CN118186137A - 鉴定菊花光反应周期长短的kasp标记、其开发方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定菊花光反应周期长短的KASP标记组合、其开发方法及应用。本发明通过基于全基因重测序的BSA‑seq技术快速定位到与光反应周期相关的变异位点，将筛选到的SNP关联位点转化成KASP标记；本发明开发的SNP位点Chr9_205233550和Chr10_20239079，可单独或组合使用，该标记组鉴定菊花品种光反应周期长短的准确率能达到82.67％。该KASP标记组可以实现菊花光反应周期的早期鉴定，无需通过漫长繁琐的田间表型调查，即避免了人工主观判断带来的误差及人力物力的浪费，又大大地提高了选择效率。本发明的鉴定方法，可在菊花生长早期快速、准确地对光反应周期进行判断，有利于亲本的选配及后代优异株系的筛选，为菊花光反应周期MAS育种体系的建立奠定基础，对菊花光反应周期研究及其周年生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴定菊花光反应周期长短的KASP标记、其开发方法及应用，属于植物分子标记辅助育种领域。
背景技术
观赏植物的开花期是构成其观赏价值的重要性状之一，开花时间会直接影响其在市场上的价格。菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat)是典型的短日照植物，花期较单一，多集中于秋季，限制了菊花的商业发展。在生产中，需要通过人工补光或者遮光来调控菊花开花，极大增加了生产成本。光反应周期是指植株感受到短日照刺激至达到初花期所需要的天数，不同品种对光周期的敏感度存在着明显差异。光反应周期过长的品种会增加生产和管理成本，而光反应周期敏感品种的生育期较短，有助于控制生产成本，还可以提高种植茬数，从而达到节本增效的目的。因此，培育短光反应周期品种是菊花育种工作的重要目标之一。
菊花是一种高度杂合的多倍体植物，且自交不亲和。因此，传统杂交育种和诱变育种仍是培育现代菊花品种的有力手段。但是传统育种依赖育种家的经验将亲本的有利基因进行随机组合，效率较低。随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)育种已成为育种的重要手段，可以针对个别性状进行精确改良，效率较高。目前研究大多是针对菊花自然花期(即定植到各个开花时期的天数)，而光反应周期研究较少。袁储聪等(2023)发现菊花光反应周期呈现连续性变化的正态分布，说明光反应周期可能属于多基因控制的数量性状。植株从感受到短日照刺激后，直到初开才能判断品种的光反应周期特性，耗时长。因此亟需建立菊花光反应周期的MAS育种体系，实现短生育期优良品种的早期选择。
菊花MAS研究目前处于初步阶段。Su等(2019)总结了近年来基于分子标记的菊花花序、株型、花期及抗逆等性状的遗传研究进展。但前期研究主要基于SRAP、AFLP、RAPD和SSR等传统分子标记，数量有限且难以高通量分型，严重影响了定位精度与效率。与传统分子标记相比，单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)和小片段***缺失(Insertion and Deletion，InDel)标记具有分布广、遗传稳定性好、二等位基因型等特点，更容易实现高通量和自动化检测。但是对于菊花(～8.5Gb)等基因组庞大的物种来说，SNP和InDel测序成本高，难以实现大规模群体基因分型。KASP分型技术，即竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele specific PCR)，是一种新的SNP和InDel自动化检测方法。KASP标记能够在更大规模个体的基因组DNA样本中准确地判断特定位点的SNP和InDel，且耗时短、成本低，应用前景广阔。BSA-seq是将二代测序技术(Next-generationsequencing，NGS)与集群分离分析法(Bulked segregant analysis，BSA)结合的一种快速定位与目标性状相关联的基因或位点方法(汪泽民等，2023)。近年来，BSA-seq和KASP分型联合分析策略已经广泛应用于大豆、甜瓜、甘蔗和小麦等经济作物的产量、抗逆等农艺性状的基因精细定位和分子标记辅助育种(Wu et al.,2023)。然而，目前在菊花光反应周期的研究中尚未见报道。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供了一种鉴定菊花光反应周期长短的KASP标记。本发明的第二目的是提供上述KASP标记的开发方法及应用。
技术方案：本发明提供了一种鉴定菊花光反应周期长短的KASP标记，所述KASP标记包括如下的一种或两种：
位于菊花9号染色体上第205233550位的SNP变异位点，该位点由T突变为A命名为KASP-Chr9_205233550-T/A；位于菊花10号染色体上第20239079位的SNP变异位点，该位点由A突变为G，命名为KASP-Chr10_20239079-A/G。
