量涂片。
100.权利要求48的方法,其中所述方法对结核分枝杆菌的耐酸性质、生存力和完整性显示出无不利影响。
101.权利要求47的方法,其中所述方法适于诊断肺结核和肺外结核且功效相同。
102.权利要求47的方法,其中所述方法与在固体和液体培养基中培养来自临床标本的分枝杆菌相容。
103.权利要求48的方法,其中对于通过涂片显微镜检术的直接方法和CDC方法已经检测为阴性的样品,所述方法可以将其检测为阳性。
104.一种用于加工临床样品的试剂盒,所述临床样品用于简单、快速、安全、灵敏和准确地诊断微生物疾病状况,所述试剂盒包含由通用样品加工(USP)溶液(由浓度3-6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.3M的β-巯基乙醇组成)组成的溶液1、由浓度65-70mM且pH6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2(可选择地,可以由无菌水代替)、由浓度0.03-0.08%的Tween 80组成的溶液3、包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B和由浓度0.2-0.4%的Tween 20组成的溶液C,任选地两组引物,分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的devRf2和devRr2引物和分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的devRf3和devRr3引物。
105.权利要求104的试剂盒,其中所述试剂盒在加工用于检测细菌感染的临床样品中有用。
106.权利要求104的试剂盒,其中所述试剂盒在加工用于检测结核病的临床样品中有用。
107.权利要求104的试剂盒,其中所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度3-6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.3M的β-巯基乙醇。
108.权利要求104的试剂盒,其中用于加工培养和涂片样品的通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约4M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.1M的β-巯基乙醇。
109.权利要求104的试剂盒,其中用于加工培养、涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约5M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度0.1-0.2M的β-巯基乙醇。
110.权利要求104的试剂盒,其中用于加工涂片和PCR样品的所述通用样品加工(USP)溶液包含浓度大约6M的盐酸胍(GuHCl)、浓度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、浓度20-30mM的EDTA、浓度0.3-0.8%的十二烷基肌氨酸钠、浓度大约0.2M的β-巯基乙醇。
111.权利要求104的试剂盒,其中所述组合物包含由通用样品加工(USP)溶液组成的溶液1、由浓度为65-70mM且pH为6.7-6.8的磷酸钠组成的溶液2、由浓度0.03-0.08%的Tween 80组成的溶液3、以及任选地,包含浓度8-12%的Chelex 100悬浮液的溶液A、和由浓度0.02-0.04%的Triton X-100组成的溶液B、和由浓度0.2-0.4%的Tween 20组成的溶液C。
112.一组分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的devRf2和devRr2引物。
113.一组分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的devRf3和devRr3引物。
114.使用基因devR的SEQ ID NO:1和2或SEQ ID NO:3和4的引物筛选结核病患者的方法,所述方法包括步骤:使用受试者的经加工样品的DNA或RNA实施聚合酶链式反应(PCR),鉴定患有结核病的受试者。
115.通过使用权利要求1的方法加工临床标本而获得的经加工临床样品。
116.权利要求112的经加工样品,其中所述临床标本包括所有类型的痰和其它体液,包括FNAC、脓、胸膜液、心包液、关节吸出物、腹膜液、脑脊髓液、子宫内膜吸出物、滑液、胃吸出物、气管内吸出物、尿、经气管吸出物、支气管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子;身体组织,包括血液、胸膜组织、骨髓和活检物;实体器官,包括***、骨、皮肤;和牛样品,包括淋巴腺、奶和血液。
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