CN116479163A - 与松散型花椰菜叶色黄化基因连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与松散型花椰菜叶色黄化基因连锁的分子标记及应用，属于分子育种领域。本发明利用1份松散型花椰菜育种高代自交系材料及其EMS突变体库中的叶色黄化材料，基于BSA群体定位获得与松散型花椰菜叶色黄化紧密连锁的染色体区域，并在候选区间内开发分子标记。根据候选基因的单碱基突变设计了1个KASP分子标记，利用该标记对359个单株进行基因型鉴定，与表型符合率达到100％。本发明可以直接用于松散型花椰菜叶色黄化植株的分子标记辅助育种，提高育种的选择效率，加快育种进程；同时为叶色黄化基因CauYL的克隆、功能验证及叶绿体发育、叶绿素代谢及合成等相关研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于花椰菜分子育种领域，涉及一种与花椰菜叶色黄化基因连锁的SNP分子标记及应用。
背景技术
花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis L.)属于十字花科芸薹属植物，由于其营养丰富，深受广大消费者的喜爱。目前我国已成为世界上最大的花椰菜生产国和消费国，花椰菜在保证我国蔬菜出口创汇和周年均衡供应中起重要作用。近年，松散型花椰菜(简称松花菜)已成为我国主要消费类型，栽培面积占总面积的90％以上，为我国农业增效、农民增收提供了重要保障。
然而我国松花菜育种研究起步晚，育种历史只有短短十几年，面临育种技术落后、种质资源匮乏、突破性品种缺乏等瓶颈问题，严重制约了我国松花菜产业的发展。特别是松花菜种内遗传背景极其狭窄，基因资源挖掘严重不足，很难满足一些特殊性状的遗传改良。
叶色突变体广泛存在于各种高等植物中，是研究高等植物光合***结构、叶绿素代谢、叶绿体发育、光合作用、激素生理等一系列生理代谢过程的理想材料，也是遗传和育种研究中的重要标记，近年来受到各国研究者的重视。
在前期研究中，我们发现了一个松散型花椰菜叶色黄化突变体‘YL-5-44’，目前控制花椰菜叶片黄化性状的基因还未被克隆，其分子机制研究未见报道。这些基因的克隆为揭示光合色素代谢、叶绿体发育的研究奠定了基础，也为花椰菜黄化基因标记开发以及克隆提供了借鉴。
发明内容
本发明的首要目的在于针对松散型花椰菜叶片中出现的黄化现象，提供一种与松散型花椰菜叶色黄化基因连锁的分子标记，为松散型花椰菜叶色黄化突变体的筛选、松散型花椰菜杂交种纯度鉴定等提供新的途径。
一种与松散型花椰菜叶色黄化基因连锁的分子标记，为花椰菜3号染色体第76347898bp位核苷酸序列G向A的突变。
进一步的，所述的分子标记对应的基因型：A：A为具有叶色黄化表型的基因型，G：A和G：G为不具有叶色黄化表型的基因型。
进一步的，针对该突变位点设计的引物(Cau-YL1标记)如下：
正向引物Primer_AlleleX(YL-1)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGCTATTCCCACGACGG(SEQ ID NO.1)；
正向引物Primer_AlleleY(YL-2)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGCTATTCCCACGACGA(SEQ ID NO.2)；
反向引物Primer_Common：TATTATCAGTCCCCCAAAGCACAA(SEQ ID NO.3)；
进一步的，两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列。正向引物YL-1的5’端连接FAM荧光接头序列，正向引物YL-2的5’端连接HEX荧光接头序列；FAM和HEX荧光接头序列分别为：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；
荧光接头序列为FAM或HEX(LGC公司合成)，优选：连接了FAM荧光接头序列的正向引物YL-1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGCTATTCCCACGACGG；连接了HEX荧光接头序列的正向引物YL-2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGCTATTCCCACGACGA。
本发明的第二个目的是提供上述分子标记的应用，有利于松散型花椰菜叶片颜色的选育，且为克隆叶色黄化基因，研究叶绿素降解的分子机制奠定基础。具体如下：
所述的分子标记用于鉴定和辅助鉴定松散型花椰菜叶片颜色。进一步的，所述的分子标记用于松散型花椰菜叶片颜色筛选育种，尤其是叶色突变体的筛选。
进一步的，所述的分子标记应用时，采用PCR反应进行检测。
具体包括以下步骤：
(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行检测与分析，如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-2对应的荧光信号，则检测位点为A：A基因型，判定为具有叶色黄化表型的突变体单株；如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-1对应的荧光信号，则检测位点为G：G基因型，判定为不具有叶色黄化表型的野生单株；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物YL-1和YL-2对应的两种荧光信号，则检测位点为G：A基因型，判定为不具有叶色黄化表型的野生单株。
进一步的，所述的分子标记应用时，采用Touchdown PCR。更进一步的，TouchdownPCR扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
本发明的优点：
