CN115029451B - 一种绵羊液相芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绵羊液相芯片及其应用，本发明发现及筛选出可用于芯片设计的935个SNP位点，利用设计的液相芯片可以通过靶向捕获测序技术实现绵羊基因分型。实验结果表明，本发明设计的芯片可用于绵羊遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定、全基因组关联分析以及基因组选择育种。

Description

一种绵羊液相芯片及其应用

技术领域

本发明涉及全基因组基因芯片领域，具体涉及一种绵羊液相芯片及其应用。

背景技术

分子标记技术(MolecularMarkerTechnology)是分子育种中的重要工具。传统分子标记，例如限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)和简单序列重复(SimpleSequenceRepeat，SSR)在遗传育种领域中发挥着重要作用。但是，也存在一定局限性，例如在基因组分布数量少，以及操作过程繁琐、通量低，导致无法满足大规模商业化育种应用的需求。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)指基因组单个核苷酸的变异，包括单个碱基对的转换、颠换、***或缺失。SNP作为基因组中分布更为广泛的遗传标记，具有密度高、遗传稳定性高和易于自动化分析等特点，已发展成为动物遗传变异研究中较为常见的分子标记。

目前，用于SNP位点分型的基因芯片技术中，传统的固相芯片基于探针与DNA序列的互补杂交，通过标记物的荧光显色信号进行分型。液相芯片基于重测序技术，对每个目标位点进行专一性捕获，并进行高深度的重测序，具有检测准确性高、通量大的优点。液相芯片一般包括根据DNA互补原理，为每个待测位点设计的一条生物素(Biotin)标记、覆盖目标SNP的探针，这些探针在液态中与基因组目标区域杂交形成双链，可以利用链霉亲和素包衣的磁珠与带有生物素的分子的吸附作用，经洗脱、扩增、建库之后进行二代测序，最终还原目标位点及其周围SNP的基因型状态。液相芯片目前在物种进化分析、种质资源评价与DNA指纹鉴定、分子遗传图谱构建、基因/QTL定位和基因克隆、分子标记辅助选择、全基因组选择等方面已经有着较为成熟的应用(徐云碧,杨泉女,郑洪建,等.靶向测序基因型检测(GBTS)技术及其应用.中国农业科学,2020,53(15):2983-3004.)。

目前，牛90K芯片(IAMARTINO D,NICOLAZZI E L,VAN TASSELL C P,et al.Designand validation of a 90K SNP genotyping assay for the water buffalo(Bubalusbubalis).PLoS One,2017,12(10):e0185220.)、绵羊Illumina 50K芯片(BOLORMAAS,GOREK,VAN DER WERF J H,et al.Design of a low-density SNP chip for the mainAustralian sheep breeds and its effect on imputation and genomic predictionaccuracy.Anim Genet,2015,46(5):544-56.)、山羊Illumina 50K芯片(LIU Z,TOSSER-KLOPP G,BARDOU P,et al.Design and Characterization of a 52K SNP Chip forGoats.PLoS ONE,2014,9(1))、猪高密度芯片(RAMOS AM,CROOIJMANS R P,AFFARAN A,etal.Design of a high density SNP genotyping assay in the pig using SNPsidentified and characterized by next generation sequencing technology.PLoSOne,2009,4(8):e6524.)、鸡600K Affymetrix高密度芯片(KRANIS A,GHEYAS A A,BOSCHIERO C,et al.Development of a high density 600K SNP genotyping array forchicken.BMC Genomics,2013,14(1):59.)，已经被广泛用于进行大规模商业化育种，具体应用包括种质资源遗传多样性分析、遗传与进化分析、亲缘关系鉴定、全基因组关联分析和基因组选择。

但是现有的固相基因芯片，例如，绵羊Illumina 50K芯片，在检测流程及应用中存在以下问题：首先，绵羊Illumina 50K固相芯片只能对芯片上所包含的SNP位点进行分型，对于这些位点周围的SNP位点则无法分型，固相芯片一经设计，则所能检测到的位点就被固定下来，无法增删，灵活性较差；其次，固相芯片分型成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵羊液相芯片及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种绵羊全基因组芯片，该芯片的基因分型对象包括935个SNP位点：1)定位于绵羊参考基因组Oar4.0上的SNP位点为903个(具体由886个新发现的SNP位点和17个已知的SNP位点组成)，可提供进行国内外各个绵羊品种性状相关基因的定位、遗传多样性分析、全基因组关联分析、基因组选择，以及品种鉴定、亲缘关系鉴定、种质资源改良与保护的SNP分子标记组合；2)定位于绵羊Y染色体(NCBI登录号：CM022046.1)上的SNP位点26个，使得芯片能够对待测样本的性别进行判定，或对性别进行二次确认；3)定位于羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)基因组(NCBI登录号分别为：CP044341.1、CP044342.1、CP044343.1)上的SNP位点6个，使得芯片可同时对绵羊进行疾病诊断。上述935个SNP位点在基因组上的坐标如表4所示。

