CN102676503A

CN102676503A - 一种快速提取dna的方法

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Publication number: CN102676503A
Application number: CN2012101517730A
Authority: CN
Inventors: 龚敬文; 梁少明; 任维
Original assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Current assignee: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO Ltd
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取DNA的方法。本发明的目的是提供一种廉价、操作更便捷的提取DNA的方法。其由以下步骤组成：a、将蛋白沉淀试剂、裂解试剂和含有DNA的生物样本依次加入容器混合均匀，使细胞内容物得以释放，蛋白质发生凝聚，得到含从生物样本释放的DNA组分和非DNA组分的裂解液，所述的蛋白沉淀试剂为多价金属盐溶液；b、将步骤a中得到的裂解液中的DNA与非DNA组分分离，得到纯化的DNA溶液。本发明的有益效果为本发明采用高效蛋白沉淀试剂去除蛋白质污染，细胞裂解和蛋白沉淀同步进行，比现有技术步骤更简单，高效，也进一步降低了使用成本。

Description

一种快速提取DNA的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取DNA的方法。

背景技术

在生命体内，核酸和蛋白质是生命最重要的物质。核酸携带遗传信息，指导蛋白质的合成。它们的关系紧密相联。在为进行核酸水平上的遗传研究或临床检测，从一些生物样本，例如动物细胞、血清、血液等，提取核酸时，却常常遇到的主要问题是如何去除含量丰富的蛋白质。

本领域技术人员所熟知的一种有效方法是酚/氯仿抽提，但这种方法是非常耗费时间和劳动力。

一种可选方法是利用SDS、蛋白质和K离子形成不溶于水的复合物，通过离心去除含蛋白质的沉淀。这种方法普遍用于提取质粒，即所称的碱裂法。申请号为201010153890.1，名称为：血液基因组磁珠小提试剂盒及其提取方法中国发明采用该方法提取全血DNA。事实上，该方法并不能彻底去除蛋白质，常常可见带颜色的上清液。

另一种可选的方法是盐析法，利用了蛋白质在高浓度盐的溶液溶解度低而析出的物理特性，通常使用单价金属盐如钠盐、铵盐、钾盐等。如Miller S.A.,等人NucleicAcids Res.,16(1988)3中报道的方法，其过程是先通过低渗溶液裂解去除占据99%全血细胞不含DNA的红细胞，再裂解含DNA的白细胞，然后加入饱和的氯化钠析出蛋白沉淀，离心沉淀后含有DNA的上清液再通过乙醇沉淀分离出DNA。在操作中，技术人员发现，血红蛋白残留过多时往往无法彻底清除，如果直接裂解全血，则无法用该方法实现去除蛋白的目的。

蛋白质去除后，接着是从含DNA的上清液中分离出DNA，这个过程称为纯化。本领域技术人员熟知的一种方法是添加乙醇或异丙醇纯化DNA，并且熟知这是一种耗时费力的方法。

另外，本领域技术人员同样熟知在离液盐的存在下核酸吸附于玻璃粒子或二氧化硅粒子(Vogelstein,B.,和Gillespie,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619)，并为核酸的色谱纯化和分离过程奠定了基础。令人惊奇的是，二氧化硅材质能特异性吸附核酸，且不吸附蛋白，糖类、脂类和常用的盐类，基本原理还未见相关文献叙述。本领域还已知使用高浓度的离液盐如碘化钠、高氯酸钠和硫氰酸胍从胞溶产物中分离和纯化DNA的方法。例如，在Boom,R.等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503中，描述了使用异硫氰酸胍和玻璃颗粒提纯人体样本如全血、血清和尿液等的方法。该方法是用异硫氰酸胍裂解人体样本，并作为结合剂使DNA吸附至玻璃颗粒表面，同样的描述也可见US5234809。然而，采用玻璃颗粒形式的纯化方法需要多次重悬操作并在溶解DNA之前为为了彻底去除干扰下游应用的乙醇，通常需要较长时间的干燥。

另一种可选的方式是磁珠法。磁珠表面包被硅胶或标记功能基团，例如氨基、羧基等，磁珠吸附DNA后，在磁场的作用下，DNA-磁珠复合体吸附至管底或管壁，除去不含DNA的上清液，洗涤和洗脱DNA-磁珠复合体，获得纯化的DNA溶液。这种方法有效地实现了DNA提取的自动化，但手工操作时，与玻璃颗粒的纯化方式同样需要多次的重悬步骤并也需长时间干燥。