本发明利用BSA群体定位结合传统遗传连锁分析，定位到一个与松散型花椰菜叶片颜色的连锁的标记，该突变位点位于3号染色体的76347898处，开发了与该松散型花椰菜叶色黄化基因相关联的KASP分子标记，可以直接用于松散型花椰菜叶片颜色表型和对应基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，加快育种效率。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到目标植株，有效的减小了种植规模，减少了后期田间鉴定的工作量，提高了选择的效率和准确性。本发明在松散型花椰菜叶片颜色育种实践及叶绿素代谢理论研究上均具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中的松散型花椰菜叶色黄化突变体‘YL-5-44’和叶片绿色野生型材料‘JL-137’。图1A表示：叶色黄化突变体‘YL-5-44’；图1B表示：叶片绿色野生型‘JL-137’。
图2为本发明‘YL-5-44’与‘JL-137’构建群体基因定位结果。
图2A表示BSA定位结果；图2B表示本发明候选区段内标记开发与连锁定位示意图。1-9代表染色体编号，叶色黄化基因CauYL位于3号染色体，即箭头指示处。
图3为本发明的YL分子标记在‘YL-5-44’与‘JL-137’构建的F2群体中进行基因分型的部分结果。
A处表示：PCR产物为连接了荧光接头序列的引物YL-1对应的荧光信号，为叶色绿色的纯合单株；
B处表示：PCR产物具有连接了荧光接头序列的引物YL-1和YL-2两种荧光信号，为叶色绿色的杂合单株；
C处表示：PCR产物为连接了荧光接头序列的引物YL-2对应的荧光信号，为叶色黄色的纯合单株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。本发明中所涉及的松散型花椰菜种质‘JL-137’、‘YL-5-44’均由天津市农业科学院蔬菜研究所提供，也可保证对外出售至少20年。
实施例1松散型花椰菜叶色黄化基因连锁分子标记的获得
1.分离群体的构建
以松散型花椰菜高代自交系材料‘JL-137’(叶片绿色，图1B)为父本，以其突变体‘YL-5-44’(叶色为黄色，图1A)为母本，该突变体能够稳定的遗传，将‘YL-5-44’与‘JL-137’进行杂交得到F1代，F1代自交后获得F2群体。
2.叶片颜色鉴定
在叶片苗期，可对叶片颜色进行绿/黄鉴定。
3.叶色黄化基因的定位
在‘YL-5-44’×与‘JL-137’的F2群体中随机选取20个叶片黄色的植株和20个叶片绿色植株的苗期幼嫩叶片分别混池，其中叶片绿色为显性子代混池GL；叶片黄色隐性子代混池YL，显性亲本‘JL-137’及隐性亲本‘YL-5-44’，利用CTAB法提取4个混池总的DNA，利用TruSeqDNA LT Sample Prep Kit(Illumina公司)对4个混池DNA建库，通过IlluminaNovaseq 6000进行基因组重测序，获得的数据。利用bwa进行mapping、samtools进行SNP的calling，过滤条件是碱基质量值大于等于30，mapping质量值大于等于30，碱基depth在两个F2混池中大于等于2且小于等于60，共获得8766个差异SNP。然后以10个SNP为窗口，4个SNP为步长做SNP-index分布图(如图2)，平均Δ(SNP-index)为0，而候选区间的Δ(SNP-index)大于0.5，候选区间为3号染色体68463349-79528530bp。
4.叶色黄化基因的精细定位
为了进一步缩小步骤3获得的控制叶色黄化基因的候选区域，扩大的F2群体进行精细定位。根据亲本重测序结果，比对花椰菜参考基因组序列，找到SNP变异位点，开发KASP标记，利用开发的KASP分子标记对F2群体的单株进行基因分型，确定交换单株。基于叶片颜色表型数据和交换单株的基因型，将控制叶色黄化的基因定位在3号染色体的76244829-77210714bp区间，如图2B。进一步结合区间内显性亲本和隐性亲本纯合，同时隐性池差异且纯合，显性池纯合或杂合的位点，发现仅76347898位点符合EMS诱变偏好性的G-A，注释为非同义突变，功能为Magnesium-chelatase subunit Ch1H，且与表型100％连锁。
5.叶色黄化基因CauYL相连锁的分子标记的开发
用该标记对‘YL-5-44’与与‘JL-137’构建的F2群体359个单株进行基因分型。出现了3种荧光信号，其中A：A的荧光信号有90个单株，G：A的荧光信号有181个单株，G：G的荧光信号有88个单株。结合表型调查数据发现基因型与叶色表型完全一致，符合率达到了100％。以上结果充分说明，本发明Cau-YL1标记具有通用性和准确性，可以应用于松散型花椰菜叶色黄化性状的预测、鉴定和筛选。
6.分子标记的应用
(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行Touchdo-wnPCR扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行检测与分析：
正向引物Primer_AlleleX(YL-1)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGCTATTCCCACGACGG；
正向引物Primer_AlleleY(YL-2)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGCTATTCCCACGACGA；
反向引物Primer_Common：TATTATCAGTCCCCCAAAGCACAA；
两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列；荧光接头序列为FAM或HEX。
