CN108531457A - 一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法 - Google Patents

一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种Cas9/RNP制备PD‑1和LAG3双基因敲除CD19 CAR‑T细胞的方法，包括将用于敲除PD‑1和LAG3基因的sgRNA及Cas9蛋白与电转试剂混合，加入CD4+/CD8+细胞中进行电穿孔转化；采用CD19 CAR慢病毒转染CD4+/CD8+阳性细胞；以及筛选并培养扩增转染后的T细胞已获得PD‑1和LAG3双基因敲除CD19CAR‑T细胞。本发明选用Cas9/RNP基因编辑***提高了转染效率和转基因的表达效率和时间，简化了CAR‑T细胞的制备流程，增加了***的可行性和负载量。另外，本发明敲除PD‑1和LAG3双基因时避免使用转染试剂，安全性更高。

Description

一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的 方法
技术领域
本发明涉及免疫细胞制备领域，具体地，本发明涉及一种利用Cas9/RNP制备PD-1和 LAG3敲除的CD19 CAR-T细胞。
背景技术
继手术、放疗、化疗后，肿瘤的免疫疗法已成为行之有效的治疗方式，近期收到广泛关注。其中嵌合抗原受体T细胞技术(Cheimeric Antigen Receptors-T cell,CAR-T)是一种新出现的过继性细胞疗法(Adoptive cell transfer therapy,ACT)，该技术将患者T细胞在体外修饰、活化和增殖后回输到患者体内，通过T细胞表达的特异性受体，靶向性的识别肿瘤细胞，并显示较强的杀伤活性和持久性。
死亡分子-1(Programmed death-1,PD-1,也称为CD279)属于T淋巴细胞的抑制性共受体，是一种重要的免疫检查点，其配体(Programmed death ligand 1,PD-L1,也称为B7-H1 或CD274)可在多种肿瘤细胞表面表达。PD-1/PD-L1结合介导负性免疫调节通路，有利于形成肿瘤微环境，促进肿瘤免疫逃逸。
淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3,LAG-3)是一种重要的免疫检查点，主要表达于活化后的效应T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、B细胞及浆细胞样树突状细胞等，在调节T细胞免疫应答中发挥着十分微妙的作用。越来越多的证据表明，无论在体内还是体外，LAG-3都会负调控效应T细胞的功能(活化、细胞因子释放和细胞杀伤)，同时会增强调节性T细胞的免疫抑制功能。LAG-3还是T细胞耗竭的一个标志，在肿瘤和慢性感染环境中，LAG-3的表达会在T细胞表面明显上调，通过单克隆抗体阻断LAG-3，会增强 T细胞的增殖和细胞因子释放，而且会延迟细胞周期停滞，增加记忆T细胞亚型的比例。
在慢性感染和肿瘤的临床前研究发现，PD-1和LAG-3在促进免疫逃逸的过程中发挥协同作用，同时阻断PD-1和LAG-3信号通路可以逆转T细胞耗竭，提高T细胞抗感染和抗肿瘤的能力。目前单独使用LAG-3抗体或联合使用PD-1抗体和LAG-3抗体治疗血液肿瘤和实体瘤的临床试验正在进行(ClinicalTrials.gov,No.NCT02061761,NCT01968109)。
嵌合抗原受体(CAR)由胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区等构成，一般通过病毒转导或电穿孔，使CAR分子表达在T细胞表面形成CAR-T细胞。CAR分子的设计根据胞内信号区的不同经历了四代发展，其中第一代信号区仅包含CD3ζ；第二代信号区在第一代基础上加了一个共刺激因子，如CD28、4-1BB、OX40等；第三代在第一代基础上加了两个串联的共刺激因子；***包含IL12、IL7、CCL19等能改善微环境的细胞因子。靶向血液肿瘤方向的CD19的CAR-T细胞，部分研究中总体缓解率达90％以上。然而在部分血液肿瘤及大部分实体肿瘤中由于肿瘤微环境的抑制，效果不是很理想，而免疫检验点是解除免疫抑制的关键环节之一，所以免疫检查点在T细胞上的敲除具有重要的临床应用价值。
