CN105392363A - 样品的固定和稳定化 - Google Patents
样品的固定和稳定化 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105392363A CN105392363A CN201480024553.9A CN201480024553A CN105392363A CN 105392363 A CN105392363 A CN 105392363A CN 201480024553 A CN201480024553 A CN 201480024553A CN 105392363 A CN105392363 A CN 105392363A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- component
- application
- congruent melting
- rna
- melting solvent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 title description 83
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 118
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 74
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 224
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 claims description 207
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 188
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 claims description 184
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical group [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 184
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 claims description 184
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 177
- NRKYWOKHZRQRJR-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetamide Chemical group NC(=O)C(F)(F)F NRKYWOKHZRQRJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 155
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 136
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 136
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 133
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 132
- -1 3,3,3-trifluoropropyl acid amides Chemical class 0.000 claims description 92
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 70
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 61
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 61
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 58
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 56
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 47
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 33
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 32
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims description 30
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 28
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 28
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 28
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 26
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 22
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims description 20
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 20
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 20
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical group [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims description 20
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 claims description 20
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 16
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 16
- 125000003709 fluoroalkyl group Chemical group 0.000 claims description 16
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 claims description 16
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 15
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims description 14
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 14
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 14
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical group NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims description 14
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 claims description 13
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical group NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 12
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 12
- XLSZMDLNRCVEIJ-UHFFFAOYSA-N methylimidazole Natural products CC1=CNC=N1 XLSZMDLNRCVEIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 12
- 125000004950 trifluoroalkyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 10
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 10
- AVQQQNCBBIEMEU-UHFFFAOYSA-N 1,1,3,3-tetramethylurea Chemical compound CN(C)C(=O)N(C)C AVQQQNCBBIEMEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ZFPGARUNNKGOBB-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-2-pyrrolidinone Chemical group CCN1CCCC1=O ZFPGARUNNKGOBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 8
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 8
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 claims description 8
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 claims description 8
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 claims description 8
- VZBAIMIVLDKBTE-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroethanethioamide Chemical group NC(=S)C(F)(F)F VZBAIMIVLDKBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 7
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 claims description 7
- ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M iodate Chemical compound [O-]I(=O)=O ICIWUVCWSCSTAQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 7
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 7
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 7
- JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium bromide Chemical group [Br-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 claims description 7
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical group CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000370738 Chlorion Species 0.000 claims description 6
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 claims description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 6
- NHGXDBSUJJNIRV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium chloride Chemical group [Cl-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC NHGXDBSUJJNIRV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- KKKDZZRICRFGSD-UHFFFAOYSA-N 1-benzylimidazole Chemical compound C1=CN=CN1CC1=CC=CC=C1 KKKDZZRICRFGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical group CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical group CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QASPDCZPPDUIIE-UHFFFAOYSA-N 2,2-difluoro-2-phenylacetamide Chemical class NC(=O)C(F)(F)C1=CC=CC=C1 QASPDCZPPDUIIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RNRBGHTUJLSGBK-UHFFFAOYSA-N 2-fluoro-2-phenylacetamide Chemical class NC(=O)C(F)C1=CC=CC=C1 RNRBGHTUJLSGBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LXBGSDVWAMZHDD-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1h-imidazole Chemical compound CC1=NC=CN1 LXBGSDVWAMZHDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZRNSSRODJSSVEJ-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentacosane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(C)C ZRNSSRODJSSVEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical group NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- XCEUHXVTRJQJSR-UHFFFAOYSA-N bromo(phenyl)phosphane Chemical compound BrPC1=CC=CC=C1 XCEUHXVTRJQJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims description 4
- 125000001028 difluoromethyl group Chemical group [H]C(F)(F)* 0.000 claims description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 4
- 125000003784 fluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(F)C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N monofluoromethane Natural products FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002769 thiazolinyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229940057054 1,3-dimethylurea Drugs 0.000 claims description 3
- IQNHBUQSOSYAJU-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-n-methylacetamide Chemical group CNC(=O)C(F)(F)F IQNHBUQSOSYAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MGJKQDOBUOMPEZ-UHFFFAOYSA-N N,N'-dimethylurea Chemical group CNC(=O)NC MGJKQDOBUOMPEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical group [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940006460 bromide ion Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 3
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-M iodide Chemical compound [I-] XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229940006461 iodide ion Drugs 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium chloride Chemical group [Cl-].CC[N+](CC)(CC)CC YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-O (R)-carnitinium Chemical group C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC(O)=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-O 0.000 claims description 2
- GFFIJCYHQYHUHB-UHFFFAOYSA-N 2-acetylsulfanylethyl(trimethyl)azanium Chemical compound CC(=O)SCC[N+](C)(C)C GFFIJCYHQYHUHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JJCWKVUUIFLXNZ-UHFFFAOYSA-M 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].C[N+](C)(C)CCO JJCWKVUUIFLXNZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- LSBDFXRDZJMBSC-UHFFFAOYSA-N 2-phenylacetamide Chemical class NC(=O)CC1=CC=CC=C1 LSBDFXRDZJMBSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 claims description 2
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 claims description 2
- 229910007926 ZrCl Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 229940051250 hexylene glycol Drugs 0.000 claims description 2
- GRHBQAYDJPGGLF-UHFFFAOYSA-N isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S GRHBQAYDJPGGLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004205 trifluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C(F)(F)F 0.000 claims description 2
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-O triphenylphosphanium Chemical compound C1=CC=CC=C1[PH+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 2
- VXIVSQZSERGHQP-HQMMCQRPSA-N 2-chloroacetamide Chemical group N[14C](=O)CCl VXIVSQZSERGHQP-HQMMCQRPSA-N 0.000 claims 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims 1
- GDCXBZMWKSBSJG-UHFFFAOYSA-N azane;4-methylbenzenesulfonic acid Chemical compound [NH4+].CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 GDCXBZMWKSBSJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 claims 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 221
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 abstract description 14
- 230000005496 eutectics Effects 0.000 abstract description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 67
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 64
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 34
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 32
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 27
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 24
- 230000008859 change Effects 0.000 description 24
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 23
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 21
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 20
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 20
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 19
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 229960004279 formaldehyde Drugs 0.000 description 18
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 16
- 238000005453 pelletization Methods 0.000 description 16
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 15
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 15
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 14
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 14
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- FVTWJXMFYOXOKK-UHFFFAOYSA-N 2-fluoroacetamide Chemical compound NC(=O)CF FVTWJXMFYOXOKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 12
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 11
- 239000002585 base Substances 0.000 description 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 11
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 11
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 10
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 10
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 10
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 9
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 9
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 9
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 8
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 8
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 8
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 8
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 8
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 8
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 7
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 229940074410 trehalose Drugs 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 6
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 6
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 6
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 6
- 235000016804 zinc Nutrition 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 5
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 5
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 5
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 5
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 5
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 5
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 4
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 4
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 4
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- CZBPPJYLRIQBNZ-UHFFFAOYSA-M tributyl(icosyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC CZBPPJYLRIQBNZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCO)C=C1 LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 3
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 3
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 3
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 3
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 3
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000031709 bromination Effects 0.000 description 3
- 238000005893 bromination reaction Methods 0.000 description 3
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 3
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- HNNSUZPWERIYIL-UHFFFAOYSA-N chembl1730100 Chemical compound O1CC2(O)CC3=CC(O)=C(O)C=C3C2=C2C1=C(O)C(=O)C=C2 HNNSUZPWERIYIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 3
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 3
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 3
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 3
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 description 3
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 239000001124 (E)-prop-1-ene-1,2,3-tricarboxylic acid Substances 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ORCCSQMJUGMAQU-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tribromoacetamide Chemical compound NC(=O)C(Br)(Br)Br ORCCSQMJUGMAQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJVAMHKKJGICOG-UHFFFAOYSA-N 2,5-hexanedione Chemical compound CC(=O)CCC(C)=O OJVAMHKKJGICOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hexadecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 2-phenylacetic acid Chemical compound O[14C](=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-M 3-carboxy-2-(carboxymethyl)-2-hydroxypropanoate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 4-oxopentanoic acid Chemical compound CC(=O)CCC(O)=O JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- 241001044369 Amphion Species 0.000 description 2
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N BAPTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1=CC=CC=C1OCCOC1=CC=CC=C1N(CC(O)=O)CC(O)=O FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000510004 Bipes Species 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- OXQKEKGBFMQTML-UHFFFAOYSA-N D-glycero-D-gluco-heptitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)CO OXQKEKGBFMQTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000360590 Erythrites Species 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101710091977 Hydrophobin Proteins 0.000 description 2
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 2
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-M L-tartrate(1-) Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-M 0.000 description 2
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 2
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] Chemical compound OS(O)(=O)=O.CCCCCCCCCCCC[Na] RCEAADKTGXTDOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 2
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YTGJWQPHMWSCST-UHFFFAOYSA-N Tiopronin Chemical compound CC(S)C(=O)NCC(O)=O YTGJWQPHMWSCST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058907 Tiopronin Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- WHMDKBIGKVEYHS-IYEMJOQQSA-L Zinc gluconate Chemical compound [Zn+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O WHMDKBIGKVEYHS-IYEMJOQQSA-L 0.000 description 2
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940091181 aconitic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXVGBQCEAQZMLW-UHFFFAOYSA-N alpha-solanine Natural products CC1CCC2C(C)C3C(CC4C5CC=C6CC(CCC6(C)C5CCC34C)OC7OC(CO)C(O)C(OC8OC(CO)C(O)C(O)C8O)C7OC9OC(CO)C(O)C(O)C9O)N2C1 RXVGBQCEAQZMLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000387 ammonium dihydrogen phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- XYXNTHIYBIDHGM-UHFFFAOYSA-N ammonium thiosulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])(=O)=S XYXNTHIYBIDHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000001754 blood buffy coat Anatomy 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 description 2
- VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N chloroacetamide Chemical compound NC(=O)CCl VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GTZCVFVGUGFEME-IWQZZHSRSA-N cis-aconitic acid Chemical compound OC(=O)C\C(C(O)=O)=C\C(O)=O GTZCVFVGUGFEME-IWQZZHSRSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 2
