CN107501405A - 一种细胞自噬抑制多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞自噬抑制多肽，其氨基酸序列为LPDISLKDLQFLQSFCPSEVQ。所述细胞自噬抑制多肽可通过人工合成或宿主细胞表达的方法制备。所述多肽可以用于制备***药物。本发明的细胞自噬抑制多肽仅有21个氨基酸，无论是人工合成该多肽还是运用宿主细胞表达制备均非常方便易行，利于大规模推广利用；且该多肽来源于生物体内固有的蛋白质，用于动物实验不会造成免疫排除，对细胞毒性更小，也更为特异；该抑制多肽可通过慢病毒或转染等手段将编码该多肽的基因片段导入细胞内进行稳定表达，操作方便，有利于细胞水平和动物水平的研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种细胞自噬“开关”起始蛋白复合体多肽抑制剂的制备及应用。
背景技术
细胞自噬通路是一种新型的肿瘤药物治疗靶点，经典细胞自噬过程见图1所示。近年来，癌细胞“吃自己为了生存”的观点表明自噬在肿瘤发生和发展过程中可能发挥重要作用。例如在肿瘤细胞周围还没有形成丰富的血管之前，自噬降解途径所产生的营养物质能够为肿瘤细胞提供能量，从而维持其在极端压力和缺乏营养情况下的生存。另有大量研究证实，在一些肿瘤细胞中使用抗癌药物和X射线照射后，自噬体数量通常有所增加，且增加的程度与肿瘤细胞的生存能力呈正相关。细胞自噬的发生是肿瘤细胞自身对肿瘤治疗的一种自我防御反应，成为一种重要的肿瘤细胞耐药机制。这些研究结果表明自噬在恶性肿瘤治疗过程中扮演着非常重要的角色，因此细胞自噬成为肿瘤治疗的重要靶点。
目前针对自噬通路国内外众多研究者对以肿瘤细胞自噬为靶点的肿瘤治疗研究进行了大量的探索。其中最为成功的一个标志是以氯喹(Chloroquine，CQ)为代表的细胞自噬抑制剂被证实对多种肿瘤模型具有良好的抑制效果。目前氯喹在美国已经进入I/II期临床试验阶段，显示了良好的临床应用前景。尽管如此，动物试验发现氯喹只有在高浓度给药条件下才能够阻断体内肿瘤细胞自噬的发生。此外，氯喹抑制细胞自噬的特异性较低，其还具有其它生物学功能，如氯喹可阻止DNA的复制和RNA的转录，这些可能成为患者预后差及发生不良反应的潜在因素，从而限制氯喹的临床应用。为了克服这些难题，开发更为高效、低毒和特异的抑制细胞自噬的药物成为肿瘤治疗领域的努力方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种自噬起始复合物的抑制多肽，其能特异性的抑制自噬复合物的形成，从而发挥抑制自噬的功能。
前期研究发现，细胞自噬的发生首先是由胞内FIP200和ATG13-ULK1蛋白相互作用形成一种被称为FIP200-ATG13-ULK1的稳定复合体，然后再由这种蛋白复合体启动细胞自噬的发生。然而，进一步研究发现，ULK1基因被敲除后，细胞仍然可以诱导自噬的发生，而FIP200基因被敲除后，自噬则被完全抑制。本发明人在实验中发现，FIP200能与atg13蛋白特异性直接相互作用(定位FIP200和atg13相互作用的缺失突变体图见图2)，而不与ULK1蛋白发生直接相互作用。在进一步的研究中，发明人将FIP200分成8段，FIP200-N段638aa结构域能特异性的与ATG13蛋白相互结合这一研究结果表明FIP200蛋白在自噬诱导过程中起着关键性作用。由此，我们利用免疫沉淀方法，找到了介导FIP200和ATG13相互作用的关键功能区域位于550aa-638aa氨基酸序列中间。随后利用截短突变技术，成功的将此多肽序列定位到574-594aa，Western blot结果显示表达这个缺失突变体区域可以显著抑制细胞饥饿引起的自噬的发生，我们将574-594aa多肽序列命名为FIP-AI。
技术方案
一种细胞自噬抑制多肽，所述多肽的氨基酸序列为LPDISLKDLQFLQSFCPSEVQ。
本申请中记载的自噬多肽抑制剂为FIP200蛋白中的一部分序列，由21个氨基酸构成。
上述抑制多肽可通过人工合成或宿主细胞表达制备，均非常方便易行。
上述抑制多肽在制备***药物中的应用。
有益效果：本发明的细胞自噬抑制多肽仅有21个氨基酸，无论是人工合成该多肽还是运用宿主细胞表达制备均非常方便易行，利于大规模推广利用；且该多肽来源于生物体内固有的蛋白质，用于动物实验不会造成免疫排除，对细胞毒性更小，也更为特异；该抑制多肽可通过慢病毒或转染等手段将编码该多肽的基因片段倒入细胞内进行稳定表达，操作方便，有利于细胞水平和动物水平的研究。
附图说明
图1是细胞自噬通路发生的细胞自噬过程示意图；
图2是定位FIP200和ATG13相互作用的缺失突变体图；
图3是免疫共沉淀法鉴定FIP200中与ATG13相互作用的区段图；
图4是免疫共沉淀法鉴定GFP-FIP200中N端截断突变体与ATG13相互作用图；
图5是Western blot分析FIP-AI-P2A-GFP对细胞自噬的抑制作用；
图6是FIP-AI-P2A-GFP的连接图谱；
图7是将FIP-AI-P2A-GFP构建到pLVX-puro慢病毒载体的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