过继性细胞输注前，体外通过Cas9/RNP(ribonucleoproteins)与单链引导 RNA(single-guide RNAs,sgRNA)靶向基因编辑技术永久敲除CAR-T细胞上的免疫检查点受体如PD-1和LAG-3，能够提高CAR-T的功能，促进可识别肿瘤抗原并产生特异性反应的T 细胞增殖，发挥其杀伤肿瘤细胞的作用。有研究报道在T细胞或CAR-T细胞中敲除PD-1能够增强T细胞或CAR-T细胞抗肿瘤功能，但目前还没有关于T或CAR-T细胞敲除PD-1和 LAG-3的报道。本发明首次利用CRISPR-Cas9***在T细胞和CAR-T细胞中进行PD-1和 LAG-3的敲除，并观察基因编辑后的T和CAR-T细胞免疫表型和功能变化。
发明内容
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的瓶颈，提供一种Cas9/RNP制备PD-1和LAG3双基因敲除CD19 CAR-T细胞的方法，并证明了其在肿瘤治疗中的潜在应用。具体地说，发明提供一种CRISPR/Cas9体外编辑T细胞或CAR-T的方法，通过编辑是T细胞或者CAR-T 细胞表面的PD-1和LAG3蛋白的表达水平下调或消失，解除免疫抑制信号，赋予T细胞更强的肿瘤杀伤能力。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种CD4+/CD8+ T细胞提取的方法，其中CD4+ T细胞和CD8+ T 细胞分别由EasySeq试剂盒(STEMCELL)按对应说明书操作分别提取出来。
本发明的第二个目的是提供一种靶向敲除T细胞PD-1和LAG3基因的Cas9/RNP体外编辑的方法，其中包括sgRNA和Cas9蛋白的合成，以及将两者电穿孔转染进T细胞中；进一步地，所述sgRNA由序列固定的tracrRNA和靶向DNA的crRNA两部分组成，其中靶向PD-1的序列如SEQ NO.1～2，靶向LAG3的序列如SEQ NO.3～4；
进一步地，所述Cas9为S.pyogenes Cas9蛋白，并且在其羧基端有一个HA标签和两个核定位信号(NLS)序列如SEQ NO.5～6；
进一步地，tracrRNA与crRNA按浓度比1:1混合成sgRNA，随后将sgRNA与Cas9蛋白按浓度比1:1混合成Cas RNP；
更进一步地，将3×105个CD4+/CD8+ T细胞与20μL Amaxa电穿孔转染试剂盒中试剂P3混合成细胞悬液，将3μL 20mM Cas9/RNP与细胞悬液混合，按4D-Nuclelfecter电转仪电转程序EH-115进行电穿孔转染。
本发明的第三个目的是提供一种CD19 CAR慢病毒载体；
进一步地，所述CAR分子是利用pCDH载体依次串联人EF1α、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区和T2A短肽连接的筛选基因CopGFP制备而成；
进一步地，胞内信号区为OX40-4-1BB-CD3ζ，OX40和4-1BB为嵌合受体共刺激分子；
优选地，所述铰链区为CD8hinge区域，所述跨膜区为CD8α；
更进一步地，CD19 CAR pCDH载体质粒在辅助质粒pSPA2和vsv-G包膜质粒pMD2.G存在的情况下，待细胞长至80-90％，共转染HEK293T细胞，收集上清，浓缩后即可制成高质量的带有CAR分子的慢病毒。
最后，本发明第四个目的是提供一种含有PD-1和LAG3敲除的编码CD19 CAR基因的重组表达载体的宿主细胞；
进一步地，所述宿主细胞为T细胞或者含有T细胞的细胞群；
进一步地，所述带有CD19 CAR分子的慢病毒与宿主细胞的moi值为1～5；
进一步地，所述宿主细胞转染后采用anti-CD3+CD28抗体磁珠激活，用于筛选并培养扩增转染后的T细胞以获得PD-1和LAG3敲除的CD19 CAR-T细胞。