本发明还提供了一种基于BSA-seq技术开发上述的鉴定菊花光反应周期长短的KASP标记的方法，(1)以光反应周期长短相差至少14天的两个切花菊品种为亲本，进行杂交获得F1分离群体，对其进行光反应周期表型鉴定；按照生产标准，植株达到20～25cm高时开始进行补光；所述光反应周期为从停止补光到花朵初开期的天数，初开期为40％～50％的花序呈半开放状态的时期；
(2)从F1子代中筛选多个短光反应周期极端株系及长光反应周期极端株系，提取亲本和所有极端株系的DNA，构建子代极端混池早花池和晚花池，对亲本及两个混池进行全基因组重测序；
(3)将测序数据质控后得到的clean reads比对到菊花参考基因组上，进行变异检测，并根据变异位点质量和样本基因型进行过滤；；
(4)利用|Δ(SNP/InDel-index)|和欧式距离ED两种算法对步骤(3)过滤后得到的变异位点进行BSA-seq分析，获得菊花光反应周期显著关联位点；
(5)采用滑窗的方法对|Δ(SNP/InDel-index)|及ED2进行拟合，取窗口内的平均值作为拟合后的值，按照窗口拟合值从大到小对窗口排序，以top 0.5％处的拟合值作为关联阈值筛选显著窗口，将两种算法获得的显著窗口取交集。
(6)选取步骤(5)中获得的交集窗口中|Δ(SNP/InDel-index)|>0.8的变异位点，利用“bedtools getfasta”程序提取每个位点上下200bp序列，筛选符合标准的序列作为适宜开发KASP标记的菊花光反应周期关联位点；
(7)根据步骤(6)中筛选到的变异位点设计相应的KASP扩增引物，在该开发群体中进行PCR扩增；
(8)针对步骤(7)中开发的KASP标记中分型清晰、阴性对照样本无特异性扩增的KASP标记进行准确率计算，在不考虑杂合位点情况下，将准确率>80％的KASP标记在自然群体中进行验证；当KASP标记在自然群体中的准确率达到80％，则可确定该KASP标记可用于早期鉴定菊花光反应周期长短。
其中，步骤(1)中所述的母本为长光反应周期菊花品种‘南农庐火’，父本为短光反应周期菊花品种‘迷你黄’。
其中，步骤(1)中所述补光天数为40～50d。
其中，步骤(2)中所述用于构建每个极端混池的株系数目为F1子代中该群体大小的10％～20％。
其中，步骤(3)中所述的菊花参考基因组为‘钟山紫桂’。
其中，步骤(3)的具体步骤包括：对亲本和两个极端混池的原始测序数据去掉接头和低质量序列，获得有效测序数据，使用BWA软件比对到菊花参考基因组上，对结果进行质控，再使用GATK软件检测变异位点，过滤掉低质量变异结果用于下一步分析。
其中，SNPs和InDels变异位点的过滤条件分别为“QD<2.0||FS>60.0||MQ<40.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0”和“QD<2.0||FS>200.0||SOR>10.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0”。
其中，步骤(4)中筛选用于BSA-seq分析的标记，过滤标准是：1)亲本分离形式符合F1群体，即nn×np、lm×ll、hk×hk；2)亲本和子代混池的基因型无缺失；3)去除亲本与子代相反表型的纯合相同位点；4)四个样本的测序深度要大于10×且小于500×；5)至少有一个子代池的SNP/InDel-index大于0.3；6)至少有一个子代池的SNP/InDel-index小于0.7。
其中，步骤(5)中滑窗时使用的窗口大小为500kb，步长大小为50kb，窗口内的SNP数目大于等于20时，该窗口为有效窗口，SNP数目不足时，该窗口的结果并入下一个窗口。
其中，步骤(6)中适合开发KASP标记的变异位点筛选标准是：1)上下游200bp序列中除目标SNP或InDel位点外，其它变异位点数目不超过5个；2)该片段在菊花基因组中的相似序列个数不超过3个，即blast比对分析时同时满足序列比对一致性百分比identity>83％和覆盖率coverage>80％时得到的序列个数越少越好。
其中，步骤(7)中所述引物包含两条竞争性前引物和一条通用后引物，前引物3’末端碱基为SNP或InDel位点等位变异碱基，前引物5’端分别加上FAM和VIC荧光序列标签。
其中，步骤(7)中KASP-PCR扩增体系为：2×KASP Mastermix 0.8μL、PrimerMix0.024μL(前引物F1浓度12μM、前引物F2浓度12μM、通用后引物浓度30μM)、ddH2O0.776μL。其中至少设置一个无DNA模板的阴性对照(NTC)。
其中，步骤(7)中KASP-PCR扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，55～65℃退火延伸60s，每个循环退火延伸温度降低1.0℃，共计10个循环；95℃变性20s，55℃退火延伸60s，20个循环。