如上所述的方法，在需检测大量样本及迅速发报结果的疾病临床诊断中是受限的。

一种快速提取DNA的可选方法，如Jakobi,R.等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201中的描述，使用玻璃纤维过滤器纯化M13噬菌体DNA的方法。该方法通过聚二乙醇/氯化钠使噬菌体粒子沉淀并用高氯酸盐使噬菌体粒子胞溶而分离DNA，洗涤与DNA结合的玻璃纤维过滤器，然后用TE溶液洗脱。玻璃纤维过滤器是一种快速纯化DNA的方法，无需添加特别的去除蛋白质的步骤，仅通过短时间离心过滤含非DNA的其它生物样本释放的组分诸如蛋白质、脂类等和盐等污染物，并使DNA迅速结合于纤维膜上，且用短时间高速离心干燥纤维膜。这种方法被市售示例性产品如Qiagen公司的全血小量提取试剂盒所采用。此类产品用于提取全血的过程较简单，先在盐酸胍和蛋白酶共同的作用通过55摄氏度温育10分钟以裂解生物样本并释放DNA，再通过加入乙醇调节结合条件，将含DNA的混合液转移至硅胶柱，离心使DNA吸附至硅胶膜上，然后洗涤和洗脱DNA。因其简便性，成为现有纯化DNA技术中的主要方法，但技术人员在使用时注意到，不加蛋白酶降解蛋白质会导致裂解液无法通过硅胶柱。因此，蛋白酶酶解过程是该方法所必需。但蛋白酶通常比较昂贵，这使得成本居高不下。

一种基于硅胶柱技术，无需蛋白酶酶解的提取DNA的试剂盒，来自市售产品AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒（爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号：AP-MN-BL-GDNA-50）。该试剂盒的提取过程是先裂解全血细胞，然后加入沉淀剂沉淀蛋白质，转移上清液,再利用硅胶柱结合DNA，洗涤杂质并最终洗脱DNA。

常规的方法认为，提取DNA时，需先裂解细胞，释放细胞内容物，再加入试剂去除蛋白质，才能得到较高产量的DNA，因此上述试剂盒的方法将裂解和沉淀分为两个独立的步骤。

现有的技术方法，成本过高，操作复杂，均不能满足需检测大量样本的试验要求，尤其在临床应用中。因此，迫切需要一种廉价、操作更便捷的提取DNA的方法。

发明内容

基于以上现有技术，本发明的目的是提供一种快速提取DNA的方法，使用了多价金属盐作为高效的蛋白质沉淀试剂，并将裂解和沉淀两个步骤合并成一步进行，是一种廉价、操作更便捷的提取DNA的方法。

本发明的技术方案为提供一种快速提取DNA的方法，由以下步骤组成：

a、将蛋白沉淀试剂、裂解试剂和含有DNA的生物样本依次加入容器混合均匀，使细胞内容物得以释放，蛋白质发生凝聚，得到含从生物样本释放的DNA组分和非DNA组分的裂解液，所述的蛋白沉淀试剂为多价金属盐溶液；

b、将步骤a中得到的裂解液中的DNA与非DNA组分分离，得到纯化的DNA溶液。

优选的，上述步骤b为：

b、将步骤a中得到的裂解液通过离心分离得到含DNA组分的上清液，上清液转移至硅胶柱过滤后，DNA结合到硅胶柱内，洗涤和洗脱后，获得分离的纯化的DNA溶液。

优选的，上述的快速提取DNA的方法，由以下步骤组成：

a、将100ul的0.5M的硫酸锌溶液、500ul的裂解试剂，所述裂解试剂为BufferAP1、200ul全血加入1.5ml离心管，剧烈振荡30秒，得到含DNA组分和非DNA组分的裂解液；

b、将将步骤a中得到的裂解液12000rpm离心10分钟；上清液转移至硅胶柱，12000rpm离心30秒；加入700ul Buffer W1A，12000rpm离心30秒；加入800ul Buffer W2，12000rpm离心30秒；再次加入500ul Buffer W2，12000rpm离心3分钟；加入150ul Buffer TE，放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集滤液为分离的纯化的DNA溶液。