优选的，所述芯片为液相芯片。

优选的，所述分子标记与绵羊主要经济性状相关联，所述经济性状涉及繁殖、生长、免疫、脂肪沉积、产奶、胸椎数、尾型、尾长、尾脂、角型、羊毛类型等。

优选的，所述分子标记的检测检测方法为基于液相芯片的SNP位点分型方法，例如，靶向捕获测序技术。

本发明的有益效果体现在：

本发明从大规模测序数据中挖掘绵羊关键功能位点及品种特异位点，发现及筛选出可用于芯片设计的935个SNP位点，且其中有886个为新发现的SNP位点，利用设计的芯片可以实现基因分型，在绵羊育种中的多个领域均具有较高的应用价值。

进一步的，本发明所涉及的绵羊液相芯片(下文称为绵羊1K液相芯片)基于靶向捕获测序技术，不仅可以对目标位点进行分型，同时目标位点周围一定范围内的SNP也可以被准确分型，因此可以得到比标记位点更多的SNP分型信息。与传统固相芯片相比，灵活性较高，可以根据应用需要随时添加标记位点；同时，液相芯片依托二代测序平台，分型成本较低，为大规模分型提供技术手段。

附图说明

图1为实施例中的绵羊1K液相芯片935个SNP位点在全基因组上的分布情况(基因组上每1M的窗口内所包含SNP的个数)。

图2为绵羊尾长性状全基因组关联分析的曼哈顿图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的保护范围的限制。

(一)绵羊1K液相芯片的设计和制备

本发明利用全世界64个品种共551只绵羊(表1)及36只绵羊野生近缘种(野绵羊；表2)的重测序数据(其中涉及中国羊434只)，首先进行了SNP分析，对位点进行过滤后共获得99406384个SNP位点用于后续的筛选。

表1.所用绵羊品种列表

表2.所用野绵羊样本列表

本发明筛选的目标SNP位点包括以下几类：中国羊受选择区域SNP、欧洲羊受选择区域SNP、湖羊受选择区域SNP、绵羊驯化相关区域SNP、绵羊品种特异SNP、重要功能基因相关位点、绵羊Y染色体SNP位点、羊布鲁氏杆菌基因组上保守位点。这几类位点的具体筛选过程如下：

1.中国羊受选择区域、欧洲羊受选择区域、湖羊受选择区域的筛选：在全基因组范围内以50K的窗口、25K的步长分别计算中国羊和野羊之间、欧洲羊和野羊之间、湖羊和蒙古羊之间的群体固定指数(Fst)和核酸多样度(θ_π)比值，将全基因组范围内Fst和θ_π比值最高的前1％的窗口取交集，分别作为中国羊受选择、欧洲羊受选择、湖羊受选择区域。

2.绵羊驯化相关区域、绵羊品种间特异区域的筛选：将文献中所报道的绵羊与野羊固定指数(Fst)和核酸多样度(θ_π)比值高的区域，以及驯化相关区域各个绵羊品种Fst和θ_π比值高的区域(LI X,YANG J,SHEN M,et al.Whole-genome resequencing of wildanddomestic sheep identifies genes associated with morphological and agronomictraits.NatCommun,2020,11(1):2815.)分别作为绵羊驯化相关区域和绵羊品种间特异区域。

3.合并区间：将上述筛选出的受选择区域采用bedtools软件进行合并，取出所有区间的并集。

4.各个区域SNP位点的筛选：对于每个受选择区域内的SNP使用PLINK软件进行以下过滤(上一步合并区间是指把来源不同的区间取并集，即只是把少数有重叠的区间合并为一个大区间，多数的原本没有重叠区间保持不变)：保留最小等位基因频率大于0.1(--maf 0.1)，位点缺失率小于0.1(--geno 0.1)，哈代温伯格平衡检验P值大于0.001(--hwe0.001)的位点；最后利用Haploview软件计算该区域的连锁情况，将每个区域中最长的连锁块当中的标签SNP(tagSNP)作为该区域的候选位点。

5.重要功能位点的确定：对于文献中已报道的与绵羊繁殖、生长、免疫、脂肪沉积、产奶、胸椎数、尾型、尾脂、角型、羊毛类型等经济性状相关的重要功能基因，在这些基因的每个外显子上至少筛选一个候选SNP位点(表3)。

表3.重要功能基因及位点数目

6.绵羊Y染色***点的筛选：本发明包括了最近发布的绵羊Y染色体(LI R,YANGP,LI M,et al.A Hu sheep genome with the first ovine Y chromosome revealintrogression history after sheep domestication.Science China Life Sciences,2020.)上的26个SNP位点，对于这类位点，直接将其添加到候选SNP列当中。