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCGGWVOVFQNRRS-UHFFFAOYSA-N dichloroacetamide Chemical compound NC(=O)C(Cl)Cl WCGGWVOVFQNRRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- GHLKSLMMWAKNBM-UHFFFAOYSA-N dodecane-1,12-diol Chemical compound OCCCCCCCCCCCCO GHLKSLMMWAKNBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 150000001261 hydroxy acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 2
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000002829 nitrogen Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 2
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 2
- 229920005644 polyethylene terephthalate glycol copolymer Polymers 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 2
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 2
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 2
- 229940001516 sodium nitrate Drugs 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 229940031352 solanine Drugs 0.000 description 2
- ZGVSETXHNHBTRK-OTYSSXIJSA-N solanine Chemical compound O([C@H]1[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)O)O[C@@H]1CC2=CC[C@H]3[C@@H]4C[C@@H]5N6C[C@@H](C)CC[C@@H]6[C@H]([C@@H]5[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZGVSETXHNHBTRK-OTYSSXIJSA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 2
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960001367 tartaric acid Drugs 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004402 tiopronin Drugs 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- GTZCVFVGUGFEME-UHFFFAOYSA-N trans-aconitic acid Natural products OC(=O)CC(C(O)=O)=CC(O)=O GTZCVFVGUGFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WGIWBXUNRXCYRA-UHFFFAOYSA-H trizinc;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Zn+2].[Zn+2].[Zn+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O WGIWBXUNRXCYRA-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- OXQKEKGBFMQTML-KVTDHHQDSA-N volemitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)[C@H](O)[C@H](O)CO OXQKEKGBFMQTML-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 2
- VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L zinc bromide Chemical compound Br[Zn]Br VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011746 zinc citrate Substances 0.000 description 2
- 235000006076 zinc citrate Nutrition 0.000 description 2
- 229940068475 zinc citrate Drugs 0.000 description 2
- 239000011670 zinc gluconate Substances 0.000 description 2
- 235000011478 zinc gluconate Nutrition 0.000 description 2
- 229960000306 zinc gluconate Drugs 0.000 description 2
- KROCKPWNILLQRI-BYPYZUCNSA-N (2R)-2-fluoro-2-(methylamino)propanoic acid Chemical compound CN[C@](C)(F)C(O)=O KROCKPWNILLQRI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- YARNOIDQQUOOES-VKHMYHEASA-N (2r)-2-amino-2-fluoropropanoic acid Chemical compound C[C@@](N)(F)C(O)=O YARNOIDQQUOOES-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RDWIWGLYYQZMFQ-SFOWXEAESA-N (2r)-2-amino-3,3-difluoropropanoic acid Chemical compound FC(F)[C@H](N)C(O)=O RDWIWGLYYQZMFQ-SFOWXEAESA-N 0.000 description 1
- XEYZCKCYJIEQQO-VKHMYHEASA-N (2r)-3-fluoro-2-(methylamino)propanoic acid Chemical compound CN[C@@H](CF)C(O)=O XEYZCKCYJIEQQO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- DHALQLNIDMSKHU-REOHCLBHSA-N (2s)-2-(fluoroamino)propanoic acid Chemical compound FN[C@@H](C)C(O)=O DHALQLNIDMSKHU-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- JXYWFNAQESKDNC-BTJKTKAUSA-N (z)-4-hydroxy-4-oxobut-2-enoate;2-[(4-methoxyphenyl)methyl-pyridin-2-ylamino]ethyl-dimethylazanium Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.C1=CC(OC)=CC=C1CN(CCN(C)C)C1=CC=CC=N1 JXYWFNAQESKDNC-BTJKTKAUSA-N 0.000 description 1
- YBBLOADPFWKNGS-UHFFFAOYSA-N 1,1-dimethylurea Chemical compound CN(C)C(N)=O YBBLOADPFWKNGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon Chemical compound CN1CCN(C)C1=O CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVUQCTGSDJLWCE-UHFFFAOYSA-N 1-benzylpyrrolidin-2-one Chemical class O=C1CCCN1CC1=CC=CC=C1 LVUQCTGSDJLWCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZZZXPLWKPNZLG-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tribromo-n-methylacetamide Chemical compound CNC(=O)C(Br)(Br)Br FZZZXPLWKPNZLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VRXFCUXLPCIOAE-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trichloro-n-methylacetamide Chemical compound CNC(=O)C(Cl)(Cl)Cl VRXFCUXLPCIOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPQQXPKAYZYUKO-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trichloroacetamide Chemical compound OC(=N)C(Cl)(Cl)Cl UPQQXPKAYZYUKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXBWKMLIVXELSF-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-n,n-dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(=O)C(F)(F)F WXBWKMLIVXELSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMQVFHZSXKJCIV-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-n-(2,2,2-trifluoroacetyl)acetamide Chemical compound FC(F)(F)C(=O)NC(=O)C(F)(F)F GMQVFHZSXKJCIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNKADNNVPMGMRX-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;zinc Chemical compound [Zn].OC(=O)C(F)(F)F NNKADNNVPMGMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLQDAFLFPNDCMJ-UHFFFAOYSA-N 2,2-dichloro-n-methylacetamide Chemical compound CNC(=O)C(Cl)Cl BLQDAFLFPNDCMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZXYQEHISUMZAT-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-hydroxy-5-methylphenyl)methyl]-4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C(CC=2C(=CC=C(C)C=2)O)=C1 XZXYQEHISUMZAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYIOVYZMKITKRO-UHFFFAOYSA-N 2-[hexadecyl(dimethyl)azaniumyl]acetate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC([O-])=O TYIOVYZMKITKRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QMNJTINEFPIEOC-UHFFFAOYSA-M 2-acetyloxyethyl(trimethyl)azanium 2,3,4-trihydroxy-4-oxobutanoate Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C.OC(C(O)C([O-])=O)C(O)=O QMNJTINEFPIEOC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VNHZCQZSRZEQTF-UHFFFAOYSA-M 2-acetyloxyethyl(trimethyl)azanium 3-carboxy-3,5-dihydroxy-5-oxopentanoate Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C.OC(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C(O)=O VNHZCQZSRZEQTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IWZHAKMNVJOUQK-UHFFFAOYSA-M 2-acetyloxyethyl(trimethyl)azanium;4-methylbenzenesulfonate Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C.CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 IWZHAKMNVJOUQK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GGRLKHMFMUXIOG-UHFFFAOYSA-M 2-acetyloxyethyl(trimethyl)azanium;hydroxide Chemical compound [OH-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C GGRLKHMFMUXIOG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SMBBQHHYSLHDHF-UHFFFAOYSA-M 2-acetyloxyethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C SMBBQHHYSLHDHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KWIPUXXIFQQMKN-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-(4-cyanophenyl)propanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(C#N)C=C1 KWIPUXXIFQQMKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYTSRQMXRROFPU-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-fluoropropanoate Chemical compound FCC(N)C(O)=O UYTSRQMXRROFPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSTRKXWIZZZYAS-UHFFFAOYSA-N 2-bromoacetyl bromide Chemical compound BrCC(Br)=O LSTRKXWIZZZYAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HOZLOOPIXHWKCI-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-methylacetamide Chemical compound CNC(=O)CCl HOZLOOPIXHWKCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- RPERJPYDELTDMR-UHFFFAOYSA-K 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound C[N+](C)(C)CCO.C[N+](C)(C)CCO.C[N+](C)(C)CCO.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O RPERJPYDELTDMR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- KIZQNNOULOCVDM-UHFFFAOYSA-M 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium;hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)CCO KIZQNNOULOCVDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FNPBHXSBDADRBT-UHFFFAOYSA-M 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].C[N+](C)(C)CCO FNPBHXSBDADRBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AQXWCZGHGXWGAL-UHFFFAOYSA-N 2-iodo-n-methylacetamide Chemical compound CNC(=O)CI AQXWCZGHGXWGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUOSDXNNLBQJLM-UHFFFAOYSA-M 2-iodoethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].C[N+](C)(C)CCI HUOSDXNNLBQJLM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WWILHZQYNPQALT-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-morpholin-4-ylpropanal Chemical compound O=CC(C)(C)N1CCOCC1 WWILHZQYNPQALT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPKKMFOXWKNEEN-UHFFFAOYSA-N 2-methylcholine Chemical compound CC(O)C[N+](C)(C)C JPKKMFOXWKNEEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 3-phenylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKHKJYWPWWBSFZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(diethylamino)phenyl]-(4-diethylazaniumylidenecyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]benzene-1,3-disulfonate;hydron Chemical compound C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C(=CC(=CC=1)S([O-])(=O)=O)S(O)(=O)=O)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 IKHKJYWPWWBSFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJVVIGOQMRRPHH-UHFFFAOYSA-N 4-methylbenzenesulfonic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 IJVVIGOQMRRPHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDFHBQSCUXNBSA-UHFFFAOYSA-N 5-(5-carboxythiophen-2-yl)thiophene-2-carboxylic acid Chemical compound S1C(C(=O)O)=CC=C1C1=CC=C(C(O)=O)S1 DDFHBQSCUXNBSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWVXXGRKLHYWKM-UHFFFAOYSA-N 5-[2-(benzenesulfonyl)ethyl]-3-[(1-methylpyrrolidin-2-yl)methyl]-1h-indole Chemical compound CN1CCCC1CC(C1=C2)=CNC1=CC=C2CCS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 PWVXXGRKLHYWKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 description 1
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 241000709770 Allolevivirus Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- GEHMBYLTCISYNY-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfamate Chemical compound [NH4+].NS([O-])(=O)=O GEHMBYLTCISYNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000724268 Bromovirus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241001505951 Coconut cadang-cadang viroid Species 0.000 description 1
- 241000723655 Cowpea mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000702216 Cystovirus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N D-threitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000047479 Escherichia virus MS2 Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N Ethylene carbonate Chemical compound O=C1OCCO1 KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002395 Euphorbia pulcherrima Species 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 238000006424 Flood reaction Methods 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012424 Freeze-thaw process Methods 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000150562 Hantaan orthohantavirus Species 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000724277 Ilarvirus Species 0.000 description 1
- WZELXJBMMZFDDU-UHFFFAOYSA-N Imidazol-2-one Chemical compound O=C1N=CC=N1 WZELXJBMMZFDDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000712902 Lassa mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000714216 Levivirus Species 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 206010024641 Listeriosis Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000709757 Luteovirus Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- URUWXKFAEKTWKG-UHFFFAOYSA-N N-(hydroxymethyl)trifluoroacetamide Chemical compound OCNC(=O)C(F)(F)F URUWXKFAEKTWKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGLHLAESQEWCR-UHFFFAOYSA-N N-(hydroxymethyl)urea Chemical compound NC(=O)NCO VGGLHLAESQEWCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FNEQHKCQXDKYEO-UHFFFAOYSA-N N-Benzyl-Pyrrole Natural products C1=CC=CN1CC1=CC=CC=C1 FNEQHKCQXDKYEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZFUMPDCEVCISZ-UHFFFAOYSA-N N.N=C=S Chemical compound N.N=C=S FZFUMPDCEVCISZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGBIKCCJZMDTLD-UHFFFAOYSA-N NC(=N)N.FC(C(=O)N)(F)F Chemical compound NC(=N)N.FC(C(=O)N)(F)F BGBIKCCJZMDTLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- LXRYOEDKIUATIT-UHFFFAOYSA-M OC([O-])=O.CC(=O)OCC[N+](C)(C)C Chemical compound OC([O-])=O.CC(=O)OCC[N+](C)(C)C LXRYOEDKIUATIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000625836 Ochrolechia Species 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- YIKSCQDJHCMVMK-UHFFFAOYSA-N Oxamide Chemical class NC(=O)C(N)=O YIKSCQDJHCMVMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241001040659 Plasmodium (Plasmodium) Species 0.000 description 1
- 241000726324 Potato spindle tuber viroid Species 0.000 description 1
- 241000709992 Potato virus X Species 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000702217 Pseudomonas virus phi6 Species 0.000 description 1
- 206010037151 Psittacosis Diseases 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011531 Quantitect SYBR Green PCR kit Methods 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108091060570 RasiRNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- BSCNFJCWQIWMKW-UHFFFAOYSA-O SCC[N+](C)(C)C.C(C)(=O)Cl Chemical compound SCC[N+](C)(C)C.C(C)(=O)Cl BSCNFJCWQIWMKW-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000046109 Sorghum vulgare var. nervosum Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STSCVKRWJPWALQ-UHFFFAOYSA-N TRIFLUOROACETIC ACID ETHYL ESTER Chemical compound CCOC(=O)C(F)(F)F STSCVKRWJPWALQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229910021627 Tin(IV) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000723573 Tobacco rattle virus Species 0.000 description 1
- 241000710145 Tomato bushy stunt virus Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLKAMFOFXYCYDK-UHFFFAOYSA-N [5-amino-4-[[3-[(2-amino-4-azaniumyl-5-methylphenyl)diazenyl]-4-methylphenyl]diazenyl]-2-methylphenyl]azanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CC1=CC=C(N=NC=2C(=CC([NH3+])=C(C)C=2)N)C=C1N=NC1=CC(C)=C([NH3+])C=C1N WLKAMFOFXYCYDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYKNUAWMBRIEKB-UHFFFAOYSA-N [Cl].[Br] Chemical compound [Cl].[Br] SYKNUAWMBRIEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSHGUOVUKKWSOX-UHFFFAOYSA-M [I+].[O-][I](=O)=O Chemical compound [I+].[O-][I](=O)=O MSHGUOVUKKWSOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZEHGKSPCAMLJDC-UHFFFAOYSA-M acetylcholine bromide Chemical compound [Br-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C ZEHGKSPCAMLJDC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960004266 acetylcholine chloride Drugs 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000250 adipic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229940090948 ammonium benzoate Drugs 0.000 description 1
- SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N ammonium bromide Chemical compound [NH4+].[Br-] SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940107816 ammonium iodide Drugs 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 1
- YCNIBOIOWCTRCL-UHFFFAOYSA-N azane;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound [NH4+].[O-]C(=O)C(F)(F)F YCNIBOIOWCTRCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOPHKSKOUDHSIM-UHFFFAOYSA-N azanium;ethanol;chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-].CCO WOPHKSKOUDHSIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004365 benzoic acid Drugs 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXHPPCXNWTUNSB-UHFFFAOYSA-M benzyl(trimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 KXHPPCXNWTUNSB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- KLOIYEQEVSIOOO-UHFFFAOYSA-N carbocromen Chemical compound CC1=C(CCN(CC)CC)C(=O)OC2=CC(OCC(=O)OCC)=CC=C21 KLOIYEQEVSIOOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N carbonyl dihydrazine Chemical compound NNC(=O)NN XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- HOPSCVCBEOCPJZ-UHFFFAOYSA-N carboxymethyl(trimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CC(O)=O HOPSCVCBEOCPJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 108091092259 cell-free RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M cetyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M chlormequat chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCCl UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QWJSAWXRUVVRLH-UHFFFAOYSA-M choline bitartrate Chemical compound C[N+](C)(C)CCO.OC(=O)C(O)C(O)C([O-])=O QWJSAWXRUVVRLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960004874 choline bitartrate Drugs 0.000 description 1
- 229960003257 choline citrate Drugs 0.000 description 1
- KRVSOGSZCMJSLX-UHFFFAOYSA-L chromic acid Substances O[Cr](O)(=O)=O KRVSOGSZCMJSLX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940117975 chromium trioxide Drugs 0.000 description 1
- WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N chromium trioxide Inorganic materials O=[Cr](=O)=O WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GAMDZJFZMJECOS-UHFFFAOYSA-N chromium(6+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Cr+6] GAMDZJFZMJECOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000019628 coolness Nutrition 0.000 description 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- ZZTURJAZCMUWEP-UHFFFAOYSA-N diaminomethylideneazanium;hydrogen sulfate Chemical compound NC(N)=N.OS(O)(=O)=O ZZTURJAZCMUWEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- SOCTUWSJJQCPFX-UHFFFAOYSA-N dichromate(2-) Chemical compound [O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O SOCTUWSJJQCPFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- UZUODNWWWUQRIR-UHFFFAOYSA-L disodium;3-aminonaphthalene-1,5-disulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 UZUODNWWWUQRIR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 238000004070 electrodeposition Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- XWBDWHCCBGMXKG-UHFFFAOYSA-N ethanamine;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCN XWBDWHCCBGMXKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZMFJUDUGYTVRY-UHFFFAOYSA-N ethyl methyl diketone Natural products CCC(=O)C(C)=O TZMFJUDUGYTVRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005082 etohexadiol Drugs 0.000 description 1