本发明还公开了一种上述的KASP标记在鉴定菊花光反应周期长短中的应用，其特征在于，对于标记KASP-Chr9_205233550-T/A，若检测基因型为T:T，则为光反应周期短；若检测基因型为A:A，则为光反应周期长；若检测基因型为杂合A:T，则光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认；对于标记KASP-Chr10_20239079-A/G，若检测基因型为A:A，则为光反应周期短；若检测基因型为G:G或G:A，则光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认；当KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G标记结合判断菊花品种光反应周期长短时，若检测基因型为T:T-A:A，则光反应周期短；若检测基因型为A:A-G:G或A:A-G:A或A:T-G:G或A:T-G:A，则光反应周期长；若为其它基因型可结合田间观察进一步确认。
本发明还公开了一种早期鉴定菊花光反应周期的方法，包括以下步骤：
(1)在苗期提取待测样品的DNA，作为扩增模板；
(2)对上述的KASP标记进行PCR扩增和基因分型，当检测KASP标记为KASP-Chr9_205233550-T/A时，若检测基因型为T:T，则光反应周期短，若为A:A，则光反应周期长，若为A:T，则光反应周期大概率长，需结合田间表型进一步确定；当检测KASP标记为KASP-Chr10_20239079-A/G时，若检测基因型为A:A，则光反应周期短；若检测基因型为G:G或G:A，光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认；当检测KASP标记为KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G时，若检测基因型为T:T-A:A，则光反应周期短；若检测基因型为A:A-G:G或A:A-G:A或A:T-G:G或A:T-G:A，则光反应周期长；若为其它基因型可结合田间观察进一步确认。
其中，步骤(2)中用于扩增KASP标记KASP-Chr9_205233550-T/A的扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的两条竞争性前引物、和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的通用后引物；用于扩增KASP标记KASP-Chr10_20239079-A/G的扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示的两条竞争性前引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的通用后引物。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明通过基于全基因重测序的BSA-seq技术快速定位到与光反应周期相关的变异位点，将筛选到的SNP关联位点转化成KASP标记，相较于传统基于普通PCR扩增的分子标记，KASP标记不需要用到凝胶电泳，可以实现快速、高通量及平台化检测；本发明开发的SNP位点Chr9_205233550和Chr10_20239079，可单独或组合使用，该标记组鉴定菊花品种光反应周期长短的准确率能达到82.67％。不需要通过漫长的田间表型调查，就可以实现菊花光反应周期的早期鉴定，即避免了人工主观判断带来的误差及人力物力的浪费，又大大地提高了选择效率。本发明的鉴定方法，可在菊花生长早期快速、准确地对光反应周期进行判断，有利于亲本的选配及后代优异株系的筛选，为菊花光反应周期MAS育种体系的建立奠定了基础，对菊花光反应周期研究及其周年生产具有重要意义。
附图说明
图1为菊花品种‘南农庐火’和‘迷你黄’及组成早花池EB的20个光反应周期短F1株系和组成晚花池LB的20个光反应周期长F1株系的同天开放状态；标尺为1cm。
图2为基于|Δ(SNP/InDel-index)|(a)和欧式距离ED2(b)两种算法的菊花光反应周期BSA-seq定位结果。每个点代表一个SNP或InDel变异位点。红色折线为采用500kb窗口50kb步长滑动窗口策略计算的每个窗口|Δ(SNP/InDel-index)|和ED2均值。
图3为KASP标记KASP-Chr9_205233550-T/A(a)、KASP-Chr10_20239079-A/G(b)和KASP-Chr10_20506493-G/T(c)对亲本及两个极端混池株系的基因分型结果。
图4为KASP标记KASP-Chr9_205233550-T/A(a)和KASP-Chr10_20239079-A/G(b)对40个短光反应周期和35个长光反应周期品种的基因分型结果。
图5为基于BSA-seq技术开发KASP标记实现早期高效鉴定菊花光反应周期长短的流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1菊花光反应周期关联位点的获得