7.羊布鲁氏杆菌基因组位点的确定：从有关专利(例如，中国专利201210190050.1)中获取羊布鲁氏杆菌VirB12基因的序列，在NCBI上(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)以nt/nr库作为目标数据库进行blast，在结果中选取羊布鲁氏杆菌的两个株系(Brucella melitensis str.M1981,Brucella melitensisstr.RM57)上的6个位点作为候选位点。

将上述所有候选位点去除重复位点，提交给石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行评估，去除在基因组上无法唯一比对的位点、去除侧翼序列中包含重复序列的位点后，再次对位点相邻间距进行评估，去除相邻位点间距小于100bp的位点，最后共获得了在绵羊基因组以及羊布鲁氏杆菌基因组上均匀分布的935个SNP位点(图1)，这些SNP位点在绵羊基因组Oar4.0版本上的坐标如表4所示。

表4.SNP位点的ID(NO.001～NO.935)及基因组位置(POSITION)

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注：突变类型格式为参考型等位基因/突变型等位基因，其中“-”指该位置发生了碱基缺失突变。

根据上述935个SNP位点的位置，在参考基因组上前后各延伸60bp，将包括目标位点在内一共121bp的碱基的反向互补序列作为该位点的探针序列。例如，对于表格中位于1号染色体上3437534bp处的第一个位点，根据NCBI数据库可以查询到该位点在绵羊Oar4.0版本的基因组上前后各延伸60bp(即1号染色体3437474bp到3437594bp)的序列为TCACACCAGCAAGTGTTCAATCACAGCTTCCCGGTGAACTTGCCAAGTGAAACTGACTGG[A/G]AAATGTGCCCCCAACAATGAACACACTGCTCTTGTTCTGGCTGCAGAGAATGTCTGCCAA，其中[A/G]为目标位点的两种等位基因，其反向互补序列为TTGGCAGACATTCTCTGCAGCCAGAACAAGAGCAGTGTGTTCATTGTTGGGGGCACATTT[T/C]CCAGTCAGTTTCACTTGGCAAGTTCACCGGGAAGCTGTGATTGAACACTTGCTGGTGTGA，将上述序列作为该位点的探针序列。其余位点的探针序列采用同样的方式确定后，通过石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行探针合成，从而得到绵羊1K液相芯片。

(二)利用绵羊1K液相芯片对绵羊DNA样品进行基因分型的流程

绵羊基因组DNA的提取：从绵羊颈静脉采血，使用酚氯仿法或血液基因组提取试剂盒(天根生物科技有限公司，北京)进行DNA的提取。

DNA样品质量检测：用质量分数为1％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像***(GelDocXRSystem，美国Bio-Rad公司)判断电泳结果，保证基因组完整性；用微量紫外分光光度计(Q5000，美国Quawell公司)或类似的核酸蛋白测定仪测量基因组DNA的浓度，将DNA浓度调整到工作浓度10～50ng/μL。

绵羊液相芯片检测：按照液相芯片检测标准流程操作(http://www.molbreeding.com/index.php/Technology/GenoBaits.html)。

数据分析：获得的原始数据采用fastp软件(CHEN S,ZHOU Y,CHEN Y,etal.fastp:an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.Bioinformatics,2018,34(17):i884-i90.)进行质控，之后用bwa软件(LI H.Aligning sequence reads,clonesequences and assembly contigs with BWA-MEM.arXiv preprint arXiv:13033997,2013.)将测序数据比对到绵羊参考基因组Oar4.0(International Sheep GenomicsConsortium,Archibald A L,Cockett N E,et al.The sheep genome referencesequence:a work in progress.Animal genetics,2010,41(5):449-453.)及绵羊Y染色体(NCBI登录号:CM022046.1)和羊布鲁氏杆菌基因组(NCBI登录号分别为：CP044341.1、CP044342.1、CP044343.1)上，采用GATK软件(VAN DER AUWERA G A,CARNEIRO M O,HARTLC,et al.From FastQ data to high-confidence variant calls:the genome analysistoolkit best practices pipeline.Current protocols in bioinformatics,2013,43(1):11.0.1-.0.33.)的标准流程检测SNP，进行基因分型。