优选的，上述步骤中的多价金属盐为钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、铁盐、锰盐、锡盐、钴盐、铜盐中的一种。

优选的，上述步骤中的多价金属盐溶液的溶质浓度为0.5-2M。

优选的，上述步骤中的裂解试剂包括离液盐，所述离液盐选自胍盐、尿酸、碘化钠或高氯酸钠中的一种。

优选的，上述步骤中的离液盐的溶质浓度为3-6M。

优选的，上述步骤中的生物样本选于全血、尿液、血清、白膜层、骨髓、淋巴细胞、血小板、体液或脱落细胞。

优选的，上述步骤中的非DNA组分包括蛋白质、脂类、RNA和糖类。

本发明的有益效果区别于现有的添加蛋白酶降解蛋白质的提取DNA的方法，本发明快速提取DNA的方法不使用蛋白酶降解蛋白质，不需要温育操作，而是采用高效蛋白沉淀试剂去除蛋白质污染，细胞裂解和蛋白沉淀同步进行，该方法尤其适用于蛋白质含量丰富的生物样本，故比现有技术步骤更简单，高效，也进一步降低了使用成本。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。

多价金属盐比单价金属盐更有效地沉淀蛋白质。所述的多价金属盐包括钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、锰盐、亚铁盐、铜盐、铝盐或铁盐。但同时，多价金属盐在低浓度的情况下也能沉淀DNA，（Kejnovsky.E,.and Kypr.J.,NucleicAcids Res.,25(1997)1870-1871；Kejnovsky.E,.and Kypr.J.,Nucleic AcidsRes.,26(1998)5295-5299）。用含多价金属盐试剂沉淀从生物样本释放的含DNA的内容物时，获得的DNA产量与市售产品（例如AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号：AP-MN-BL-GDNA-50）相当。

基于以上原因，本发明将多价金属盐作为高效的蛋白沉淀试剂应用于DNA的分离纯化，并进一步简化了步骤。多价金属盐选自：钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、亚铁盐、锰盐、锡盐、钴盐、和铜盐。本发明的蛋白沉淀试剂，尤其适用于蛋白含量丰富的生物样本的核酸提取过程，用于去除蛋白污染。

进一步地，本发明提供一种快速提取DNA的方法，所述方法无需使用蛋白酶消化蛋白质，而是采用高效蛋白沉淀试剂去除蛋白质污染，并且使细胞裂解和蛋白沉淀同步进行。该方法尤其适用于蛋白质含量丰富的生物样本，包括但不限于全血、尿液、血清、白膜层、骨髓、淋巴细胞、血小板、体液、脱落细胞，优选全血。

本发明是通过以下的技术方案达到本发明目的的：

在离心管依次加入蛋白沉淀试剂、裂解试剂和生物样本，剧烈振荡均匀，使细胞内容物得以释放，并且蛋白质发生凝聚，形成一种含有生物样本的DNA组分和非DNA组分的裂解液，通过离心分离得到含DNA组分的上清液，上清液转移至硅胶柱过滤后，DNA结合到硅胶柱内，洗涤和洗脱后，获得分离的DNA溶液。

上述的生物样本含有DNA，选自但不限于：全血、尿液、血清、白膜层、骨髓、淋巴细胞、血小板、体液和脱落细胞，优选全血。本文涉及的“全血”是指：采集于含有抗凝剂溶液中的血液，包括血细胞和血浆的所有成分。生物样本通常也含有蛋白质、脂类、糖类和RNA。本文所述的DNA是指总DNA，包含基因组DNA、线粒体DNA和质粒DNA。所述的非DNA组分来源于生物样本，从生物样本释放，包括蛋白质、脂类、糖类、RNA。

本发明的蛋白沉淀试剂是多价金属盐溶液。多价金属盐选自：钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、亚铁盐、锰盐、锡盐、钴盐、和铜盐，浓度为0.5-2M。

现有的蛋白沉淀试剂一般是AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒（中BufferAP2。

本发明的裂解试剂，含有离液盐，离液盐选自：胍盐、尿酸、碘化钠、和高氯酸钠的一种，溶质浓度为3-6M。所述的裂解试剂优选于AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒中的Buffer AP1，或自行配置为A溶液：100mMTris-HCl,50mM EDTA,5M异硫氰酸胍,100mM乙酸钠,pH6.4。