- 239000000374 eutectic mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- AWJWCTOOIBYHON-UHFFFAOYSA-N furo[3,4-b]pyrazine-5,7-dione Chemical compound C1=CN=C2C(=O)OC(=O)C2=N1 AWJWCTOOIBYHON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- WPIULSIZRNJJDL-UHFFFAOYSA-N guanidine;isocyanic acid Chemical compound N=C=O.NC(N)=N WPIULSIZRNJJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZSNUOIONTCOONQ-UHFFFAOYSA-M hexadecyl(trimethyl)azanium;fluoride Chemical compound [F-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C ZSNUOIONTCOONQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diol Chemical compound OCCCCCCO XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DQKGOGJIOHUEGK-UHFFFAOYSA-M hydron;2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium;carbonate Chemical compound OC([O-])=O.C[N+](C)(C)CCO DQKGOGJIOHUEGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N keto-neuraminic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- SXQFCVDSOLSHOQ-UHFFFAOYSA-N lactamide Chemical compound CC(O)C(N)=O SXQFCVDSOLSHOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940094506 lauryl betaine Drugs 0.000 description 1
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940040102 levulinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 1
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 229940041290 mannose Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229940100630 metacresol Drugs 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L methyl green Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)[N+](C)(C)C)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 DWCZIOOZPIDHAB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QRPRIOOKPZSVFN-UHFFFAOYSA-M methyl(triphenyl)phosphanium;chloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=CC=1[P+](C=1C=CC=CC=1)(C)C1=CC=CC=C1 QRPRIOOKPZSVFN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JNMIXMFEVJHFNY-UHFFFAOYSA-M methyl(triphenyl)phosphanium;iodide Chemical compound [I-].C=1C=CC=CC=1[P+](C=1C=CC=CC=1)(C)C1=CC=CC=C1 JNMIXMFEVJHFNY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- YTCQFLFGFXZUSN-BAQGIRSFSA-N microline Chemical compound OC12OC3(C)COC2(O)C(C(/Cl)=C/C)=CC(=O)C21C3C2 YTCQFLFGFXZUSN-BAQGIRSFSA-N 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- LCEDQNDDFOCWGG-UHFFFAOYSA-N morpholine-4-carbaldehyde Chemical compound O=CN1CCOCC1 LCEDQNDDFOCWGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- CODXZFSZJFCVBE-UHFFFAOYSA-N n,n-diethyl-2,2,2-trifluoroacetamide Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(F)(F)F CODXZFSZJFCVBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N n,n-diethyl-5-iminobenzo[a]phenoxazin-9-amine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=[NH2+])C2=C1 SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N n-dodecyl-n,n-dimethylglycinate Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC([O-])=O DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVEZGQGDAZLHQG-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-2,2,2-trifluoroacetamide Chemical compound CCNC(=O)C(F)(F)F SVEZGQGDAZLHQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008239 natural water Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000006259 organic additive Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000000901 ornithosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O phosphocholine Chemical compound C[N+](C)(C)CCOP(O)(O)=O YHHSONZFOIEMCP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O phosphonium Chemical compound [PH4+] XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 150000004714 phosphonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920001084 poly(chloroprene) Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 231100000586 procarcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000008684 selective degradation Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M sodium;2-iodoacetate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CI AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- GFISHBQNVWAVFU-UHFFFAOYSA-K terbium(iii) chloride Chemical compound Cl[Tb](Cl)Cl GFISHBQNVWAVFU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DPKBAXPHAYBPRL-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;iodide Chemical compound [I-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DPKBAXPHAYBPRL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UQFSVBXCNGCBBW-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium iodide Chemical compound [I-].CC[N+](CC)(CC)CC UQFSVBXCNGCBBW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QSUJAUYJBJRLKV-UHFFFAOYSA-M tetraethylazanium;fluoride Chemical compound [F-].CC[N+](CC)(CC)CC QSUJAUYJBJRLKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GTDKXDWWMOMSFL-UHFFFAOYSA-M tetramethylazanium;fluoride Chemical compound [F-].C[N+](C)(C)C GTDKXDWWMOMSFL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RXMRGBVLCSYIBO-UHFFFAOYSA-M tetramethylazanium;iodide Chemical compound [I-].C[N+](C)(C)C RXMRGBVLCSYIBO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- NBOMNTLFRHMDEZ-UHFFFAOYSA-N thiosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1S NBOMNTLFRHMDEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940103494 thiosalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L thiosulfate(2-) Chemical compound [O-]S([S-])(=O)=O DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J tin(iv) chloride Chemical compound Cl[Sn](Cl)(Cl)Cl HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 210000002105 tongue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N triethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCO ZIBGPFATKBEMQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 229940102001 zinc bromide Drugs 0.000 description 1
- LRXTYHSAJDENHV-UHFFFAOYSA-H zinc phosphate Chemical compound [Zn+2].[Zn+2].[Zn+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O LRXTYHSAJDENHV-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000165 zinc phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- DUNKXUFBGCUVQW-UHFFFAOYSA-J zirconium tetrachloride Chemical compound Cl[Zr](Cl)(Cl)Cl DUNKXUFBGCUVQW-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2250/00—Food ingredients
- A23V2250/30—Other Organic compounds
- A23V2250/302—Betaine, trimethylglycine
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/305—Fixative compositions
- G01N2001/307—Fixative compositions non-toxic, no Hg, no formaldehyde
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
可以使用深共熔溶剂(DES)使诸如细胞、组织、活组织检查和血液等生物样品中的生物分子(例如RNA、DNA和蛋白质)稳定化。可以使用DES混合物来将诸如组织块、癌活组织检查和全血等生物样品中的细胞形态固定和保持。本发明描述了使用DES混合物稳定和保存生物分子、全细胞、组织、血液和生物样品的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子特别是RNA的稳定化,包括用于稳定RNA的方法、用于稳定RNA的组合物和试剂盒和含有经稳定化RNA的组合物。还涉及细胞、组织、血液、外泌体和其他生物样品的固定和稳定化。
背景技术
从生物样品提取完整生物分子是许多实验室和临床诊断步骤的关键部分。诸如核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质的不稳定性是公知的,并且其完整性取决于许多参数,例如样品在从其最初环境取出之前的物理条件,样品是如何快速地从其来源取出,样品冷却速率、样品贮存温度和生物分子纯化方法。众所周知的是,生物样品纯化之前和期间对生物样品进行处理可以引起样品分析物的完好性和完整性方面的非常重要的变化。例如众所周知的是,尤其是RNA是极其易变的分子,如果不正确地处理,其在数分钟内会完全不可逆地受损。虽然RNA可能是较为易变的生物分子之一,包括翻译后修饰在内的蛋白质、脂质、对于代谢分析而言关键的小于2000道尔顿的小分子和DNA也进行实质性的降解过程。
虽然内源性细胞酶是大多数降解性过程的原因,分析物总是倾向于在贮存或处理的过程中同时水解,并且该过程很大地取决于诸如温度、含水量、pH、光和稳定性等贮存条件以及分析物分子的分子量,而且还可以取决于所用试剂的品质。
成功贮存的最常见的简单方法之一是降低生物样品的温度。通常将样品贮存在低于室温(20℃~24℃)的温度;蛋白质溶液贮存在4℃或-20℃,核酸在干冰或液氮中贮存在-20℃或-80℃的冰箱中。可以添加诸如叠氮化钠等抗微生物剂以控制微生物生长。
众所周知的是,RNA对于被酶降解、自发性水解、二价金属阳离子催化的水解、碱敏感性和FFPE(***固定的石蜡包埋的)样品中的交联特别敏感。诸如铅、镁和锰等许多金属溶液对RNA极具破坏性,并且确实不仅对于核酶而且对于诸如DNA酶I、绿豆核酸酶和S1核酸酶等核酸酶活性是关键的。铁(2+)已经作为芬顿反应的一部分参与核苷碱基的氧化,产生翻译上受损的rRNA和mRNA(Honda等人,(2005)J.Biol.Chem.280,20978-20986),例如将鸟嘌呤转变为8-氧-鸟嘌呤。已经综述了金属离子在磷酸二酯键的酶促和非酶促切割中的其他可能的催化作用(Yarus,M.(1993)FASEBJ.7,31-39)。实际上经常将诸如EDTA和EGTA等螯合剂添加至RNA或RNA裂解液以用于通过除去金属离子来减少RNA降解的目的。核糖核酸酶(RNA酶)是一大组与包括微生物、人类皮肤、灰尘以及细胞和组织的内含物等许多来源相关的普遍存在的酶。在冷冻-解冻过程中他们也易于从细胞内囊泡释放。已知包括胰腺在内的一些组织特别富含RNA酶A。RNA酶A是已知最稳定的酶之一,在例如离液盐(chaotropicsalt)变性后容易恢复其酶促活性,使得其极其难以破坏。需要高浓度的离液剂(例如胍(4M~6M))来破坏RNA酶活性(Thompson.J.和Gillespie.D.AnalBiochem.(1987)163:281-91)。
存在数种方法来抑制RNA酶活性,例如使用:(i)核糖核酸酶肽抑制剂(“RNasin”),其是一种昂贵的试剂,仅以少量获得,并且对RNA酶A、B和C具有特异性;(ii)诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇等还原剂,其破坏RNA酶中的二硫键,但是该效果是有限的和临时的并且具毒性和不稳定;(iii)诸如蛋白酶K等消化RNA酶的蛋白酶,但是蛋白酶在试剂盒中的转运及其通常缓慢的作用使得分析物生物分子降解;(iv)将温度降低至低于酶的活性温度;常见的是将组织和细胞样品贮存在-80℃或在液氮中;(v)抗-RNA酶抗体;(vi)使用诸如丙酮等溶剂或诸如硫酸铵等亲液盐(kosmotropicsalt)将包含RNA酶、DNA和RNA的细胞蛋白沉淀,硫酸铵的一种市售制品称为RNAlaterTM(Sigma-Aldrich,美国;LifeTechnologies,美国;Qiagen,德国);(vii)使全血中的核酸稳定化的洗涤剂,例如见于PAXgeneTMDNA和RNA提取试剂盒(PreAnalytix,德国)中的洗涤剂;(viii)离液盐;(ix)醇,例如见于PAXgeneTM组织稳定剂(PreAnalytix,德国)中的醇。RNAIsolationandAnalysis,Jones编(1994)第2章中提出了各种此类离液混合物。
样品贮存的主要目标是将对分析物生物分子的任何改变最小化(所述改变可以是由于预分析步骤和样品纯化而引入),从而使分析结果尽可能近地与生物分子的原始体内复杂性和多样性相似,由此提高检验精度、敏感性和特异性。虽然存在可用于减少预分析变化的各种方法和产品,其都有各种缺点,使得其使用存在问题或者是次优的。有效地稳定一类生物分子的方法通常对于稳定其他是无效的,对于每种生物分子分析物技术人员必须选择特定的试剂和方法。例如,PAXgeneTM体系(PreAnalytix)(美国专利6,602,718和6,617,170)可用于核酸,而不是蛋白质,并且需要冗长的纯化步骤以及多种洗涤缓冲液,同时蛋白酶抑制剂的混合物有助于防止蛋白质降解而不是核酸。PAXgeneTM组织稳定试剂盒需要对组织进行两个单独的处理,并且包括有毒和易燃的化学品。组织的RNAlaterTM处理减少了其在免疫组织化学、组织学的有用性,并且增加了组织硬度,而且没有完全保护RNA,虽然其已经被采纳为RNA保护的金标准品。
在提取样品的时间或地点纯化RNA不总是可行的,所述样品例如来自医院手术室的活组织检验或来自医生办公室的血液样品。在这些情况下,在提取RNA之前样品必须非常仔细地贮存,RNA的提取可能短至30分钟进行,但是更常见的是仅仅在通过医院病理实验室处理后数小时或数天发生。通常对预分析步骤的时间和温度的记录较差,导致对样品品质的认知模糊。结果,需要针对每种组织和RNA的最终用途开发单独的样品贮存条件。如已提及,这通常包括使用专用的稳定液(例如RNAlater或PAXgene)或者立即将样品冷冻在液氮中。至少在PAXgene稳定剂的情况下,稳定剂的不完全去除会在纯化过程中对RNA产率产生负面影响(PAXgeneBloodRNAKitHandbook,2005年6月)。
组织贮存可以通过使用固定剂的组织固化实现。“固定(fixation)”是指增加机械强度、硬化、防腐和增加诸如新鲜细胞、活组织检查或组织等受处理组织样品的稳定性,并且将样品保持在与处天然状态的原位的原始新鲜样品尽可能相似的状态。固定经常用于病理学、组织学、组织化学、细胞化学、解剖学研究和研究细胞,并且通常先于例如贮存、包埋、染色、免疫组织化学和/或免疫细胞化学等另外的步骤。固定方法理想地抑制诸如核酸酶和蛋白酶等酶,停止微生物在样品上的生长,并保持总体组织形态以及细胞超微结构如高尔基体、细胞核、内质网、线粒体、溶酶体和胞质膜。作为一个实例,保持正确的细胞形态对于病理学家诊断患者中癌的存在、类型和等级而言是重要的,但是为了正确地这样做,必须也能够将样品正确地染色或用抗体标记以用于免疫组织化学。通常样品用1%~5%的***(甲醛)、多聚甲醛或戊二醛的缓冲水溶液在室温处理1~24小时,以使蛋白质与其他细胞成分交联,然后在组织切片后,用苏木精和曙红染色剂(H&E)染色。虽然也可使用戊二醛,其向组织的渗透速率慢于甲醛(当相对于组织体积添加18~20体积时,其以约1mm/小时渗透)。虽然RNA也可以此方式保存,但是通常在***固定过程中或固定后变得高度降解,使得基因表达高度成问题和失真。一个具体问题在于,RNA分析物与诸如蛋白质等其他生物分子交联,因此随后在分析之前需要将它们释放,该方法通常非常苛刻且需要长期处于升高的温度,这导致显著的RNA降解。固定的另一问题在于将诸如RNA和蛋白质等可溶性分析物保持在细胞中,因此他们可以通过例如原位杂交或免疫组织化学而完整化。特别地,***固定的另一问题在于细胞蛋白质的共价修饰导致抗原性免疫识别的损失,这使得免疫组织化学技术难以或不可能依赖于抗体。作为一个另外实例,***固定的组织例行地包埋在石蜡中,以使组织块被薄切片并进行显微镜检查(FFPE)。其他常见组织固定法包括使用甲醇、乙醇或丙酮,其导致蛋白质沉淀而不是交联。特别需要在固定组织、保持良好的RNA品质的同时能够进行免疫组织化学染色的方法。众所周知的是,常用的固定剂例如甲醛、多聚甲醛、戊二醛和甲醇是高度有毒的潜在致癌原,同时乙醇和丙酮是高度易燃的。理想的固定剂应该作用于广泛的包括神经、淋巴和脂肪在内的各种组织,保存大片组织,并且与免疫组织化学、组织化学和原位杂交以及其他专门性技术相容。其还应该与自动化组织固定方法相容。关于详细策略的综述已经由Bancroft(2008)‘TheoryandPracticeofHistologicalTechniques’和Stanta(2011)‘GuidelinesforMolecularAnalysisinArchiveTissues’公开,而将组织固定和染色的代表性实例可见于Ross和Pawlina(2011)‘HistologyATextandAtlas’。
发明内容
在一个方面,本发明提供深共熔溶剂抑制生物分子的降解的应用。
已经令人惊奇地发现,可以使用深共熔溶剂(DES)使生物样品中的如RNA、DNA和蛋白质等生物分子稳定化。还已经发现,可以使用DES混合物来固定和保持诸如组织块、癌活组织检查和全血等生物样品中的细胞形态。本发明描述了用于使用DES混合物稳定和保持生物分子、全细胞、组织和生物样品。样品或组织可以包含实体组织或非实体组织。
发明人已经令人惊奇地发现,许多DES混合物能够稳定和保持RNA、诸如蛋白质和DNA等其他生物分子、细胞和组织结构。使用在诸如氯化胆碱(6M)或尿素(5M)等水性溶液中的单独的个体DES组分不提供RNA稳定化或细胞固定,仅当所述组分组合在DES(如氯化胆碱:尿素)中时,他们才进行保持和稳定化(表1)。发明人已经发现,仅举例而言,氯化胆碱与三氟乙酰胺的混合物对于稳定细胞中的RNA同时保持细胞形态特别有效。发明人还发现氯化胆碱与山梨糖醇的混合物对于稳定全组织中的RNA特别有效。不过,DES组分的极其大量的其他组合和比例也可用于实践本发明。
已经报道了通过天然离子液体和天然DES分离混合物中的组分(WO2011/155829),但是DES对稳定生物分子或细胞的效果尚未报道。实际上在US2009/0117628A1中已经指出,可以在DES中进行酶促反应,并且各种酶反应在各种DES中具有活性,表明核酸酶和蛋白酶以及其他分解代谢酶会同样地具有活性。令人惊奇地是发明人发现,RNA和其他生物分子在DES混合物中得到稳定,并且细胞形态被固定,证明细胞骨架也被固定。
DES是当组合在一起时具有共熔点的两种以上组分的混合物,共熔点是固化或凝固的温度(Fp)。组合组分的共熔点通常大大低于任一个或者以任何其他比例混合的个体组分,并且在单一温度发生而且个体组分不会在固化时发生分离。DES的性质已经描述于以下文献中:A.P.Abbott,G.Capper,D.L.Davies,R.K.Rasheed,V.Tambyrajah,Chem.Commun.7(2003)70–71.;A.P.Abbott,D.Boothby,G.Capper,D.L.Davies,R.K.Rasheed,J.Am.Chem.Soc.126(2004)9142–9147;[7]G.Imperato,E.Eibler,J.Niedermaier,B.Konig,Chem.Commun.9(2005)1170–1172.;S.Gore,S.Baskaran,B.Koenig,GreenChem.13(2011)1009–1013.;J.T.Gorke,F.Srienc,R.J.Kazlauskas,Chem.Commun.10(2008)1235–1237.;A.P.Abbott,J.Collins,I.Dalrymple,R.C.Harris,R.Mistry,F.Qiu,J.Scheirer,W.R.Wise,Aust.J.Chem.62(2009)341–347.;Y.H.Choi,J.vanSpronsen,Y.Dai,M.Verberne,F.Hollmann,I.W.C.E.Arends,G.J.Witkamp,R.Verpoorte,PlantPhysiol.156(2011)1701–1705;且在ZhangQ,DeOliveiraVigierK,RoyerS,F.ChemSocRev.2012Nov7;41(21):7108-46中进行了综述。
工业上DES已经用于电化学电镀、采矿应用和钻探润滑剂(US2009/0247432)、工业酶应用(US2009/0117628A1)、制备无机化合物(D.Freudenmann,S.Wolf,M.Wolff和C.Feldmann,Angew.Chem.,Int.Ed.,(2011),50,11050–11060)或有机化合物(S.Gore,S.Baskaran和B.Koenig,GreenChem.,(2011),13,1009–1013)、生物提取(WO2011/155829)、在电化学中作为电解质用于染料敏化的太阳能电池和金属电抛光(H.-R.Jhong,D.Shan-Hill,C.-C.Wan,Y.-Y.Wang和T.-C.Wei,Electrochem.Commun.,(2009),11,209–211)、电沉积(E.Gomez,P.Cojocaru,L.Magagnin和E.Valles,J.ElectroanalyticalChem.,(2011),658,18–24)、生物柴油的纯化(K.Shahbaz,F.S.Mjalli,M.A.Hashim和I.M.AlNashef,EnergyFuels,(2011),25,2671–2678)、药物的增溶(H.G.Morrison,C.C.Sun和S.Neervannan,Int.J.Pharm.,(2009),378,136–139)、金属氧化物的增溶(A.P.Abbott,D.Boothby,G.Capper,D.L.Davies和R.K.Rasheed,J.Am.Chem.Soc.,(2004),126,9142–9147)和CO2的增溶(X.Li,M.Hou,B.Han,X.Wang和L.Zou,J.Chem.Eng.Data,(2008),53,548–550)。VanSpronsen等人在WO2011/155829中提出将天然来源的DES(例如氨基酸、糖和羧酸的各种组合)用于提取,但是没有提到他们在稳定或固定细胞和组织方面的应用。所描述的DES用于提取目的而不是稳定和固定。
DES不被认为是离子液体,原因在于:(i)他们不完全由离子物质组成,和(ii)他们也可由非离子物质获得,(iii)他们是混合物而不是化合物。与传统离子液体相比,源自例如氯化胆碱的DES具有数个优点,例如:(1)低成本,(2)对水是化学惰性的,(3)容易通过简单混合两种以上组分制备,(4)大多数是生物降解性和非毒性的,(5)即使加热时也是低挥发性的,和(6)不易燃。所有DES都在低于150℃是液体,许多在室温~70℃是液体,少数突出的实例在0℃为液体。
DES往往通过将卤化季铵盐与诸如ZnCl2等金属盐或诸如尿素等氢键供体混合而获得,所述金属盐或氢键供体具有与季铵盐的卤素阴离子形成络合物的能力。不过已经发现例外,例如,在甜菜碱:三氟乙酰胺等DES中不存在卤素阴离子。如本文所用,除非另外规定,术语“甜菜碱(betaine)”是指N,N,N-三甲基甘氨酸。
本文讨论的深共熔溶剂可以包括具有季铵基团的组分。
具有季铵基团的组分可以是进一步包含羧酸根基团的两性离子组分。优选的两性离子组分是甜菜碱(N,N,N-三甲基甘氨酸)。
作为选择,包含季铵基团的组分可以是具有合适的抗衡离子的盐的形式。抗衡离子合适地是卤素离子,优选是氯离子、溴离子或碘离子,最优选氯离子。其他合适的抗衡离子包括硝酸根和四氟硼酸根等。当所述组分为盐的形式时,抗衡离子优选不包含羧酸根基团。
在另一方面,本发明提供使含RNA样品中的RNA稳定化的方法,所述方法包括使所述样品与含DES的混合物接触以形成稳定的含RNA组合物。
在另一方面,本发明提供使含DNA样品中的DNA稳定化的方法,所述方法包括使所述样品与含DES的混合物接触以形成稳定的含DNA组合物。
在另一方面,本发明提供使含肽样品中的蛋白质(包括磷蛋白)稳定化的方法,所述方法包括使所述样品与含DES的混合物接触以形成稳定的含蛋白质组合物。
在另一方面,本发明提供固定细胞的天然形态和固定细菌、真菌、动物或植物样品(例如大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、拟南芥、水稻、小麦、玉米、烟草和/或马铃薯)中的RNA、DNA和/蛋白质的方法。
在另一方面,本发明提供固定和稳定含细胞样品中的细胞的天然形态的方法,所述样品例如器官、组织,活组织检查、循环肿瘤细胞(CTC)、血液样品、血浆样品、血清样品、组织培养细胞、唾液、尿、脑脊液、医学样品、卵、胚胎、或成体组织、或者FFPE样品,所述方法包括使所述含细胞样品与含DES的混合物接触以形成细胞结构和形态的固定物和稳定物,其与细胞计数、CTC检测、免疫组织化学、组织化学、染色和着色、流式细胞术、质谱法、原位杂交、激光捕获显微切片和对例如RNA、DNA和/或蛋白质等的分子分析相容。
在另一方面,本发明提供固定和稳定含细胞样品中的细胞的天然形态的方法,由此可以通过使用着色剂、抗体或适体确定蛋白含量和蛋白细胞定位,所述方法包括使所述含细胞样品与含DES的混合物接触以形成细胞结构和形态的固定物和稳定物,同时或随后使所述样品与着色剂、抗体或适体接触。
在另一方面,本发明提供用于固定和稳定含细胞样品中的细胞天然形态的方法,由此可以通过使用经标记或未标记的探针确定RNA含量和其细胞定位,所述探针例如寡核苷酸、引物、PNA、LNA、DNA、bDNA或RNA序列、天然或合成互补核酸序列,所述方法包括使含细胞样品与含DES的混合物接触以形成细胞结构和形态的固定物或稳定物,并且同时或随后使所述样品与天然或合成杂交序列接触以用于分子分析。
在另一方面,本发明提供用于使生物样品中的RNA、DNA和/或蛋白质稳定化的试剂盒,所述试剂盒包含至少一个含DES混合物的容器。所述试剂盒还包含用于使所述样品与DES混合物接触的说明书,由此所述生物样品中的RNA、DNA和/或蛋白质针对降解而稳定。
在另一方面,本发明提供用于使生物样品中的细胞结构稳定化的试剂盒,所述试剂盒包含至少一个含DES混合物的容器。所述试剂盒还包含用于使所述样品与DES混合物接触的说明书,由此所述DES混合物充当细胞结构的固定剂和/或稳定剂,所述细胞结构用于显微镜和/或组织学研究,例如染色和着色、ISH和/或IHC。
在另一方面,本发明提供用于固定生物样品中的细胞和组织结构与形态的试剂盒,所述试剂盒包含至少一个含DES固定和/或稳定性混合物的容器,并且可选地是其中所述容器是可渗透的,并且最大高度为10mm,所述样品浸入该容器并且被固定和/或稳定化。可渗透容器的壁可以是滤网(sieve)或格栅,或者设置有狭缝,该狭缝允许DES混合物进入和接近细胞或组织样品,和/或随后接触液体石蜡。
在另一方面,本发明提供DES混合物与添加剂的组合的充当生物分子的固定剂和稳定剂的应用,所述生物分子包括RNA、DNA和/或蛋白质。
在另一方面,本发明提供经稳定化的含RNA组合物,所述组合物包含RNA和DES混合物。
在另一方面,本发明提供经稳定化的含DNA组合物,所述组合物包含DNA和DES混合物。
在另一方面,本发明提供经稳定化的含蛋白质组合物,所述组合物包含蛋白质和DES混合物。
在另一方面,本发明提供DES混合物作为细胞结构和/或组织的组织学和/或形态学的稳定剂以及RNA、DNA和/或蛋白质的稳定剂的应用。
在另一方面,本发明提供DES混合物作为细胞结构和/或组织的组织学和/或形态学的稳定剂在随后包埋到石蜡和切片机切片以及可选的染色、原位杂交和/或免疫组织化学中的应用。
在另一方面,本发明提供DES混合物作为细胞结构和/或组织的组织学和/或形态学的稳定剂在随后冷冻冰冻切片(frozencryostatsectioning)以及可选的染色、原位杂交和/或免疫组织化学中的应用。
在另一方面,本发明提供DES混合物作为细胞结构和/或组织的组织学和形态学的稳定剂在随后激光捕获显微切割(LCM)以及可选的回收蛋白质、DNA和RNA中的应用。
在另一方面,本发明提供DES混合物作为用于后续诊断分析的血浆、血清和血液(其包括循环肿瘤细胞和/或血液白细胞和/或全血)中的生物分子和/或细胞的稳定剂的应用,所述诊断分析包括细胞捕获、计数和/或分型、染色和/或着色、质谱、原位杂交和/或免疫组织化学。可选地,可以进行蛋白质、DNA和RNA的回收。
在另一方面,本发明提供DES混合物作为外泌体、其他类型的囊泡、微囊泡、亚细胞体和颗粒(例如,胶束;脂质体;内体;细胞碎片;细胞膜;细胞核;如胞吞室、高尔基、内质网和/或线粒体等细胞质成分)的稳定剂的应用。其还涉及对源自血液、血清、血浆、尿、脑脊液和其他体液的外泌体内含有的RNA、DNA和/或蛋白质的稳定化,以便用于贮存、运输和处理从而用于诊断测试,例如提取、分析和/或鉴定外泌体或其他细胞外微囊泡内含有的miRNA或mRNA。
在另一方面,本发明提供DES混合物作为预纯化颗粒和分子的稳定剂的应用,所述预纯化颗粒和分子例如病毒颗粒、噬菌体、RNA、DNA、诸如酶和抗体等蛋白质、脂质和脂肪和/或碳水化合物。此处将预纯化定义为样品由大于80%的目标颗粒或分子组成。
在另一方面,本发明提供DES混合物作为用于后续病原体诊断分析(包括细菌和/或病毒诊断)的血浆、血清、血沉棕黄层和/或血液中的生物分子、细菌、真菌和/或其他病原体(例如,利什曼原虫属(Leishmania)、锥虫属(Trypanosoma)和/或疟原虫属(Plasmodium))的稳定剂的应用。
在另一方面,本发明提供DES混合物作为用于后续病毒诊断分析的诸如痰、拭液、血浆、血清、血沉棕黄层和/或血液等生物样品中的病毒、病毒颗粒、病毒核酸和/或蛋白质(例如流感病毒、HPV、HIV、HBV、HCV、***病毒、流感病毒、SARS和/或西尼罗河病毒)的稳定剂的的应用。
在另一方面,本发明提供适用于细胞或组织固定和/或适用于抑制生物分子的降解的设备,所述设备包括:由第一深共熔溶剂形成的第一深共熔溶剂层;和在所述第一深共熔溶剂层中的用于接收包含所述生物分子的样品的凹槽(recess),其中所述第一深共熔溶剂是固体或凝胶。所述设备可以还包含由第二深共熔溶剂形成的第二深共熔溶剂层,其中所述第二深共熔溶剂层包封所述凹槽;并且其中所述第二深共熔溶剂是固体或凝胶。
所述第一深共熔溶剂和/或第二深共熔溶剂是如本文所定义的深共熔溶剂,并优选包含选自3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-二氟-2-苯基乙酰胺、尿素和硫脲的组分。
所述第一深共熔溶剂和/或第二深共熔溶剂还可以包含选自氯化胆碱、碘化丁酰胆碱和N,N,N-三甲基甘氨酸的组分。
本发明的适用于细胞或组织固定和/或适用于抑制生物分子的降解的设备包含由第一深共熔溶剂形成的第一深共熔溶剂层。所述第一深共熔溶剂是固体或凝胶。合适的是,选择深共熔溶剂的组分以使深共熔溶剂在期望的使用条件(例如约25℃的温度和约1个大气压的压力)下是固体。作为选择或另外地,所述深共熔溶剂可以与在期望使用条件下为固体或凝胶的基质材料共混。
具体而言,用作第一深共熔溶剂的优选深共熔溶剂包括:氯化胆碱:3,3,3-三氟丙酰胺(可选的是摩尔比为约1:2);氯化胆碱:2,2-二氟-2-苯基乙酰胺(可选的是摩尔比为约1:1);氯化胆碱:海藻糖(可选的是摩尔比为约1:1);碘化丁酰胆碱:尿素(可选的是摩尔比为约1:2)。
如果所述设备包含第二深共熔溶剂,所述第一深共熔溶剂和第二深共熔溶剂可以相同或不同。优选的是,第二深共熔溶剂选自:氯化胆碱:3,3,3-三氟丙酰胺(可选的是摩尔比为约1:2);氯化胆碱:2,2-二氟-2-苯基乙酰胺(可选的是摩尔比为约1:1);氯化胆碱:海藻糖(可选的是摩尔比为约1:1);碘化丁酰胆碱:尿素(可选的是摩尔比为约1:2)。
在另一方面,本发明提供其中深共熔溶剂是本文所定义的深共熔溶剂的试剂盒。
本发明不特别限制在任何类型的生物分子的稳定化,但是通常较为显著的是RNA的品质和完整性的改善,因为RNA是细胞中最脆弱的分子之一,这归因于其长度和对环境攻击的化学敏感性。通常凭经验而言,可以认为如果细胞rRNA分子是完好的则mRNA、DNA、蛋白质、脂质、碳水化合物和小代谢物也会是完好的,但是如果rRNA被降解,则取决于各生物分子的具体化学敏感性,其他生物分子可能也被降解或者可能不被降解。存在一些例外,例如如果组织或细胞特别富含诸如RNA酶、DNA酶、脂酶、酯酶、蛋白酶或磷酸酶等特定酶,其会引起一类特定生物分子的特异性降解或修饰。