对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-2对应的荧光信号，则检测位点为A：A基因型，判定为具有叶色黄化表型的突变体单株；如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-1对应的荧光信号，则检测位点为G：G基因型，判定为不具有叶色黄化表型的野生单株(绿色表型)；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物YL-1和YL-2对应的两种荧光信号，则检测位点为G：A基因型，判定为不具有叶色黄化表型的野生单株(绿色表型)。
分子标记应用时，采用Touchdown PCR。
进一步的，Touchdown PCR扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
采用本发明的Cau-YL1标记对待测样本叶片的基因型进行检测，对其表型进行统计，结果见表1(部分结果)。
表1 Cau-YL1标记在F2群体中单株叶片颜色及基因型
上述鉴定结果表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到引物连接了荧光接头序列的引物YL-2对应的HEX荧光信号的材料，就能够选育出叶色为黄色的纯合材料。保留检测到连接了荧光接头序列的引物YL-1对应的FAM荧光信号的材料，就能够选育出叶色为绿色的纯合材料。保留检测到连接了荧光接头序列的引物YL-1和YL-2两种荧光信号的材料，就能够选育出叶色为绿色的杂合材料。通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
Claims (9)
1.一种与松散型花椰菜叶色黄化基因连锁的分子标记，其特征在于，为花椰菜3号染色体第76347898位核苷酸处G向A的突变。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的分子标记对应的基因型：A：A为具有叶色黄化表型的基因型，G：A和G：G为不具有叶色黄化表型的基因型。
3.根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于，针对突变位点设计的引物如下：
正向引物YL-1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGCTATTCCCACGACGG-3’；
正向引物YL-2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGCTATTCCCACGACGA-3’；
反向引物Primer_Common：5’-TATTATCAGTCCCCCAAAGCACAA-3’。
4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列；正向引物YL-1的5’端连接FAM荧光接头序列，正向引物YL-2的5’端连接HEX荧光接头序列；FAM和HEX荧光接头序列分别为：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
5.权利要求1-4任一项所述的分子标记在鉴定和辅助鉴定松散型花椰菜叶片颜色性状中的应用。
6.一种鉴定松散型花椰菜叶色黄化性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)以待测花椰菜样品基因组DNA为模板，利用权利要求3中所述的分子标记引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行荧光检测与分析，对扩增产物进行荧光检测与分析，如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-2对应的HEX荧光信号，则检测位点为A：A基因型，判定为具有具有叶色黄化表型的纯合单株；如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-1对应的FAM荧光信号，则检测位点为G：G基因型，判定为叶色绿色表型的纯合单株；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物YL-1和YL-2对应的两种HEX和FAM荧光信号，则检测位点为G：A基因型，判定为叶色绿色表型的杂合单株。
7.根据权利要求6所述的鉴定松散型花椰菜叶色黄化性状的方法，其特征在于，采用Touchdown PCR；Touchdown PCR扩增程序为：94℃ 15min；95℃ 20s；65℃-56℃ 60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃ 20s；57℃ 60s，26个循环。
8.一种用于鉴定花椰菜叶色黄化性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3中所述的引物。
9.用于检测权利要求1中所述分子标记是否存在的试剂在花椰菜叶色黄化基因CauYL定位中的应用，其特征在于，扩增所述分子标记引物的正向引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，反向引物序列如SEQ ID NO.3所示。
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| CN116356073A (zh) * | 2023-04-21 | 2023-06-30 | 天津市农业科学院 | 与松散型花椰菜矮茎基因连锁的分子标记及应用 |
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| KR101836109B1 (ko) * | 2017-05-23 | 2018-03-08 | 충남대학교산학협력단 | 자색 양배추 품종을 선발하기 위한 분자 마커 및 이의 용도 |
| CN113862392A (zh) * | 2021-11-15 | 2021-12-31 | 西北农林科技大学 | 大白菜黄子叶基因Bryc连锁的SSR分子标记引物及其应用 |
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