(1)群体构建与光反应周期统计
以长光反应周期品种‘南农庐火’(LH)为母本，短光反应周期品种‘迷你黄’(MiniY)为父本进行杂交(判断长光/短光反应周期品种条件为光反应周期相差至少14天)，获得F1分离群体(n＝208)。所有材料保存于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”，本领域技术人员可以从“中国菊花种质资源保存中心”中获得上述种质。采用扦插方法对两个亲本及208个F1株系进行无性扩繁，分别于2022年08月09日和2023年07月26日定植，植株达20cm高时开始进行补光，补光时间为每日22时～次日2时。统计亲本及F1子代从停止补光到初开期的天数(即为光反应周期)，初开期为50％的花序呈半开放状态的时期，两年停光时间分别为2022年09月30日(E1，补光50天)和2023年09月16日(E2，补光36天)，进行常规水肥管理。
(2)极端混池构建与高通量测序
在每次种植结束后，将F1子代群体的光反应周期进行排序，选取短光反应周期株系20个(反应周期最短的20个株系)和长光反应周期株系20个(反应周期最长的20个株系)结果如图1和表1所示，采集上述每个株系及两个亲本材料的舌状花花瓣3～4片于离心管中，液氮冷冻研磨，送至深圳华大基因科技服务有限公司进行DNA提取及文库构建(文库构建时，将开发群体中的20个短光反应周期子代DNA及20个长光反应周期子代DNA进行等浓度混合，分别构建早花池(EB)和晚花池(LB))，利用DNBseq平台进行全基因组重测序。此外，在自然群体中选取40个短光反应周期品种和35个长光反应周期品种用于KASP标记的验证，在第二次扦插培养(E2)时同时进行种植并统计光反应周期。
表1 117份供试材料及其光反应周期信息
注：E和L分别为用于验证KASP标记的短光反应周期品种和长光反应周期品种。
(3)序列比对与变异检测
原始测序数据去掉接头和低质量序列后，获得的有效测序数据详见表2。使用BWA软件(Version：0.7.17)的mem算法比对到栽培菊花品种‘钟山紫桂’参考基因组(https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21655364.v2)上，生成sam格式的比对结果文件，然后再用SAMtools(Version：1.9)软件的sort、fixmate、markdup等工具将sam文件转变为排序后bam文件，最后对bam文件进行基因组比对率、覆盖深度等质控。四个样本LH、Mini Y、EB和LB的比对率分别为99.69％、99.50％、99.66％和99.66％，1×覆盖率百分比在87.67％以上，混池测序平均深度为35.67×，说明样本数据量充足，测序正常。再用GATK软件(Version：4.2.6.1)检测变异结果，对获得的原始SNP和InDel位点分别根据“QD<2.0||FS>60.0||MQ<40.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0”和“QD<2.0||FS>200.0||SOR>10.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0”过滤标准去除低质量变异。
表2BSA-seq测序数据统计
(4)标记筛选
为尽量控制背景噪音，依照以下标准进行SNP/Indel位点的过滤，满足以下条件的位点用于后续的BSA分析：1)亲本分离形式符合F1群体，即nn×np、lm×ll、hk×hk；2)亲本和子代混池的基因型无缺失；3)去除亲本与子代混池表型相反的纯合相同位点；4)四个样本的测序深度要大于10×并且小于500×；5)至少有一个子代池的SNP/InDel-index大于0.3；6)至少有一个子代池的SNP/InDel-index小于0.7。按上述标准过滤后，获得3,470,467个SNPs和417,168个InDels用于后续的BSA-seq分析。
(5)BSA-seq分析
采用|Δ(SNP/InDel-index)|和欧式距离ED两种方法确定显著关联位点。计算上述满足条件的SNPs和InDels在两个混池(早花池和晚花池)中突变位点的reads数占该位点所有reads数的比例，即SNP/InDel-index值，根据公式|Δ(SNP/InDel-index)|＝|SNP/InDel-index(EB)-SNP/InDel-index(LB)|计算混池间SNPs频率差异的绝对值。根据欧式距离ED计算公式估计SNPs和InDels位点的四种碱基深度在两个混池间的差异平方和的根。
其中Amut为A碱基在突变混池中的频率，Awt为A碱基在野生型混池中的频率；Cmut为C碱基在突变混池中的频率，Cwt为C碱基在野生型混池中的频率；Gmut为G碱基在突变混池中的频率，Gwt为G碱基在野生型混池中的频率；Tmut为T碱基在突变混池中的频率，Twt为T碱基在野生型混池中的频率。为减少背景噪音，通常会对原始ED值进行乘方处理，以ED2作为最后的关联值。|Δ(SNP/InDel-index)|和ED2值越大代表该位点与目标性状越关联。综合比较两种算法的分析结果，获得最终的菊花光反应周期关联位点。如图2所示，|Δ(SNP/InDel-index)|>0.8和ED2>1.3的显著关联位点主要位于染色体Chr10、Chr11和Chr19。