所提及的RNA可以发现于样品、源自样品或与样品结合,所述样品例如为病毒、细胞、循环肿瘤细胞、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、血清、血浆、血液、外泌体、诸如FFPE块或切片等其他微泡保存的样品、活组织检查、固体或液体的组织或其他生物样品。也可以是含核苷或核苷酸的分子,例如cAMP、ATP、GTP、脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的单体、二聚体和寡聚体、脱氧核糖寡核苷酸和核糖寡核苷酸、质粒DNA、基因组DNA、线粒体DNA、RNA(诸如微RNA(miRNA)、piRNA、siRNA、tRNA、类病毒、循环RNA、循环单链或双链的非编码RNA、hnRNA、mRNA、rRNA(如5S、5.8S、16S、18S、23S和28SrRNA物质)以及源自例如HCV、西尼罗河病病毒、***病毒、流感病毒、SARS或HIVRNA的病毒RNA和/或细胞外RNA(exRNA))。
其也可以是源自合成有机步骤(如寡聚物合成仪)的分子、RNA和DNA的混合物、RNA和DNA的嵌合物、如体外RNA转录等酶促反应的产物、扩增的RNA(aRNA)、核酶、适体、PCR扩增、滚环扩增(RCA)或连接酶链反应(LCR)、内部对照标准物或对照RNA。
会受益于本发明的RNA分析法包括mRNA模板的体外或体内蛋白质翻译、RNA依赖性RNA聚合、DNA依赖性RNA聚合、RNA剪接分析、RNA折叠分析、适体和核酶生产、光密度(OD)测定、RNA:蛋白质相互作用研究、RNA电泳和沉降(包括分子量标准物)、RNA生物缀合、RNA连接、RNA折叠研究、RNA足迹分析、RNANMR结构研究、RNA寡核苷酸合成、RNA原位、原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、RNA测序、逆转录(RT)、RT-PCR、RT-qPCR、核酸酶保护分析、杂交技术(例如包括RNA印迹)bDNA和微阵列(包括探针制备)、荧光核酸标记、NASBA、RNAi、miRNA技术(例如提取和定量)以及要求对RNA进行品质控制和/或定量或定性测定的那些方法。
不稳定性是指RNA的分子量的改变或RNA的化学结构的改变,此类不稳定性与分析物分子的处理、贮存、运输和/或实际分析相关。生物分子不稳定性经常取决于天然存在的代谢酶、特别是RNA酶的活性,RNA酶可以显著改变RNA的分子量或涉及分子量小得多的原始分析物分子的变体。此类RNA酶的来源可以为生物样品自身,例如他们可以在样品处理后逐渐地释放,或者由于对组织进行不良处理而大量释放,例如对其进行了冷冻-解冻,该过程通常导致含有蛋白酶和核酸酶的细胞内囊泡的破裂,所述蛋白酶和核酸酶随后流入细胞质从而导致分析物的非常高速率的降解。作为选择,降解性酶可以来自样品环境的外部污染,例如微生物污染或样品的腐败。分析物不稳定性通常与分析过程的敏感性或性能降低相关,无论分析物是蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质还是代谢物。
“降解”是指作为生物分子和/或分析物不稳定性的后果所发生的物理或化学变化。作为与核酸相关的降解的一些实例,降解可以是指核苷碱基的脱氨基(例如胞嘧啶转化为尿嘧啶)、诸如鸟嘌呤等核苷碱基的氧化、甲基-胞嘧啶的甲基的失去、例如脱嘌呤过程中一个或多个核苷碱基的失去、磷酸二酯键的切割(导致链切割)以及从大体积的核酸分子失去一个或多个核苷酸。其不仅仅指分子的二级结构或三级结构的变化。
“完整性”是指分子的完整度,因此与降解相反。
“实质上降解”是指所含的至少一半分析物分子被切割或者分子量减少5%以上的样品。确定降解的方法是公知的,并且取决于分析物分子(参见Sambrook等,(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版),ColdSpringHarborUniversityPress,NY)。分子量以及因此核酸的降解程度的确定通常使用变性或天然凝胶电泳进行,并且可以包括使用经标记的杂交探针进行的DNA或RNA印迹。RNA定量可以包括使用RNA芯片和AgilentBioanalyser2100TM***进行分析并计算“RNA完整数”(RIN)。核酸降解也可以使用例如LightcyclerTM(Roche)和合适的扩增探针通过用于DNA的Q-PCR和用于RNA的RT-qPCR方便地定量。在使用寡dT引物进行逆转录后,计算(通常是β-肌动蛋白的)mRNA的3’/5’末端的RT-qPCR扩增比,也常用于评估RNA降解。其他方法包括细胞或组织的全部mRNA含量的RNAseq,或者使用 进行分析之后比较表示mRNA的3’至5’位点的寡核苷酸的相对杂交信号。长度小于100个核苷酸的较小单链或双链核酸(例如寡核苷酸和miRNA),通过质谱法(例如MALDI-TOFMS)最准确地定量,该技术的额外优点是还能够确定不显著改变分析物的分子量的降解事件(例如核苷碱基的脱嘌呤或脱氨基)。大多数miRNA分析通过专用RT-qPCR进行。虽然用于确定RNA的降解程度的方法精密,显然一些mRNA序列比其他序列对降解要更敏感的多,并且由于18和28SrRNA对降解相对稳定,他们仅仅是mRNA降解程度的不良替代标志物。如上所解释的,准确地分析mRNA降解目前使用RT-qPCR最好地进行。对于评价作为RNA纯化的结果的RNA降解方法的详细描述,请参见Muyal等,(2009)Diag.Path.4:9。
RNA或DNA的“纯样品”是指其中OD260/280比为1.7以上的核酸水溶液。
虽然通常而言不稳定性和降解与被研究分子(“分析物”)的总分子量减少相关,与之相反地,其也可以与贮存过程中逐渐聚集的复合物的分子量增加相关。后者的一个实例是在全组织贮存过程中蛋白质复合或聚集至核酸上,或者将样品例如用***固定的石蜡包埋组织(”FFPE”)处理过程中分子的化学交联。
“稳定”是指与对照相比分析物分子的降解量总体减少的状况。所述对照可以是不应用本发明所用的条件,例如不使用任何稳定剂(图11)贮存,但是RNA的降解速率通常过高以致于不能作为有用的比较,因此较佳的对照是根据制造商说明使用的市售RNAlater(货号76106,Qiagen,德国)。对照可以是一块切除的组织(例如生物活组织)、血液或血清样品,或者是在RNAlater中于例如4℃、20℃或37℃贮存1~16小时或1~45天的贮存的一块组织。
组织破坏是指大组织样品分成颗粒的过程,所述颗粒足够小以能够随后通过添加离液剂溶液(chaotropesolution)被裂解。破坏将样品分成块,所述块小至足以能够充分地释放分析物以用于随后的RNA提取和纯化。
可以进行“RNA酶失活”步骤以使RNA酶充分地失活,并允许随后用DES混合物稳定化而不会显著地降解RNA。对于使RNA酶失活,本领域已知许多方法,例如用诸如胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶或蛋白酶K等蛋白酶酶促降解;用β-巯基乙醇(Chirgwin等,"IsolationofBiologicallyActiveRibonucleicAcidfromSourcesEnrichedinRibonuclease,"Biochemistry,18:5294-5299,1979)、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、谷胱甘肽或TCEP来减少二硫键;添加RNasin蛋白(LifeTechnologies,美国)、RNAsecureTM(LifeTechnologies,美国);用诸如盐酸胍、异硫氰酸胍(Chomczynski和Sacchi,"SingleStepMethodofRNAIsolationbyAcidGuanidineIsothiocyanate-Phenol-ChloroformExtraction,"Anal.Biochem.,162:156-159,1987;Sambrook等,"MolecularCloning,ALaboratoryManual,"pp.7.16-7.52,1989)、尿素、甲酰胺、甲醛或碘乙酸钠等离液剂处理;用诸如Tween-20、TritonX-100、NP-40、SLS或SDS、EDTA、EGTA、柠檬酸钠处理;热或酸变性;用氧钒核糖核苷复合物(Berger和Birkenmeier,1979)抑制或用戊二醛交联。如本文一个实施例中所提出,在DES混合物处理之前,首先处理组织样品以使RNA酶活性减少至其未处理活性的至少50%、75%或更优选100%。处理前的残留RNA酶活性可以使用RNaseAlertTM试剂盒(LifeTechnologies,美国)监测。用于使组织中的RNA酶失活的方法在美国专利第6,777,210号和美国专利申请公开第2009/0286304号中提出。
举例而言,但并非限制,DES通过将一种或多种组分与一种或多种也能形成DES的其他组分混合或者混合和加热而制造,所述一种或多种组分可以选自下述组:硝酸胆碱、四氟硼酸胆碱、氢氧化胆碱、酒石酸氢胆碱、柠檬酸二氢胆碱、对甲苯磺酸胆碱、碳酸氢胆碱、氯化胆碱、溴化胆碱、碘化胆碱、氟化胆碱、氯化氯代胆碱、溴化溴代胆碱、碘化碘代胆碱、氢氧化乙酰胆碱、酒石酸氢乙酰胆碱、柠檬酸二氢乙酰胆碱、对甲苯磺酸乙酰胆碱、碳酸氢乙酰胆碱、氯化乙酰胆碱、溴化乙酰胆碱、碘化乙酰胆碱、氟化乙酰胆碱、氯化氯乙酰胆碱、溴化溴乙酰胆碱、碘化碘乙酰胆碱、氢氧化丁酰胆碱、酒石酸氢丁酰胆碱、柠檬酸二氢丁酰胆碱、对甲苯磺酸丁酰胆碱、碳酸氢丁酰胆碱、氯化丁酰胆碱、溴化丁酰胆碱、碘化丁酰胆碱、氟化丁酰胆碱、氯化氯丁酰胆碱、溴化溴丁酰胆碱、碘化碘丁酰胆碱、氯化乙酰硫代胆碱、L-肉毒碱、D-肉毒碱、甜菜碱、肌氨酸、N-氧化三甲基胺、盐酸甜菜碱、十六烷基甜菜碱、十六烷基三甲基氟化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、月桂基甜菜碱、N,N-二亚甲基乙醇氯化铵、N,N-二乙基乙醇氯化铵、氯化β-甲基胆碱、氯化磷酸胆碱、柠檬酸胆碱、氯化苯甲酰胆碱、月桂基磺基甜菜碱、苯甲基三甲基氯化铵、甲基三苯基氯化鏻、甲基三苯基溴化鏻、甲基三苯基碘化鏻、甲基三苯基氟化鏻、N,N-二亚乙基乙醇氯化铵、乙基氯化铵、四甲基氯化铵、四甲基溴化铵、四甲基碘化铵、四甲基氟化铵、四乙基氯化铵、四乙基溴化铵、四乙基碘化铵、四乙基氟化铵、四丁基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基碘化铵、四丁基氟化铵、(2-氯乙基)三甲基氯化铵、氯化铽(III)、氯化锌(Ⅱ)、溴化锌(Ⅱ)、氯化锆(III)、氯化铁(III)、氯化锡(Ⅱ)、氯化铜(II)、氯化镁(Ⅱ);所述一种或多种其他组分包括例如(但并非限制)选自下述组的化学品:尿素、甲酰胺、硫脲、1-甲基脲、1,1-二甲基脲、1,3-二甲基脲、碳酰肼、四甲基脲、1,3-双(羟基甲基)脲、苯甲酰胺、吉拉尔特试剂(GirardsReagent)T、乳酰胺、乙酰胺、氟乙酰胺、二氟乙酰胺、三氟乙酰胺、氯氟乙酰胺、氯二氟乙酰胺、氯乙酰胺、二氯乙酰胺、二氯氟乙酰胺、三氯乙酰胺、溴乙酰胺、二溴乙酰胺、三溴乙酰胺、溴氟乙酰胺、溴二氟乙酰胺、溴氯氟乙酰胺、碘乙酰胺、二碘乙酰胺、三碘乙酰胺、2-甲基-2,2-二氟乙酰胺、2-甲基-2-氟乙酰胺、2,2-二甲基-2-氟乙酰胺、2-乙基-2,2-二氟乙酰胺、2-乙基-2-氟乙酰胺、2,2-二乙基-2-氟乙酰胺、2-丙基-2,2-二氟乙酰胺、2-丙基-2-氟乙酰胺、2,2-丙基-2-氟乙酰胺、2-氟丙酰胺、3-氟丙酰胺、2,2-二氟丙酰胺、2,3-二氟丙酰胺、3,3-二氟丙酰胺、3,3,3-三氟丙酰胺、2-氟-3,3,3-三氟丙酰胺、2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、五氟丙酰胺、六氟丁酰胺、三甲基乙酰胺、1-(三氟乙酰基)咪唑、N,O-双(三氟乙酰基)羟胺、双三氟乙酰胺、N-甲基-氟乙酰胺、N-甲基-二氟乙酰胺、N-甲基-三氟乙酰胺、N-甲基-氯氟乙酰胺、N-甲基-氯二氟乙酰胺、N-甲基-氯乙酰胺、N-甲基-二氯乙酰胺、DN-甲基-二氯氟乙酰胺、N-甲基-三氯乙酰胺、N-甲基-溴乙酰胺、N-甲基-二溴乙酰胺、N-甲基-三溴乙酰胺、N-甲基-溴氟乙酰胺、N-甲基-溴二氟乙酰胺、N-甲基-溴氯氟乙酰胺、N-甲基-碘乙酰胺、N-甲基-二碘乙酰胺、N-甲基-三碘乙酰胺、N-甲基-2-甲基-2,2-二氟乙酰胺、N-甲基-2-甲基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2,2-二甲基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2-乙基-2,2-二氟乙酰胺、N-甲基-2-乙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2,2-二乙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2-丙基-2,2-二氟乙酰胺、N-甲基-2-丙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2,2-丙基-2-氟乙酰胺、N-甲基-2-氟丙酰胺、N-甲基-3-氟丙酰胺、N-甲基-2,2-二氟丙酰胺、N-甲基-2,3-二氟丙酰胺、N-甲基-3,3-二氟丙酰胺、N-甲基-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2-氟-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2,2-氯-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-2,2-溴-3,3,3-三氟丙酰胺、N-甲基-五氟丙酰胺、N-甲基-六氟丁酰胺、N,N-二甲基-2,2,2-三氟乙酰胺、N-乙基-2,2,2-三氟乙酰胺、N,N-二乙基-2,2,2-三氟乙酰胺、N-(羟基甲基)三氟乙酰胺、三氟乙酸乙酯、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、β-巯基乙醇、青霉胺、硫普罗宁(Tiopronin)、丙烯酰胺、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、甲醛、戊二醛、牛磺酸、乌头酸、己二酸、苯甲酸、柠檬酸、丙二酸、苹果酸、DL-马来酸、草酸、苯乙酸、苯丙酸、琥珀酸、乙酰丙酸、酒石酸、没食子酸、对甲苯磺酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、乙二醇、三乙二醇、甘油、间苯二酚、苯酚、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇、1,8-辛二醇、1,12-十二烷二醇、间甲酚、咪唑、1-甲基咪唑、4-甲基咪唑、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、N-苯甲基吡咯烷酮、2-咪唑啉酮、四氢-2-嘧啶酮、胍、盐酸胍、异氰酸胍、硫酸胍、乙酸铵、碳酸氢铵、氯化铵、柠檬酸氢二铵、甲酸铵、碘化铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、氨基磺酸铵、硫酸铵、酒石酸氢二铵、异硫氰酸铵、苯甲酸铵、溴化铵、氟化铵、硫酸氢铵、三氟乙酸铵、硫代硫酸铵、阿东糖醇(Adonitol)、核糖醇、鼠李糖、海藻糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖醇、山梨糖、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、甘露糖醇、***糖、半乳糖、棉子糖、肌醇、赤藓糖醇或木糖。
应该意识到,本文公开的一些化合物可以是可电离的,即一些化合物可以是弱酸、弱碱或两性电解质。可解离化合物的游离形式的代表旨在涵盖相应的电离形式。例如,羧酸基团的代表涵盖相应的羧酸根基团。
应该注意,诸如氯化锌等某些化合物可以不仅与氯化胆碱还与尿素形成DES;氯化胆碱和氯化锌出现在上述同一组分组中,因此某些DES混合物可以由同一组内的化学品形成。
还应该注意,以上列表是非排他性的,并且除了DES组分之间常存在氢键外(但并非必须),DES组分不特别限于任何类型的分子或性质。
根据本发明使用的深共熔溶剂优选基本上不含有机酸。具体而言,根据本发明使用的深共熔溶剂优选基本上不含选自以下的有机酸:苹果酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、丙酮酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乌头酸、酒石酸、抗坏血酸、丙二酸、草酸、葡糖醛酸、神经氨酸和唾液酸。作为选择或另外地,式II和III中所示的R6、R7和R8经选择以使所得化合物不包含羧酸基团。在优选设定中,当R6是OH时,R7不是羰基。在另一优选设定中,当R7是–Z-C(O)R8时,R8不是OH。
根据本发明使用的深共熔溶剂优选基本上不含金属盐。在一个设定中,深共熔溶剂基本上不含除了锌或锆的盐之外的金属盐。深共熔溶剂优选基本上不含NaH2PO4、Na2HPO4、NaHSO3、Na2SO4、MgCl2、CaCl2、KCl、NaCl和KI。如果深共熔溶剂包含糖或糖醇,则深共熔溶剂特别优选不包含金属盐。
根据本发明使用的深共熔溶剂优选基本上不含选自以下的糖或糖醇:蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、***糖、核糖、核酮糖、半乳糖、鼠李糖、棉子糖、木糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、赤藓醇和阿东糖醇。如果深共熔溶剂包含金属盐,则深共熔溶剂特别优选不包含糖或糖醇。
还应该注意,DES混合物中的DES组分没有特定的最大数目,例如可以将2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种组分以通常为整数(但并非必须)的摩尔比混合,以产生DES混合物,例如在双组分DES混合物中,组分1和组分2可以以下述比例混合:10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10(摩尔:摩尔);或者例如在三组分DES混合物中,组分1、组分2和组分3可以以这些比例混合:10:1:1、9:1:1、8:1:2、7:1:3、6:1:4、5:1:5、4:1:6、3:1:7、2:1:8、1:1:9、1:2:8、1:3:7、1:4:6、1:5:5、1:6:4、1:7:3、1:8:2、1:9:1、1:10:1(摩尔:摩尔:摩尔)。
技术人员会理解,组分的其他混合比例也是可以的,例如20:1或者1:30(摩尔:摩尔),并且对于特定目的,例如稳定RNA和/或固定细胞形态而言,产生共熔点的特定摩尔比不必是最优的期望的摩尔比。DES的稳定活性可以与DES混合物的氢键合性质相关。对于制造用于特定应用的有用DES混合物对组分的数目或者混合比例没有特别限制或限定。可以通过添加另外的组分,或者作为选择,通过添加下述的“添加剂”,来改变DES的其他物理性质,例如粘性或密度。一些DES混合物可以使用分数摩尔比制备,例如,ZnCl2:尿素以1:3.5(摩尔:摩尔)制备,并且同样地,对使用的组分1和组分2、或者组分1、组分2和组分3的摩尔比没有特别限定,包含在待用于诸如细胞固定等应用的DES混合物中的组分的最佳比例通过经验最精确地确定。仅举例而言,氯化胆碱/三氟乙酰胺可以以2:1、1.75:1、1.5:1、1.25:1、1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75或1:2(摩尔:摩尔)的比例或其其他的分数量混合,然后单独地测试以确定具有最佳RNA稳定化和/或细胞固定性质的比例。
诸如成本或毒性等其他因素也可以使技术人员减少特定组分的比例,并且用便宜的替代品部分地将其代替。仅举例而言,对于一些应用,氯化乙酰胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)DES混合物可以被较便宜的氯化胆碱代替,如氯化乙酰胆碱:氯化胆碱:尿素(1摩尔:1摩尔:4摩尔)。
对技术人员显而易见的是,例如,由于在用于制造DES的组分中污染的存在(例如水、氧化、吸收CO2、合成过程中污染副产物或组分之一的分解产物),1:1(摩尔:摩尔)(仅举例而言)混合物的所需确切比例可以实际上意味着在组分1或者组分2的确切量上有+/-10%、但更优选5%、甚至更优选1%的差异。举例而言,5%的误差可能产生以下最终摩尔比:0.95:1、1:0.95、1.05:0.95或0.95:1.05(摩尔:摩尔),该误差的影响通常仅凭经验确定,例如其对RNA品质的影响,如在实施例1中提出。通常为了除去包括水在内的污染物,可以进行公知的在乙醇中再结晶的步骤,然后充分抽真空和/或化学干燥。方法见‘PurificationofLaboratoryChemicals’Butterworth-Heinemann(2012)中所述。
通常而言,但不是排除性的,通过将氢键受体与氢键供体混合来制备DES,所述氢键受体来自下述类别的化学品之一:(i)具有带正电阳离子的氮盐,例如伯氮、仲氮、叔氮或季氮,氮盐的一个实例是具有卤离子的氮盐,例如氯化胆碱;(ii)金属盐,例如过渡金属卤化物;所述氢键供体可以包括(iii)胺;(iv)羟基;(v)醛;(vi)酰胺或(vii)羧酸,因此可以包括例如糖、羧酸、脲(诸如三氟乙酰胺)和醇等氢键供体。
在一个设定中,深共熔溶剂是III型或IV型深共熔溶剂,其中如使用AgilentBioanalyser2100所测定,大鼠肝脏样品与400mg深共熔溶剂在24℃温育20天,提取自10mg所述大鼠肝脏样品的RNA具有的RNA完整数(RNAintegritynumber)(RIN)为至少4.0。
RNA完整数可以使用RNA6000Nano总RNA试剂盒(货号5067-1511,AgilentTechnologies,美国)和Bioanalyser2100仪器(货号G2939AA,AgilentTechnologies,美国)测定。
如本文所用,术语“III型深共熔溶剂”是指具有至少第一组分和第二组分的深共熔溶剂,其中所述第一组分是季铵或鏻化合物,例如氯化胆碱或N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜碱),并且其中第二组分是氢键供体,例如尿素或三氟乙酰胺。IV型深共熔溶剂是包含至少第一组分和第二组分的深共熔溶剂,其中第一组分是金属盐,例如氯化锌,并且其中第二组分是氢键供体,例如尿素。
本领域技术人员熟悉从组织样品提取RNA的方法。适合的是,RNA可以使用RNeasy微型试剂盒(货号:74106,Qiagen,德国)根据制造商说明提取,虽然可以使用其他方法。
本发明提供深共熔溶剂作为病毒、细胞或组织固定剂来产生经固定的病毒、细胞或组织的应用。优选的是,对于生长于基体(substrate)上并与深共熔溶剂在24℃温育1小时的海拉细胞,在用水替换深共熔溶剂并在24℃温育1小时之后,所述海拉细胞中的至少75%仍然附着。
本领域技术人员熟悉用于确定保持附着在基体的细胞的数量的方法。例如,约2,000个海拉细胞可以生长在合适的基体上,例如盖玻片上。合适的盖玻片的一个实例是CellatticeTM:(微划线细胞培养盖玻片表面,货号:CLS5-25D-050NexcelomBioscience,美国)。可以将基体放在组织培养板上,并在合适的缓冲液中(例如2mlDMEM/10%FBS)中生长过夜。在基体的规定区域中附着细胞的数量可以使用10×显微镜物镜手动计数。组织培养基可以使用例如移液管除去,并用400mg的深共熔溶剂替换。可以将组织培养物在室温温育1小时,以允许进行细胞固定,然后用2ml蒸馏水替换除去深共熔溶剂,在室温温育1小时,并对规定的栅格区域中的细胞数量手动计数。然后可以计算残留在规定区域中的附着细胞相对于最初数量的百分比。
在特别优选的设定中,大鼠肝脏样品在24℃与400mg深共熔溶剂温育20天,如使用AgilentBioanalyser2100所测定,提取自10mg上述大鼠肝脏样品的RNA具有的RNA完整数为至少4.0;并且对于生长于基体上并且在24℃与深共熔溶剂温育1小时的海拉细胞,在用水替换深共熔溶剂并在24℃温育1小时后,所述海拉细胞的至少75%保持附着在基质上。
可选地是,根据本发明使用的深共熔溶剂是III型深共熔溶剂,其中所述深共熔溶剂包含含有三氟甲基的化合物。含有三氟甲基的化合物在深共熔溶剂中的存在量可以为所述深共熔溶剂的至少5重量%。
在一个设定中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中第一组分是式I化合物:
其中:
R6是H或OH;
R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和
Z选自-CH2-、O和S;
R8是R11或OH;和
其中所述第二组分包含式II化合物或其盐:
其中:
A选自O、S和NH;
R1选自H、具有1~6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)aCH3和-C(R3)(R4)(R5);
其中a是0或1~5的整数;
R2选自H和具有1~3个碳原子的直链烷基;
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环,其中所述取代基是R10;
R4和R5各自独立地是H或F;和
其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基和具有1~3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。
优选的是,在该设定中,A选自O、S和NH;R1选自H、-CH=CH2、R9、-NH2、-NHCH3和-C(R3)(R4)(R5);R2选自H和-CH3;R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环,其中所述取代基是R10;并且R4和R5各自独立地是H或F;并且R9和R10各自独立地选自具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基、具有1~3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。可选地是,R7选自H、Br、羰基氧和
A可以是O或S。
R2可以是H。
R1可以选自H、R9、-CH=CH2和-C(R3)(R4)(R5)。在该设定中优选的是,R1是R9,其中R9优选具有1个碳原子。
优选的是,所述第二组分是乙酰胺,或者2-氯乙酰胺。
在另一设定中,R9是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
所述第二组分优选是三氟乙酰胺、三氟硫代乙酰胺或N-甲基三氟乙酰胺。
在另一设定中,R9具有2个碳原子,优选的是R9是一氟乙基、二氟乙基或三氟乙基。
优选的是第二组分是2,2-二氟丙酰胺或3,3,3-三氟丙酰胺。在另一设定中,第二组分是甲酰胺或丙烯酰胺。
在又一设定中,R1是C(R3)(R4)(R5),其中R4和R5优选是F。
R3可以是可选地具有取代基的6元芳香环,例如可选地具有取代基的苯基。优选的是,第一组分是2,2-二氟-2-苯基乙酰胺。作为选择,R3包含取代基,该取代基优选位于苯基的2位。
所述取代基优选是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。因此,在一个设定中,第二组分是2-(三氟甲基)苯基乙酰胺。
在又一设定中,R1选自-NH2和–NHCH3。优选的是,第二组分是尿素、硫脲或1,3-二甲基脲。
在又一设定中,A是NH。在该设定中,第二组分可以是胍,可选地是其中所述胍以氢异硫氰酸盐(hydroisothiocyanatesalt)的形式存在。
在又一设定中,R7是H。在该设定中,第一组分优选包含胆碱。
在另一设定中,第一组分包含溴胆碱。
在另一设定中,第一组分是N,N,N-三甲基甘氨酸,可选地是第二组分选自三氟乙酰胺和尿素。
在另一设定中,R7是
在该设定中,Z可以是O或S,并且R8可以是R11,其中R11优选具有1个碳原子。
在该设定中,所述第一组分优选包含乙酰胆碱或乙酰基硫代胆碱。
作为选择,R11可以具有3个碳原子,其中,所述第一组分优选包含丁酰胆碱。
在又一设定中,Z可以是CH2。在该设定中,R8可以是OH。在该设定中,第二组分优选是肉毒碱。
所述第一组分可以包含抗衡离子,所述抗衡离子通常是卤素阴离子,但可以是另一阴离子,例如硝酸根(NO3 -)或四氟硼酸根(BF4 -)。所述卤素阴离子可以选自氟离子、氯离子、溴离子和碘离子,优选氯离子。在该设定中优选的是,第一组分是氯化胆碱,可选地是其中第二组分选自三氟乙酰胺、三氟硫代乙酰胺、3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-二氟-2-苯基乙酰胺、硫脲和尿素,优选三氟乙酰胺。
第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:3~2:1,优选1:1.5~1:2.5,更优选1:2。
在又一设定中,深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分是胆碱的卤化盐;并且其中第二组分是可选地具有取代基的咪唑,其中各取代基是具有1~3个碳原子的烷基。在该设定中,第一组分与第二组分的摩尔比优选是2.8:1~2:1。
所述胆碱的卤化盐优选是氯化胆碱,并且所述具有取代基的咪唑优选是甲基咪唑,例如N-甲基咪唑或4-甲基咪唑。也设想了具有苯甲基取代基的咪唑(例如1-苯甲基咪唑)的应用。作为选择,所述咪唑是未经取代的。
在又一设定中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中第一组分包含式III化合物:
其中:
R6是H或OH;
R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和
Z选自-CH2-、O和S;
其中R8选自OH、具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基和具有1~3个碳原子的一三氟烷基、二三氟烷基、或三氟烷基;和
其中所述第二组分是具有至少3个碳原子的糖或糖醇。
R7可选地选自H、Br、羰基氧和
所述糖醇可以选自甘油、苏糖醇、木糖醇、山梨糖醇和庚七醇(volemitol),优选选自甘油、木糖醇和山梨糖醇,最优选是山梨糖醇。作为选择,所述糖可以是海藻糖。
在该设定中,第二组分可以包含胆碱,例如氯化胆碱。第一组分与所述第二组分的摩尔比可以为1:2~2:1,优选1:0.8~1:1.2。
在又一设定中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分是卤化锌(II)或卤化锆(IV),并且其中所述第二组分是式IV化合物:
其中:
A选自O、S和NH;
R1选自H、具有1~6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)nCH3和-C(R3)(R4)(R5);
其中n是0或1~5的整数;
R2选自H和具有1~3个碳原子的直链烷基;
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环,其中所述取代基是R10;
R4和R5各自独立地是H或F;和
其中R9选自具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基和具有1~3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基、或三氟烷基。
优选的卤化锌(II)是ZnCl2。优选的卤化锆(IV)是ZrCl4。第二组分优选是尿素。第一组分与第二组分的摩尔比可以是1:3~1:4。
第二组分优选是尿素。
在又一设定中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中第一组分是式V化合物:
其中:
Y-是Cl-或Br-;
X是N或P;
R12、R13、R14和R15各自独立地是具有1~16个碳原子的直链烷基、具有1~16个碳原子的直链醇基、苯甲基或苯基;
其中所述第二组分是式I化合物或其盐:
其中:
A选自O、S和NH;
R1选自H、-CH=CH2、R9、-NH2、-NHCH3和-C(R3)(R4)(R5);
R2选自H和-CH3;
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环,其中所述取代基是R10;并且
R4和R5各自独立地是H或F;
其中R9和R10各自独立地选自具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基、具有1~3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。
Y-可以是Cl-。在替代性设定中,Y-可以是任何合适的抗衡离子,例如卤离子、硝酸根或四氟硼酸根。
X可以是N;在该设定中,式V化合物是季铵盐。
可选地是,R12、R13、R14和R15各自独立地是具有1~16个碳原子的直链烷基、苯甲基或苯基。
R12、R13、R14和R15各自独立地选自具有1~4个碳原子的直链烷基,并且优选各自是甲基。在该设定中第一组分优选是四甲基氯化铵。
作为选择,R12、R13、R14和R15各自是乙基。在该设定中,第一组分优选是四乙基氯化铵。
作为选择,R12、R13、R14和R15各自是丁基。在该设定中,第二组分是四丁基氯化铵或四丁基溴化铵。
作为选择,第一组分包含:
作为选择,第一组分包含:
在另一设定中X可以是P。
R12、R13、R14和R15的至少一个是苯基。在该设定中,所述第一组分优选包含甲基三苯基鏻,并且可以是甲基三苯基溴化鏻。
在另一设定中,A可以是O或S。
R1可以选自-NH2和–NHCH3,并且所述第二组分优选是尿素。作为选择,所述第二组分可以是三氟硫代乙酰胺。作为选择,所述第二组分可以是三氟乙酰胺。
第一组分与第二组分的摩尔比可以是1:1.5~1:2.5,优选1:1.8~1:2.2。
在又一设定中,深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分包含胆碱,并且其中所述第二组分是具有5~7个碳原子的烷基二醇。所述烷基二醇优选是己二醇。
在又一设定中,深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分包含胆碱,并且其中所述第二组分包含N-烷基吡咯烷酮,其中所述N-烷基具有1~5个碳原子。优选的是,N-烷基吡咯烷酮是N-甲基吡咯烷酮。优选的是,所述胆碱是氯化胆碱。在该设定中,第一组分与第二组分的摩尔比可以是1:2。
在另一设定中,深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分包含胆碱,并且其中所述第二组分包含β-巯基乙醇。在该设定中,所述胆碱可以是氯化胆碱,并且/或者第一组分与第二组分的摩尔比可以是约1:2。
在另一设定中,深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分包含胆碱,并且其中所述第二组分包含二硫苏糖醇。所述胆碱可以是氯化胆碱。第一组分与第二组分的摩尔比可以是约1:2。
DES混合物最简单地从商业化的化学原液制备,所述原液可获自化学试剂公司,例如AcrosOrganics(法国)、TCI(比利时)和Fluka(法国)等。通常而言,将正确量的各组分一起添加在聚丙烯试管中,短暂摇晃,通过标准手段加热至100℃,并且必要时对于难以溶解的组分或添加剂进行超声,这是极其有效的混合方法。注意对于吸湿性的诸如氯化胆碱等组分,可能需要对原液进行另外的真空干燥或重结晶。DES混合物的原液可以在真空下或者借助于诸如硅胶等干燥剂而保持干燥。通常在室温于密封管中贮存。
还已经发现,用诸如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)等DES混合物处理植物和动物组织,保持了叶、花、血液和组织的颜色,这可能通过与未处理样品或者用RNAlater、Formol或冷冻相比,减少了氧化。颜色保持可用于正确地鉴定试样和/或试验的组分。
已经发现在氯化胆碱和挥发性/有气味化学品(例如二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、β-巯基乙醇或苯酚)之间制备DES混合物,减少了挥发性以及进而减少呼吸此类化学品的令人不愉快或危险的效果。该效果可能是挥发性化学品与氯化胆碱之间的氢键合的结果。除了在组分之间需要有氢键键合之外,对于DES混合物中挥发性组分的组合没有特别限制。还存在减少诸如低分子量醇、其他有机化学品(例如包括DMSO和甲酰胺在内的溶剂)等其他挥发性组分的损失的手段。因此本发明还包括减少用于贮存或用于开放环境的组分的蒸发和/或挥发性的手段。其优点包括更好的卫生和安全性,减少有价值的试剂的蒸发损失,减少可燃性和更简单的处置。
双组分或更多组分的DES混合物的共熔点是其中组分1相对于其他组分的比例导致最低熔融温度的点。例如,氯化胆碱:尿素DES混合物的共熔点是(1摩尔:2摩尔)具有的凝固点(Fp)为12℃。从实际的标准点开始,这意味着DES在室温时可以作为液体操作,但是在冰箱里其缓慢地固化。其他DES混合物,特别是含有与甘油、乙二醇和三氟乙酰胺或苯乙酸混合的氯化胆碱的那些DES混合物,具有低得多的Fp,在低于0℃甚至-20℃仍是液体。虽然操作液体具有一些优点,如容易测定准确体积和混合,重要的是应该注意本发明绝不以任何方式限定至在任何其他特定温度的于室温为液体的DES混合物。加热和混合DES的组分提供用于使个体原子或分子与其他原子和分子建立氢键或其他相互作用的手段,因此产生DES混合物的特定性质。一旦这发生,无论DES混合物是液体、凝胶或固体,不会必然改变其例如稳定组织样品中的RNA的能力。组织样品与DES混合物之间的简单接触,即使在DES于室温为固体时也会发生,因此可以出现快速稳定。虽然传统上RNA稳定剂是液体,如RNAlater、AllProtect、PAXgeneTissue或***,本文所述的发明可以利用液体、凝胶或固体DESRNA稳定化和/或细胞固定性质。实际上使用固体形式的DES在处理组织样品时可能是有利的;DES的固体块可以通过将DES固体加热至高于其共熔点而形成,从而使其熔融,然后将其浇入合适的容器中以冷却或固化,或者经成型或切割以适合特定的容器,并且将组织样品置于固体DES表面上以引起稳定化。可以在固体DES表面中制造常规的孔、凹陷或槽以充当各样品的特定贮存位置,一个孔接收一种样品等,使用孔时有利的是,固体DES与样品之间的接触面积增加(图1A),而在位于孔中的样品之上的另外的DES固体或液体的层会进一步增加可利用的DES的总量或与样品接触的表面积(图1B)。血液收集管示于(图1C),其装有DES液体并具有可穿孔的帽,以便通过注射针头或血液收集试剂盒(PreAnalytix)使血液进入。举例而言,表1中列出了在室温为固体或液体的DES混合物。
本发明还包括添加剂与DES混合物的组合应用。添加剂的目的在于改善DES混合物的性质,例如RNA、DNA和/或蛋白质稳定化和/或细胞和组织固定或另一应用。各种添加剂对细胞形态的效果例如在表6中列出。添加剂的目的在于增强DES混合物用于特定应用的性质,例如RNA稳定化、贮存、运输和/或细胞或组织固定。仅举例而言,添加剂可以是:(i)辅助处理或染色或加工组织的着色剂或染料,例如H&E染料、考马斯蓝、亚甲基蓝、二甲苯蓝、结晶紫、品红、吖啶橙、DAPI、胭脂红、曙红、溴化乙锭、俾斯麦棕、赫司特(Hoechst)、孔雀石绿、甲基绿、中性蓝、尼罗蓝、四氧化锇、罗丹明或者番红;(ii)与DES混合物一起提高细胞质膜的渗透的洗涤剂、季铵盐或皂苷,例如SDS、十二烷基硫酸钠(SLS)、十六烷基四丁基溴化铵(CTAB)、四丁基溴化铵(TBAB)、脱氧胆酸钠、Brij-35、Brij-58、NP-40、TritonX-100、TritonX-114、Tween-20、Tween-80、辛基β葡糖苷、CHAPS、茄碱;(iii)抗微生物剂,例如抗生素或防腐剂,例如卡那霉素、链霉素或青霉素、硝酸钠、亚硝酸钠或苯甲酸钠;(iv)蛋白质沉淀剂如三氯乙酸、硫酸铵、磺基水杨酸,如氯化锌或硫酸锌等锌盐;(v)从DES混合物中除去过量的水的干燥剂,例如分子筛4A、硅胶、CaCl2或LiCl;(vi)探针、杂交互补核酸、肽、蛋白质、核酸或标记分子、内部对照、阻断序列或载体核酸,例如,(a)单链或双链RNA或DNA序列,(b)肽、酶或其他蛋白质如抗体,(c)用于检测分析物的分子,例如生物素、辣根过氧化物酶、亲和素、链亲和素、如荧光素等荧光标记分子、德克萨斯红、AlexaFluorTM标记的LNA;(d)MolecularBeaconTM、Scorpion探针TM;(vii)从样品除去氧并减少贮存期间对例如RNA或DNA核碱基的损伤性氧化效果的抗氧化剂,例如维生素C或谷胱甘肽;(viii)核糖核酸酶抑制剂,例如RNasin、SUPERase·INTM、RNaseOUTTM;或者蛋白酶抑制剂,例如苯甲基磺酰氟(PMSF)、二异丙基氟磷酸(DFP)、抑肽酶(aprotinin)或PefablocSCTM;(ix)以0.5mM~20mM使用的将pH稳定在5~8、优选6~7的缓冲剂,例如Tris-HCl、PIPES、MES、HEPES、MOPS、MOPSO、CAPS、CAPSO、BIPES、磷酸盐、咪唑;(x)以0.5mM~20mM使用的用于除去二价金属阳离子的螯合剂,例如BAPTA、EDTA、EGTA、柠檬酸、D-青霉胺;(xi)用来增强细胞、组织和器官活力的溶解氧(终浓度2%~20%)和/或CO2(终浓度0.01%~5%)、诸如氩气等非反应性气体(终浓度1%~20%)和/或缓冲剂、营养物(终浓度2%~20%)(例如葡萄糖和氨基酸);和/或(xii)减小DES粘性的1%~20%(重量:重量)的醇,例如叔丁醇。