(三)绵羊1K液相芯片在绵羊全基因组关联分析中的应用

采集323只拥有尾巴长度(尾长)表型记录的湖羊和东佛里生绵羊杂交F2代(东湖羊)的血液样本(于2020年10月在甘肃省金昌市元生农牧科技有限公司奶绵羊基地采集)，并采用绵羊1K液相芯片进行基因分型(具体的分型方法参考以上第二部分)。对获得的基因分型结果进行质量控制，去除最小等位基因频率小于0.05、基因型缺失率大于0.1、以及样本缺失率大于0.1的个体，最终得到3160个SNP标记，以及317个个体。随后，用筛选得到的SNP位点与采集的东湖羊尾长性状数据进行全基因组关联分析，采用PLINK软件的线性回归模型进行分析，最终与东湖羊尾长性状显著相关的标记位点为包括NO.504、NO.511、NO.526、NO.527在内的4个标记位点及其周围SNP位点，分别对应绵羊参考基因组Oar4.0上包括11:26376293、11:27804260、11:42057024、11:42449398在内的4个位置及其周围区域(图2)，经过注释，鉴定到了ALOX12、HSD17B1、RPL27等基因。ALOX基因多态性与骨质疏松症相关，HSD17B1基因与绵羊胎盘激素含量相关，影响胎儿发育，推测上述两个基因可能与绵羊尾椎骨的生长发育相关，具体调控通路仍需更多的实验证明。上述结果表明，即使采用标记位点不足1K的极低密度的液相芯片，在已经设计的芯片(935个SNP)基础上，结合靶向捕获测序(无需进行填充就可以获得比标记位点更多的SNP)，能够进行更准确的全基因组关联分析。相比于绵羊Illumina 50K固相芯片，可以以更低的成本开展绵羊育种工作。

(四)绵羊1K液相芯片在品种鉴定中的应用

为鉴定待测样本是否为湖羊，分别采集待测绵羊以及包括5只湖羊、5只小尾寒羊、5只乌珠穆沁羊、5只滩羊在内的样本血液，并采用绵羊1K液相芯片进行基因分型(具体的分型方法参见以上第二部分)。之后将基因分型得到的SNP集合分别进行主成分分析和***发育树的构建，若待测样本在主成分分析结果中与湖羊聚在一起，且***发育树中与湖羊聚为一个支系，则判定待测样本为湖羊，反之则为非湖羊品种。

(五)绵羊1K液相芯片在性别鉴定中的应用

对未知性别的绵羊采集血样并采用绵羊1K液相芯片进行基因分型(具体的分型方法参见以上第二部分)，分别统计常染色***点和26个Y染色体上位点的平均测序深度。若Y染色体平均测序深度大于常染色***点测序深度的1/10，则判定该样本为公羊；若Y染色体平均测序深度小于常染色***点测序深度的1/10(理论上应该为0×，这里设置较为宽泛的阈值以排除由于比对错误可能产生的误判)，则判定该样本为母羊。

(六)绵羊1K液相芯片的优点

(1)相对于传统的固相芯片，本发明与具有相同数目探针的固相芯片相比，可以检测出更多的SNP位点(4～6K)。并且设计灵活，后期可随时添加感兴趣的标记位点。

(2)相比于全基因组重测序，本发明有明显的价格优势，可以进行绵羊的大规模分型，进而促进绵羊的育种工作。

(3)本发明包含了大量绵羊功能基因相关位点，筛选了已有研究中与繁殖、生长、免疫、脂肪沉积、产奶、胸椎数、尾型、尾脂、角型、羊毛类型等性状显著相关的位点，增加了芯片进行基础研究的准确性。

(4)本发明用于设计芯片的样本来源于全世界各地64个品种共551只绵羊及36只绵羊野生近缘种(野绵羊)，来源广泛、代表性强；并且其中包含了中国羊434只，即具有更多中国地方绵羊品种特有的中高频SNP位点，更适合用于地方绵羊品种的研究，有利于绵羊育种工作的开展以及对绵羊种质资源的研究与保护。

Claims (6)

1.一种绵羊全基因组液相芯片，其特征在于：该芯片的基因分型对象包括定位于绵羊参考基因组Oar4.0和羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)基因组上的935个SNP位点，这些SNP位点在绵羊参考基因组和羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)基因组上的位置及突变类型如NO.001至NO.935项所示：

根据上述935个SNP位点的位置，在参考基因组上前后各延伸60bp，将包括目标位点在内一共121bp的碱基的反向互补序列作为该位点的探针序列。

2.如权利要求1所述的绵羊全基因组液相芯片在绵羊育种中的应用。

3.如权利要求1所述的绵羊全基因组液相芯片在绵羊基因组选择、绵羊性状相关基因的定位、绵羊遗传多样性分析、绵羊全基因组关联分析、绵羊品种鉴定、绵羊亲缘关系鉴定或绵羊种质资源改良与保护中的应用。

4.一种绵羊基因组分子标记及其检测方法在绵羊育种中的应用，其特征在于：该分子标记定位于绵羊参考基因组Oar4.0和羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)基因组上的935个SNP位点中的一个或多个，所述935个SNP位点在绵羊参考基因组和羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)基因组上的位置及突变类型如NO.001至NO.935项所示：

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5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述检测方法为基于液相芯片的SNP位点分型方法。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述SNP位点中，与东湖羊尾长性状显著相关的分子标记位点包括11:26376293、11:27804260、11:42057024、11:42449398。