为了进一步降低背景噪音，按照滑窗的方法对计算获得的|Δ(SNP/InDel-index)|及ED2结果进行拟合，取窗口内的平均值作为拟合后的值，滑窗时使用的窗口大小为500kb，使用的步长大小为50kb，窗口内的SNP数目大于等于20时，该窗口为有效窗口，SNP数目不足时，该窗口的结果并入下一个窗口。按照窗口拟合值从大到小对窗口排序，以top0.5％处的拟合值为阈值筛选显著窗口，则|Δ(SNP/InDel-index)|及ED2两种算法的阈值分别为0.2677和0.2022。两种算法分别获得209个和194个显著窗口，将两种算法获得的显著窗口取交集，最终获得153个交集窗口。
实施例2菊花光反应周期KASP标记开发及其应用
(1)适宜开发KASP标记的关联位点筛选
选取上述153个显著窗口中|Δ(SNP/InDel-index)|>0.8的135个SNPs和23个Indels，利用“bedtools getfasta”程序提取每个位点侧翼200bp序列，满足以下标准的适宜开发KASP标记：1)上下游200bp序列中除目标SNP或InDel位点外，其它变异位点数目不超过5个；2)该片段在菊花基因组中的相似序列个数不超过3个，即blast比对分析时同时满足序列比对一致性百分比identity>83％和覆盖率coverage>80％时得到的序列个数越少越好。最终筛选出6个SNP位点和1个InDel位点用于KASP标记开发(表3)。
表3用于开发KASP标记的7个SNP/InDel变异位点信息
(2)引物设计与KASP-PCR扩增
根据7个变异位点前后200bp侧翼序列和引物设计原则，设计出7对引物，每对引物包含两条竞争性前引物(FAM-F1和VIC-F2)和一条通用后引物(Com-R)，前引物3’末端碱基为SNP或InDel位点等位变异碱基，前引物5’端分别加上FAM(5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’)和VIC(5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’)荧光序列标签。引物由北京中玉金生物科技股份有限公司(http://www.cgmb.com.cn)合成。引物序列信息见表4。
表4 7个KASP标记的引物信息
注：下划线为FAM荧光序列标签；双下划线为VIC荧光序列标签。
KASP标记的命名原则为：KASP+变异位点位置+分型结果，如KASP-Chr9_205233550-T/A表示检测位点为位于9号染色体上的SNP变异位点Chr9_205233550，该位点的野生和突变基因型分别为T和A；KASP-Chr25_73557141-G/GA表示检测位点为位于25号染色体上的InDel变异位点Chr25_73557141，该位点的野生和突变基因型分别为G和GA。
用植物基因组DNA快速提取试剂(上海浦迪生物科技有限公司，AG504A)提取两个亲本及40个极端株系的DNA，并稀释至50～100ng·μL–1，用做PCR扩增模板。KASP-PCR反应在Douglas Array Tape基因分型平台上进行，加入1.6μL溶解好的DNA样品到96孔PCR反应板底部并烘干，反应体系1.6μL：2×KASP Mastermix 0.8μL、Primer Mix 0.024μL(前引物FAM-F1浓度12μM、前引物VIC-F2浓度12μM、通用后引物浓度30μM)、ddH2O 0.776μL。其中至少设置一个无DNA模板的ddH2O作为阴性对照(NTC)。
采用Touchdown方法进行PCR扩增：94℃预变性15min；94℃变性20s，55～65℃退火延伸60s，每个循环退火延伸温度降低1.0℃，共计10个循环；95℃变性20s，55℃退火延伸60s，20个循环。
(3)KASP基因分型与准确率计算
KASP-PCR反应结束后，利用ARAYA荧光扫描仪读取荧光信号并转变为碱基基因型，按照分型清晰、NTC无特异性扩增的原则进行样品SNP或InDel分型，并通过R软件v4.2.3可视化分型结果。
进一步地，针对分型清晰的3个KASP标记在混池群体中进行准确率计算(图3；表5)。
表5 3个KASP标记在混池群体中的光反应周期鉴定准确性
注：E和L分别为短光反应周期和长光反应周期个体的数目。
对于标记KASP-Chr9_205233550-T/A，若检测位点为T:T，则光反应周期短，若为A:A，则光反应周期长，若为A:T，则光反应周期大概率长，需结合田间表型进一步确定，混池平均准确率为76.52％。
对于标记KASP-Chr10_20239079-A/G，若检测位点为A:A，则光反应周期短，若为G:G，则光反应周期长，若为G:A，则光反应周期大概率长，混池平均准确率为79.17％。