此处将“添加剂”定义为可以溶解在特定DES混合物中的任何物质,并且可以以大于、等于或小于DES混合物的总量(重量:重量)的量存在。仅举例而言,对于氯化胆碱:尿素:氯化锌(1摩尔:2摩尔:0.5摩尔),ZnCl2是添加剂;或者对于氯化胆碱:三氟乙酰胺:尿素(1摩尔:2摩尔:0.1摩尔),尿素是添加剂。还应该注意添加剂对DES混合物的凝固点不必具有任何特定效果或者与任何DES组分形成氢键,但是赋予DES混合物独特的性质。
添加至DES混合物的可能添加剂的非排除性列表是:对甲苯磺酸铵、对甲苯磺酸钠、硫酸铵、氯化铵、硫代硫酸盐、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、苯甲酸钠、十二烷基二甲基(3-磺丙基)氢氧化铵、二甲苯磺酸、刚果红、吉姆萨(Giemsa)、DAPI、溴化乙锭、马洛里氏染色、地衣红、醛一品红、四氧化锇、三氧化铬、铬酸、富尔根(Feulgen)、重铬酸盐、氯化汞、苏木精和曙红染色(H&E)、甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇、甲醇、甲基三苯基溴化鏻、十六烷基四丁基溴化铵(CTAB)、四丁基溴化铵(TBAB)、脱氧胆酸钠、Brij-35、Brij-58、NP-40、TritonX-100、TritonX-114、吐温-20、吐温-80、辛基β葡糖苷、CHAPS、茄碱、卡那霉素、链霉素或青霉素、硝酸钠、亚硝酸钠或苯甲酸钠、单链或双链RNA或DNA序列、单链或双链RNA或DNA标记序列、适体、肽、酶、抗体、生物素、生物素标记的分子、辣根过氧化物酶、亲和素、链亲和素、GFP或其变体、荧光素酶、荧光素、若丹明、德克萨斯红、AlexaFluorTM、LNA、标记的LNA、MolecularBeaconTM、Scorpion探针TM、FISH探针、bDNA、PCR引物、寡(dT)、PNA、抗氧化剂、RNasin、SUPERase·INTM、RNaseOUTTM、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二异丙基氟磷酸(DFP)、抑肽酶或PefablocSCTM、Tris-盐酸、PIPES、MES、HEPES、MOPS、MOPSO、CAPS、CAPSO、BIPES、磷酸盐、咪唑BAPTA、EDTA、EGTA、柠檬酸、D-青霉胺、O2、CO2、N2、氩气、丙醇、叔丁醇、三氯乙酸、硫代水杨酸、水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、四甲基脲、咪唑、1-甲基咪唑、1-乙基咪唑、1-苄基咪唑、4-甲基咪唑、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、N-苄基吡咯烷酮、胍、盐酸胍、异硫氰酸胍、核糖醇、鼠李糖、海藻糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖醇、山梨糖、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、甘露糖醇、***糖、半乳糖、棉子糖、肌醇、赤藓醇、木糖、醋酸锌、EDTA锌、磷酸锌、三氟乙酸锌、柠檬酸锌、PTSA锌、葡萄糖酸锌、氯化锌和/或硫酸锌。对DES混合物不溶的添加剂包括但不限于:石蜡、硅胶、硫酸钠或MolecularSievesTM、聚丙烯酰胺、气凝胶、聚丙烯酸和/或量子点。
已经发现向氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加乙醇或者诸如甲醇和异丙醇等其他醇对RNA的稳定性具有强负面影响(参见表2)。尚未理解为何特别是乙醇对RNA稳定性具有此类负面影响,但是三氟乙酰胺与氯化胆碱氢键合的改变可以作为部分解释。在任何情况下,优选的是避免使用相对于组分1(氯化胆碱)大于0.1的摩尔比的乙醇。但是,如果期望对已经用乙醇或另一醇中的DES混合物处理过的组织样品进行加工或贮存,可以使用吸收性纸从组织样品除去过量的DES混合物,在100%乙醇中洗涤2次,然后将组织长时间静置,这消除了对RNA稳定化的负面影响。作为选择,可以使用相同的方法来用第二DES混合物替换第一DES混合物,例如可以用氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或者可以用对于某些涉及RNA稳定化的应用优选的另一DES混合物替换氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合物。作为选择,一旦从DES混合物除去,可以将生物样品置于干燥环境中,例如含有分子筛、Drierite、干燥的糖(例如海藻糖、木糖醇或山梨糖醇)、(Biomatrica,美国)或氯化钙的密封容器以用于贮存目的。另一备选方案是将经处理的生物样品置于液体贮存基质中,例如醇(例如甲醇、乙醇、丙醇或丁醇)、RNALater(LifeTechnologies,美国)、AllProtect(Qiagen,德国)、PAXgene组织、PAXgeneBlood(PreAnalytix,德国)、GenTegraRNA(Integenx,美国)、Cell-FreeRNA(Streck,美国)或CellSavePreservative(Veridex,美国)。作为另一选择,用DES混合物处理后的样品,可以转移至交联固定剂的溶液中,例如10倍体积的4%甲醛或戊二醛溶液,并且温育合适的时间,例如15分钟~24小时。虽然用交联剂处理样品会对RNA、DNA和蛋白质的品质具有负面影响,但该处理对于载玻片制品可以改善样品的刚性以及其在某些检验中的性能,所述检验例如利用对***处理过的蛋白质表位具有特异性的抗体的免疫组织化学。另一备选方案是用10倍体积的4%甲醛或戊二醛溶液预处理样品,并使其温育合适的时间,例如15分钟~24小时,然后除去样品,并将其添加至10倍体积的DES混合物(例如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔))15分钟~24小时。
优选的是,避免利用或存在水,以减少分析物水解的风险,特别是RNA、DNA和蛋白质水解。因此对于需要RNA、DNA或蛋白质稳定化的应用,DES混合物含有50%以下、更优选40%以下、还更优选30%以下、还更优选20%以下、还更优选10%以下、还更优选5%以下、最优选小于2%的水(重量百分比)。对于细胞结构和形态以及组织固定,DES混合物可以含有50%以下、更优选40%以下、更优选30%以下、更优选20%以下、更优选10%以下、最优选10%~5%的水(重量百分比)。
对于最优的RNA稳定化,已经发现优选向氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合物添加干燥剂。合适的干燥剂包括硅胶、聚丙烯酰胺、硫酸钠、DrieriteTM和分子筛。用于RNA稳定化的优选干燥剂是与DES混合物、优选氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合物一起以5%~50%重量:重量使用的分子筛4A型(粉末化或球团形式,例如4目~12目)。另外的优点在于已经发现分子筛减少氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合物中出现的结晶。
显然,可以制造许多类型的DES混合物,并且出于保存样品中的RNA的目的,具体的DES的选择可以通过DES的一个或多个以下优选特征来确定:(1)与RNA的相容性,优选的是当与样品混合时其应该具有的pH为pH4.5~8.5,更优选pH5~8,更优选pH5.5~7.5,最优选pH6~7;(2)与RNA纯化试剂和策略的相容性,例如其不应该干扰RNA和二氧化硅旋转柱如RNeasy(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)之间的结合,或者改变RNA在含苯酚试剂如TRIzol(货号15596018,LifeTechnologies,美国))中的分配;(3)足够快地使组织样品中的RNA稳定化以实质上改变核糖核酸酶的活性和/或RNA对水解的可及性;作为选择,RNA在组织中足够快的稳定,从而使得在室温与DES混合物一起贮存18~24个小时的过程中,与来自相同类型的未经贮存的新鲜组织样品提取的RNA相比,RNA完整数(RIN)不减少超过2个RIN单位,更优选不超过1个RIN单位,还更优选不超过0.5个RIN单位,最优选小于0.1个RIN单位;(4)当组织占DES混合物的重量的至少10%、更优选20%、甚至更优选至少50%时(重量:重量),具有稳定RNA的能力;(5)与新鲜组织相比,将RNA产率不减少超过20%;(6)提供DNA、蛋白质或者磷蛋白的磷酸基的稳定化;(7)是化学稳定的、非炎性的、对使用者和环境无毒的、可生物降解的、不与漂白剂或RNA纯化过程中使用的试剂反应而形成毒性化合物;(8)在室温具有至少6个月贮存期;(9)固定和稳定天然细胞形态和组织学,包括抗体表位、亚细胞机构和细胞器,同时稳定RNA和其他生物分子;(10)固定和稳定细胞,其方式使得随后允许组织学和免疫组织化学应用,例如利用抗体和染色(如Hoechst或H&E染色)的组织学和免疫组织化学应用;(11)稳定FFPE样品中的RNA以保护和增强在温度高于50℃时***交联的逆转,并使其熔融,由此容易从经固定样品除去石蜡;(12)固定和稳定全血中的循环肿瘤细胞,以允许其纯化、检测和分子分析。
样品中RNA的稳定可以是DES处理、或者DES处理与另一物理加工的组合的结果,例如核糖核酸酶的失活,由于水分子的置换所致的细胞蛋白质和核酸的沉淀,或者溶解的DES进入组织的细胞结构中并导致RNA稳定,或者这些的组合。DES所致的细胞和RNA中及其周围的氢键的修饰或改变可能是本发明提出的所观察到的生物分子和细胞稳定化的重要因素,但是DES混合物能够进行稳定化的确切机制仍是未知的。
含有分析物的样品或组织可以是:(i)液体,例如血液、血浆、血清、脑脊液(CSF)、痰、***、支气管肺泡灌洗(BAL)、羊水、乳汁和尿液;(ii)固体,例如身体组织(肝、脾、脑、肌肉、心脏、食管、睾丸、卵巢、胸腺、肾、皮肤、肠、胰腺、肾上腺、肺、骨和骨髓);(iii)用于医疗测试的临床,例如***、乳腺或癌症样品、肿瘤或活组织检查,包括FFPE样品、循环肿瘤细胞、血液检查、临床拭子、干血、外来体、微泡;(iv)源自生物医学研究或基础生物学的动物组织(猴、大鼠、小鼠、斑马鱼、爪蟾、果蝇、线虫、酵母),及其各发育阶段(卵、胚胎、幼虫、成虫)的动物组织;(v)用于药物开发目的的组织和组织培养物;(vi)病原性和非病原性微生物,例如真菌、古细菌、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,包括引起痢疾、白喉、破伤风、梅毒、鹦鹉病、退伍军人症、李斯特菌病和麻风病的大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、分枝杆菌、假单胞菌和细菌;(vii)在各种生物样品中发现的病原性或非病原性类病毒、噬菌体或病毒,所述样品例如细菌、植物、血液、人类组织、动物血液、血清、血浆和组织、以及临床样品;(viii)植物,例如水稻、玉米、高粱、棕榈、葡萄、西红柿、小麦、大麦、烟草、甘蔗和拟南芥的叶、花、花粉、种子、茎和根;(ix)固定的组织,例如FFPE组织和活组织检查,其经常需要用于提取高品质的核酸的专门的策略;(x)与有关的生物恐怖威胁相关的潜在病原性材料,例如炭疽热,其可能需要或可能不需要从发现地点运输到测试设备;(xi)极小的样品,例如来自激光捕获显微切片样品(LCM)的那些样品;(xii)食物样品,其例如可以含有食源性疾病;(xiii)土壤样品。应该注意的是样品可能不仅源自生物源样品,而且源自化学或酶促合成的样品,例如核酸类拷贝分子或扩增产物,例如体外转录RNA和PCR产物、寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸、PNA和LNA。对于可与本发明一起使用的样品类型没有特别限制。
本发明还用于RNA、DNA和蛋白质内部对照(IC)和标准物的稳定化,例如HIV或HCV诊断试剂盒(如AmplicorTM(RocheMolecularDiagnostics))中所包括的那些,或可以包括在此类诊断试剂盒中的载体RNA。对于此应用,RNAIC通常与试剂盒的剩余组分一起运输和贮存,通常是在可能导致降解的室温或4℃进行。RNAIC或载体RNA的稳定化改善了试剂盒性能并在运输和贮存期间保持其完整性。
有用的是,本发明可用于保存单链和/或双链RNA病毒,这些病毒包括:已经发现对人类健康具有显著影响的动物RNA病毒,例如诺瓦克病毒、轮状病毒、脊髓灰质炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、汉坦病毒、狂犬病病毒、流感病毒、黄热病病毒、冠状病毒、SARS、西尼罗河病毒、甲型肝炎病毒、病型肝炎病毒(HCV)和戊型肝炎病毒、登革热病毒、披膜病毒(toga)(如风疹病毒)、弹状病毒(如狂犬病病毒和VSV)、细小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒和鼻病毒)、粘病毒(如流感)、逆转录病毒(例如,HIV、HTLV)、布尼亚病毒、日冠状病毒和呼肠孤病毒,包括类病毒样病毒,例如丁型肝炎病毒;以及对农业生产均有显著影响的植物RNA病毒及类病毒,例如番茄丛矮病毒、大麦黄矮病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、烟草脆裂病毒、豇豆花叶病毒、线虫传多角体病毒、Almovirus、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、等轴不稳环斑病毒、椰子死亡类病毒(cadang-cadangviroid)和马铃薯纺锤块茎类病毒;上述病毒在用于诊断检测目的之前、期间或之后都易于降解。本发明还可用于使单链RNA噬菌体稳定化,例如包括肠杆菌噬菌体MS2在内的轻小噬菌体属(genusLevivirus),和包括肠杆菌噬菌体Qβ在内的异轻小噬菌体属(genusAllolevivirus),或使双链RNA噬菌体稳定化,例如,包括假单胞菌噬菌体Φ6在内的囊状噬菌体属或其他类型的噬菌体,例如用作用于诊断应用的内部RNA对照的那些噬菌体,例如用于Armored(Ambion)的那些噬菌体。本发明还可通过将DES与纯核酸混合,而用于对用于诊断试剂盒的内部对照(IC)RNA或DNA序列的稳定化。
本发明还可用于使样品稳定化以用于分析miRNA、siRNA和其他小的天然存在的RNA分子,例如snRNA、snoRNA、ncRNA、snoRNA、piRNA和rasiRNA。其还可用于涉及RNAi类型的合成RNA的研究、诊断和治疗。
有用的是,本发明可用于在胍和血液、血清、血浆细胞和/或其他医学上重要的样品类型(如细胞和组织)的混合物中保存病毒RNA,例如逆转录病毒,如HIV、轮状病毒、HCV和西尼罗河病毒。
已经发现,一些DES混合物、特别是氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)具有强抗微生物活性(实施例34),由此使样品的操作和运输更为安全。其他应用包括稳定和固定可能已经被毒素、病毒、细菌和/或真菌故意污染的土壤和/或其他环境样品,以便于随后对RNA、DNA和/或蛋白质的运输和实验室分析。
因此本发明涉及改善RNA的贮存、保存、存档和运输、保护RNA免受降解、增加其稳定性并由此改善分析敏感性和检验品质的方法。
对于本领域技术人员显而易见的是,如实施例1中所提出,可以对各种DES通过将其以至少10:1(重量:重量)的比例添加至样品而测试其在本发明中的适合性。可以使用根据制造商说明书使用的RNAlater(10:1(体积:重量)的对照溶液(货号:76106,Qiagen,德国),进行相对RNA稳定化的比较。在例如37℃温育1天以上之后,根据标准策略例如RNeasy(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)提取RNA,并且通过凝胶电泳或通过使用RNA6000Nano总RNA试剂盒(货号:5067-1511,AgilentTechnologies,美国)以及Bioanalyser2100或其他合适的方法(如上述的RT-qPCR)来分析其完整性。可以通过OD260nm紫外光谱确定RNA产率,并通过公知的OD260/230和OD260/280比率确定纯度。NanodropND2000(ThermoScientificInc.,美国)是用于此类测定的合适的分光仪的一个实例。一旦鉴定出合适的DES混合物,可以通过进一步的此类测试确定其最佳量、纯度、污染水的量和用途。
通常用于优化的最重要的一个因素是DES混合物的各组分的相对摩尔比。首先,仅混合DES混合物的两种组分是最直接的手段来合适地鉴定或通过上述经验手段合适地鉴定产生所需效果的组分,所述效果例如RNA稳定化、产率、纯度和对于诸如RT-PCR或杂交等下游应用的适合性。但是对本领域技术人员显而易见的是,可能理想的是超过两种组分的共混物,以进一步增强DES混合物或为DES混合物添加新性质。显然存在非常大量的可以形成DES混合物的组分的潜在混合物,但是最容易首先以DES组分的简单化学计量摩尔比制备开始,例如仅举例而言,2:1、1:1或1:2摩尔比(摩尔:摩尔)的氯化胆碱和尿素。据认为双组分DES混合物的凝固点的降低至少部分地由可利用的氢键供体(例如氯化胆碱)和受体(例如尿素)之间的氢键决定。但是应该注意的是,DES混合物的优选组分及其对于诸如RNA保存或细胞固定等特定应用的最佳混合比并不必然地与所观察到的凝固点降低的程度相关。因此鉴定对于应用的最佳DES混合物必须通过经验确定,并因此可以包括试错测试。显然,鉴定用于大于两种组分的DES混合物的特定目的的最佳共混物可能要花费显著的努力。因此,起初为了快速地限定组分的合适摩尔比,如上所述可以使用化学计量比例。一旦已经鉴定出合适的摩尔比,可以进行进一步完善,包括固定一种组分的摩尔量,同时变化其他两种或多种组分的摩尔量。应该注意的是,各种DES组分的摩尔浓度是可变的,并且取决于各组分的密度、摩尔比和分子量。举例而言,氯化胆碱:尿素(1:2)混合物中的氯化胆碱浓度约为5M且尿素浓度是10M,而相比之下氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2)混合物中氯化胆碱浓度为3.6M且三氟乙酰胺浓度为7.2M。
如TimothyD.Veenstra,RichardD.Smith编写的ProteomeCharacterizationandProteomics(2003)中所述,可以通过制备型或分析型2-DPAGE、质谱、合适的抗磷抗体和ELISA来确定蛋白质和磷蛋白的完整性。
从粘性DES液体混合物回收样品的方法包括将其固定或附着至回收器(retriever),例如线、针、刷、棒(baton)、筛、***物,将其捕获在两层可渗透膜之间或含有足够的DES的两个聚合物垫之间,以允许有效的DES稳定化和/或固定,或者使用能够在处理过程中抓持样品的成型塑料保持器。优选的是,组织样品携带的任何DES混合物容易溶解于例如RLT(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)等RNA裂解液中并且不影响RNA产率或者增加RNA产率、不引起样品从溶液沉淀出,并且如果其随RNA样品携带,其不影响或者增强敏感的下游应用,例如RT-qPCR。确定RNA产率和品质的变化的方法是公知的,并且包括分光光度法、采用AgilentBioanalyser2100定量的RNA6000Nano总RNA试剂盒(货号:5067-1511,AgilentTechnologies,美国)和/或RT-qPCR。
使用DES混合物的本发明显示的结果特别令人意外,因为众所周知核酸酶对活性具有非常宽的要求,例如核糖核酸酶A是稳健的核酸酶,其在pH4~10、例如+4℃~60℃的可变温度、0~3M的钠浓度、至多400mM的胍离液剂浓度下具有活性,并且能够煮沸数分钟而存活(Raines(1998)Chem.Rev.98:1045-1065)。虽然非常难以使此类酶失活,用许多不同的DES混合物处理可以对核酸酶活性造成显著影响,因此改善RNA品质。一种解释是,DES组分与诸如核酸酶、特别是核糖核酸酶等酶形成氢键,置换这些酶周围的天然水分子并且导致变性和失活,并且/或者RNA在经变性的DES处理的核糖核蛋白复合物(例如核糖体)内得到保护。
对本领域技术人员显而易见的是,可以以许多方式进行测试具体DES对生物分子贮存的功效。首先,可以向设定量的预称重组织(例如20mg的冷冻-解冻大鼠肝)添加已知量的DES,并在37℃一起温育不同的时间量(例如5小时、10小时、20小时、40小时和60小时),温育后回收组织,并通过纯化回收RNA或其他生物分子并分析完整性。可以例如通过RT-qPCR或Bioanalyser2100(Agilent,美国)RIN分析确定RNA品质。
优选的是,DES混合物在制备后具有合理的贮存期,意味着其稳定活性在常温贮存至少6个月以上的过程中不会显著改变。
DES混合物与组织样品的搅拌、混合和温度对于最佳RNA稳定都是重要因素。DES混合物在组织样品周围的温和搅拌可帮助增加样品的稳定速率。混合或搅拌的手段包括使用Thermomixer(Eppendorf,德国)的混合功能、旋转轮或平台,例如LabRoller(LabNet,美国)。虽然使用DES混合物观察到的RNA的降解量是有限的,但是从样品被从其在整个动物的正常环境中取出到DES混合物开始减少或完全抑制核糖核酸酶活性之间的时滞过程中,样品会出现不可避免的一些降解。对于本发明,关键步骤是从向样品添加DES混合物到核糖核酸酶失活之间的时滞,并且显然核糖核酸酶在25℃~37℃比在4℃~16℃更具活性。优选地,将DES和容器预冷却并在关键的DES处理步骤期间保持这种降低的温度,但是对于诸如大鼠肝等具有平均水平的核糖核酸酶的组织而言(与诸如大鼠胰腺等含有较高水平的组织相比)这并不是关键。通过使用降低的温度(例如4℃)的DES混合物、容器和环境,可以在具有高核糖核酸酶活性的组织中改善RNA品质。
用于保存生物样品中的RNA的DES混合物的合适选择依赖于多种重叠的物理和化学性质。理想的是DES混合物应该能够:(1)快速有效地稳定包括生物样品中的RNA、DNA、蛋白质、翻译后修饰蛋白质(如磷蛋白)、碳水化合物、脂质和代谢物在内的生物分子;(2)当与生物样品一起以20:1(重量:重量)比、更优选15:1、还更优选10:1、还更优选8:1、还更优选6:1、还更优选4:1、还更优选3:1、还更优选2:1、最优选1:1添加时,最佳地用于稳定诸如RNA等生物分子;(3)在低于120℃、还更优选低于100℃、还更优选低于80℃、还更优选低于60℃、最优选在室温为液体;(4)其粘度不至于特别难以对其操作和/或将其从固体样品去除,并且在25℃具有的粘度小于100000cP、还更优选小于75000cP、还更优选小于50000cP、还更优选小于25000cP、还更优选小于10000cP、还更优选小于5000cP、还更优选小于2500cP、还更优选小于1000cP、还更优选小于750cP、还更优选小于500cP、还更优选小于250cP、还更优选小于100cP、还更优选小于75cP、还更优选小于50cP、还更优选小于25cP、还更优选小于10cP、最优选小于5cP;(5)具有与RNA和RNA纯化试剂的相容性,所述RNA纯化试剂例如盐酸胍、硫氰酸胍、裂解缓冲液RLT(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)硅胶旋转柱、磁性硅胶珠例如MagNA(RocheAppliedScience,英国)、(LifeTechnologies,美国);(6)与标准纯化相比,将RNA与例如RNeasy(Qiagen,德国)等硅胶柱的结合减少不超过20%,并且将OD260/280nm分光光度比值减少不超过0.2;和(7)即使与RNA纯化试剂组合对于使用者也是无毒和非炎性的;(8)生物降解;和(9)具有不挥发性。
作为DES用于从FFPE样品提取RNA的应用的一个实例,***固定公知会引起RNA和蛋白质之间的多重交联,使随后的RNA提取成问题并且使RNA的品质低。用于从FFPE样品的RNA中除去交联物的标准策略是对其加热,例如在80℃加热15至60分钟,但是这引起进一步的RNA降解(RNeasyFFPE试剂盒,货号73504,Qiagen,德国)。通过将DES与逆转交联所需的试剂组合,可以在关键的加热步骤期间保护RNA,从而产生更高品质的RNA样品。作为合适的DES的一个实例,可以使用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2)在80℃处理FFPE样品,从而从RNA除去石蜡和交联物。
作为DES在医疗领域的应用的一个实例是用于处理全血以使循环肿瘤细胞(CTC)稳定化。这些细胞源自肿瘤然后进入血流,其正越来越多地用于诊断、预后和治疗目的,并且还作为化疗药物的许多临床试验的终点。但是,对全血中的这些细胞的稳定化存在问题,因此患者血液的运送可能导致损失,或者难以正确地鉴定CTC和/或进行分子诊断分析。使用DES混合物来在体外使全血中的CTC稳定化,这克服了CTC保存的现有技术的许多缺点。仅举例而言,可以用至少6倍体积的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)处理全血中的CTC以固定细胞和保存RNA。随后可以收集CTC,并使用例如CellSieveTM(MD,美国)等许多不同方法中的任一种将其纯化。
仅出于例举的目的,并参照以下实施例和附图,更详细地描述本发明。
附图说明
图1A-1C显示了其中DES混合物置于带盖小瓶中的本发明的设备。
图2显示对根据本发明和现有技术提取的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图3显示在一定温度范围根据本发明对在DES中稳定化的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图4显示根据本发明或现有技术对在组织中保存的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图5A和B显示根据本发明使用DES和现有技术对在小鼠组织样品中稳定化的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图6显示根据本发明和现有技术对在可变量的组织中保存的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图7显示对从掺杂有海拉细胞的经DES稳定化的全血细胞纯化的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图8显示对在提取之前在掺杂有海拉细胞的全血细胞中稳定18小时的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图9显示用胍或氯化胆碱:三氟乙酰胺使全血中的RNA稳定化。
图10显示根据本发明用氯化胆碱:三氟乙酰胺固定的海拉细胞的光学显微镜图像。
图11显示对在不存在任何稳定剂下在组织样品中降解的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图12显示根据本发明或现有技术稳定化的海拉细胞中的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图13显示对来自根据本发明或现有技术稳定化的小鼠肝脏的蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。
图14显示对来自经稳定化的海拉细胞的并且可选地在纯化之前进行了加工步骤的DNA和RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图15显示对在根据本发明或现有技术固定后测定其完整性的RNA和DNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图16显示对来自根据本发明或现有技术处理的黑腹果蝇胚胎的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
图17显示对来自根据本发明或现有技术稳定化的洋葱的幼叶(leafshoot)的RNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果。
实施例
1.在动物组织样品中的RNA稳定化
向标准1.5ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)添加2mg~25mg大鼠肝样品,并在室温预温育20分钟,以将其稳定化和/或固定,然后样品可以在-80℃、-20℃、4℃、20℃、37℃、42℃或55℃在DES混合物中温育1小时至数周,然后用镊子回收组织样品,然后如下所述进行RNA纯化。
固定过程中使用真空***,例如Nalgene手持真空泵(货号:6132-0020,ThermoScientific,英国)可以改善一些稠密、充有空气和/或成问题的组织的固定速率。
然后向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品,根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)将组织匀质化。然后根据制造商说明立即将300μl部分的裂解液纯化,并洗脱到20μl~50μl水中。然后通过OD260/280nm比较RNA的产率和纯度,并且通过使用寡dTcDNA引发和β-肌动蛋白PCR引物(QuantiTectSYBRGreenPCR试剂盒,货号:204141,Qiagen,德国)和LightCycler(RocheAppliedScience,法国)进行RT-qPCR确定RNA完整性,或者通过使用RNA6000Nano总RNA试剂盒(货号:5067-1511,AgilentTechnologies,美国)和Bioanalyser2100仪器(货号:G2939AA,AgilentTechnologies,美国)获得RNA完整数(RIN)来确定RNA完整性。
其他类型的市售RNA纯化试剂盒可以代替RNeasy试剂盒,并且对所用的试剂盒类型没有特别限制。
肝样品可以被其它组织和细胞类型替换,例如肝、脾、脑、肌肉、心脏、食道、睾丸、卵巢、胸腺、肾、皮肤、肠、胰腺、肾上腺、肺、骨髓或细胞(例如COS-7、NIH/3T3、HeLa、293和CHO细胞)或者甚至液体样品,例如血清、血浆或血液。
图2.使用RNeasy试剂盒提取的300ngRNA样品的1%琼脂糖-EtBr凝胶电泳图像。对于泳道1-5的经氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)稳定化的或者泳道6-10的晶RNAlater(货号:76106,Qiagen,德国)稳定化的15mg大鼠肝,贮存5分钟(泳道1+6)、1天(泳道2+7)、3天(泳道3+8)、7天(泳道4+9)或21天(泳道5+10)。可以观察到在37℃贮存后,通过7天后的比较,与RNAlater相比,用氯化胆碱:尿素稳定的样品具有改善的RNA稳定性,氯化胆碱:尿素样品的RNA完整数为RIN=8,而对于RNAlater稳定的样品的RNA完整数RIN=5.10。
2.使用其他氯化胆碱类DES混合物在动物组织样品中的RNA稳定化
向标准1.5ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或氯化胆碱:山梨糖醇(1摩尔:1摩尔)添加2mg~25mg大鼠肝样品,并在室温预温育20分钟,以将其稳定化和/或固定,然后样品可以在-80℃、-20℃、4℃、20℃、37℃、42℃或55℃温育1小时~数周,然后用镊子回收组织样品,然后如以下实施例所述进行RNA纯化。
然后向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品,根据制造商说明书(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)将组织匀质化。然后根据制造商说明立即将300μl部分的裂解液纯化,并洗脱到20-50μl水中。如实施例1和表1所述确定RNA产率和品质,并且对于两种DES混合物的RNA完整性与RNAlater相比都较优。
氯化胆碱的合适来源是货号:110295000,AcrosOrganics,法国;山梨糖醇是S0065,TCI,比利时;三氟乙酰胺是货号:T0598,TCI,比利时。
3.使用其他DES混合物在动物组织样品中的RNA稳定化
向2ml聚丙烯管中的400μl以下DES混合物添加5mg~15mg大鼠组织(冷冻组织原液),20分钟固定步骤后,将样品在37℃温育18小时,然后使用RNeasyMicro试剂盒(货号:74004,Qiagen,德国)进行RNA提取/纯化。无论DES混合物在室温是固体还是液体,计算提取后的RNA产率和和RNA品质,等级为1~10(0表示无稳定化,10表示无降解,与从新鲜的大鼠肝组织样品提取后立即的RNA品质=10相比)。结果示于以下表1(nd=未确定,“饱和”的溶液不是DES)。
表1.使用双组分DES混合物在动物组织中的RNA稳定化
定量RNA品质等级如下:0(高度降解)~10(最高品质)。表1和2中的RNA分析如下进行:溴化乙锭染色,1%琼脂糖0.5×TAE凝胶电泳,然后目视分析在紫外线下拍摄的的照片以分析18S和28SrRNA条带的完整性。RNA品质评分为8以上的RNA样品具有的18S与28SrRNA溴化乙锭染色比为1:2;而RNA品质评分为5的RNA样品具有的18S与28SrRNA染色比为约1:1。
表2.加上添加剂的双组分DES混合物
定量RNA品质等级如下:0(高度降解)~10(最高品质)。表1和2中的RNA分析如下进行:溴化乙锭染色,1%琼脂糖0.5×TAE凝胶电泳,然后目视分析在紫外线下拍摄的的照片以分析18S和28SrRNA条带的完整性。RNA品质评分为8以上的RNA样品具有的18S与28SrRNA溴化乙锭染色比为1:2;而RNA品质评分为5的RNA样品具有的18S与28SrRNA染色比为约1:1。
4.DES与支撑基质的混合组合物
为了改善DES液体混合物从贮存样品(例如组织或活组织检查)的物理分离,将DES与各种支撑基质混合。基质材料不特别限定,但是其应该即使与DES混合时也保持结构强度,因此应该不会溶解或反应。优选的是支撑基质可以直接例如用条形码标记或者通过打印机或墨水笔标记有贮存有效期。
向3.2gPEG(MW8000)、琼脂糖、聚丙烯酸或3MM纤维素纤维(Whatmann,英国)添加10ml氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:1摩尔),并在搅拌下于100℃加热30分钟,以将混合物匀质化,然后将混合物灌入合适的容器来冷却。
此类复合混合物的优点是比液体DES混合物更容易处理,并且减少被携带至提取步骤(例如RNA纯化)的DES。可以将复合物灌入、成型、成形、切割、分层或形成到任何数量的容器中,例如96、24或6孔板,1.5ml微量离心管,5ml、15ml或50ml管。
5.在不同温度下全组织中的RNA稳定化
向标准2ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或RNAlater添加10mg大鼠肝样品,并在室温预温育20分钟,以将其稳定化和/或固定,然后完整样品可以在-20℃、4℃、37℃、50℃或65℃在DES混合物中温育18小时,然后回收完整组织样品,并如下所述进行RNA纯化。
然后向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品,根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)从胍匀质化的组织提取RNA。然后根据制造商说明使用300μl份的胍裂解液立即将RNA纯化,并洗脱到20~50μl水中。如实施例1所述确定RNA产率和品质,对于DES稳定混合物,RNA完整性在大于37℃并且在等于-20℃和4℃的所有温度都优于RNAlater。结果示于图3。泳道1、3、5、7、9为氯化胆碱:尿素(1:2),泳道2、4、6、8、10为RNAlater。
对本领域技术人员显而易见的是氯化胆碱:尿素可以被其他DES混合物(例如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔))替代。
6.于24℃全组织中的RNA的长期稳定化
向在标准2ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或RNAlater添加10mg大鼠肝样品,并在室温预温育20分钟,以将其稳定和/或固定,然后完整样品可以在24℃在氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)中温育0~19天,然后回收完整组织样品,并如以下实施例中所述进行RNA纯化。
向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品,根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)从胍匀质化的组织提取RNA。然后根据制造商说明使用300μl部分的胍裂解液立即将RNA纯化,并洗脱到20μl水中。如实施例1所述确定RNA产率和品质,对于DES稳定混合物,RNA完整性在所有时间点优于RNAlater。结果示于图4。泳道1、3、5为氯化胆碱:尿素(1:2),泳道2、4、6为RNAlater处理的样品。
7.从不同的组织类型纯化
向标准2ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或RNAlater添加10mg份的冷冻小鼠脑(泳道3和4)或肾样品(泳道1、2、5、6),并在室温预温育20分钟,以将其稳定化和/或固定,然后完整样品可以在37℃在氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)中温育1至7天,然后回收完整组织样品,并如下文所述进行RNA纯化(图5A)。泳道1、3、5:用氯化胆碱:尿素(1:2)稳定化;泳道2、4、6:用RNAlater(Qiagen,法国)稳定化,进行24小时(泳道1-4)或7天(泳道5和6)。
作为选择,将10mg份的经预先冷冻的小鼠组织添加至400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺,在37℃温育18小时,然后进行RNA纯化(图5B)。泳道1、3、5、7、9、11、13、15:用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2)稳定化;泳道2、4、6、8、9、10、12、14、16:用RNAlater(Qiagen,德国)稳定化。
向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品,根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)从胍匀质化的组织提取RNA。然后根据制造商说明使用300μl份的胍裂解液立即将RNA纯化,并洗脱到20μl水中。如实施例1所述确定RNA产率和品质,对于DES稳定混合物,RNA完整性等于或优于RNAlater。
8.从不同量的组织纯化
向标准2ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)或RNAlater添加15mg(泳道1和2)或25mg大鼠肝(泳道3和4),并在室温预温育20分钟,以将其稳定和/或固定,然后完整样品可以在37℃在氯化胆碱:尿素中温育0至18小时,然后回收完整组织样品,并如下文所述进行RNA纯化。
向含有350μl裂解缓冲液RLT的新试管添加所述样品,根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)从胍匀质化的组织提取RNA。然后根据制造商说明使用300μl份的胍裂解液立即将RNA纯化,并洗脱到20μl水中。
如实施例1所述确定RNA产率和品质,对于DES稳定混合物,与RNAlater相比,RNA完整性在所有时间点优于RNAlater。结果示于图6。泳道1和5为氯化胆碱:尿素(1:2),泳道2和4为RNAlater处理的样品。
发现含有氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)的DES混合物比氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)显著更有效地稳定新鲜组织中的RNA。但是,如果将组织首先在-20℃或-80℃冷冻,则氯化胆碱:尿素与氯化胆碱:三氟乙酰胺的有效性相等。尚未理解为何氯化胆碱:尿素对于稳定在新鲜组织中的RNA的有效性较差,但是已经发现向氯化胆碱:尿素(2摩尔:1摩尔)添加33mMZnCl2或ZnSO4显著地降低在使用新鲜组织时发生的RNA的降解量。