图1是细胞自噬通路发生的细胞自噬过程示意图，图2是定位FIP200和atg13相互作用的缺失突变体图。
实施例1
一、含有FIP200及其各截断突变体与ATG13蛋白的相互作用测试，目的在于鉴定出潜在的介导FIP200与ATG13蛋白相互需要的最小结构域：
主要实验材料：
1)细胞
本实验选择293T细胞。该细胞培养方便，生长较快，体外脂质体转染自噬活性较高，在自噬诱导情况下，通过免疫共沉淀，可以显著地检测到FIP200与ATG13蛋白的相互作用，而且在自噬标记物LC3ii条带较易检测。
293T，细胞，购置ATCC公司，培养基DMEM Gibico,含10％胎牛血清life tech公司，在5％CO2,37度，95％湿度的细胞培养箱中培养，3)、抗体，flag抗体sigma，1：2000，HA-beads sigma，GFP抗体，FIP200抗体，LC3抗体，cell signal technology公司。
首先是通过常规的PCR为基础的截断突变方法，以全长的pcDNA-HAFIP200为模板，得到如下一系列截断突变体如：HA-FIP(N250,N450,N550,N638,N859，WT)，然后测序鉴定以后，用lipofectamin2000，在HEK293细胞中分别转染HA-FIP(N250,N450,N550,N638,N859,WT)36小时后，用裂解液裂解(含20mM Tris(pH 7.5),135mM NaCl,2mM EDTA,2mM DTT,25mMβ-glycerophosphate,2mM焦磷酸钠，10％甘油，1％Triton X-100，1mM钒酸钠和蛋白酶抑制剂)裂解细胞。冰置20分钟后，15,000g，4℃离心10分钟。用HA-beads sigma进行免疫共沉淀，将beads与裂解液4度孵育4小时，用裂解液洗4次。免疫沉淀复合物经4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，再用ATG13抗体检测二者结合情况，结果如图3和4所示。
图3是免疫共沉淀法鉴定FIP200中与ATG13相互作用的区段图；表明FIP200N端含有638氨基酸残基的功能区能与ATG13相互作用，然而当缺失了550aa-638aa之间的N550aa突变体就失去与ATG13相互作用的能力，这显示550aa-638aa这段氨基酸序列含有蛋白相互作用的必要的肽序列间的N550aa突变体就失去与ATG13相互作用的能力，这显示550aa-638aa这段氨基酸序列含有蛋白相互作用的必要的肽序列图；图4是免疫共沉淀法鉴定GFP-FIP200中N端截断突变体与ATG13相互作用图。表明FIP200N端含有594氨基酸残基的功能区能与ATG13相互作用，然而当缺失了573aa-594aa之间的21个氨基酸，N573aa突变体就失去与ATG13相互作用的能力，这显示574aa-594aa这段氨基酸序列含有蛋白相互作用的必要的肽序列图。
根据鉴定结果，本发明人进一步构建了一系列更小的截短突变体，以全长的GFP-FIP200载体为模板，通过PCR方法截断突变体。如：GFP-FIP200-N573AA，GFP-FIP200-N594AA。经测序鉴定后，用以上类似的IP方法，将构建好的GFP-FIP200-573AA，突变体和GFP-FIP200-594AA突变体表达质粒分别转染到293细胞中，转染24小时后，分别用以上相同的IP裂解液裂解细胞，离心。用GFP抗体进行免疫共沉淀。将beads与裂解液4度孵育4小时，用裂解液洗4次。免疫沉淀复合物经4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜上。再用ATG13抗体检测二者结合情况，结果显示574aa-594aa是潜在的介导FIP200与ATG13蛋白相互作用的关键氨基酸残基，因此如果特异性在体内过表达该短肽，可能竞争性的阻断FIP200与ATG13蛋白的相互作用，因此下一步需构建过表达该多肽的载体。
二、pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP慢病毒载体构建：
主要实验材料：
1)实验试剂及菌株
宿主菌Stbl3由本实验室保存。pLVX-puro慢病毒载体，购自Addgene；XhoⅠ和XbaⅠ限制性内切酶，T4连接酶购自NEB公司，质粒大提试剂盒和割胶回收试剂盒购自Qiagen公司，Tyrptone、酵母提取物购自OXOID公司，质粒小提试剂盒购自Promega，HEK293T细胞购自ATCC公司；培养基DMEM购自Gibico；胎牛血清购自life tech。
2)5’-XhoI-FIP-AI-P2A-XbaI-3’序列的制备
首先通过人工全基因合成FIP-AI-P2A序列。(由于该片段较短，不需要PCR方法扩增)，该片段与GFP基因的N段有15个碱基重叠，用于重叠PCR反应。序列如下所示：