对于标记KASP-Chr10_20506493-G/T，若检测位点为G:G，则光反应周期大概率短，需结合田间表型进一步确定，若为T:T，则光反应周期长，若为T:G，则光反应周期大概率短，混池平均准确率为61.44％。
综上所述，3个KASP标记中KASP-Chr9_205233550-T/A的基因分型聚类最清晰(图3a)，在不考虑杂合位点的条件下，混池群体中75.00％携带T:T基因型的个体的光反应周期短，100.00％携带A:A基因型的个体的光反应周期长，即KASP-Chr9_205233550-T/A在混池群体的平均准确率可达87.50％。其次是KASP-Chr10_20239079-A/G标记(图3b)，在不考虑杂合位点的条件下，混池群体中62.50％携带A:A基因型的个体的光反应周期短，100.00％携带G:G基因型的个体的光反应周期长，即KASP-Chr10_20239079-A/G在混池群体的平均准确率可达81.25％。而KASP-Chr10_20506493-G/T的基因分型聚类最差(图3c)，在不考虑杂合位点的条件下，混池群体中52.17％携带G:G基因型的个体的光反应周期短，75.00％携带T:T基因型的个体的光反应周期长，即KASP-Chr10_20506493-G/T在混池群体的平均准确率为63.59％。因此，KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G标记能够对混池群体成功分型。
其中，SNP变异位点Chr9_205233550上下200bp序列为：GTTTCACCCAAGAATA TAATGACAACATCTGTATTAGAGGCATTGAACCACCACGACATCACTCCCTTTGACATTGGAATCACGTCTCCTTTCTTAATC[T/A]CCACAATCGTTTCTTCTGAACTGTTTG GTGATATCAATCCAACTGTGCAACTGCCTGTACATGCATGCACATATTTGTTAATTGT TATGATCAGTTTACA。
SNP变异位点Chr10_20239079上下200bp序列为：GCGTGAATATTCATC TAGTATATACAAAAAGATAAAATATTTAAAATGGAAAAAGTTGTTAATTTACATCAA TTCTCATCCCTGTGCTTCGATGCTGAC[A/G]ACACGCGAAACACAAAGACAACAAC ATAACGTTTATTTCAACTTGTTCCAAATTTAAAACTTAAAGTATATAAGGAAGTACA ATTTCATTCCTCCAATGT。
(4)KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G标记的验证
为了进一步验证KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G标记在其他群体中是否通用，另外选取了40个短光反应周期品种和35个长光反应周期品种(表1中用于验证的品种)进行验证。利用植物基因组DNA快速提取试剂提取75个菊花品种的DNA，作为扩增模板，稀释至100ng·μL–1，参照步骤(2)和(3)进行KASP-PCR扩增和基因分型，并通过R软件v4.2.3可视化分型结果(图4)。
进一步地，根据步骤(3)中相应标记的基因型所对应的表型，对KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G标记在验证群体中进行基因型与表型的一致性分析(表6)。
表6 KASP-Chr9205233550-T/A和KASP-Chr1020239079-A/G标记的验证结果
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注：a E：短光反应周期品种；L：长光反应周期品种；b？：无信号或信号弱；Uncallable：有信号但无明确分型；
c NA：未检测出基因型，无法判断与表型的一致性。
对于标记KASP-Chr9_205233550-T/A，共有29个品种基因型为T:T，其中19个品种为短光反应周期，一致性率为65.52％；共有39个品种基因型为A:T，其中24个品种为长光反应周期，一致性率为61.54％，在验证群体中的平均一致性率为63.53％。可见该标记在长光反应周期菊花品种筛选中表现更好(24/35＝68.57％)。
对于标记KASP-Chr10_20239079-A/G，共有50个品种基因型为A:A，其中27个品种为短光反应周期，一致性率为54.00％；共有4个品种基因型为G:A，其中1个品种为长光反应周期，一致性率为25.00％；共有3个品种基因型为G:G，其中1个品种为长光反应周期，一致性率为33.33％，在验证群体中的平均一致性率为37.44％。可见该标记在短光反应周期菊花品种筛选中表现更好(27/40＝67.50％)。