通常,用诸如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)等DES将处理至少1小时、然后在-80℃冷却的诸如肝、肾和肌肉等组织,显著地比未经处理的组织更软,这允许活组织检查针刺穿。当样品不可完全解冻而仅取出一部分用于进一步分析时这特别有用。还应该注意的是,用氯化胆碱:三氟乙酰胺处理的组织特别是血液的颜色不会显著改变或褪色,而未经处理或经***处理的样品不论经冷冻或未经冷冻都迅速地失去其颜色强度;这种颜色的保持对于正确地分析活组织检查试样和在活组织检查试样中的细胞类型而言是重要的优点。
9.从DES稳定的掺杂有海拉细胞的全血中纯化RNA
向400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加掺杂有50μl的150,000个海拉细胞的50μl人类全血,通过轻微吹吸(pipetting)将其混合,使样品静置,以在室温稳定化20分钟,然后进行RNA提取。将50μl(泳道1)或100μl(泳道2)的该经稳定化DES-血液/细胞混合物与300μl的裂解缓冲液RLT(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)混合,以裂解细胞并提取RNA,如下进行纯化。
将胍血液裂解物在14,000g离心60秒,将上清液转移至含有300μl的70%乙醇的新试管,通过吹吸混合,然后转移至MinElute旋转柱(RNeasyMicro试剂盒,货号:74004,Qiagen,德国)。根据制造商说明,用700μl的缓冲液RW1将MinElute柱洗涤1次,然后用500μl的缓冲液RPE洗涤2次,离心60秒以将柱干燥,然后用20μl水洗脱。使用Nanodrop(ThermoScientific,美国)通过OD260nm吸光度确定RNA产率,并加载在1%琼脂糖、0.5×TAE凝胶中对其进行分析。
表3.源自掺杂了海拉细胞的血液样品的RNA的产率
样品体积 | 总RNA产率 | |
1 | 50μl | 200ng |
2 | 100μl | 2400ng |
结果示于图7。值得注意的是,通过胍-血液裂解物后的二氧化硅MinElute旋转柱目视未被血红素污染。因此氯化胆碱:三氟乙酰胺-胍混合物似乎防止二氧化硅膜被非特异性污染。
10.使用氯化胆碱:三氟乙酰胺使掺杂有海拉细胞的全血中的RNA稳定化
向1000μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加掺杂有50μl的1,000,000个海拉细胞的200μl人类全血,通过轻微吹吸将其混合,试样在室温温育18小时,然后进行RNA提取。将100μl(图8;泳道1)、150μl(泳道2)、200μl(泳道3)或250μl(泳道4)的该经稳定DES-血液/细胞混合物与250μl的裂解缓冲液RLT(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)混合,以裂解细胞并提取RNA,如下进行纯化。
将胍血液裂解物在14,000g离心60秒,将上清液转移至含有300μl的70%乙醇的新试管,通过吹吸混合,然后转移至MinElute旋转柱(RNeasyMinElute,货号:74204,Qiagen,德国)。根据制造商说明,用700μl的缓冲液RW1将MinElute柱洗涤1次,然后用500μl的缓冲液RPE洗涤2次,离心60秒以将柱干燥,然后用20μl水洗脱。使用Nanodrop(Agilent,美国)确定RNA产率,并加载在1%琼脂糖、0.5×TAE凝胶中对其进行分析。OD260/280nm数据证明RNA基本上不含污染蛋白,而RNA产率表明MinElute柱被RNA饱和,并且MinElute柱(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)会提供更好的产率。
表4.血液样品贮存18小时后的RNA产率和品质
样品体积 | OD 260/280nm | 总RNA产率 | |
1 | 100μl | 2.03 | 640ng |
2 | 150μl | 2.03 | 1500ng |
3 | 200μl | 2.01 | 1120ng |
4 | 250μl | 2.09 | 600ng |
在全血中过夜的RNA稳定还如下证明。将50,000个海拉细胞与50μl的新鲜人类全血混合,然后将细胞和血液加至400μl的缓冲液RLT(Qiagen,德国)或400μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔),在24℃温育过夜,然后根据制造商说明纯化RNA(RNeasyMini,Qiagen,德国)。RNA在全血中显著地受氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)保护免遭降解,但是当在缓冲液RLT中贮存过夜时降解。可以通过添加1:8以上、优选1:10的全血至氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔),而以诸如白细胞或循环肿瘤细胞等细胞形式、或者诸如外来体或其他微泡形式等亚细胞形式、或者在病毒颗粒内来进行全血中RNA的贮存。作为选择,向氯化胆碱:三氟乙酰胺添加具有或不具有20%重量:重量分子筛4A的10mMZnCl2或ZnSO4,以进一步改善RNA稳定性。
图9显示使用胍或氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)对全血中的RNA的稳定化。使样品在24℃在缓冲液RLT(Qiagen,德国)(泳道1)或400μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道2)中贮存过夜,总RNA在胍中显著降解,但在氯化胆碱:三氟乙酰胺并未如此。
11.使用真空血液抽取管的全血稳定化
向10ml聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)血液收集管添加7ml的无菌氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔),用HemogardTM(BectonDickinson,美国)或其他合适的塞封闭所述管,部分除去空气以形成真空。作为选择,除了7ml氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)之外血液收集管可以含有ZnSO4,以在稀释的血样样品中提供1mM、5mM、10mM、33mM、100mM或200mM的终浓度。作为血液抽取管(blooddrawtube)装置的实例,参见图1C。使用血液收集组件(PreAnalytix,德国)将约2ml的全血抽入所述管,或者或经由装入常规的鲁尔锁紧接头(luer-lock)注射器和针,并转移2ml内容物至血液收集管。加入血液后,将管颠倒10次以将组分混合,然后在室温温育20分钟以固定和稳定血液白细胞中的RNA,所述血液白细胞例如T淋巴细胞和B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞(例如PBMC)、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞(多形核细胞)、血小板和说明书中提及的任何细菌或病毒,包括HPV、HIV、HCV、HBV、流感病毒和SARS中涉及的冠状病毒。通常红细胞在该混合物中不会保持完好。还可以使用该方法稳定和固定其他细胞类型例如循环肿瘤细胞,这允许更好的捕获、分析和贮存CTC。
在血液收集管中贮存例如在37℃至多24小时、在室温至多3天、在4℃至多1个周或者在-20℃至多3个月后,如下从经氯化胆碱:三氟乙酰胺稳定的血液提取RNA。打开全血收集管,取出1ml经稳定的样品,将其与3ml裂解缓冲液RLT混合,在14,000g离心60秒,除去上清液,并添加至等体积的70%乙醇,然后加载至RNeasyMinElute(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)或RNeasyMidi旋转柱(RNeasyMidi试剂盒,货号:75142,Qiagen,德国),然后用缓冲液RWI和RPE洗涤该旋转柱,并根据试剂盒制造商说明洗脱RNA。
12.测定DES混合物的细胞固定性质
向12孔组织培养板中的各孔添加在1mlDMEM/5%FBS中的20,000个新鲜的胰蛋白酶化的海拉细胞,然后通过在合适的组织培养温育器中在37℃温育至少6小时,使细胞附着至板表面。然后使用真空移液管取出组织培养基,并向各孔添加400μl的DES混合物,同时在20×光学显微镜下实时检查细胞的任何形态学变化。将组织培养板返回至37℃温育器90分钟,然后再进行显微镜检查。使用达尔伯克(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)作为非毒性对照,结果示于以下表中。通过标准台盼蓝染色评估细胞活力。
表5.各种固定剂和添加剂对细胞形态的影响
表6.具有或不具有添加剂的各种DES混合物对细胞形态的影响
对海拉细胞形态的影响,等级为+(最差)~+++++(最好)。
13.用含有DES混合物的三氟乙酰胺进行细胞固定
在24孔组织培养板中使海拉组织培养细胞生长在标准组织培养条件下至汇聚,取出1ml的DMEM/FBS培养基,并用0.2ml~1.0ml的(A)达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(DPBS)或(B)氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)替换,在50×标准光学显微镜下使细胞成像。代表性视场的细胞示于图10中,在DPBS或氯化胆碱:三氟乙酰胺处理的细胞之间未看到细胞形态的实质改变。作为证明经DES处理的细胞被固定的一个测试,除去DPBS或氯化胆碱:三氟乙酰胺并用2ml自来水洗涤细胞两次,发现在室温1小时后,仅经DPBS处理的细胞膨胀然后由于水的渗透压而破裂,而经氯化胆碱:三氟乙酰胺处理的细胞即使在室温浸入水中1个月后通过上述额处理仍然很大程度上保持不变。此外,作为细胞固定的证据,将它们用1mL的0.05%胰蛋白酶在室温处理1小时,发现与经DPBS处理的细胞不同,对细胞没有影响或没有可见的蛋白酶降解,他们保持完整。
氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)可以被氯化胆碱:三氟乙酰胺1:1、1:1.5、1:1:75、1:2.25、1:2.5、1:2.75或1:3(摩尔:摩尔)代替。作为选择,氯化胆碱:三氟乙酰胺可以被甜菜碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或氯化乙酰胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)代替。对于用于细胞固定的DES混合物没有特别限制,但是含有三氟乙酰胺的混合物特别对于细胞固定和RNA稳地化特别有用(参见表1)。
组织培养细胞和组织可以用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)在不同温度下固定,而不会发生细胞裂解或畸变。将400μl份的氯化胆碱:三氟乙酰胺在37℃、100℃或120℃预热,用预热的移液管头添加至24孔板中的海拉细胞。添加热氯化胆碱:三氟乙酰胺后对细胞立即进行显微镜观察显示,明显的是,他们的形态与在室温固定的细胞非常相似。热氯化胆碱:三氟乙酰胺的粘度显著低于在室温的粘度。
具体而言,如下确定和定量深共熔溶剂的细胞固定性质。使约2,000个海拉细胞生长在25mmCellatticeTM上。将Micro-RuledCellCultureSurface(微划线的细胞培养载玻片表面,货号:CLS5-25D-050NexcelomBioscience,美国)置于24孔组织培养板中,并在2ml的DMEM/10%FBS中生长过夜,使用10×显微镜物镜对网格的规定区域中的附着细胞的数量进行计数,然后使用抽吸移液管除去组织培养基,并用深共熔溶剂替换,在室温温育1小时使细胞固定,然后用抽吸移液管除去深共熔溶剂,用2ml蒸馏水替换,在室温温育1小时,对在与之前处理相同的网格规定区域中的细胞数量进行手动计数。计算残留在网格中的附着细胞相对于初始细胞数量的百分比,并且发现在用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)处理后至少75%的细胞附着。注意细胞不应该生长至汇聚,因为据发现大量的松散附着的将死细胞容易脱落,因此引起细胞计数的误差。对本领域技术人员显而易见的是,也可以使用该方法确定其他深共熔溶剂的细胞固定性质。
14.氯化胆碱:尿素中的盐混合物的溶解度
令人注目地发现,氯化锌(ZnCl2)能够溶于氯化胆碱:尿素(1:2)中以提供1:2:2(摩尔:摩尔:摩尔)的氯化胆碱:尿素:ZnCl2的DES混合物;异硫氰酸胍可以溶解于氯化胆碱:尿素中以提供1:2:5(摩尔:摩尔:摩尔)的氯化胆碱:尿素:异硫氰酸胍的DES混合物;以及乙酸铵可以溶解于氯化胆碱:尿素(1:2)中,以提供1:2:3(摩尔:摩尔:摩尔)的氯化胆碱:尿素:乙酸铵的DES混合物。
15.不存在稳定剂时的RNA降解
为了确定在不存在DES混合物或其他稳定剂时RNA的降解速率,50mg份额的大鼠肝在20℃温育(泳道1)0分钟、(泳道2)1分钟、(泳道3)2分钟、(泳道4)5分钟或(泳道5)20分钟。结果示于图10。
发现RNA在室温5分钟后明显降解,并且在20分钟后显著降解。这提供了评估组织中的RNA在其开始降解之前可以保持完整的最大时间量的方法,因此可以针对快速性和有效性对DES固定剂进行比较。例如来自具有相对低RNA降解速率的组织(例如肌肉)的样品的重量可以大于来自具有较高速率的组织(例如胰腺)。
16.动物组织样品中的DNA稳定化
向在标准1.5ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加2mg~25mg大鼠肝样品,并在室温预温育20分钟,以将其稳定和/或固定,然后样品可以在-80℃、-20℃、4℃、20℃、37℃、42℃或55℃温育1小时至数周,然后用镊子回收组织样品,然后如下所述进行RNA继而DNA纯化。
简言之,将样品在400μl裂解缓冲液RLT中机械裂解,根据制造商说明(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国)将RNA洗脱在至少40μl水中,然后将二氧化硅膜用100μl水洗涤,在10,000×g离心60秒,弃去流通液,然后添加100μl的10mMNaOH,在70℃温育15分钟,以破坏残留的RNA,然后在10,000×g离心60秒,收集含有DNA的流通液并使用1%琼脂糖凝胶进行分析。
还可以使用诸如(货号:12183018A,LifeTechnologies,美国)和DNeasyMini试剂盒(DNeasyMini试剂盒,货号:69504,Qiagen,德国)等市售DNA纯化试剂盒,对可用于DNA纯化的试剂盒类型或组织类型没有特别限制。
肝样品可以被其他组织和细胞类型代替,例如肝、脾、脑、肌肉、心脏、食管、睾丸、卵巢、胸腺、肾、皮肤、肠、胰腺、肾上腺、肺、骨髓或细胞(如COS-7、NIH/3T3、HeLa、293、和CHO细胞),或者甚至是液体样品、如血清、血浆或血液。
据发现,与400μlRNAlater相比,从在室温在400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2)中固定和稳定的大鼠肝样品提取的DNA具有显著更完整的DNA,证明DES混合物的稳定比RNAlater(一种已经被推荐来保存DNA以及RNA的产品)更优。也可添加1mM~33mMZnSO4来改善DNA稳定化。
结果示于图12中。在24℃将海拉细胞球团在氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道1和3)、RNAlater(泳道2和3)中稳定9天(泳道1和2)或15天(泳道3和4)。与氯化胆碱:三氟乙酰胺相比,在RNAlater稳定的样品中的DNA降解得显著更多。
17.动物组织样品中的蛋白质稳定化
向标准1.5ml聚丙烯微量离心管中的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)、10mMZnSO4·7H2O和40mg分子筛4A中添加10mg经冷冻-解冻的小鼠肝,在24℃温育4天、7天或18天。在蛋白质提取之前,将对照小鼠肝样品在400μl的PBS中温育0分钟、36小时、6天或13天。
通过向肝样品添加10倍体积的1×样品缓冲液(125mMTris-HClpH6.8,2%SDS,10%甘油,5%β-巯基乙醇,0.001%溴酚蓝)来提取蛋白质,用球团杵研磨30秒,然后立即在70℃加热样品10分钟,将管置于冰上5分钟,然后在10,000×g离心5分钟,接下来通过Bradford法(Bio-Rad,法国)进行蛋白质计量(proteindosing)。将30μg的各蛋白与Laemlli缓冲液混合,加载至标准SDS-7.5%丙烯酰胺凝胶,并在110V电泳3小时。然后将蛋白质转移至蛋白质印迹PVDF/ECL+膜,并在4℃于TBS(0.1%Tween-20,5%奶粉)中与1:500稀释度的一抗(抗-α-肌动蛋白)一起温育过夜,用TBS(0.1%Tween-20,5%奶粉)将膜洗涤三次,并在24℃与1:100稀释度的HRP标记的小鼠抗-IgG二抗一起温育60分钟,洗涤并用SupersignalWestpico化学发光试剂盒(Pierce,法国)显影。
结果示于图13中。在24℃将小鼠肝在PBS(泳道2-4)或氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道5-7)中稳定0分钟(泳道1)、36小时(泳道2)、6天(泳道3)、13天(泳道4)、4天(泳道5)、7天(泳道6)或18天(泳道7)。与用氯化胆碱:三氟乙酰胺贮存相比,PBS贮存样品中的IgG和肌动蛋白蛋白质降解显著更多。
18.用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)进行细胞固定以用于免疫组织化学(IHC)
使海拉细胞在24孔组织培养板中的13mm玻璃盖玻片上生长至20%细胞密度,用真空移液管回收DMEM生长培养基,用卫生纸将边缘拭干;将盖玻片转移至12孔板,直接将600μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加到盖玻片上,在室温在摇晃的平台上静置60分钟,以便能够固定。然后从固定剂取出盖玻片和细胞,用真空移液管除去过量的固定剂,用卫生纸擦拭,并用2mlPBS洗涤4×5分钟。在摇晃的平台上用2ml的PBS/1%BSA将细胞封闭,然后添加合适稀释度(例如1:100)的一抗,并在4℃静置过夜。接着将细胞在3×2ml的PBS/1%BSA中各自洗涤5分钟,添加合适稀释度的二抗(例如1:1000的Alexafluor488山羊抗小鼠IgG1(LifeTechnologies,英国))的一抗,并在黑暗中于室温温育30分钟。将细胞在3×2ml的PBS/1%BSA中洗涤然后在3×2ml的PBS中洗涤,然后在水中短暂冲洗,接着用Vectashield/DAPI(VectorLabs,英国)固定,并用合适的显微镜观察。
作为选择,可以在细胞固定之前进行将10mMZnSO4、ZnCl2、5%(体积:体积)N-乙基吡咯烷酮、5-10%的水溶液(例如水、PBS或DMEM)、2.5%(体积:体积)1-苄基咪唑或者1%(体积:体积)四甲基脲添加至氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)中,以改善免疫组织化学结果。
19.用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)进行哺乳动物组织固定以用于染色或免疫组织化学(IHC)
将新解剖的小鼠组织碎块(例如肝、肾、肺、脑、平滑肌、骨骼肌或心肌、脾、胸腺、唾液腺、子宫、睾丸、皮肤、眼睛、舌、食道、胃、肠、胰腺、肾上腺、胆囊)添加至10倍体积的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔),在4℃或室温温育至少1小时,以使发生渗透和组织固定。大于1小时的较长时间的温育也是相容的,例如4小时、8小时、15小时、24小时或72小时。还可以将组织样品冷冻并贮存在氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)中待用。组织固定所需时间会依赖于许多因素,包括组织类型、尺寸、密度、脂肪含量、形状、表面积和固定剂类型。对于特定组织确定用于固定所需的最小时间可以最简单地通过下述进行:将组织温育不同长度的时间,然后观察在切片机切片过程中组织如何表现;通过在通过切片机刀片的过程中的组织撕裂会检测出不充分的固定时间。合适的固定时间产生不仅用于切片机切片而且用于RNA稳定的可靠样品。
在氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)中固定后将组织在10倍体积的PBS中短暂冲洗,然后在70%乙醇中脱水45分钟、80%乙醇中脱水45分钟、在100%乙醇中脱水30分钟两次、在甲苯中脱水30分钟两次,接下来分别在65℃和100℃包埋在石蜡(熔点56℃~58℃)各1小时。使含有经固定组织的石蜡块冷却至室温,接着根据与用于甲醛固定组织相同的标准策略进行显微切片。详细的方法在Al-Mulla和Gohlmann(2011)Formalin-FixedParaffin-EmbeddedTissues:MethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology)中提出。必要时甲苯可以被二甲苯或组织透明剂(Histosol)替代。
向氯化胆碱:三氟乙酰胺添加1mM~33mM、优选10mM~33mM的锌盐(例如氯化锌、硫酸锌或柠檬酸锌)改善组织被固定剂渗透和固定的速率,而另外存在的分子筛4A改善样品中的RNA稳定。
用苏木精和曙红进行的组织切片染色遵循标准的公知方法。
20.石蜡包埋后用氯化胆碱:三氟乙酰胺进行的海拉细胞RNA和DNA稳定化
将海拉细胞球团(1000000个细胞)添加至含有10mMZnCl2的400mg氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔),并在室温固定60分钟。将经固定细胞立即加工或者随后执行标准石蜡包埋策略;(i)浸入1ml的100%乙醇中30分钟,(ii)1ml甲苯浸渍15分钟,接着在55℃用1ml石蜡浸润(iii)15分钟或(iv)60分钟。随后纯化(RNeasy,Qiagen,德国)RNA和DNA,并确定RIN(AgilentBioanalyser2100)。海拉细胞RNA的RIN从不进行固定的9.6(泳道1,阳性对照)降低至经固定、脱水和石蜡包埋后的8.6(泳道6),证明虽然在加工过程中确实发生一些RNA降解,但是总量是非常可接受的。还发现氯化胆碱:三氟乙酰胺固定与用甲醛处理的样品相比,产生低得多的RNA降解(数据未示出)。DNA样品的完整性目视不变化,证明在规定过程中DNA也得到稳定。结果示于图14中。
21.石蜡包埋后用氯化胆碱:三氟乙酰胺进行的小鼠肝和肾组织的RNA和DNA稳定化
10mg小鼠肝或肾碎块添加至含有10mMZnSO4和分子筛4A(3%(重量:重量)的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔),或者添加至400μlPBS,并在4℃或24℃温育64小时。然后如下处理组织样品:70%乙醇60分钟,80%乙醇60分钟,95%乙醇60分钟,100%乙醇30分钟两次,100%乙醇60分钟,甲苯中30分钟两次,100%甲苯中60分钟,55℃的石蜡中2小时,55℃的石蜡中5小时,然后-80℃将包埋在石蜡中的样品冷冻约2个周。然后通过如下纯化RNA和DNA:首先使用手术刀从石蜡块取出包埋组织,然后使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen,德国)在400μl缓冲液RLT中直接裂解,使用RNA6000Nano总RNA试剂盒(AgilentBioanalyser2100,美国)确定RIN。
结果示于图15中。发现对于肝(泳道1-4)和肾(泳道5-8),在氯化胆碱:三氟乙酰胺、ZnSO4和分子筛处理(泳道1、2、5、6)后,与PBS(泳道3、4、7、8)相比,RNA完整性显著更好。作为实例,将RIN值示于图14,并且发现在24℃将氯化胆碱:三氟乙酰胺、ZnSO4和分子筛(泳道1)与PBS(泳道3)相比,RIN值从7.5降低至2.4,还发现在氯化胆碱:三氟乙酰胺、ZnSO4和分子筛处理后DNA品质也显著更好。
22.用氯化胆碱:三氟乙酰胺、硫酸锌和分子筛进行的海拉细胞RNA稳定化
对在添加或不添加水的贮存的生物样品中向氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加各种锌盐和分子筛的RNA稳定效果进行比较。使用1,000,000个海拉细胞的经新鲜离心的球团作为RNA来源,并且向各球团添加400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔),然后如表中所示在存在或不存在33mM硫酸锌和33%(重量:重量)分子筛4A型时添加终浓度为10或15%(体积:体积)的水。将样品在37℃贮存18小时,然后使用二氧化硅旋转柱(Invitek,德国)进行RNA纯化和根据制造商说明使用AgilentBioanalyser2100确定RNA完整数(RIN)。虽然向海拉细胞球团/氯化胆碱:三氟乙酰胺添加水显著降低RNA完整性,但是如RIN数增加所表明,当存在水时添加硫酸锌或者更优选硫酸锌和分子筛4A型可以显著地减少RNA的降解量。当存在显著量的水(例如在稳定液中超过10%终浓度)时,例如使用较大组织样品、血液、血清、血浆或植物材料的情形,这是改善样品分析物品质的特别有用的手段。当需要长期贮存样品时,对于含有低于10%水的样品也可以获得一些改善。
已经发现1mM~33mM、优选10mM(终浓度)的硫酸锌比氯化锌或EDTA锌对于减少RNA降解略微更有效,但是比葡萄糖酸锌、乙酸锌或对甲苯磺酸锌显著更有效(表2)。
表7.从海拉细胞球团提取的RNA的RIN分数
DES混合物(摩尔:摩尔) | 添加剂 | RIN分数 | |
1 | 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) | - | 8.4 |
2 | 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) | 10%水 | 6.2 |
3 | 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) | 10%水+33mM ZnSO4 | 7.3 |
4 | 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) | 10%水+33mM ZnSO4+33%分子筛 | 8.2 |
5 | 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) | 15%水 | 2.9 |
6 | 氯化胆碱:三氟乙酰胺(1:2) | 15%水+33mM ZnSO4 | 5.3 |
23.使用氯化胆碱:三氟乙酰胺与有机添加剂进行的海拉细胞RNA稳定化
对在添加或不添加水的贮存生物样品中向氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加N-乙基吡咯烷酮或四甲基脲的RNA稳定效果进行比较。使用1,000,000个海拉细胞的经新鲜离心的球团作为RNA来源,并且如表中所示在存在或不存在2.5%、5%、10%或20%(体积:体积)N-乙基吡咯烷酮、5%或20%(体积:体积)四甲基脲时,向各球团添加400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)。将样品在24℃贮存20天,然后使用二氧化硅旋转柱(InviTrapSpinUniversalRNAMini试剂盒,货号:1060100200StratecMolecular,德国)进行RNA纯化和根据制造商说明使用AgilentBioanalyser2100确定RNA完整数(RIN)。发现与单独氯化胆碱:三氟乙酰胺相比,N-乙基吡咯烷酮和四甲基脲都改善长期贮存后海拉细胞球团的RNA品质。
表8使用N-乙基吡咯烷酮和四甲基脲的RNA产率和品质
定量RNA品质等级如下:0(高度降解)~10(最高品质)。表1和2中的RNA分析如下进行:溴化乙锭染色,1%琼脂糖0.5×TAE凝胶电泳,然后目视分析在紫外线下拍摄的的照片以分析18S和28SrRNA条带的完整性。RNA品质评分为8以上的RNA样品具有的18S与28SrRNA溴化乙锭染色比为1:2;而RNA品质评分为5的RNA样品具有的18S与28SrRNA染色比为约1:1。
24.使用各种季铵盐和氢键供体
室温(24℃)DES液体不能由以1摩尔:2摩尔的比例混合氯化胆碱与下述任一种而制备:脯氨酸、草酰胺、新戊酰胺、1-乙基-2-吡咯、4-甲酰基吗啉、乙酰基丙酮(Acetonylacetone)、碳酸亚乙酯、四甲基脲、N-乙基咪唑、1-苄基咪唑和/或1,3-二甲基-2-咪唑烷酮。以下铵盐也不能形成室温DES液体:磷酸铵和乙酸铵。硫酸铵和氯化铵能够部分地在100℃而不是在24℃与异硫氰酸胍、山梨糖醇和/或木糖醇以1摩尔:2摩尔的比例形成液体。
表9:使用各种季铵盐的双组分混合物
25.黑腹果蝇胚胎中的RNA的稳定化
在RNA纯化之前(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,Qiagen,德国),将10mg黑腹果蝇胚胎(0-24小时)与400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道1-3)或RNAlater(泳道4-6)混合,并在37℃温育12小时(泳道1,4)、2天(泳道2,5)或45天(泳道3,6)。RNA品质示于图16中,经氯化胆碱:三氟乙酰胺稳定化的RNA比RNAlater显著更好。
26.洋葱幼叶中的RNA的稳定化
在RNA纯化之前(RNeasyMini试剂盒,货号:74106,德国),将10mg洋葱幼叶(leafshoot)与400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)(泳道1-3)或RNAlater(泳道4-6)混合,并在22℃温育18小时(泳道1,4)、3天(泳道2,5)或9天(泳道3,6)。RNA品质示于图17中,经氯化胆碱:三氟乙酰胺稳定化的RNA比RNAlater显著更好。
27.DES稳定后的原位杂交应用
使用氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)和10mMZnSO4在4℃和固定时间为1小时至24小时,如实施例21所述制备组织样品并将其石蜡包埋。然后如下处理组织样品:70%乙醇60分钟,80%乙醇60分钟,95%乙醇60分钟,100%乙醇30分钟两次,100%乙醇60分钟,甲苯中30分钟两次,100%甲苯中60分钟,55℃的石蜡中2小时,55℃的石蜡中5小时。切片机制备石蜡组织切片(3μm~12μm厚)后,在室温使用二甲苯除去石蜡10分钟,然后通过在100%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、25%乙醇和水中各自温育5分钟将组织切片水化。接着在室温将组织切片进行蛋白酶K(10μg/ml)处理5分钟,然后在PBS中冲洗和在含有500μl超纯50%甲酰胺、250μl的20×SSC、50μl10μg/μl酵母t-RNA和20μl的50×邓哈特液(Denhardt’ssolution)的1ml缓冲液中预杂交,然后用合适的显色或荧光标记的探针杂交。原位杂交的策略是公知的,并且由J.M.Bridger和KMorris(2010)在FluorescenceinsituHybridization(FISH):ProtocolsandApplications(MethodsinMolecularBiology)和Summersgill等,(2007)NatureProtoc.3:220-234中描述。
28.用于流式细胞术的细胞的制备
将约500,000个培养细胞例如海拉、MCF-7、NCI60、PC3、Vero、GH3、MC3T3、ZF4或IMR-90(如果生长在固体表面上则首先稍微胰蛋白酶化以使其脱离)与10mlEMEM/10%FBS混合,并以900×g(24℃)在15ml试管中离心10分钟。然后将细胞球团再悬浮于100μlDPBS缓冲液中,并立即与1ml氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)混合,并用10ml移液管温和地吹吸,以彻底混合。然后将细胞静置以在4℃或24℃固定1小时至24小时,接着添加14mlDPBS,通过温和的反转将试管内含物混合,并在900×g离心10分钟,并将细胞球团温和地再悬浮于100μlDPBS中,通过添加在染色缓冲液(100mMTris,pH7.4,150mMNaCl,1mMCaCl2,0.5mMMgCl2,0.1%NonidetP-40)中的1mlDAPI(3μM)将细胞核染色15分钟(24℃)。然后将经染色和固定的细胞用于流式细胞术。发现经氯化胆碱:三氟乙酰胺固定的细胞是单分散的,并且可以根据其荧光分类成细胞周期的各种阶段。
29.生物样品的两步处理
向含有10mMZnSO4和分子筛4A(3%(重量:重量)的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加10mg小鼠组织碎片,在24℃温育1小时,然后除去组织,用纸巾简单擦拭以除去过量的稳定剂,然后浸入例如氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)、氯化胆碱:尿素(1摩尔:2摩尔)、氯化胆碱:山梨糖醇(1摩尔:2摩尔)、氯化甜菜碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或4%多聚甲醛中,随后温育并贮存至少1小时,但优选过夜。作为选择,本申请提出的许多DES混合物中的任一种都可充当第一稳定或固定溶液,然后是第二稳定或固定溶液。作为另一个实例,可以首先用例如4%多聚甲醛在室温进行组织固定1小时,然后将组织转移至含有10mMZnSO4和分子筛4A(3%(重量:重量)的400μl氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)。该两步法提供了如下的手段:通过该手段例如可将用于细胞形态的最佳稳定剂随后与用于RNA、DNA和蛋白质的最佳稳定剂组合。还提供借助其通过改变最终的稳定混合物而可以减少源自生物样品的水含量的手段。对本领域技术人员显而易见的是,存在许多第一和第二混合物的组合,并且必须至少部分地通过经验手段(例如H&E染色组织切片的品质和RNA品质)确定最合适的选择。还应该注意,使用的稳定和固定混合物可以是液体或固体。
30.DES混合物与胍和苯酚纯化试剂的相容性
有利地是,氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)完全可溶并且与异硫氰酸胍或盐酸胍类病毒、细胞和组织裂解缓冲液(例如见于下述RNA纯化试剂盒:RNeasyMini,(Qiagen,德国)、PureLinkTM(LifeTechnologies,美国)、MagNAPureLCRNA分离试剂盒III、高纯RNA组织试剂盒和RNAMicroKitAmplicorHCV(RocheAppliedScience,美国)、Multi-8VirusRAV(MachereyNagel,德国)、TEMPUSTM血液RNA管(AppliedBiosystems,美国)、SVRNA试剂盒和PureYieldTM试剂盒(Promega,美国)、ToTALLYRNATM试剂盒(Ambion,美国)、GenEluteTM哺乳动物总RNA纯化试剂盒(Sigma-Aldrich,美国)、PAXgeneTM血液RNA试剂盒(PreAnalytix,德国))以及和苯酚类纯化试剂(例如TRIzol(LifeTechnologies,美国))相容,这允许经氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)稳定化的样品直接与胍或苯酚纯化试剂混合而无需从氯化胆碱:三氟乙酰胺分离样品。在例如要分离已经被固定剂渗透的组织样品不实际时,或者当个体细胞(例如组织培养细胞、血液或CTC)与体积大得多的固定剂混合并且可能难以或不可能通过离心进行分离时,这可能特别有利。作为参照,RNAlater(Qiagen,德国)中的哺乳动物细胞不能通过离心成球团,或者不能通过将细胞和RNAlater与胍裂解缓冲液混合来纯化RNA,因为RNA产率显著下降。
作为实例,已经发现包含在氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)中的低至6%(样品5,表10)以下的缓冲液RLT的含RNA样品,在与1体积的70%乙醇混合时能够用于有效地将RNA结合至旋转柱膜(RNeasymini,Qiagen,德国),具有优良的产率和纯度,如表10中所示。通过裂解100mg在1ml缓冲液RLT中的肝而制备小鼠肝裂解物,然后将20μl份的裂解物添加至缓冲液RLT,接着添加至氯化胆碱:三氟乙酰胺,然后如表10所示与70%乙醇混合,并结合至Rneasy最小旋转柱。然后用50μl洗脱体积的水根据制造商说明(RNeasymini,Qiagen,德国)将RNA纯化。使用NanodropND-1000确定RNA产率和纯度。令人惊奇地发现,不仅氯化胆碱:三氟乙酰胺允许胍发挥离液活性来起到降解样品的作用,而且其对RNA结合至二氧化硅旋转柱膜没有任何影响,因此产率不受影响或略微增加。
此外,在添加至胍裂解物(20μl)时,氯化胆碱:三氟乙酰胺可以代替70%乙醇的关键的RNA结合功能,如表11所示,标准的制造商策略(RNeasyMini,Qiagen,德国)需要添加1体积的70%乙醇至裂解物,以使RNA结合至二氧化硅膜。如果不添加70%乙醇至裂解物,则RNA不能结合至二氧化硅膜,但是如果样品含有氯化胆碱:三氟乙酰胺,则RNA可以在即使不存在乙醇时结合,这提供了减少步骤数的手段并且改善了例如Rneasy试剂盒的RNA纯化步骤,而无需使用炎性液体。应该注意的是,溶解于缓冲液RLT(1重量:1重量)中的氯化胆碱或者氯化胆碱:尿素都不具有该性质,而溶解于缓冲液RLT(1重量:1重量)中的仅三氟乙酰胺产生的RNA产率与溶解于缓冲液RLT(1重量:1重量)中的氯化胆碱:三氟乙酰胺相比仅为15%。还发现缓冲液RLT:(氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)的1:1混合物具有非常良好的海拉细胞裂解活性,并且可用作在不存在70%乙醇时的独立的裂解和二氧化硅膜集合缓冲液,使用该新型混合物的RNA产率比仅缓冲液RLT显著更好。
令人吃惊的是,据发现在200μl的缓冲液RLT:(氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)的1:1混合物中制备的海拉细胞裂解物,当在65℃加热10分钟然后添加1体积的70%乙醇并根据制造商说明结合至二氧化硅旋转柱(RNeasyMini,Qiagen,德国)时,导致对小RNA(miRNA、tRNA和5SrRNA)的专门纯化。如果省略加热步骤,纯化出包括18和28SrRNA物质的总RNA,因此加热提供了从细胞裂解物选择性纯化小RNA的新方法。在裂解缓冲液中用尿素替代三氟乙酰胺然后加热,产生极其多的RNA降解,在不存在氯化胆碱:三氟乙酰胺时加热裂解物也是如此。
表10.来自胍/氯化胆碱:三氟乙酰胺混合物的RNA产率
表11.在不存在用于结合的乙醇时来自胍/氯化胆碱:三氟乙酰胺混合物的RNA产率
31.细菌中总RNA的稳定化
将300μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)添加至10mg的大肠杆菌DH5α,并在22℃温育18小时,然后除去DES液体并向球团加入400μl缓冲液RLT,或者向球团和DES液体直接添加400μl缓冲液RLT,将试管旋转20秒,然后短暂地超声以破坏细胞,并使用RNeasyMini试剂盒根据制造商说明(Qiagen,德国)继续RNA纯化。发现16和23SrRNA的完整性与从新鲜细菌球团提取的RNA相比不变。作为选择,可以将ZnSO4添加至氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)以提供1mM-33mM、优选33mM的终浓度,也可以可选地添加10%(重量:重量)的分子筛以改善稳定化。
32.多组分DES混合物