本发明洗涤所用的试剂通常含有乙醇，浓度60%-80%之间。优选的洗涤试剂是AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒（爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号：AP-MN-BL-GDNA-50）中的Buffer W2。

所述的洗脱所用的试剂选自：水、Tris溶液(10mM Tris-HCl,pH8.5)。优选地，洗脱试剂是AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒中的Buffer TE。

Buffer W1A concentrate（AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒）：洗涤液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。

Buffer W2concentrate（AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒）：去盐液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。

Buffer TE（AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒）：5mM Tris-HCl，0.1mMEDTA，pH 8.5。室温密闭贮存。

本发明使用的AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒为：爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号：AP-MN-BL-GDNA-50。

实例1

使用多价金属盐硫酸锌溶液作为蛋白质沉淀剂与市售蛋白质沉淀剂采用现有方法提取DNA的比较：

本发明的蛋白质沉淀剂：将硫酸锌（Sigma-Aldrich中国，分类号：Z4750）加入去离子水，充分溶解后配制成溶质溶度为0.5M、1M、2M的溶液备用。

市售蛋白质沉淀剂是AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒（爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号：AP-MN-BL-GDNA-50）中的Buffer AP2。

现有方法提取全血DNA：

全血样本收集后，保存于4℃，96小时内使用。对各样本编号分别为：Y465、Y466、Y467、2039、2041、2045。

按AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒（爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号：AP-MN-BL-GDNA-50）的方法提取DNA。试剂盒的组分包括：Buffer AP1、Buffer AP2、Buffer W1A、BuffeW2、Buffer TE和硅胶柱。提取方法如下：

在含有500ul Buffer AP1的1.5ml离心管内加入200ul全血样本，剧烈振荡30秒；加入100ul Buffer AP2或硫酸锌溶液，剧烈振荡30秒；12000rpm离心10分钟；

收集上清液转移至硅胶柱，12000rpm离心30秒；在硅胶柱内加入700ulBuffer W1A，12000rpm离心30秒；加入800ul Buffer W2，12000rpm离心30秒；再次加入500ul Buffer W2，12000rpm离心3分钟；加入100ul Buffer TE，室温放置1分钟，12000离心1分钟，收集滤液。

如下表1为各个样本使用Buffer AP2和硫酸锌溶液采用现有方法提取的DNA紫外测定结果。按以上方法，各样本加入硫酸锌溶液的溶度分别为：Y465加入0.5M的硫酸锌溶液，Y466加入0.5M的硫酸锌溶液，Y467加入1M的硫酸锌溶液，2039加入1M的硫酸锌溶液，2041加入2M的硫酸锌溶液，2045加入2M的硫酸锌溶液。

表1

样本编号	所用蛋白沉淀剂	A₂₆₀/A₂₈₀	产量μg
				Y465	AP2	1.84	8.3
Y465	硫酸锌	1.88	8.0
				Y466	AP2	1.87	6.0
Y466	硫酸锌	1.83	6.0
				Y467	AP2	1.90	5.6
Y467	硫酸锌	1.84	4.5
				2039	AP2	1.85	5.3
2039	硫酸锌	1.82	5.1
				2041	AP2	1.85	6.6
2041	硫酸锌	1.85	6.6
				2045	AP2	1.88	6.3
2045	硫酸锌	1.88	5.9

紫外分光光度计分析:

DNA的浓度通过NanoDrop 2000测定，计算体积得出产量。纯净的DNA在波长260nm和280nm都有吸收值，但以260nm最高。而DNA提取过程中最主要的污染物蛋白质在280nm处有强烈的吸收值，所以计算这两个吸收峰的比值就可以确定DNA的纯度,比值一般为1.7<A260/A280<1.9。

表1结果说明，用硫酸锌溶液代替BufferAP2作为蛋白沉淀试剂时DNA的产量相当。

实例2

现有市售试剂盒提取的标准方法和本发明的快速方法并使用多价金属盐硫酸锌溶液作为蛋白质沉淀剂的比较:

收集全血样本后，直到使用前，保存于4℃，96小时内进行DNA的提取，对各样本编号分别为：Y465、Y466、Y467、2039、2041、2045。分别用AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒和本发明的提取DNA。市售试剂盒（爱思进生物技术(杭州)有限公司，分类号：AP-MN-BL-GDNA-50）的组分包括：BufferAP1、BufferAP2、Buffer W1A、BuffeW2、Buffer TE和硅胶柱。本实用硫酸锌溶液代替BufferAP2。

a、市售试剂盒提取DNA的方法：

在含有500ul Buffer AP1的1.5ml离心管内加入200ul全血样本，剧烈振荡30秒，加入100ul BufferAP2；然后剧烈振荡30秒，12000rpm离心10分钟；

收集上清液转移至硅胶柱，12000rpm离心30秒；加入700ul Buffer W1A，12000rpm离心30秒；加入800ul Buffer W2，12000rpm离心30秒；再次加入500ul Buffer W2，12000rpm离心3分钟；加入150ul Buffer TE，室温放置1分钟，12000离心1分钟，收集滤液。

b、本发明的快速提取DNA的方法：

于1.5ml离心管内加入100ul多价金属盐溶液；然后慢慢加入500ulA溶液，加入200ul全血，剧烈振荡30秒，12000rpm离心10分钟；上清液转移至硅胶柱，12000rpm离心30秒；加入700ulW1A，12000rpm离心30秒；加入800ul W2，12000rpm离心30秒；再次加入500ul W2，12000rpm离心3分钟；加入150ul BufferTE，室温放置1分钟，12000离心1分钟，收集滤液。

上述b方法中各样本加入的多价金属盐为：Y465加入0.5M的硫酸锌溶液，Y467加入0.5M的硫酸铁溶液，2039加入1M的氯化钡溶液，2041加入1.5M的乙酸铅溶液，2045加入2M的氯化锌溶液。

紫外分光光度计分析:如表2为各个样本使用不同多价金属盐溶液采用本发明的快速提取DNA的方法与市售试剂盒提取的方法的DNA产量比较。

表2

样本编号	所用提取DNA方法	A₂₆₀/A₂₈₀	产量μg
				Y465	a	1.88	8.0
Y465	b	1.82	7.3
				Y466	a	1.83	6.0
Y466	b	1.84	6.0
				Y467	a	1.84	4.5
Y467	b	1.83	5.0
				2039	a	1.82	5.1
2039	b	1.85	4.6
				2041	a	1.85	6.6
2041	b	1.85	6.2
				2045	a	1.88	5.9
2045	b	1.88	5.4

上述表2结果表明，本发明的快速提取DNA的方法与市售试剂盒提取的方相比，将提取DNA的方法中裂解和沉淀两个步骤合并成一步进行，步骤更简单操作更便捷，并且DNA产量相当,使用的蛋白沉淀剂（硫酸锌溶液）相对于市售试剂盒的蛋白沉淀剂更廉价，易得，所以本发明的快速提取DNA的方法简单，高效，也进一步降低了使用成本。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种快速提取DNA的方法，其特征在于，由以下步骤组成：

a、将蛋白沉淀试剂、裂解试剂和含有DNA的生物样本依次加入容器混合均匀，使细胞内容物得以释放，蛋白质发生凝聚，得到含从生物样本释放的DNA组分和非DNA组分的裂解液，所述蛋白沉淀试剂为多价金属盐溶液；

2.根据权利要求1所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述步骤b为：

3.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，由以下具体步骤组成：

b、将步骤a中得到的裂解液12000rpm离心10分钟；上清液转移至硅胶柱，12000rpm离心30秒；加入700ul Buffer W1A，12000rpm离心30秒；加入800ulBuffer W2，12000rpm离心30秒；再次加入500ul Buffer W2，12000rpm离心3分钟；加入150ul Buffer TE，放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集滤液为分离的纯化的DNA溶液。

4.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述多价金属盐为钙盐、镁盐、钡盐、铅盐、锌盐、铁盐、锰盐、锡盐、钴盐、铜盐中的一种。

5.根据权利要求4所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述多价金属盐溶液的溶质浓度为0.5-2M。

6.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述的裂解试剂包括离液盐，所述离液盐选自胍盐、尿酸、碘化钠或高氯酸钠中的一种。

7.根据权利要求6所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述离液盐的溶质浓度为3-6M。

8.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述的生物样本选于全血、尿液、血清、白膜层、骨髓、淋巴细胞、血小板、体液或脱落细胞。

9.根据权利要求2所述的快速提取DNA的方法，其特征在于，所述的非DNA组分包括蛋白质、脂类、RNA和糖类。