综上所述，KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G综合使用能够更好地鉴定菊花光反应周期长短。在验证群体中，只要至少一个标记的基因型结果与表型一致，就认为光反应周期鉴定正确。按照此标准，在短光反应周期品种中，准确率为90.00％；在长光反应周期品种中，准确率为74.29％，在验证群体中的平均准确率为82.67％(表6)。所以，KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G标记组可高效率、低成本应用于菊花光反应周期的分子标记辅助育种中。
实施例3KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G标记组在早期高通量筛选短光反应周期菊花品种中的应用
在苗期提取待测样本的DNA，作为扩增模板，稀释至100ng·μL–1，参照实施例2中步骤(2)和(3)进行KASP-PCR扩增和基因分型。KASP-Chr9_205233550-T/A两条竞争性前引物序列分别为SEQ ID NO.1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAACAGTTCAGAAGAAACGATTGTGGA(下划线部分为FAM荧光序列)和SEQ ID NO.2：
(双下划线部分为VIC荧光序列)，通用后引物序列为SEQ ID NO.3:CCACGACATCACTCCCTTTGACATT。若检测基因型为T:T，则光反应周期短；若检测基因型为A:A，则光反应周期长；若检测基因型为杂合A:T，光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认。
KASP-Chr10_20239079-A/G两条竞争性前引物序列分别为SEQ ID NO.4：GAAGGTG ACCAAGTTCATGCTTTGTTGTCTTTGTGTTTCGCGTGTT(下划线部分为FAM荧光序列)和SEQ IDNO.5： (双下划线部分为VIC荧光序列)，通用后引物序列为SEQ ID NO.6:CATCAATTCTCATCCCTGTGCTTCGAT。若检测基因型为A:A，则光反应周期短；若检测基因型为G:G或G:A，光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认。
利用KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G标记组鉴定菊花品种光反应周期长短。若检测基因型为T:T-A:A，则光反应周期短；若检测基因型为A:A-G:G或A:A-G:A或A:T-G:G或A:T-G:A，则光反应周期长；若为其它基因型可结合田间观察进一步确认。
Claims (10)
1.一种鉴定菊花光反应周期长短的KASP标记，其特征在于，所述KASP标记包括如下的一种或两种：
位于菊花9号染色体上第205233550位的SNP变异位点，该位点由T突变为A命名为KASP-Chr9_205233550-T/A；位于菊花10号染色体上第20239079位的SNP变异位点，该位点由A突变为G，命名为KASP-Chr10_20239079-A/G。
2.一种基于BSA-seq技术开发权利要求1所述的鉴定菊花光反应周期长短的KASP标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以光反应周期长短相差至少14天的两个切花菊品种为亲本，进行杂交获得F1分离群体，对其进行光反应周期表型鉴定；按照生产标准，植株达到20～25cm高时开始进行补光；所述光反应周期为从停止补光到花朵初开期的天数，初开期为40％～50％的花序呈半开放状态的时期；
(2)从F1子代中筛选多个短光反应周期极端株系及长光反应周期极端株系，提取亲本和所有极端株系的DNA，构建子代极端混池早花池和晚花池，对亲本及两个混池进行全基因组重测序；
(3)将测序数据质控后得到的clean reads比对到菊花参考基因组上，进行变异检测，并根据变异位点质量和样本基因型进行过滤；
(4)利用Δ(SNP/InDel-index)和欧式距离ED两种算法对步骤(3)过滤后得到的变异位点进行BSA-seq分析，获得菊花光反应周期显著关联位点；
(5)采用滑窗的方法对|Δ(SNP/InDel-index)|及ED2进行拟合，取窗口内的平均值作为拟合后的值，按照窗口拟合值从大到小对窗口排序，以top 0.5％处的拟合值作为关联阈值筛选显著窗口，将两种算法获得的显著窗口取交集；
(6)选取步骤(5)中获得的交集窗口中|Δ(SNP/InDel-index)|>0.8的变异位点，利用“bedtools getfasta”程序提取每个位点上下200bp序列，筛选符合标准的序列作为适宜开发KASP标记的菊花光反应周期关联位点；
(7)根据步骤(6)中筛选到的变异位点设计相应的KASP扩增引物，在该开发群体中进行PCR扩增；