已经发现稳定RNA的DES混合物可以简单地通过将多于两种组分混合在一起而制备,例如以甜菜碱:氯化胆碱:三氟乙酰胺(0.5摩尔:0.5摩尔:2摩尔)代替甜菜碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)。作为选择,新型DES混合物可以从如下制备,例如氯化胆碱:尿素:三氟乙酰胺(1摩尔:1摩尔:1摩尔),或甜菜碱:尿素:三氟乙酰胺(1摩尔:1摩尔:1摩尔),或者甜菜碱:氯化胆碱:尿素:三氟乙酰胺(0.5摩尔:0.5摩尔:1摩尔:1摩尔)。基于单个DES混合物中的所有组分一起的相互作用和性质,这种三种以上组分的DES混合物可以具有令人感兴趣的新性质,例如降低的粘度、改善的贮存期、改善的核酸稳定性或细胞固定性质。
作为实例,向海拉细胞球团(500,000个细胞)添加各自含有10mMZnSO4的400mg的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)、甜菜碱:氯化胆碱:三氟乙酰胺(0.5摩尔:0.5摩尔:2摩尔)或甜菜碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔),在37℃温育过夜,然后使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen,德国)进行RNA和DNA纯化,并确定RIN(AgilentBioanalyser2100,美国)。
对本领域技术人员显而易见的是,许多此类DES混合物是可行的,具有可变的组分和摩尔浓度,并且用于应用的最合适的混合物需要经经验确定。
表12.三种不同的DES混合物对在37℃温育过夜的海拉细胞的RNA、DNA产率和RNA完整数(RIN)的比较
33.用于细胞固定的DES水性混合物
已经发现氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)的水溶液能够固定组织培养细胞和组织。向氯化胆碱:三氟乙酰胺的溶液添加DMEM组织培养基(LifeTechnologies,法国)以产生终浓度为0%、6%、12%、21%或50%的DMEM,然后将400μl份的混合物添加至在24孔板中的海拉组织培养细胞,并用显微镜观察。已经发现,虽然所有混合物都能固定细胞而对细胞没有低毒性或高毒性作用,但是含有氯化胆碱:三氟乙酰胺的6%DMEM产生最佳品质的细胞形态,甚至优于纯氯化胆碱:三氟乙酰胺。应该注意的是,具有大于15%的水的氯化胆碱:三氟乙酰胺稀释液能够引起细胞膜形成微液滴然后从细胞丧失,其细胞质保持完整。DES的水性稀释液提供减少粘性和成本以及潜在改善细胞固定性质的简单手段,但是水的存在对RNA稳定性具有不利影响。对本领域技术人员显而易见的是,许多不同的水性溶液,例如水、PBS、DPBS、糖溶液或DMEM能够与不同的DES混合,并且对细胞固定和生物分子稳定性的影响可能必须通过经验测试。
34.DES混合物的抗细菌活性
在室温用90μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)水性稀释液处理1×109个大肠杆菌DH5a细胞的球团25分钟,以提供90%、9%或0.9%的终浓度,然后放置到将琼脂板上,在37℃温育过夜,以使集落生长。发现90%氯化胆碱:三氟乙酰胺而不是9%或0.9%的稀释液停止所有细菌生长和集落形成。因此氯化胆碱:三氟乙酰胺似乎具有强力的抗细菌活性,并且对本领域技术人员显而易见的是,较长的处理期或不同的DES混合物可以产生甚至更强的抗细菌效应。有利地是,可预期细菌生长会在贮存于氯化胆碱:三氟乙酰胺中的组织样品中受抑制,其腐败得到阻止。
35.DES液体的原位制备
虽然通常方便的是事先在其用于固定和稳定之前制备DES混合物,备选方案是与样品一起同时添加作为固体的DES的两种以上组分。例如,在一个试管中,向2g三氟乙酰胺固体添加1.28g氯化胆碱固体,然后添加50μl-100μl的全血或25mg的组织样品,使固体自由地混合,并在生物样品的存在下形成(1摩尔:2摩尔)的共熔混合物。作为选择,可以将两种固体作为两个预加载层添加至合适的容器中,例如血液收集管,但是通过当与样品接触时破裂或溶解的膜分隔开,由此使组分混合并仅在样品存在时形成DES液体。另一可能是在合适的密闭顶部容器(topvessel)中具有两个开放的室,每个室预加载有合适量的例如氯化胆碱以及三氟乙酰胺。摇晃或反转时两种组分可以自由混合并形成DES液体,必要时在样品存在时形成。
36.使用贴壁组织培养细胞进行的RNA稳定化
在24孔组织培养板中使人胚胎成纤维细胞(HEF)生长至80%汇聚(约200,000个细胞),除去生长培养基,并用400μl的氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔)或RNAlater替换,在37℃温育0小时、32小时或9天,然后进行RNA纯化和RIN分析(AgilentBioanalyser)。表13显示,使用任一氯化胆碱:三氟乙酰胺(1摩尔:2摩尔),贴壁组织培养细胞RNA都得到极其良好的保存。
表13.对于提取自在37℃贮存的人胚胎成纤维细胞(HEF)贴壁细胞的RNA的RIN分数
Claims (159)
1.深共熔溶剂抑制生物分子的降解的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其中,所述生物分子选自RNA、DNA和蛋白质。
3.如权利要求2所述的应用,其中,所述生物分子是RNA。
4.如任一项前述权利要求所述的应用,其中,所述生物分子存在于样品或组织中。
5.如权利要求4所述的应用,其中,所述样品或组织包含实体组织。
6.如权利要求4所述的应用,其中,所述样品或组织包含血浆、血清或全血。
7.如权利要求6所述的应用,其中,所述全血包括循环肿瘤细胞。
8.深共熔溶剂作为病毒、细胞或组织固定剂来产生经固定的病毒、细胞或组织的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其中,所述组织是全血。
10.如权利要求8所述的应用,其中,所述组织是实体组织。
11.如权利要求9所述的应用,其中,所述全血包括循环肿瘤细胞。
12.如权利要求8~11中任一项所述的应用,其中,所述应用还包括处理所述经固定的细胞或组织,所述处理包括选自包埋、切片、染色、显微术、原位杂交、流式细胞术、免疫组织化学法和免疫细胞化学法中的一种或多种方法。
13.如任一项前述权利要求所述的应用,其中,所述深共熔溶剂是III型或IV型深共熔溶剂,其中经使用AgilentBioanalyser2100测定,从与400mg所述深共熔溶剂在24℃温育20天的10mg大鼠肝脏样品提取的RNA所具有的RNA完整数为至少4.0。
14.如任一项前述权利要求所述的应用,其中,海拉细胞生长于基体上并与所述深共熔溶剂在24℃温育1小时,在用水替换所述深共熔溶剂并在24℃温育1小时之后,所述海拉细胞的中的至少75%仍然附着在所述基体上。
15.如任一项前述权利要求所述的应用,其中,所述深共熔溶剂是III型深共熔溶剂,并且其中所述深共熔溶剂包含含有三氟甲基的化合物。
16.如任一项前述权利要求所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分是式I化合物:
其中:
R6是H或OH;
R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和
Z选自-CH2-、O和S;
R8是R11或OH;且
其中所述第二组分包含式II化合物或其盐:
其中:
A选自O、S和NH;
R1选自H、具有1~6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)nCH3和-C(R3)(R4)(R5);
其中n是0或1~5的整数;
R2选自H和具有1~3个碳原子的直链烷基;
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环,其中所述取代基是R10;
R4和R5各自独立地是H或F;且
其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基以及具有1~3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。
17.如权利要求16所述的应用,其中:
A选自O、S和NH;
R1选自H、-CH=CH2、R9、-NH2、-NHCH3和-C(R3)(R4)(R5);
R2选自H和-CH3;
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环,其中所述取代基是R10;
R4和R5各自独立地是H或F;并且
其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基、具有1~3个碳原子的一、二或三氟烷基。
18.如权利要求16或权利要求17所述的应用,其中,A是O或S。
19.如权利要求16~18中任一项所述的应用,其中,R2是H。
20.如权利要求16~19中任一项所述的应用,其中,R1选自H、R9、-CH=CH2和C(R3)(R4)(R5)。
21.如权利要求20所述的应用,其中,R1是R9。
22.如权利要求21所述的应用,其中,R9具有1个碳原子。
23.如权利要求22所述的应用,其中,所述第二组分是乙酰胺。
24.如权利要求22所述的应用,其中,所述第二组分是2-氯乙酰胺。
25.如权利要求22所述的应用,其中,R9是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
26.如权利要求25所述的应用,其中,所述第二组分是三氟乙酰胺。
27.如权利要求25所述的应用,其中,所述第二组分是三氟硫代乙酰胺。
28.如权利要求25所述的应用,其中,所述第二组分是N-甲基三氟乙酰胺。
29.如权利要求21所述的应用,其中,R9具有2个碳原子。
30.如权利要求29所述的应用,其中,R9是一氟乙基、二氟乙基或三氟乙基。
31.如权利要求30所述的应用,其中,所述第二组分是2,2-二氟丙酰胺。
32.如权利要求30所述的应用,其中,所述第二组分是3,3,3-三氟丙酰胺。
33.如权利要求20所述的应用,其中,所述第二组分是甲酰胺。
34.如权利要求20所述的应用,其中,所述第二组分是丙烯酰胺。
35.如权利要求20所述的应用,其中,R1是C(R3)(R4)(R5)。
36.如权利要求35所述的应用,其中,R4和R5是F。
37.如权利要求35或权利要求36所述的应用,其中,R3是可选地具有取代基的6元芳香环。
38.如权利要求37所述的应用,其中,R3是可选地具有取代基的苯基。
39.如权利要求38所述的应用,其中,所述第二组分是2,2-二氟-2-苯基乙酰胺。
40.如权利要求38所述的应用,其中,R3包含取代基。
41.如权利要求40所述的应用,其中,所述取代基位于所述苯基的2位。
42.如权利要求40或权利要求41所述的应用,其中,所述取代基是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。
43.如权利要求42所述的应用,其中,所述第二组分是2-(三氟甲基)苯基乙酰胺。
44.如权利要求16~19中任一项所述的应用,其中,R1选自-NH2和–NHCH3。
45.如权利要求44所述的应用,其中,所述第二组分是尿素。
46.如权利要求44所述的应用,其中,所述第二组分是硫脲。
47.如权利要求44所述的应用,其中,所述第二组分是1,3-二甲基脲。
48.如权利要求16或权利要求17所述的应用,其中,A是NH。
49.如权利要求48所述的应用,其中,所述第二组分是胍。
50.如权利要求49所述的应用,其中,所述胍以氢异硫氰酸盐的形式存在。
51.如权利要求16~50中任一项所述的应用,其中,R7是H。
52.如权利要求51所述的应用,其中,所述第一组分包含胆碱。
53.如权利要求16~50中任一项所述的应用,其中,所述第一组分包含溴化胆碱。
54.如权利要求16~50中任一项所述的应用,其中,所述第一组分是N,N,N-三甲基甘氨酸。
55.如权利要求16~50中任一项所述的应用,其中,R7是
56.如权利要求55所述的应用,其中,Z是O或S。
57.如权利要求55或权利要求56所述的应用,其中,R8是R11。
58.如权利要求57所述的应用,其中,R11具有1个碳原子。
59.如权利要求58所述的应用,其中,所述第一组分包含乙酰胆碱。
60.如权利要求58所述的应用,其中,所述第一组分包含乙酰基硫代胆碱。
61.如权利要求57所述的应用,其中,R11具有3个碳原子。
62.如权利要求61所述的应用,其中,所述第一组分包含丁酰胆碱。
63.如权利要求55所述的应用,其中,Z是CH2。
64.如权利要求63所述的应用,其中,R8是OH。
65.如权利要求64所述的应用,其中,所述第一组分是肉毒碱。
66.如权利要求16~65中任一项所述的应用,其中,所述第一组分包含抗衡离子,所述抗衡离子是卤素阴离子。
67.如权利要求66所述的应用,其中,所述卤素阴离子选自氯离子、溴离子和碘离子。
68.如权利要求67所述的应用,其中,所述卤素阴离子是氯离子。
69.如权利要求68所述的应用,其中,所述第一组分是氯化胆碱。
70.如权利要求69所述的应用,其中,所述第二组分选自三氟硫代乙酰胺、3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-二氟-2-苯基乙酰胺、硫脲和尿素。
71.如权利要求70所述的应用,其中,所述第二组分是三氟硫代乙酰胺。
72.如权利要求54所述的应用,其中,所述第二组分选自三氟乙酰胺和尿素。
73.如权利要求16~72中任一项所述的应用,其中,所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:3~2:1。
74.如权利要求73所述的应用,其中,所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:1.5~1:2.5。
75.如权利要求74所述的应用,其中,所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:2。
76.如权利要求1~15中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分是胆碱的卤化盐;和
其中所述第二组分是可选地具有取代基的咪唑,其中各个取代基是具有1~3个碳原子的烷基。
77.如权利要求76所述的应用,其中,所述胆碱的卤化盐是氯化胆碱。
78.如权利要求76或权利要求77所述的应用,其中,所述具有取代基的咪唑是甲基咪唑。
79.如权利要求78所述的应用,其中,所述甲基咪唑是N-甲基咪唑。
80.如权利要求78所述的应用,其中,所述甲基咪唑是4-甲基咪唑。
81.如权利要求76或权利要求77所述的应用,其中,所述咪唑不具有取代基。
82.如权利要求76~81中任一项所述的应用,其中,所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为2.8:1~2:1。
83.如权利要求1~14中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分包含式III化合物:
其中:
R6是H或OH;
R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和
Z选自-CH2-、O和S;
其中R8选自OH、具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基和具有1~3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基、或三氟烷基;并且
其中所述第二组分是具有至少3个碳原子的糖或糖醇。
84.如权利要求83所述的应用,其中,所述糖醇选自甘油、木糖醇和山梨糖醇。
85.如权利要求84所述的应用,其中,所述糖醇是山梨糖醇。
86.如权利要求83所述的应用,其中,所述糖是海藻糖。
87.如权利要求83~86中任一项所述的应用,其中,所述第一组分包含胆碱。
88.如权利要求83所述的应用,其中,所述第一组分是氯化胆碱。
89.如权利要求83~88中任一项所述的应用,其中,所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:2~2:1。
90.如权利要求89所述的应用,其中,所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:0.8~1:1.2。
91.如权利要求1~14中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分是卤化锌(II)或卤化锆(IV),并且其中所述第二组分是式IV化合物:
其中:
A选自O、S和NH;
R1选自H、具有1~6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)nCH3和-C(R3)(R4)(R5);
其中n是0或1~5的整数;
R2选自H和具有1~3个碳原子的直链烷基;
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环,其中所述取代基是R10;
R4和R5各自独立地是H或F;和
其中R9选自具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基和具有1~3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基、或三氟烷基。
92.如权利要求91所述的应用,其中,所述第一组分是尿素。
93.如权利要求91或权利要求92所述的应用,其中,所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:3~1:4。
94.如权利要求91~93中任一项所述的应用,其中,所述第一组分是卤化锌(II),并且所述卤化锌(II)是ZnCl2。
95.如权利要求91~93中任一项所述的应用,其中,所述第一组分是卤化锆(IV),并且所述卤化锆(IV)是ZrCl4。
96.如权利要求1~14中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分是式V化合物:
其中:
Y-是Cl-或Br-;
X是N或P;
R12、R13、R14和R15各自独立地是具有1~16个碳原子的直链烷基、具有1~16个碳原子的直链醇基、苯甲基或苯基;
其中所述第二组分是式I化合物或其盐:
其中:
A选自O、S和NH;
R1选自H、-CH=CH2、R9、-NH2、-NHCH3和-C(R3)(R4)(R5);
R2选自H和-CH3;
R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环,其中所述取代基是R10;并且
R4和R5各自独立地是H或F;
其中R9和R10各自独立地选自具有1~3个碳原子的烷基、具有1~3个碳原子的一氯烷基和具有1~3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。
97.如权利要求96所述的应用,其中,Y-是Cl-。
98.如权利要求96或权利要求97所述的应用,其中,所述式V化合物是季铵盐。
99.如权利要求96~98中任一项所述的应用,其中,R12、R13、R14和R15各自独立地选自具有1~4个碳原子的直链烷基。
100.如权利要求99所述的应用,其中,R12、R13、R14和R15各自是甲基。
101.如权利要求100所述的应用,其中,所述第一组分是四甲基氯化铵。
102.如权利要求99所述的应用,其中,R12、R13、R14和R15各自是乙基。
103.如权利要求102所述的应用,其中,所述第一组分是四乙基氯化铵。
104.如权利要求99所述的应用,其中,R12、R13、R14和R15各自是丁基。
105.如权利要求104所述的应用,其中,所述第一组分是四丁基氯化铵。
106.如权利要求104所述的应用,其中,所述第一组分是四丁基溴化铵。
107.如权利要求96所述的应用,其中,所述第一组分包含:
108.如权利要求96所述的应用,其中,所述第一组分包含:
109.如权利要求96或权利要求97所述的应用,其中,X是P。
110.如权利要求109所述的应用,其中,R12、R13、R14和R15的至少一个是苯基。
111.如权利要求110所述的应用,其中,所述第一组分包含甲基三苯基鏻。
112.如权利要求111所述的应用,其中,所述第一组分是甲基三苯基溴化鏻。
113.如权利要求96~112中任一项所述的应用,其中,A是O或S。
114.如权利要求96~113中任一项所述的应用,其中,R1选自-NH2和–NHCH3。
115.如权利要求114所述的应用,其中,所述第一组分是尿素。
116.如权利要求113所述的应用,其中,所述第一组分是三氟硫代乙酰胺。
117.如权利要求113所述的应用,其中,所述第一组分是三氟乙酰胺。
118.如权利要求96~117中任一项所述的应用,其中,所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:1.5~1:2.5。
119.如权利要求118所述的应用,其中,所述第一组分与所述第二组分的摩尔比为1:1.8~1:2.2。
120.如权利要求1~14中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分包含胆碱,并且其中所述第二组分是具有5~7个碳原子的烷基二醇。
121.如权利要求120所述的应用,其中,所述烷基二醇是己二醇。
122.如权利要求1~14中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分包含胆碱,并且其中所述第二组分包含N-烷基吡咯烷酮,其中所述N-烷基具有1~5个碳原子。
123.如权利要求122所述的应用,其中所述N-烷基吡咯烷酮是N-甲基吡咯烷酮。
124.如权利要求1~14中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分包含胆碱,并且其中所述第二组分包含β-巯基乙醇。
125.如权利要求1~14中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分,其中所述第一组分包含胆碱,并且其中所述第二组分包含二硫苏糖醇。
126.如任一项前述权利要求所述的应用,其中,所述深共熔溶剂的pH是5~7.5。
127.如权利要求126所述的应用,其中,所述深共熔溶剂的pH是6~7。
128.如权利要求13~127中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂还包含选自着色剂、染料、洗涤剂、季铵盐、皂苷、抗微生物剂、干燥剂、探针、内部对照、抗氧化剂、核糖核酸酶抑制剂、缓冲剂、螯合剂、溶解的气体、醇和蛋白沉淀剂中的至少一种添加剂。
129.如权利要求128的应用,其中,所述至少一种添加剂选自硫酸锌、氯化锌、EDTA锌、硫酸铵、甲苯磺酸铵和山梨糖醇。
130.如权利要求129所述的应用,其中,所述至少一种添加剂是硫酸锌。
131.如权利要求128~130中任一项所述的应用,其中,所述至少一种添加剂以所述深共熔溶剂的0.01重量%~1重量%的量存在于所述深共熔溶剂中。
132.如权利要求131所述的应用,其中,所述至少一种添加剂以所述深共熔溶剂的0.01重量%~0.2重量%的量存在。
133.如权利要求128~132中任一项所述的应用,其中,所述至少一种添加剂以所述深共熔溶剂的0.5重量%~1.5重量%的量存在于所述深共熔溶剂中。
134.如权利要求133所述的应用,其中,所述至少一种添加剂以所述深共熔溶剂的0.8重量%~1.2重量%的量存在于所述深共熔溶剂中。
135.如权利要求133或权利要求134所述的应用,其中,所述至少一种添加剂是氯化锌。
136.如权利要求13~135中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂还包含40体积%~60体积%的量的硅胶。
137.如权利要求129~136中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂还包含所述深共熔溶剂的2.5重量%~12.5重量%的量的山梨糖醇。
138.如权利要求13~137中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂还包含N-烷基吡咯烷酮,其中所述N-烷基具有1~5个碳原子。
139.如权利要求138所述的应用,其中,其中所述N-烷基吡咯烷酮是N-甲基吡咯烷酮。
140.如权利要求139所述的应用,其中,其中所述N-烷基吡咯烷酮是N-乙基吡咯烷酮。
141.如权利要求138~140中任一项所述的应用,其中,所述N-烷基吡咯烷酮以所述深共熔溶剂的2重量%~20重量%的量存在于所述深共熔溶剂中。
142.如权利要求13~141中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂还包含1-苯甲基咪唑。
143.如权利要求13~142中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂还包含四甲基脲。
144.如权利要求13~143中任一项所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含所述深共熔溶剂的至多50重量%的量的水。
145.如权利要求144所述的应用,其中,所述深共熔溶剂包含所述深共熔溶剂的5重量%~10重量%的量的水。
146.如权利要求128~145中任一项所述的应用,其中,所述第一组分是氯化胆碱。
147.如权利要求146所述的应用,其中,所述第二组分是尿素。
148.如权利要求140所述的应用,其中,所述第二组分是三氟乙酰胺。
149.如权利要求146~148中任一项所述的应用,其中,所述第一组分与第二组分的摩尔比为0.8:2~1.2:2。
150.一种适用于细胞或组织固定和/或适用于抑制生物分子的降解的设备(100),所述设备包括:
由第一深共熔溶剂形成的第一深共熔溶剂层(10);和
在所述第一深共熔溶剂层(10)中的凹槽(11),该凹槽(11)用于接收包含生物分子的样品,
其中所述第一深共熔溶剂是固体或凝胶。
151.如权利要求150所述的设备,所述设备还包含由第二深共熔溶剂形成的第二深共熔溶剂层(12),
其中所述第二深共熔溶剂层(12)包封所述凹槽(11);和
其中所述第二深共熔溶剂是固体或凝胶。
152.如权利要求150或权利要求151所述的设备,其中,所述第一深共熔溶剂和/或第二深共熔溶剂是如权利要求13~149中任一项所定义的深共熔溶剂。
153.如权利要求152所述的设备,其中,所述第一深共熔溶剂和/或第二深共熔溶剂包含选自3,3,3-三氟丙酰胺、2,2-二氟-2-苯基乙酰胺、尿素和硫脲的组分。
154.如权利要求152或权利要求153所述的设备,其中,所述第一深共熔溶剂和/或第二深共熔溶剂包含选自氯化胆碱、碘化丁酰胆碱和N,N,N-三甲基甘氨酸的组分。
155.如权利要求151~154中任一项所述的设备,其中,所述设备还包含选自线、针、刷、棒、筛、渗透膜、聚合物垫和塑料支架的回收器,所述回收器与所述样品能够脱离和连接。
156.如权利要求151~155中任一项所述的设备,其中所述第一深共熔溶剂和/或第二深共熔溶剂包含选自聚乙二醇、琼脂糖、聚丙烯酸酯和纤维素的支撑基质。
157.一种生物样品固定设备,所述设备包括:
含有深共熔溶剂(20)的容器(21);和
盖(22);
其中所述盖(22)能够构造为使所述容器(21)密封;并且
其中所述盖(22)是能够穿刺的。
158.如权利要求157所述的设备,其中,所述深共熔溶剂(20)是如权利要求13~149中任一项所定义的深共熔溶剂。
159.如权利要求157或权利要求158所述的设备,其中所述盖(22)具有自身再密封性。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1303666.0 | 2013-03-01 | ||
GBGB1303666.0A GB201303666D0 (en) | 2013-03-01 | 2013-03-01 | Sample fixation and stabilisation |
PCT/EP2014/054009 WO2014131906A1 (en) | 2013-03-01 | 2014-02-28 | Sample fixation and stabilisation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105392363A true CN105392363A (zh) | 2016-03-09 |
CN105392363B CN105392363B (zh) | 2017-09-29 |
Family
ID=48142243
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480024553.9A Active CN105392363B (zh) | 2013-03-01 | 2014-02-28 | 样品的固定和稳定化 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US9696247B2 (zh) |
EP (3) | EP2961268B1 (zh) |
JP (3) | JP6317372B2 (zh) |
CN (1) | CN105392363B (zh) |
AU (1) | AU2014222618B2 (zh) |
CA (1) | CA2904765C (zh) |
ES (1) | ES2709064T3 (zh) |
GB (1) | GB201303666D0 (zh) |
WO (1) | WO2014131906A1 (zh) |
Cited By (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107982299A (zh) * | 2018-01-01 | 2018-05-04 | 广东汇群中药饮片股份有限公司 | 一种低共熔试剂保护的麸炒白术炮制方法 |
CN108094412A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-06-01 | 安徽工业大学 | 一种用于细胞冷冻保存的新型冷冻保护剂及其应用 |
CN108186575A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-06-22 | 安徽工业大学 | 一种基于低共熔溶剂为溶剂的包埋体系 |
CN108251414A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-07-06 | 云健康基因科技(上海)有限公司 | 骨髓细胞基因组dna的提取方法及提取试剂盒 |
CN108375571A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-08-07 | 苏州长光华医生物医学工程有限公司 | 一种用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂及试剂盒 |
CN109757466A (zh) * | 2018-10-29 | 2019-05-17 | 中国医学科学院阜外医院 | 尿液保存液、尿液采集容器、方法及试剂盒 |
CN109781977A (zh) * | 2019-01-09 | 2019-05-21 | 首都医科大学附属北京安定医院 | IL15Rα以及相关膜蛋白检测试剂盒及其应用 |
CN109837272A (zh) * | 2017-11-27 | 2019-06-04 | 北京自然博物馆 | 血液组织rna成分保存剂及其制备方法 |
CN110441531A (zh) * | 2019-08-17 | 2019-11-12 | 宁波奥丞生物科技有限公司 | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 |
CN110519985A (zh) * | 2017-03-31 | 2019-11-29 | 弗劳恩霍夫应用研究促进协会 | 低温指示剂混合物,用于监测低温下的温度转变的装置和方法 |
CN110604126A (zh) * | 2018-06-14 | 2019-12-24 | 宁波化奇工程技术有限公司 | 一种非甲醛环保病理组织固定剂 |
CN110633719A (zh) * | 2018-06-21 | 2019-12-31 | 北京新羿生物科技有限公司 | 一种微液滴数据的分类方法 |
CN111088319A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-05-01 | 深圳市上为生物科技有限公司 | 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法 |
CN111218502A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-06-02 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 提升qPCR检测性能的组合物、反应液、用途及方法 |
CN111302499A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-06-19 | 桂林理工大学 | 一种快速催化降解己烯雌酚的方法 |
CN111397997A (zh) * | 2020-04-26 | 2020-07-10 | 中烨(山东)检验检测有限公司 | 一种用于新鲜组织样本固定的组织固定液 |
CN111556788A (zh) * | 2017-12-01 | 2020-08-18 | 意大利科潘恩集团公司 | 用于保存生物样品的支持物及相关生产方法 |
CN112400861A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-02-26 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 一种用于快速细胞免疫组化的细胞保存液及其制备方法和应用 |
CN112662561A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-04-16 | 中农新科(苏州)有机循环研究院有限公司 | 一种常温细菌核糖核酸保护剂及其制备方法与应用 |
CN112760360A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-05-07 | 洛阳赛奥生物工程技术有限公司 | 一种rna保护剂及其应用 |
CN113009184A (zh) * | 2021-04-20 | 2021-06-22 | 浙江科技学院 | 一种基于低共熔溶剂制备冷冻电镜检测样品的方法 |
CN113218723A (zh) * | 2021-03-16 | 2021-08-06 | 吴敏 | 一种用于显微镜观察的组合物及其制备方法和应用 |
WO2021174673A1 (zh) * | 2020-03-04 | 2021-09-10 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途 |
CN113533292A (zh) * | 2021-08-24 | 2021-10-22 | 常州工学院 | 一种双酚s含量的荧光检测方法 |
CN113817718A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-12-21 | 上海市刑事科学技术研究院 | 一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液 |
CN114082218A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-02-25 | 齐鲁工业大学 | 一种可调控且选择性提取木质素的开关型低共熔溶剂的制备与应用 |
CN114901067A (zh) * | 2019-12-18 | 2022-08-12 | 阿达克斯生物科学有限公司 | 通过在用去酸甲醛制备的缓冲***中固定组织来保存核酸序列 |
CN115993457A (zh) * | 2023-03-22 | 2023-04-21 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种用于化学发光免疫分析仪检测光子含量的发光剂及其制配方法 |
CN116891910A (zh) * | 2023-04-23 | 2023-10-17 | 北京森康生物技术开发有限公司 | 一种具有抗干扰能力的非洲猪瘟病毒荧光pcr检测试剂盒 |
CN117054182A (zh) * | 2023-07-31 | 2023-11-14 | 广东湛江海洋医药研究院 | 一种可塑形的组织透明化试剂及其制备方法和使用方法 |
Families Citing this family (69)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009144581A1 (en) | 2008-05-27 | 2009-12-03 | Dako Denmark A/S | Hybridization compositions and methods |
US11021733B2 (en) | 2011-09-26 | 2021-06-01 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
EP2761000B1 (en) | 2011-09-26 | 2016-03-16 | PreAnalytiX GmbH | Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids |
JP6608280B2 (ja) | 2012-09-25 | 2019-11-20 | キアゲン ゲーエムベーハー | 生物学的試料の安定化 |
GB201303666D0 (en) * | 2013-03-01 | 2013-04-17 | Goldsborough Andrew S | Sample fixation and stabilisation |
US10144952B2 (en) | 2013-03-18 | 2018-12-04 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
US11525155B2 (en) | 2013-03-18 | 2022-12-13 | Qiagen Gmbh | Stabilisation of biological samples |
FI126757B (en) * | 2014-02-28 | 2017-05-15 | Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy | EUTEXT SOLVENT MIXTURES AND THEIR USE |
JP6664332B2 (ja) * | 2014-03-18 | 2020-03-13 | キアゲン ゲーエムベーハー | 細胞外核酸の安定化および単離 |
CN104023526B (zh) * | 2014-03-24 | 2016-01-13 | 金仕生物科技(常熟)有限公司 | 一种处理生物材料的方法及经该方法处理的生物材料 |
JP2017524899A (ja) * | 2014-05-22 | 2017-08-31 | ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー | 性別および他の特徴に従って選択的に卵を処理するための方法と装置 |
EP3149446B1 (en) * | 2014-05-28 | 2022-07-06 | Qiagen GmbH | Fixative composition for cell-comprising liquid samples |
EP3234177A1 (en) | 2014-12-17 | 2017-10-25 | F. Hoffmann-La Roche AG | Activity assay for bond forming enzymes |
WO2016096787A1 (en) | 2014-12-17 | 2016-06-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Enzymatic one-pot reaction for double polypeptide conjugation in a single step using sortase |
US10111842B2 (en) * | 2014-12-31 | 2018-10-30 | University Of Oslo | Eutectic solvents and uses thereof |
US9896682B2 (en) | 2015-03-06 | 2018-02-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Stabilized RNA solutions |