5-CTTCCAGATATTTCATTAAAAGATTTACAGTTTCTGCAATCATTTTGTCCTTCGGAAGTTCAGGGATCCGGCGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGGTGAGCAAGGGCGAG-3
然后以PEGFP-C3质粒为模板，通过PCR扩增GFP片段，引物序列如下：
GFP-F1:5-AATCCTGGACCGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3
GFP-R1:5-TCTAGACTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3，将扩增好的PCR产物进行割胶回收，得到的产物用于下一步PCR反应的模板；
最后，以全基因合成FIP-AI-P2A序列、GFP片段为模板，通过重叠PCR，同时在序列中引入Xho I和Xba I酶切位点。用引物PCR扩增出FIP-AI-P2A-EGFP片段，得到带Xho I和Xba I酶切位点的片段，所得到的片段经PCR产物试剂盒纯化回收，用于下一步克隆反应，FIP-AI-P2A-GFP的连接图谱见图6。所用的引物序列如下所示：
FIP-F2:5’-gtgCTCGAGATGCTTCCAGATATTTCATTAAAAGATTTAC-3’，
FIP-R2:5’-gagTCTAGACTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’；
三、pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP构建
图7为将FIP-AI-P2A-GFP构建到pLVX-puro慢病毒载体的示意图，如图所示，在多克隆位点通过XhoⅠ和XbaⅠ连接入上述FIP-AI-P2A-GFP序列。过程如下：
1.pLVX-puro慢病毒载体酶切
酶切体系(30μl)：
置37℃水浴锅酶切过夜(>3h)。1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，用Nanodrop 2000测回收产物浓度。
2.PCR产物酶切
酶切体系(30μl)：
置37℃水浴锅酶切过夜(>6h)。1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，用Nanodrop 2000测回收产物浓度。
3.连接
连接反应体系10μl：
置16℃水浴锅连接16h。
4.连接产物转化
A,将20μl连接产物加到200μl制备好的stbl3感受态细胞中，轻轻混匀置冰上30min-1h；
B,42℃水浴热激90s后立即冰置5min；
C,加入预热的800μl LB液体培养基，37℃振荡培养1.5h-2h；
D,4000rpm，室温离心5min，留200μl培养基重悬菌体，用涂布棒将其均匀涂与平板中，37℃倒置培养过夜。
5.基因测序
将构建成功的pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP质粒用通用pLVX-puro的通用引物进行基因测序，由上海Invitrogen公司测序。
6.慢病毒包装
以pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP：psPAX2：pMD2.G＝4:3:3的比例转染至HEK293FT细胞中，48小时后，收集细胞上清液，超速离心，得到浓缩的病毒颗粒，备用。
通过上述方法可以制得细胞自噬抑制多肽，序列为LPDISLKDLQFLQSFCPSEVQ，该多肽还可以进行人工合成。
性能测试
FIP-AI-P2A-GFP对细胞自噬抑制作用的测试：
实验材料及试验方法：
1)细胞
293T，细胞，购置ATCC公司，培养基DMEM Gibico,含10％胎牛血清life tech公司，在5％CO2,37度，95％湿度的细胞培养箱中培养，
2)抗体，
LC3抗体cell signal technology，1：1000
3)将上述包装成功的pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP质粒，用于直接转染293细胞，并用GFP空质粒做空白对照，进行鉴定体内表达该21氨基酸多肽抑制自噬作用的研究。待细胞感染36小时后，更换自噬培养基(Hank’s balanced salt solution[HBSS])饥饿2小时。BafA1(100nM)，是一种溶酶体抑制剂，在饥饿的同时加入2小时，然后裂解细胞，收集上清，Westernblot检测目前自噬公认的标志物LC3II，结果见图5。由图5可以看出：该多肽可以显著抑制LC3II的聚集，说明该多肽具有潜在的抑制细胞自噬的活性。
Claims (2)
1.一种细胞自噬抑制多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为LPDISLKDLQFLQSFCPSEVQ。
2.权利要求1所述的细胞自噬抑制多肽在制备***药物中的应用。
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