CN101225429A - 解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒及其应用方法，所述的试剂盒包括药敏和定量测试板条、液相培养基、固相培养基，所述的液相、固相培养基均为偏酸性，其pH值为6.0左右。与现有技术相比，本发明在分离培养、鉴定、相对定量和药敏实验方面具有操作简便、方法可靠、质量稳定、结果易于观察和判断等优点，同时，本发明的特异性和灵敏度好，液固组合培养试剂盒可降低假阳性率5－10％左右、假阴率性2－5％左右，并且基本排除了杂菌污染干扰实验结果的问题，具有重要的实际应用价值和很好的市场前景。

Description

解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒及其应用方法

技术领域

本发明涉及生物医药的试剂盒，尤其是涉及一种解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒及其应用方法。

背景技术

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，目前已分离到的支原体有150多种。与人类疾病有关的支原体主要是解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum，以下简称Uu)、人型支原体(Mycoplasma hominis，以下简称Mh)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)，其中Uu和Mh是国际上公认的引起泌尿生殖道感染的病原体(曹玉璞，叶元康主编，支原体与支原体病，北京：人民卫生出版社，2000，5)。我国的支原体研究，尤其在致病支原体的实验诊断的研究，起步晚、方法落后，又由于支原体培养阳性率低及杂菌污染，易出现假阳性等诸多问题，尚不能广泛用于临床诊断。国外支原体的培养分离有商品化的Difco、Oxoid干燥基础基，以及法国生物梅里埃的成品培养基，国内各实验室用于支原体的分离培养基，有的从国外进口，但价格昂贵；有的自己配制，但质量不稳定，直接影响支原体分离培养的成败(TullyJG，et al.Methods in mycoplasmology，Vol I、II，New York：Academic press，1983；Tully JG，et al.Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmologydiagnostic procedures，Vol I，New York：Academic press，1996)。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种质量稳定、使用方便、检验结果准确的解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒及其应用方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒，包括药敏和定量测试板条、液相培养基、固相培养基，所述的液相、固相培养基均为偏酸性，其pH值为6.0左右。

所述的药敏和定量测试板条附透明封口膜，所述的液相培养基为瓶装液相培养基，所述的固相培养基为板条装固相培养基。

所述的液相、固相培养基的配方包括：基础基600～800体积份，马或牛血清100～300体积份，25％酵母浸液50～150体积份，40％尿素10～20体积份，30％L-精氨酸25～35体积份，0.4％酚红2.5～7.5体积份，10000IU/ml青霉素40～60体积份；所述的固相培养基的配方还包括10～12克琼脂粉/1000ml液相培养基。

所述的基础基的配方为每1000ml基础基含牛心粉45～55g、蛋白胨9～11g、NaCl4.5～5.5g。

所述的药敏和定量测试板条包括C+孔、C-孔、解脲支原体(Uu)孔、人型支原体(Mh)孔、药敏实验孔，所述的C+孔为阳性对照孔，所述的C-孔为阴性对照孔，所述的Uu孔用以指示有无Uu生长及定量，所述的Mh孔用以指示有无Mh生长及定量，所述的药敏实验孔每2个孔一组，每组含一种高剂量和低剂量的抗生素。

所述的抗生素包括强力霉素(Doxycycline)、美满霉素(Minocycline)、交沙霉素(Josamycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、阿奇霉素(Azithromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、林可霉素(Lincomycin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、壮观霉素(Spectinomycin)。

一种解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒的应用方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)取待检标本；

(2)将待检标本接种到液相培养基和固相培养基上；

(3)取解脲支原体、人型支原体标准菌种培养物0.1ml加入药敏和定量测试板条的C+孔，取液相培养基0.1ml加入C-孔，取带有待检标本的液相培养基0.1ml加入Uu孔、Mh孔、药敏实验孔，用透明封口膜密封，将药敏和定量测试板条置于37℃的孵育箱中；

(4)孵育16、24、36、48小时，分别观察与记录结果；

(5)结果分析：

a.若培养基由淡黄色变为红色或***，显微镜下放大40～100倍，能看到棕褐色的解脲支原体菌落和人型支原体的油煎蛋样菌落，说明解脲支原体和人型支原体为阳性，若培养基淡黄色不变，不能看到棕褐色的解脲支原体菌落和人型支原体的油煎蛋样菌落，说明解脲支原体和人型支原体为阴性；

b.Uu孔16小时内变色说明Uu≥10⁵ccu/ml，24小时内变色说明Uu≥10⁴ccu/ml，36小时后变色说明Uu≤10⁴ccu/ml；Mh孔24小时内变色说明Mh≥10⁵ccu/ml，36小时内变色说明Mh≥10⁴ccu/ml，48小时后变色说明Mh≤10⁴ccu/ml；

c.药敏实验孔每组的高剂量、低剂量2个孔均阴性指示解脲支原体和人型支原体对该药敏感，每组的高剂量、低剂量2个孔均阳性指示解脲支原体和人型支原体对该药耐药，每组中高剂量孔阴性、低剂量孔阳性指示解脲支原体和人型支原体对该药中度敏感。

本发明的试剂盒将解脲支原体和人型支原体的分离、定量、鉴定、药敏测定方法融于一体，试剂盒包括液相培养基和固相培养基，并选用抗支原体感染有效的四大类抗菌素进行药敏试验，液相培养用于初步定量和药敏，固相培养用于分离和鉴定，根椐菌落多少和颜色变化时间也可进行初步定量，使用方便。选用的培养基偏酸(pH值为6.0左右)，并含有解脲支原体和人型支原体生长的丰富营养，还含尿素(解脲支原体底物)和精氨酸(人型支原体底物)、酚红指示剂，和抑菌剂(可抑制人体内大多数的细菌)，当解脲支原体或人型支原体在该培养基中生长，就能分解尿素或精氨酸，产铵，使培养基pH值上升(pH值为7.0或8.0以上)，变碱，酚红出现颜色变化，就可指示解脲支原体或人型支原体的生长。

与现有技术相比，本发明在分离培养、鉴定、相对定量和药敏实验方面具有操作简便、方法可靠、质量稳定、结果易于观察和判断等优点，同时，本发明的特异性和灵敏度好，液固组合培养试剂盒可降低假阳性率5-10％左右、假阴率性2-5％左右，并且基本排除了杂菌污染干扰实验结果的问题，具有重要的实际应用价值和很好的市场前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒，包括药敏和定量测试板条、透明封口膜、瓶装液相培养基、板条装固相培养基，所述的培养基为淡黄色、透明、清亮液体或固体，其成份配方如下：

基础基              700ml，

马(或牛)血清        200ml，

25％酵母浸液        100ml，

40％尿素            15ml，

30％L-精氨酸        33ml，

0.4％酚红           5ml，

10000IU/ml青霉素    50ml，

所述的基础基的配方为每1000ml基础基含牛心粉50g、蛋白胨10g、NaCl5g，在1000ml培养基中，调pH至6.0，固相培养基需加10～12g琼脂粉；

所述的药敏和定量测试板条有26个小孔：C+孔是阳性对照孔，C-孔是阴性对照孔，Uu孔指示Uu有无生长，Mh孔指示Mh有无生长，另外22个孔为药敏实验孔，每2个孔一组，每组含一种高剂量和低剂量抗生素(浓度范围如表1所示)做药敏实验用，所述的抗生素包括强力霉素(Doxycycline)、美满霉素(Minocycline)、交沙霉素(Josamycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、阿奇霉素(Azithromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、林可霉素(Lincomycin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、壮观霉素(Spectinomycin)。

表1  药物敏感实验选用的11种抗生素的浓度

抗生素	低浓度	高浓度
			强力霉素(Doxycycline)美满霉素(Minocycline)	4mg/l4mg/l	8mg/l8mg/l

交沙霉素(Josamycin)克拉霉素(Clarithromycin)阿奇霉素(Azithromycin)罗红霉素(Roxithromycin)林可霉素(Lincomycin)诺氟沙星(Norfloxacin)氧氟沙星(Ofloxacin)司帕沙星(Sparfloxacin)壮观霉素(Spectinomycin)

2mg/l1mg/l1mg/l1mg/l1mg/l1mg/l1mg/l1mg/l1mg/l

8mg/l4mg/l4mg/l4mg/l4mg/l4mg/l4mg/l4mg/l4mg/l

实施例2

一种解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒的应用方法，该方法包括以下步骤：

(1)取待检标本：如尿道分泌物用无菌棉签沾取，***用滴管吸取；

(2)将待检标本用常规方法接种到液相培养基和固相培养基上：如液体标本直接加入液相培养基中和涂抹在固相培养基表面；

(3)用滴管吸取解脲支原体、人型支原体标准菌种培养物0.1ml加入药敏和定量测试板条的C+孔，取液相培养基0.1ml加入C-孔，取带有待检标本的液相培养基0.1ml加入Uu孔、Mh孔、药敏实验孔，用透明封口膜密封，将药敏和定量测试板条置于37℃的孵育箱中；

(4)孵育16、24、36、48小时，分别观察与记录结果；

(5)结果分析：

a.若培养基由淡黄色变为红色或***，显微镜下放大40～100倍，能看到棕褐色的解脲支原体菌落和人型支原体的油煎蛋样菌落，说明解脲支原体和人型支原体为阳性，若培养基淡黄色不变，不能看到棕褐色的解脲支原体菌落和人型支原体的油煎蛋样菌落，说明解脲支原体和人型支原体为阴性；

b.Uu孔16小时内变色说明Uu≥10⁵ccu/ml，24小时内变色说明Uu≥10⁴ccu/ml，36小时后变色说明Uu≤10⁴ccu/ml；Mh孔24小时内变色说明Mh≥10⁵ccu/ml，36小时内变色说明Mh≥10⁴ccu/ml，48小时后变色说明Mh≤10⁴ccu/ml；

c.药敏实验孔每组的2个孔均阴性指示解脲支原体和人型支原体对该药敏感，每组的2个孔均阳性指示解脲支原体和人型支原体对该药耐药，每组中高剂量孔阴性、低剂量孔阳性指示解脲支原体和人型支原体对该药中度敏感。

实施例3

一种生长性能试验方法：

菌种：人型支原体(ATCC 23114)37℃24h培养物，

解脲支原体(ATCC 27618)37℃24h培养物，

设备：培养箱(36℃±1℃)，无菌吸管

步骤：(1)取被检培养基，

(2)用无菌吸管各吸取0.1ml人型支原体和解脲支原体上述菌种培养物加入到液体和固体培养基中，然后置培养箱(36℃±1℃)培养，

(3)人型支原体培养48h，解脲支原体培养24h，取出观察结果。

实施例4

用拭子取尿道或生殖道分泌物，接种在液体和固体培养基上，然后置培养箱(36℃±1℃)培养，24、48和72小时分别观察结果，根据培养基的颜色变化和菌落判定有无人型支原体和解脲支原体生长。

实施例5

一种解脲和人型支原体检测液固组合培养试剂盒，包括药敏和定量测试板条、透明封口膜、瓶装液相培养基、板条装固相培养基，所述的培养基为淡黄色、透明、清亮液体或固体，其成份配方如下：

基础基              600ml，

马(或牛)血清        300ml，

25％酵母浸液        50ml，

40％尿素            10ml，

30％L-精氨酸        25ml，

0.4％酚红           2.5ml，

10000IU/ml青霉素    40ml，

所述的基础基的配方为每1000ml基础基含牛心粉45g、蛋白胨9g、NaCl4.5g，在1000ml培养基中，调pH至6.0，固相培养基需加10～12g琼脂粉；

所述的药敏和定量测试板条有26个小孔：C+孔是阳性对照孔，C-孔是阴性对照孔，Uu孔指示Uu有无生长，Mh孔指示Mh有无生长，另外22个孔为药敏实验孔，每2个孔一组，每组含一种高剂量和低剂量抗生素(浓度范围如表1所示)做药敏实验用，所述的抗生素包括强力霉素(Doxycycline)、美满霉素(Minocycline)、交沙霉素(Josamycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、阿奇霉素(Azithromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、林可霉素(Lincomycin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、壮观霉素(Spectinomycin)。

实施例6

一种解脲和人型支原体检测液固组合培养试剂盒，包括药敏和定量测试板条、透明封口膜、瓶装液相培养基、板条装固相培养基，所述的培养基为淡黄色、透明、清亮液体或固体，其成份配方如下：

基础基              800ml，

马(或牛)血清        100ml，

25％酵母浸液        150ml，

40％尿素            20ml，

30％L-精氨酸        35ml，

0.4％酚红           7.5ml，

10000IU/ml青霉素    60ml，

所述的基础基的配方为每1000ml基础基含牛心粉55g、蛋白胨11g、NaCl5.5g，在1000ml培养基中，调pH至6.0，固相培养基需加10～12g琼脂粉；

所述的药敏和定量测试板条有26个小孔：C+孔是阳性对照孔，C-孔是阴性对照孔，Uu孔指示Uu有无生长，Mh孔指示Mh有无生长，另外22个孔为药敏实验孔，每2个孔一组，每组含一种高剂量和低剂量抗生素(浓度范围如表1所示)做药敏实验用，所述的抗生素包括强力霉素(Doxycycline)、美满霉素(Minocycline)、交沙霉素(Josamycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、阿奇霉素(Azithromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、林可霉素(Lincomycin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、壮观霉素(Spectinomycin)。

Claims (7)

1.解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒，包括药敏和定量测试板条、液相培养基、固相培养基，所述的液相、固相培养基均为偏酸性，其pH值为6.0左右。

2.根据权利要求1所述的解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒，其特征在于，所述的药敏和定量测试板条附透明封口膜，所述的液相培养基为瓶装液相培养基，所述的固相培养基为板条装固相培养基。

3.根据权利要求1所述的解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒，其特征在于，所述的液相、固相培养基的配方包括：基础基600～800体积份，马或牛血清100～300体积份，25％酵母浸液50～150体积份，40％尿素10～20体积份，30％L-精氨酸25～35体积份，0.4％酚红2.5～7.5体积份，10000IU/ml青霉素40～60体积份；所述的固相培养基的配方还包括10～12克琼脂粉/1000ml液相培养基。

4.根据权利要求3所述的解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒，其特征在于，所述的基础基的配方为每1000ml基础基含牛心粉45～55g、蛋白胨9～11g、NaCl4.5～5.5g。

5.根据权利要求1所述的解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒，其特征在于，所述的药敏和定量测试板条包括C+孔、C-孔、解脲支原体(Uu)孔、人型支原体(Mh)孔、药敏实验孔，所述的C+孔为阳性对照孔，所述的C-孔为阴性对照孔，所述的Uu孔用以指示有无Uu生长及定量，所述的Mh孔用以指示有无Mh生长及定量，所述的药敏实验孔每2个孔一组，每组含一种高剂量和低剂量的抗生素。

6.根据权利要求5所述的解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒，其特征在于，所述的抗生素包括强力霉素(Doxycycline)、美满霉素(Minocycline)、交沙霉素(Josamycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、阿奇霉素(Azithromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、林可霉素(Lincomycin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、壮观霉素(Spectinomycin)。

7.一种解脲和人型支原体分离培养、鉴定、定量和药敏实验液固组合培养试剂盒的应用方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)取待检标本；

(2)将待检标本接种到液相培养基和固相培养基上；

(3)取解脲支原体、人型支原体标准菌种培养物0.1ml加入药敏和定量测试板条的C+孔，取液相培养基0.1ml加入C-孔，取带有待检标本的液相培养基0.1ml加入Uu孔、Mh孔、药敏实验孔，用透明封口膜密封，将药敏和定量测试板条置于37℃的孵育箱中；

(4)孵育16、24、36、48小时，分别观察与记录结果；

(5)结果分析：

a.若培养基由淡黄色变为红色或***，显微镜下放大40～100倍，能看到棕褐色的解脲支原体菌落和人型支原体的油煎蛋样菌落，说明解脲支原体和人型支原体为阳性，若培养基淡黄色不变，不能看到棕褐色的解脲支原体菌落和人型支原体的油煎蛋样菌落，说明解脲支原体和人型支原体为阴性；

b.Uu孔16小时内变色说明Uu≥10⁵ccu/ml，24小时内变色说明Uu≥10⁴ccu/ml，36小时后变色说明Uu≤10⁴ccu/ml；Mh孔24小时内变色说明Mh≥10⁵ccu/ml，36小时内变色说明Mh≥10⁴ccu/ml，48小时后变色说明Mh≤10⁴ccu/ml；

c.药敏实验孔每组的高剂量、低剂量2个孔均阴性指示解脲支原体和人型支原体对该药敏感，每组的高剂量、低剂量2个孔均阳性指示解脲支原体和人型支原体对该药耐药，每组中高剂量孔阴性、低剂量孔阳性指示解脲支原体和人型支原体对该药中度敏感。