(8)针对步骤(7)中开发的KASP标记中分型清晰、阴性对照样本无特异性扩增的KASP标记进行准确率计算，在不考虑杂合位点情况下，将准确率>80％的KASP标记在自然群体中进行验证；当KASP标记在自然群体中的准确率达到80％，则可确定该KASP标记可用于早期鉴定菊花光反应周期长短。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述补光天数为40～50d。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述用于构建每个极端混池的株系数目为F1子代中该群体大小的10％～20％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体步骤包括：对亲本和两个极端混池的原始测序数据去掉接头和低质量序列，获得有效测序数据，使用BWA软件比对到菊花参考基因组上，对结果进行质控，再使用GATK软件检测SNPs和InDels变异位点，过滤掉低质量变异结果用于下一步分析。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，SNPs和InDels变异位点的过滤条件分别为“QD<2.0||FS>60.0||MQ<40.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0”和“QD<2.0||FS>200.0||SOR>10.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0”。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中筛选用于BSA-seq分析的标记，过滤标准是：1)亲本分离形式符合F1群体，即nn×np、lm×ll、hk×hk；2)亲本和子代混池的基因型无缺失；3)去除亲本与子代混池表型相反的纯合相同位点；4)四个样本的测序深度要大于10×且小于500×；5)至少有一个子代池的SNP/InDel-index大于0.3；6)至少有一个子代池的SNP/InDel-index小于0.7。
8.一种权利要求1所述的KASP标记在鉴定菊花光反应周期长短中的应用，其特征在于，对于标记KASP-Chr9_205233550-T/A，若检测基因型为T:T，则为光反应周期短；若检测基因型为A:A，则为光反应周期长；若检测基因型为杂合A:T，则光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认；对于标记KASP-Chr10_20239079-A/G，若检测基因型为A:A，则为光反应周期短；若检测基因型为G:G或G:A，则光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认；当KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G标记结合判断菊花品种光反应周期长短时，若检测基因型为T:T-A:A，则光反应周期短；若检测基因型为A:A-G:G或A:A-G:A或A:T-G:G或A:T-G:A，则光反应周期长；若为其它基因型可结合田间观察进一步确认。
9.一种早期鉴定菊花光反应周期的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在苗期提取待测样品的DNA，作为扩增模板；
(2)对权利要求1所述的KASP标记进行PCR扩增和基因分型，当检测KASP标记为KASP-Chr9_205233550-T/A时，若检测基因型为T:T，则光反应周期短，若为A:A，则光反应周期长，若为A:T，则光反应周期大概率长，需结合田间表型进一步确定；当检测KASP标记为KASP-Chr10_20239079-A/G时，若检测基因型为A:A，则光反应周期短；若检测基因型为G:G或G:A，光反应周期大概率长，可结合田间表型进一步确认；当检测KASP标记为KASP-Chr9_205233550-T/A和KASP-Chr10_20239079-A/G时，若检测基因型为T:T-A:A，则光反应周期短；若检测基因型为A:A-G:G或A:A-G:A或A:T-G:G或A:T-G:A，则光反应周期长；若为其它基因型可结合田间观察进一步确认。
10.根据权利要求9所述的早期鉴定菊花光反应周期的方法，其特征在于，步骤(2)中用于扩增KASP标记KASP-Chr9_205233550-T/A的扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的两条竞争性前引物、和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的通用后引物；用于扩增KASP标记KASP-Chr10_20239079-A/G的扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示的两条竞争性前引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的通用后引物。
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