CN111996276B - 鉴定寒富苹果杂种后代抗寒性的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定‘寒富’苹果杂种后代抗寒性的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，SEQ ID NO.1序列第140位碱基处存在一个A/C颠换类型单核苷酸多态性变异，为140A或140C。本发明还公开了用于检测SNP标记的引物对及SNP标记在鉴定‘寒富’苹果杂种后代抗寒性苹果品种中的应用方法,可用于筛选‘寒富’苹果的抗寒后代,提高选种效率和准确性。

Description

鉴定寒富苹果杂种后代抗寒性的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及苹果育种技术领域,具体涉及一种与‘寒富’苹果杂交后代抗寒性状相关的SNP分子标记、检测方法及应用。
背景技术
我国北纬40度以北广大冷凉地区受低温限制，历来是优质大苹果生产的禁区，富士系、元帅系等许多优质大苹果品种不能正常越冬，无法实现正常生产。
我国自主选育的抗寒性苹果品种‘寒富’，因其兼具自花结实、优质、丰产等性状，是能良好适应“三北”地区低温环境的优质品种，已被多家单位用作抗寒性育种的核心亲本，开展多年苹果抗寒性品种选育工作，并已育成一些抗寒苹果品种。
但目前苹果育种仍以常规杂交的方式为主，由于苹果实生苗童期较长,通过常规杂交选育品种通常需要15年以上，周期长、效率低，苹果抗寒性的评价往往也要对盛果期大树连年观察检测才能明确。而分子标记的开发应用，尤其是针对‘寒富’后代的抗寒性分子标记，使得杂交后代幼苗期即可完成抗寒性状的快速准确筛选，是缩短苹果抗寒性育种年限、精简育种成本、提高育种效率的有效途径。因此，‘寒富’苹果杂种后代抗寒性分子标记是快速育成抗寒、优质品种亟待突破的技术壁垒，对改善冷凉地区种植结构、助力乡村振兴战略实施、改善生态效益具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是利用SNP分子标记易检测、成本低的优点,提供一个用于鉴别‘寒富’苹果杂种后代抗寒性状的SNP分子标记 HF13247081,并提供用于鉴别此标记的引物及应用方法,以解决鉴定‘寒富’苹果杂种后代抗寒性状标记的匮乏问题。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一方面,本发明提供了一种‘寒富’苹果杂种后代抗寒性状相关的SNP分子标记,所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；其中，SEQ ID NO.1序列第140位碱基处存在一个A/C颠换类型单核苷酸多态性变异，为140A或140C。
另一方面,本发明提供了一种用于检测上述SNP分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如正向引物F和反向引物R所示：
所述正向引物F:5'TTTTGTCCCACCCGCTCAT 3'
所述反向引物R:5'CCGCCCAGTTTACTCCACC 3'。
再一方面，本发明提供了上述SNP分子标记及上述引物对筛选‘寒富’苹果抗寒性杂种后代中的应用。
又一方面，本发明提供了一种鉴定‘寒富’苹果杂种后代抗寒性的方法，通过检测待测苹果上述SNP分子标记基因型以鉴定所测苹果的抗寒性高低。
作为优选，所述鉴定‘寒富’苹果杂种后代抗寒性的方法具体包括：
步骤(1):提取待测苹果的基因组DNA；
步骤(2):利上述引物对,以待测苹果的DNA为模板，进行PCR 扩增，获得PCR扩增产物后进行凝胶电泳；
步骤(3):对所述凝胶电泳结果中的目的条带进行切胶测序以获得测序结果；
步骤(4):对比所述测序结果与上述的SNP分子标记，判断待测苹果的抗寒性高低。
抗寒性高低与基因型关系如下：CA基因型＞CC基因型。
本发明的有益效果：根据本发明的实施例，抗寒性较强的‘寒富’苹果杂种后代在本发明所述的SNP分子标记处基因型为[CA]，抗寒性较弱的‘寒富’苹果杂种后代在本发明所述的SNP分子标记处基因型为[CC]。因此，本发明的SNP分子标记能够有效鉴定‘寒富’苹果杂种后代的抗寒性状，进而能够在苗期快速且高效的辅助选育抗寒性较高的‘寒富’苹果杂种后代。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为本发明实施例提供的‘寒富’苹果ב岳帅’苹果杂种后代的半致死温度分布频率直方图；其中，半致死温度即代表杂种后代的抗寒性状表型。
图2为本发明实施例提供的SNP分子标记HF13247081的测序结果；其中，[CA]基因型为抗寒性较高的‘寒富’苹果杂种后代，[CC] 基因型为抗寒性较低的杂种后代。
具体实施方式
以下结合实施例和附图1-2，对本发明的具体实施方式进行详细描述，实施例用来说明本发明的具体内容，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
(1)实验植物
‘寒富’苹果ב岳帅’苹果的杂交后代14-61，栽种于辽宁省果树科学研究所。
(2)测量半致死温度
2019年12月采集当年生枝条，采用梯度低温处理后测量枝条电导率，利用logistic回归分析预测半致死温度为-47.94℃。
(3)目的片段的扩增、测序及分析
2020年5月采集新鲜叶片，根据所述方法进行检测：利用14-61 的新鲜叶片提取基因组DNA，稀释浓度至300-400ng/μL,吸取1μL 做模板；加入1μL所述正向引物F及1μL所述反向引物R；加入 mix和水进行PCR扩增，获得PCR扩增产物后进行凝胶电泳。
电泳结果只有一条长约300bp的亮带为目的条带，将此亮带切胶送测序以获得测序结果。
查看测序结果，发现所述SNP分子标记HF13247081基因型为 [CA]，属于抗寒性较高的‘寒富’苹果杂种后代。截至2020年8月，向北最远可在辽宁省沈阳市康平县(北纬42°31′-43°02′,2019年1月平均气温-9.1℃,2019年1月最低气温-24.5℃,2020年1月平均气温-12.9℃,2020年1月最低气温-24.7℃)正常生长。
实施例2
(1)实验植物
‘寒富’苹果ב岳帅’苹果的杂交后代17-67，栽种于辽宁省果树科学研究所。
(2)测量半致死温度
2019年12月采集当年生枝条，采用梯度低温处理后测量枝条电导率，利用logistic回归分析预测半致死温度为-31.76℃。
(3)目的片段的扩增、测序及分析
2020年5月采集新鲜叶片，根据所述方法进行检测：利用17-67 的新鲜叶片提取基因组DNA，稀释浓度至300-400ng/μL,吸取1μL 做模板；加入1μL所述正向引物F及1μL所述反向引物R；加入 mix和水进行PCR扩增，获得PCR扩增产物后进行凝胶电泳。
电泳结果只有一条长约300bp的亮带为目的条带，将此亮带切胶送测序以获得测序结果。
查看测序结果，发现所述SNP分子标记HF13247081基因型为 [CC]，属于抗寒性较低的‘寒富’苹果杂种后代。截至2020年8月，可在辽宁省营口市熊岳镇(北纬40°18′-40°27′,2019年1月平均气温 -5.3℃，2019年1月最低气温-18.1℃,2020年1月平均气温-5.4℃， 2020年1月最低气温-17.3℃)正常生长。
实施例3
(1)实验植物
‘寒富’苹果ב望香红’苹果的杂交后代29-37，栽种于辽宁省果树科学研究所。
(2)目的片段的扩增、测序及分析
2019年10月采集新鲜叶片，根据所述方法进行检测：利用29-37 的新鲜叶片提取基因组DNA，稀释浓度至300-400ng/μL,吸取1μL 做模板；加入1μL所述正向引物F及1μL所述反向引物R；加入 mix和水进行PCR扩增，获得PCR扩增产物后进行凝胶电泳。
电泳结果只有一条长约300bp的亮带为目的条带，将此亮带切胶送测序以获得测序结果。
查看测序结果，发现所述SNP分子标记HF13247081基因型为 [CA]，属于抗寒性较高的‘寒富’苹果杂种后代。截至2020年8月，向北最远可在辽宁省沈阳市康平县(北纬42°31′-43°02′,2019年1月平均气温-9.1℃,2019年1月最低气温-24.5℃,2020年1月平均气温-12.9℃,2020年1月最低气温-24.7℃)正常生长。
实施例4
(1)实验植物
‘寒富’苹果ב望香红’苹果的杂交后代24-99，栽种于辽宁省果树科学研究所。
(2)目的片段的扩增、测序及分析
2019年10月采集新鲜叶片，根据所述方法进行检测：利用24-99 的新鲜叶片提取基因组DNA，稀释浓度至300-400ng/μL,吸取1μL 做模板；加入1μL所述正向引物F及1μL所述反向引物R；加入 mix和水进行PCR扩增，获得PCR扩增产物后进行凝胶电泳。
电泳结果只有一条长约300bp的亮带为目的条带，将此亮带切胶送测序以获得测序结果。
查看测序结果，发现所述SNP分子标记HF13247081基因型为 [CC]，属于抗寒性较低的‘寒富’苹果杂种后代。截至2020年8月，可在辽宁省营口市熊岳镇(北纬40°18′-40°27′,2019年1月平均气温 -5.3℃，2019年1月最低气温-18.1℃,2020年1月平均气温-5.4℃， 2020年1月最低气温-17.3℃)正常生长；在沈阳市康平县(北纬42°31′ -43°02′,2019年1月平均气温-9.1℃,2019年1月最低气温-24.5℃, 2020年1月平均气温-12.9℃,2020年1月最低气温-24.7℃)栽种植株已死亡。
实施例5
(1)实验植物
‘62-45’苹果ב寒富’苹果的杂交后代18-23-40，栽种于辽宁省果树科学研究所。
(2)目的片段的扩增、测序及分析
2019年10月采集新鲜叶片，根据所述方法进行检测：利用 18-23-40的新鲜叶片提取基因组DNA，稀释浓度至300-400ng/μL, 吸取1μL做模板；加入1μL所述正向引物F及1μL所述反向引物 R；加入mix和水进行PCR扩增，获得PCR扩增产物后进行凝胶电泳。
电泳结果只有一条长约300bp的亮带为目的条带，将此亮带切胶送测序以获得测序结果。
查看测序结果，发现所述SNP分子标记HF13247081基因型为 [CA]，属于抗寒性较高的‘寒富’苹果杂种后代。截至2020年8月，向北最远可在辽宁省沈阳市康平县(北纬42°31′-43°02′,2019年1月平均气温-9.1℃,2019年1月最低气温-24.5℃,2020年1月平均气温-12.9℃,2020年1月最低气温-24.7℃)正常生长。
实施例6
(1)实验植物
‘62-45’苹果ב寒富’苹果的杂交后代18-23-11，栽种于辽宁省果树科学研究所。
(2)目的片段的扩增、测序及分析
2019年10月采集新鲜叶片，根据所述方法进行检测：利用 18-23-11的新鲜叶片提取基因组DNA，稀释浓度至300-400ng/μL, 吸取1μL做模板；加入1μL所述正向引物F及1μL所述反向引物 R；加入mix和水进行PCR扩增，获得PCR扩增产物后进行凝胶电泳。
电泳结果只有一条长约300bp的亮带为目的条带，将此亮带切胶送测序以获得测序结果。
查看测序结果，发现所述SNP分子标记HF13247081基因型为 [CC]，属于抗寒性较低的‘寒富’苹果杂种后代。截至2020年8月，可在辽宁省营口市熊岳镇(北纬40°18′-40°27′,2019年1月平均气温 -5.3℃，2019年1月最低气温-18.1℃,2020年1月平均气温-5.4℃， 2020年1月最低气温-17.3℃)正常生长。在沈阳市康平县(北纬42°31′ -43°02′,2019年1月平均气温-9.1℃,2019年1月最低气温-24.5℃, 2020年1月平均气温-12.9℃,2020年1月最低气温-24.7℃)栽种植株已死亡。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易做到的变化和替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 鉴定寒富苹果杂种后代抗寒性的SNP分子标记及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 337
<212> DNA
<213> 苹果(Malus domestica）
<220>
<221> misc_feature
<222> (140)..(140)
<223> n为a或c
<400> 1
ttttgtccca cccgctcata gttggtctca ctcaacgttt ttatgtcata tgtagatttt 60
cacacaaaag tgcttcttcc taatgtggag ataaattttg ctttcaaaaa aatcttgtca 120
attcttgcta atctcttctn aatattggaa tagatttgta acaaaatttg aaattttact 180
aatccacgtg ttatgataaa aattaacaac acaattaata tttatgaatc taaagtaatt 240
gggggctaac atatacttgg gggcgtttgg cccatatctc atcaaagaat tttgggcctt 300
tcagcaacca aataatatgg tggagtaaac tgggcgg 337

Claims (3)

1.一种用于鉴定寒富苹果杂种后代抗寒性的SNP分子标记在筛选寒富苹果抗寒性杂种后代中的应用,其特征在于,所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，SEQID NO.1序列第140位碱基处存在一个A/C颠换类型单核苷酸多态性变异，为140A或140C。
2.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的引物对在筛选寒富苹果抗寒性杂种后代中的应用,其特征在于,所述引物包括正向引物F和反向引物R；
正向引物F:5'TTTTGTCCCACCCGCTCAT 3'
反向引物R:5'CCGCCCAGTTTACTCCACC 3'。
3.一种鉴定寒富苹果杂种后代抗寒性的方法,其特征在于,包含如下步骤:
步骤(1):提取待测苹果的基因组DNA；
步骤(2):利用权利要求2所述的引物对,以待测苹果的DNA为模板,进行PCR扩增,获得PCR扩增产物后进行凝胶电泳；
步骤(3):对所述凝胶电泳结果中的目的条带进行切胶测序以获得测序结果；
步骤(4):对比所述测序结果与权利要求1所述的SNP分子标记,判断待测苹果的抗寒性高低；
抗寒性高低与基因型关系如下：CA基因型＞CC基因型。
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Denomination of invention: SNP molecular markers for identifying cold resistance in offspring of Hanfu apple hybrids and their applications

Granted publication date: 20210323

License type: Exclusive License

Record date: 20230407

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