CN104887723A (zh) * | 2015-06-18 | 2015-09-09 | 天津理工大学 | 一种利用低共熔溶剂提取银杏叶中黄酮类化合物的方法 |
WO2017017461A1 (en) * | 2015-07-30 | 2017-02-02 | Arcis Biotechnology Holdings Limited | Method and composition |
GB201513492D0 (en) * | 2015-07-30 | 2015-09-16 | Arcis Biotechnology Holdings Ltd | Method and composition |
WO2017027439A1 (en) * | 2015-08-07 | 2017-02-16 | Yangchuan Xing | Synthesis of deep eutectic solvent chemical precursors and their use in the production of metal oxides |
CN105158129B (zh) * | 2015-08-26 | 2018-04-17 | 武汉东方华康科技有限公司 | 一种红细胞沉降率标准品及其制备方法 |
CN108026560A (zh) | 2015-09-25 | 2018-05-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 在低共熔溶剂中使用分选酶的转酰胺反应 |
JP6895953B2 (ja) | 2015-09-25 | 2021-06-30 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ソルターゼaを利用してチオエステルを作製するための方法 |
WO2017050866A1 (en) | 2015-09-25 | 2017-03-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel soluble sortase a |
JP2017082063A (ja) * | 2015-10-26 | 2017-05-18 | 日本化薬株式会社 | 深共晶溶媒を含む光波長変換要素およびその光波長変換要素を含む物品 |
CN108291250B (zh) | 2015-11-20 | 2022-05-27 | 凯杰有限公司 | 用于稳定细胞外核酸的已灭菌组合物的制备方法 |
EP3411492A1 (en) * | 2016-02-05 | 2018-12-12 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Thiol-based deep eutectic solvent |
AU2017229088B2 (en) * | 2016-03-07 | 2021-05-13 | X-Zell Inc. | Compositions and methods for identifying rare cells |
WO2017164627A2 (ko) * | 2016-03-21 | 2017-09-28 | 주식회사 엘지생활건강 | 바이오필름 억제 또는 제거용 조성물 |
KR101978828B1 (ko) * | 2016-03-21 | 2019-05-15 | 주식회사 엘지생활건강 | 바이오필름 제거용 조성물 |
US20190153427A1 (en) * | 2016-07-08 | 2019-05-23 | President And Fellows Of Harvard College | Determination of rna in blood or other fluids |
FR3058905B1 (fr) * | 2016-11-18 | 2020-02-28 | Universite Du Littoral Cote D'opale | Procede d'epuration d'un effluent gazeux |
US11882823B2 (en) * | 2017-01-22 | 2024-01-30 | Chryos, Llc | Composition and method of use of the same for preserving cells for analysis |
CN110520045A (zh) * | 2017-02-03 | 2019-11-29 | 斯特里克公司 | 带防腐剂的采样管 |
US20220125042A1 (en) * | 2017-05-17 | 2022-04-28 | Universidade Nova De Lisboa | Cryoprotectant and/or cryopreservant composition, methods and uses thereof |
CN107177024B (zh) * | 2017-05-23 | 2019-07-30 | 广州纽楷美新材料科技有限公司 | 可聚合低共熔溶剂在制备透明导电弹性体中的应用 |
WO2019089898A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Danisco Us Inc | Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes |
EP3485874A1 (en) * | 2017-11-17 | 2019-05-22 | SeraNovo B.V. | Method of preparing a natural deep eutectic solvent (nades)-active ingredient system; a nades-, and preferably a polymeric precipitation inhibitor containing nades-, based drug formulation technology and development method |
CN107870190B (zh) * | 2017-11-21 | 2020-02-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 脑缺血近交系长爪沙鼠的遗传生化位点标记及其应用 |
AR113996A1 (es) | 2017-12-22 | 2020-07-08 | Intervet Int Bv | Vacunas líquidas de virus envueltos vivos |
US12031891B2 (en) | 2017-12-29 | 2024-07-09 | Hoffman-La Roche, Inc. | Tissue sample preparation system |
JP7178607B2 (ja) * | 2018-02-23 | 2022-11-28 | 学校法人麻布獣医学園 | アミロイドタンパク質を抽出する試薬 |
EP3781192A1 (en) * | 2018-04-16 | 2021-02-24 | Merck Patent GmbH | Additives for protein formulations to improve thermal stability |
EP3827241B1 (en) | 2018-07-24 | 2024-03-13 | Andrew Simon Goldsborough | Dissociation of biological samples |
KR102220167B1 (ko) * | 2018-09-04 | 2021-02-25 | 성균관대학교산학협력단 | 단백질 상온 안정화 및 저장용 천연공융용매 |
EP3851184A4 (en) * | 2018-09-14 | 2022-06-08 | Sumitomo Chemical Company Limited | PROCESS FOR MAKING A MEMBRANE FOR ACID GAS SEPARATION |
CN109706113B (zh) * | 2019-02-28 | 2022-08-26 | 华侨大学 | 一种利用低共熔溶剂提取大豆线粒体的方法 |
JP2022526542A (ja) | 2019-03-29 | 2022-05-25 | インターベット インターナショナル ベー. フェー. | 液体組成物中の生モリクテス綱細菌の安定化 |
CN110286019B (zh) * | 2019-04-26 | 2021-10-15 | 青岛农业大学 | 一种去膜端黄卵的整胚固定方法 |
CN110448996A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-15 | 浙江工业大学 | 一种基于Emim[Cl]低共熔溶剂捕集二氧化硫的方法 |
CN110954380A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-04-03 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种生化校准品用基质以及一种生化校准品 |
FR3107282A1 (fr) * | 2020-02-14 | 2021-08-20 | Enalees | Trousses et procédés pour l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons complexes |
US20230220313A1 (en) | 2020-04-10 | 2023-07-13 | Andrew Simon Goldsborough | Composition and method for inactivating a virus |
CN111397998A (zh) * | 2020-04-26 | 2020-07-10 | 中烨(山东)检验检测有限公司 | 一种用于组织细胞切片的染色液 |
US20220011298A1 (en) * | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Acutis Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for isolation and rapid detection of micro-organisms from blood and bodily fluids |
CN111982626B (zh) * | 2020-08-20 | 2023-07-25 | 江苏瑞思坦生物科技有限公司 | 一种软骨球快速石蜡切片鉴定方法 |
WO2022101877A1 (pt) * | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Targetalent, Lda | Composição de criopreservação de amostras biológicas para pcr |
EP4317127A1 (en) | 2021-03-26 | 2024-02-07 | Daicel Corporation | Eutectic mixture and liquid composition |
CN113125482A (zh) * | 2021-04-20 | 2021-07-16 | 浙江科技学院 | 一种用于冷冻电镜制样的低共熔溶剂及其制备方法 |
WO2022254209A1 (en) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | Imperial College Innovations Limited | Stable composition |
CN113484192B (zh) * | 2021-09-06 | 2021-12-14 | 广汉市福客科技有限公司 | 一种下沉式延缓起泡剂的评价装置与评价方法 |
CN113740134B (zh) * | 2021-09-24 | 2023-11-28 | 中国电建集团成都勘测设计研究院有限公司 | 一种用于三轴试验土样制备装置 |
WO2023086847A1 (en) | 2021-11-10 | 2023-05-19 | Encodia, Inc. | Methods for barcoding macromolecules in individual cells |
CN114740121A (zh) * | 2022-04-24 | 2022-07-12 | 杭州广科安德生物科技有限公司 | 基于一级质谱分析的双氨基酸稳定同位素标记方法及应用 |
WO2024075941A1 (ko) * | 2022-10-04 | 2024-04-11 | 인천대학교 산학협력단 | 세포밖 소포체 또는 세포의 고흡수성 수지 기반 표면 고정 기술 |
CN115678191B (zh) * | 2022-11-08 | 2023-09-26 | 曲阜师范大学 | 一种高机械强度抗冻自粘自修复导电弹性体的制备方法及应用 |
CN115777695B (zh) * | 2023-02-07 | 2023-05-12 | 成都海默云因医学检验实验室有限公司 | 适用于脑脊液细胞形态学检查的复合保存液及其制备方法 |
CN116656671B (zh) * | 2023-07-27 | 2023-11-21 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种rna提取方法 |
CN117129605B (zh) * | 2023-10-25 | 2024-02-02 | 济南和合医学检验有限公司 | 一种液相色谱串联质谱法检测11种抗高血压药物和3种代谢物的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1503910A (zh) * | 2000-11-08 | 2004-06-09 | ���˶ٵϿ�ɭ��˾ | 收集和稳定生物样品的方法和装置 |
US20090117628A1 (en) * | 2007-09-21 | 2009-05-07 | Gorke Johnathan T | Enzymatic processing in deep eutectic solvents |
WO2011155829A1 (en) * | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Universiteit Leiden | Process for extracting materials from biological material |
CN102711674A (zh) * | 2009-08-26 | 2012-10-03 | 大塚医疗器械有限公司 | 管腔内留置用医疗设备及其制造方法 |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3667928A (en) * | 1969-11-12 | 1972-06-06 | Union Oil Co | Increased component concentration of nutrient solutions of trace metals |
US4579580A (en) * | 1982-12-22 | 1986-04-01 | Moore William P | Urea-methylolurea plant food composition |
US5010183A (en) | 1989-07-07 | 1991-04-23 | Macfarlane Donald E | Process for purifying DNA and RNA using cationic detergents |
US5300635A (en) | 1993-02-01 | 1994-04-05 | University Of Iowa Research Foundation | Quaternary amine surfactants and methods of using same in isolation of nucleic acids |
US6777210B1 (en) | 1998-09-24 | 2004-08-17 | Ambion, Inc. | Method and reagents for inactivating ribonucleases RNase A, RNase I and RNase T1 |
DE10031236A1 (de) | 2000-06-27 | 2002-01-10 | Qiagen Gmbh | Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien |
IN188857B (zh) * | 2000-07-14 | 2002-11-16 | Govind Kane Dr Shantaram | |
GB0023706D0 (en) * | 2000-09-27 | 2000-11-08 | Scionix Ltd | Ionic liquids |
US6602718B1 (en) | 2000-11-08 | 2003-08-05 | Becton, Dickinson And Company | Method and device for collecting and stabilizing a biological sample |
US20040077519A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-04-22 | The Procter & Gamble Co. | Ionic liquid based products and method of using the same |
GB0217963D0 (en) * | 2002-08-02 | 2002-09-11 | Cyclops Genome Sciences Ltd | Purification of nucleic acids |
US20060094616A1 (en) | 2004-11-01 | 2006-05-04 | Hecht Stacie E | Ionic liquids derived from surfactants |
US20060188892A1 (en) | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Ambion, Inc. | Enzymatic digestion of tissue |
US7763715B2 (en) | 2005-04-22 | 2010-07-27 | The Procter & Gamble Company | Extracting biopolymers from a biomass using ionic liquids |
CA2629586C (en) * | 2007-04-20 | 2016-05-24 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Adsorption of nucleic acids to solid phases under low-salt conditions |
CA2629589C (en) * | 2007-04-20 | 2016-03-29 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Isolation and purification of nucleic acid molecules with a solid phase |
DE102007025277A1 (de) | 2007-05-31 | 2008-12-04 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe |
WO2009085574A2 (en) * | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Spring Bioscience Corporation | Microwave antigen retrieval in non-aqueous solvents |
US8022014B2 (en) | 2008-03-26 | 2011-09-20 | Shrieve Chemical Products, Inc. | Deep eutectic solvents and applications |
JP5827948B2 (ja) * | 2009-08-17 | 2015-12-02 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングMerck Patent Gesellschaft mit beschraenkter Haftung | ウイルスを単離する方法 |
EP2516016B1 (en) | 2009-12-23 | 2018-04-11 | Colgate-Palmolive Company | Anhydrous liquid antiperspirant/deodorant composition |
US8292625B2 (en) | 2010-07-23 | 2012-10-23 | Pulpdent Corporation | Radically curable urethane dimethacrylates and compositions thereof for tougher dental prosthetics |
WO2012145522A2 (en) | 2011-04-19 | 2012-10-26 | Georgia Tech Research Corporation | Deep eutectic solvent systems and methods |
WO2014055936A1 (en) | 2012-10-04 | 2014-04-10 | Integenx Inc. | Preservation of biological materials in non-aqueous fluid media |
GB201303666D0 (en) | 2013-03-01 | 2013-04-17 | Goldsborough Andrew S | Sample fixation and stabilisation |
US9840731B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-12-12 | Gentegra, Llc | Preservation of biological materials in non-aqueous fluid media |
-
2013
- 2013-03-01 GB GBGB1303666.0A patent/GB201303666D0/en not_active Ceased
-
2014
- 2014-02-28 ES ES14708231T patent/ES2709064T3/es active Active
- 2014-02-28 EP EP14708231.7A patent/EP2961268B1/en active Active
- 2014-02-28 AU AU2014222618A patent/AU2014222618B2/en active Active
- 2014-02-28 US US14/193,680 patent/US9696247B2/en active Active - Reinstated
- 2014-02-28 EP EP20202872.6A patent/EP3788873A1/en not_active Withdrawn
- 2014-02-28 CN CN201480024553.9A patent/CN105392363B/zh active Active
- 2014-02-28 JP JP2015559516A patent/JP6317372B2/ja active Active
- 2014-02-28 WO PCT/EP2014/054009 patent/WO2014131906A1/en active Application Filing
- 2014-02-28 EP EP18192098.4A patent/EP3430903B1/en active Active
- 2014-02-28 CA CA2904765A patent/CA2904765C/en active Active
-
2017
- 2017-05-30 US US15/608,300 patent/US10393633B2/en active Active
- 2017-08-14 US US15/676,365 patent/US10539488B2/en active Active
-
2018
- 2018-03-29 JP JP2018064225A patent/JP6527616B2/ja active Active
-
2019
- 2019-05-10 JP JP2019089830A patent/JP2019141098A/ja active Pending
-
2020
- 2020-01-17 US US16/745,782 patent/US20200225128A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-02-03 US US18/105,758 patent/US20240027309A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1503910A (zh) * | 2000-11-08 | 2004-06-09 | ���˶ٵϿ�ɭ��˾ | 收集和稳定生物样品的方法和装置 |
US20090117628A1 (en) * | 2007-09-21 | 2009-05-07 | Gorke Johnathan T | Enzymatic processing in deep eutectic solvents |
CN102711674A (zh) * | 2009-08-26 | 2012-10-03 | 大塚医疗器械有限公司 | 管腔内留置用医疗设备及其制造方法 |
WO2011155829A1 (en) * | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Universiteit Leiden | Process for extracting materials from biological material |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
韦露 等: "低共熔溶剂及其应用研究进展", 《化学通报》 * |
Cited By (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110519985A (zh) * | 2017-03-31 | 2019-11-29 | 弗劳恩霍夫应用研究促进协会 | 低温指示剂混合物,用于监测低温下的温度转变的装置和方法 |
CN109837272A (zh) * | 2017-11-27 | 2019-06-04 | 北京自然博物馆 | 血液组织rna成分保存剂及其制备方法 |
CN109837272B (zh) * | 2017-11-27 | 2021-07-16 | 北京自然博物馆 | 血液组织rna成分保存剂及其制备方法 |
CN111556788A (zh) * | 2017-12-01 | 2020-08-18 | 意大利科潘恩集团公司 | 用于保存生物样品的支持物及相关生产方法 |
CN107982299A (zh) * | 2018-01-01 | 2018-05-04 | 广东汇群中药饮片股份有限公司 | 一种低共熔试剂保护的麸炒白术炮制方法 |
CN108251414A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-07-06 | 云健康基因科技(上海)有限公司 | 骨髓细胞基因组dna的提取方法及提取试剂盒 |
CN108375571A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-08-07 | 苏州长光华医生物医学工程有限公司 | 一种用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂及试剂盒 |
CN108094412A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-06-01 | 安徽工业大学 | 一种用于细胞冷冻保存的新型冷冻保护剂及其应用 |
CN108186575A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-06-22 | 安徽工业大学 | 一种基于低共熔溶剂为溶剂的包埋体系 |
CN110604126A (zh) * | 2018-06-14 | 2019-12-24 | 宁波化奇工程技术有限公司 | 一种非甲醛环保病理组织固定剂 |
CN110633719A (zh) * | 2018-06-21 | 2019-12-31 | 北京新羿生物科技有限公司 | 一种微液滴数据的分类方法 |
CN110633719B (zh) * | 2018-06-21 | 2022-05-20 | 清华大学 | 一种微液滴数据的分类方法 |
CN109757466A (zh) * | 2018-10-29 | 2019-05-17 | 中国医学科学院阜外医院 | 尿液保存液、尿液采集容器、方法及试剂盒 |
CN109781977A (zh) * | 2019-01-09 | 2019-05-21 | 首都医科大学附属北京安定医院 | IL15Rα以及相关膜蛋白检测试剂盒及其应用 |
CN110441531A (zh) * | 2019-08-17 | 2019-11-12 | 宁波奥丞生物科技有限公司 | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 |
CN110441531B (zh) * | 2019-08-17 | 2022-08-23 | 宁波奥丞生物科技有限公司 | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及制备方法 |
CN111302499B (zh) * | 2019-11-07 | 2022-04-08 | 桂林理工大学 | 一种快速催化降解己烯雌酚的方法 |
CN111302499A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-06-19 | 桂林理工大学 | 一种快速催化降解己烯雌酚的方法 |
CN114901067A (zh) * | 2019-12-18 | 2022-08-12 | 阿达克斯生物科学有限公司 | 通过在用去酸甲醛制备的缓冲***中固定组织来保存核酸序列 |
WO2021174673A1 (zh) * | 2020-03-04 | 2021-09-10 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途 |
CN111088319B (zh) * | 2020-03-25 | 2020-07-21 | 深圳市上为生物科技有限公司 | 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法 |
CN111088319A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-05-01 | 深圳市上为生物科技有限公司 | 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法 |
CN111218502B (zh) * | 2020-04-23 | 2020-07-21 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 提升qPCR检测性能的组合物、反应液、用途及方法 |
WO2021212771A1 (zh) * | 2020-04-23 | 2021-10-28 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 提升qPCR检测性能的组合物、反应液、用途及方法 |
CN111218502A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-06-02 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 提升qPCR检测性能的组合物、反应液、用途及方法 |
CN111397997A (zh) * | 2020-04-26 | 2020-07-10 | 中烨(山东)检验检测有限公司 | 一种用于新鲜组织样本固定的组织固定液 |
CN112400861A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-02-26 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 一种用于快速细胞免疫组化的细胞保存液及其制备方法和应用 |
CN112662561A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-04-16 | 中农新科(苏州)有机循环研究院有限公司 | 一种常温细菌核糖核酸保护剂及其制备方法与应用 |
CN113218723A (zh) * | 2021-03-16 | 2021-08-06 | 吴敏 | 一种用于显微镜观察的组合物及其制备方法和应用 |
CN112760360B (zh) * | 2021-03-22 | 2023-12-19 | 洛阳赛奥生物工程技术有限公司 | 一种rna保护剂及其应用 |
CN112760360A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-05-07 | 洛阳赛奥生物工程技术有限公司 | 一种rna保护剂及其应用 |
CN113009184A (zh) * | 2021-04-20 | 2021-06-22 | 浙江科技学院 | 一种基于低共熔溶剂制备冷冻电镜检测样品的方法 |
CN113533292A (zh) * | 2021-08-24 | 2021-10-22 | 常州工学院 | 一种双酚s含量的荧光检测方法 |
CN113533292B (zh) * | 2021-08-24 | 2024-04-26 | 常州工学院 | 一种双酚s含量的荧光检测方法 |
CN113817718B (zh) * | 2021-09-16 | 2023-10-24 | 上海市刑事科学技术研究院 | 一种利用低共熔溶剂裂解细胞并直接用于聚合酶链式扩增反应的方法 |
CN113817718A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-12-21 | 上海市刑事科学技术研究院 | 一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液 |
CN114082218A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-02-25 | 齐鲁工业大学 | 一种可调控且选择性提取木质素的开关型低共熔溶剂的制备与应用 |
CN115993457A (zh) * | 2023-03-22 | 2023-04-21 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种用于化学发光免疫分析仪检测光子含量的发光剂及其制配方法 |
CN116891910A (zh) * | 2023-04-23 | 2023-10-17 | 北京森康生物技术开发有限公司 | 一种具有抗干扰能力的非洲猪瘟病毒荧光pcr检测试剂盒 |
CN117054182A (zh) * | 2023-07-31 | 2023-11-14 | 广东湛江海洋医药研究院 | 一种可塑形的组织透明化试剂及其制备方法和使用方法 |
CN117054182B (zh) * | 2023-07-31 | 2024-03-15 | 广东湛江海洋医药研究院 | 一种可塑形的组织透明化试剂及其制备方法和使用方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3430903A1 (en) | 2019-01-23 |
JP2019141098A (ja) | 2019-08-29 |
JP6317372B2 (ja) | 2018-04-25 |
US20240027309A1 (en) | 2024-01-25 |
EP3430903B1 (en) | 2020-10-21 |
EP2961268B1 (en) | 2018-11-21 |
CA2904765A1 (en) | 2014-09-04 |
AU2014222618B2 (en) | 2017-12-14 |
WO2014131906A1 (en) | 2014-09-04 |
US10539488B2 (en) | 2020-01-21 |
JP6527616B2 (ja) | 2019-06-05 |
JP2018113982A (ja) | 2018-07-26 |
GB201303666D0 (en) | 2013-04-17 |
US20180058988A1 (en) | 2018-03-01 |
CN105392363B (zh) | 2017-09-29 |
ES2709064T3 (es) | 2019-04-15 |
US10393633B2 (en) | 2019-08-27 |
US20170328819A1 (en) | 2017-11-16 |
US20140295404A1 (en) | 2014-10-02 |
US20200225128A1 (en) | 2020-07-16 |
EP3788873A1 (en) | 2021-03-10 |
US9696247B2 (en) | 2017-07-04 |
JP2016510976A (ja) | 2016-04-14 |
CA2904765C (en) | 2023-01-03 |
EP2961268A1 (en) | 2016-01-06 |
AU2014222618A1 (en) | 2015-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105392363A (zh) | 样品的固定和稳定化 | |
EP2598660B1 (en) | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures | |
CN102939381B (zh) | 从蜡包埋样品中提取核酸 | |
US9845489B2 (en) | Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures | |
EP2430195B1 (en) | Compositions and methods for biological sample storage | |
US8372637B2 (en) | Method for stabilising a biological sample | |
KR20070115874A (ko) | Dna 분석용 생물 시료를 보관 및 처리하는 시약 및 방법 | |
WO2011008553A1 (en) | Rna sample stabilization in the presence of a transitional metal | |
US20230220313A1 (en) | Composition and method for inactivating a virus | |
CN103881978B (zh) | 一种rna保存液、包含该保存液的试剂盒及其应用 | |
US20200187489A1 (en) | Matrices and methods for storage and stabilization of biological samples comprising viral rna | |
AU2021201421A1 (en) | Methods of preserving the biological activity of ribonucleic acids | |
Katoch et al. | Techniques in Molecular Biology |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |