CN107907682A - 用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒。所述试剂盒包括包被有丙氨酸氨肽酶底物的反应试纸垫置、样品稀释液和显色剂，其中所述丙氨酸氨肽酶底物包括L‑丙氨酸‑4‑甲氧基‑β‑萘胺和/或L‑丙氨酸‑4‑硝基苯胺。所述反应试纸垫上还包被有稳定剂和/或表面活性剂。本发明检测试剂盒的制备方法简单，性能稳定，易保存，便于判定***感染的革兰氏菌，是***感染病人诊断、鉴别诊断和疗效评价的辅助指标，同时适用于医院检验科及非专业检验人员使用。

Description

用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒及制备方法
技术领域
本发明属于医学检验测定技术领域，具体地说，涉及一种用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
女性生殖道微生态是生殖健康的第一道生物屏障，是维系生殖健康的主要元素。女性生殖道微生态失衡，既可导致女性生殖道感染和***等妇科疾病，还可造成***不育，早产流产和宫内感染，新生儿感染等重大生殖健康问题。正常女性***内部95％以上为乳酸杆菌，而包含拟杆菌、肠球菌、表皮葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌、大肠杆菌、韦荣球菌、消化链球菌、加德纳菌,以及除了细菌以外的原虫、病毒、支原体和白假丝酵母菌等众多的微生物任何一种微生物(常驻或过路)过度增殖均会造成***微生态的改变，导致***感染。然而临床上却不能及时有效的区分这些感染时的致病菌。
按照传统的方法，细菌通常被革兰氏染色分为两大类——革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。在革兰氏染色实验中，首先添加了结晶紫，再添入另一种复染染料(通常使用番红)，革兰氏阳性菌在反应后的除色溶液中将呈现龙胆紫的颜色，革兰氏阴性菌细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类含量高。当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁通透性增强，使结晶紫极易被乙醇抽出而脱色；再度染上复染液番红的时候，便呈现红色了。尽管革兰氏染色提供了一个非常实用的鉴别微生物的方法，但是这种方式需要多种试剂且操作繁琐。1978年，Cerny,G等人发明了一种L-丙氨酸氨肽酶方法，这一酶主要存在于革兰氏阴性菌的细胞壁上，根据酶底物显色的原理，将革兰氏阳性菌与阴性菌加以区分。可将此酶底物添加于培养基中，底物分解后使菌落着色。James,A等人就采用这种方法，通过合成新的显色底物，将显色底物添加于含凝胶的培养基中，通过目测菌落色泽判断试验菌株为阴性或阳性菌。此种方法由于采用培养方式，需在专用培养上培养24h后目测菌落是否产生色泽进行区分，存在耗时长的问题。Merck等公司研发了商业化试剂盒用以相关的微生物鉴别,但却没有相关产品应用到***微生态检测中。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒及其制备方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒，其包括：
1)包被有丙氨酸氨肽酶底物的反应试纸垫；
2)样品稀释液；
3)显色剂。
本发明所述丙氨酸氨肽酶底物包括L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺和/或L-丙氨酸-4-硝基苯胺，优选L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺。
前述的试剂盒，其中所述反应试纸垫上还包被有稳定剂和/或表面活性剂。
本发明所述稳定剂选自D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖T70、β-环糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、α-乳糖、聚乙二醇、明胶、肌醇、木糖或***糖醇等中的至少一种，优选稳定剂为D-海藻糖和葡聚糖T70。
所述表面活性剂选自吐温80、吐温20、Triton X-100、NP40或山梨醇等中的至少一种，优选表面活性剂为Triton X-100。
稳定剂D-海藻糖和葡聚糖T70的加入能够有效增加底物在试纸垫中的稳定性，保证试剂盒的有效性，防止光、热分解或氧化分解等作用；表面活性剂Triton X-100能够增加底物在试纸垫中的溶解性，使酶显色反应均匀，提高显色辨识度。
前述的试剂盒，所述样品稀释液是由0.9％生理盐水、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES缓冲液组成的pH6.5±0.2的稀释液。前述的试剂盒，所述显色剂选自固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR中的至少一种，优选固蓝B。
本发明用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒，可按照如下方法制备得到：
(1)反应试纸垫的制备：
所述试纸垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；尺寸可为优选
以100-1000mmol/L pH 7.5-9.0的缓冲液为溶剂，配制含有0.001-0.01g/mL丙氨酸氨肽酶底物、0.005％-50％稳定剂和0.005％-50％表面活性剂的底物溶液；
(2)样品稀释液的配制：
所述样品稀释液是由0.9％生理盐水、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES缓冲液组成的pH6.5±0.2的稀释液；(3)显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的显色剂溶液。
前述的方法，步骤(1)所述缓冲液选自磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或PIPES缓冲液等中的至少一种。优选500-1000mmol/LpH8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液。
在本发明的一个具体实施方式中，所述检测试剂盒的制备方法如下：
(1)反应试纸垫由底物溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
以500mmol/L pH 8.7的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制成含有0.005g/mL L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10％D-海藻糖和10％葡聚糖T70的底物溶液；
(2)样品稀释液的配制：配制含有质量百分浓度0.9％NaCl和pH6.5，10mmol/L MES缓冲液的稀释液；
(3)显色剂的制备：固蓝B 1.5g，Triton X-100 2g，PVPK30 4g，蒸馏水1000ml，充分混匀，分装在深色瓶中。
前述的方法，还包括不同浓度的丙氨酸氨基肽酶的配制。
本发明还提供一种非诊断目的利用上述试剂盒检测样品中丙氨酸氨基肽酶的方法。
本发明进一步提供上述试剂盒在检测***分泌物中快速区分革兰氏菌的应用。
分泌物经稀释后滴加到反应试纸垫上，通过酶反应，5-10min后添加显色剂孵育3-5min即可判别。含有L-丙氨酸-4-四甲氧基-β-萘胺盐酸盐的试纸垫，对具有氨基肽酶的革兰氏阴性菌高度敏感，反应后会产生明显颜色变化。其可作为革兰氏阴性菌特异性指标，细菌性***病的诊断指标，亦可在需氧菌性***炎感染时作为主要感染菌鉴别的辅助性指标，是***感染病人的诊断、鉴别诊断和疗效评价的辅助指标。
考虑到试剂盒保存的需要，所制备的反应垫必须具备相当高的稳定性，在大量实验研究的基础上，最终确定了上述底物液的组成及其配方，使得试剂盒具有理想的稳定性，能够在实际应用中推广。
本发明建立了一种简便、快速的检测革兰氏阴性菌的干化学测定试纸垫，包括丙氨酸氨肽酶浓度的检测。
本发明可以配合相关检测来达到***感染性疾病的诊断。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次以L-丙氨酸-4-四甲氧基-β-萘胺盐酸盐为底物区分***分泌物中革兰氏菌的试剂盒，该指标可作为医用实验单独使用，亦可联合临床上其他指标进行联合诊断；通过加入稳定剂、表面活性剂等物质，对试剂进行了最优的配比，在此条件下，有效提高反应的灵敏度和准确性，使液体试剂能够在试纸垫上稳定保存；采用固相风干技术将试剂点印在试纸垫上，制成相应的试剂盒，操作简便快速，准确性高，适用于临床常规检测特别是临床病人床旁检测使用，进而指导合理临床用药。只需将收集的***分泌物进行稀释，加到试纸垫上，反应显色不需大型仪器设备，操作全程只需10min，可在医院急诊室、基层医疗与保健单位及病人家庭使用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒的制备
本实施例提供的用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒包括：①包被有丙氨酸氨肽酶底物的反应试纸垫；②***分泌物稀释液；③显色剂。
所述检测试剂盒的制备方法如下：
(1)反应试纸垫由底物溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
以500mmol/L pH 8.7的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制成含有0.005g/mL L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10％D-海藻糖和10％葡聚糖T70的底物溶液；
(2)稀释液的配制：配制含有质量百分浓度0.9％NaCl和pH6.5，10mmol/L MES缓冲液的稀释液；
(3)显色剂的制备：固蓝B 1.5g，Triton X-100 2g，PVPK30 4g，蒸馏水1000ml，充分混匀，分装在深色瓶中；
(4)丙氨酸氨肽酶标准液的制备：用稀释液配制不同浓度的丙氨酸氨基肽酶溶液，将上述不同色标的标准液滴加到反应试纸垫上进行显色，由3-5个人目测，显色颜色与丙氨酸氨基肽酶的浓度成正比。以此选出标准色，进行印刷，并进行验证，经过反复几次验证，最终确定标准比色板。
实施例2快速区分***分泌物中革兰氏菌的应用
本发明的试纸垫是一种检测***分泌物中丙氨酸氨肽酶的方法，可以对临床上***感染患者分泌物的样本进行检测，也可对健康人群的***分泌物样本进行检测，其可作为革兰氏阴性菌特异性指标，细菌性***病的诊断指标，亦可在需氧菌性***炎感染时作为主要感染菌鉴别的辅助性指标，是***感染病人的诊断、鉴别诊断和疗效评价的辅助指标。
本发明实施例1制备的试纸垫的具体使用方法如下：
1)在使用时，首先将试纸垫从保存温度下取出，平衡到室温开始使用；
2)稀释液处理：用棉签从***后穹窿取分泌物后加入400μl稀释液稀释分泌物；
3)取25μl分泌物稀释液加到试纸垫上；
4)在干浴器(设置温度为45℃)上反应7min后滴加显色液孵育3min，读取显色结果，无色为阴性，红色即为阳性。本领域技术人员应当理解，根据本领域的现有技术，在使用其他保温容器如培养箱、烘箱、水浴容器等的设置温度为35-50℃的条件下反应后，也能够实现结果的对比判断。
本发明的试剂盒性能稳定，保质期为18个月。
本发明试剂盒的检测结果准确率高达95％以上。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (10)

1.用于区分***分泌物中革兰氏菌的检测试剂盒，其特征在于，其包括：
1)包被有丙氨酸氨肽酶底物的反应试纸垫；
2)样品稀释液；
3)显色剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述丙氨酸氨肽酶底物包括L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺和/或L-丙氨酸-4-硝基苯胺。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应试纸垫上还包被有稳定剂和/或表面活性剂；其中，所述稳定剂选自D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖T70、β-环糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、α-乳糖、聚乙二醇、明胶、肌醇、木糖或***糖醇中的至少一种，优选D-海藻糖和葡聚糖T70；所述表面活性剂选自吐温80、吐温20、Triton X-100、NP40或山梨醇中的至少一种，优选Triton X-100。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液是由0.9％生理盐水、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES缓冲液组成的pH6.5±0.2的稀释液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂选自固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR中的至少一种，优选固蓝B。
6.权利要求1-5任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)反应试纸垫的制备：
所述试纸垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
以100-1000mmol/L pH 7.5-9.0的缓冲液为溶剂，配制含有0.001-0.01g/mL丙氨酸氨肽酶底物、0.005％-50％稳定剂和0.005％-50％表面活性剂的底物溶液；
(2)样品稀释液的配制：
所述样品稀释液是由0.9％生理盐水、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES缓冲液组成的pH6.5±0.2的稀释液；
(3)显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的显色剂溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述缓冲液选自磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或PIPES缓冲液中的至少一种，优选所述缓冲液为500-1000mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)反应试纸垫由底物溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
以500mmol/L pH 8.7的Tris-HCl缓冲液为溶剂，配制成含有0.005g/mL L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10％D-海藻糖和10％葡聚糖T70的底物溶液；
(2)样品稀释液的配制：配制含有质量百分浓度0.9％NaCl和pH6.5，10mmol/L MES缓冲液的稀释液；
(3)显色剂的制备：固蓝B 1.5g，Triton X-100 2g，PVPK30 4g，蒸馏水1000ml，充分混匀，分装在深色瓶中。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括不同浓度的丙氨酸氨基肽酶的配制。
10.一种非诊断目的检测样品中丙氨酸氨肽酶的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述试剂盒进行检测。
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KR20220157110A (ko) * 2021-05-20 2022-11-29 주식회사 핏펫 구강 박테리아 검사 막대
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