在一个实施例中，将CD19 CAR-T细胞与表达CD19(+)PD-1(-)LAG3(-)、 CD19(+)PD-1(+)LAG3(+)的肿瘤细胞系K652共孵育，结果显示CD19 CAR-T细胞能够在 CD19(+)PD-1(-)LAG3(-)靶细胞刺激的情况下大量的产生IFN-γ；但是却不能与 CD19(+)PD-1(+)LAG3(+)靶细胞共孵育时产生IFN-γ；同时非CD19靶向的T细胞不能够在 CD19(+)靶细胞刺激下产生IFN-γ。该实施案例说明了PD-1和LAG3双基因敲除的CAR-T 细胞有良好的靶向性，能够在CD19靶点的刺激下将T细胞杀伤功能激活，并且能够解除PD-1 和LAG-3免疫抑制剂对免疫的抑制效果。
在另一个实施中，证明了在一定的效靶比(CAR-T细胞：靶细胞)下，CD19 CAR-T细胞或敲除PD-1和LAG3的CD189 CAR-T细胞，均能够杀伤CD19阳性的肿瘤细胞，且无论是否敲出PD-1和LAG3，两者杀伤的能力差异不显著；但是非靶向CD19的T细胞或PD-1 和LAG3敲除的T细胞，均不能杀伤CD19阴性的肿瘤细胞。该实例说明CD19 CAR-T细胞能够有效杀伤CD19阳性的肿瘤细胞，且敲除PD-1和LAG3对CD19 CAR-T细胞的活性影响较小。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
目前，CAR-T技术在实体瘤领域的应用并不成功，一个重要的原因就是免疫微环境的免疫抑制效应，通过体外Cas9/RNP敲除PD-1和LAG3基因，能够通过免疫检验点的减弱从而解除免疫微环境的抑制功能；Cas9/RNP是通过体外带有引导入核序列的S.pyogenes Cas9蛋白和合成的PD-1和LAG3 sgRNA组成，避免了载体转染时外部序列对细胞的干扰，增加了临床应用的安全性。本发明所述的利用Cas9/RNP将PD-1和LAG3基因敲除的CAR-T细胞制备方法，能够特异性解除免疫微环境的抑制，特异高效杀伤靶向肿瘤细胞。
附图说明
图1为靶向PD-1和LAG3基因的sgRNA靶向序列的说明示意图；
图2为慢病毒pCDH载体的基因结构的说明示意图；
图3为流式检测PD-1和LAG3敲除T细胞的敲除PCR结果示意图；
图4为流式检测PD-1和LAG3敲除T细胞的敲除T7EH1酶切结果示意图；
图5为流式检测CD19 CAR表达水平的示意图；
图6为正常CAR-T细胞和PD-1(-)LAG3(-)CD19(+)CAR-T细胞，分别与K562白血病细胞系和Raji淋巴瘤细胞共培养后，分泌IFN-γ情况的示意图；
图7A和图7B为正常CAR-T细胞和PD-1(-)LAG3(-)CD19(+)CAR-T细胞体外杀伤CD19+K652细胞的结果示意图。
具体实施方式
本发明提供一种Cas9/RNP制备PD-1和LAG3双基因敲除CD19 CAR-T细胞的方法，其包括CD4+/CD8+ T细胞制备、PD-1和LAG3敲除的sgRNA和Cas9蛋白准备、将Cas9/RNP 与T细胞的电穿孔转染、CD19 CAR慢病毒的转染、anti-CD3+CD28抗体磁珠激活并通过筛选培养获得CD19 CAR-T细胞。
CD4+/CD8+T的制备：
用EDTA抗凝管采集健康人外周血，将入等体积磷酸缓冲液PBS稀释，将外周血稀释液加入到等体积淋巴细胞分离液(Ficoll)的50ml离心管中，400g 30min离心；小心吸取淋巴分离液上的白膜层细胞，转入新的50ml离心管中，用PBS离心300g 10min洗涤3次，即可获得PBMC 细胞；将PBMC细胞分别按照EasySeq试剂盒(EasySepTMHuman CD4+/CD8+ T CellEnrichment Kit,STEMCELL)说明书操作即可获得CD4+和CD8+ T细胞；
T细胞存储在含有20％人AB血清和10％DMSO的RPIM培养基中；T细胞复苏后，用含有30U/ml的T细胞培养基培养过夜；T细胞培养基(T cell culture medium,TCM)由以下组成：X-Vivo15(Lonza)，5％人AB血清(Valley Biomedical)，55μMβ-巯基乙醇，10mM N-乙酰L-半胱氨酸。
Cas9/RNP介导T细胞基因编辑的sgRNA和Cas9蛋白的准备：
Cas9/RNP由靶向基因的sgRNA和用于剪切基因的Cas9蛋白两部分组成；sgRNA由固定组成的tracrRNA和靶向目标基因的crRNA构成，用于敲除PD-1和LAG3基因的crRNA 的靶向序列(SEQ NO.1～2和SEQ No.3～4)由上海吉满生物化学合成，示意图见图1；Cas9为S.pyogenes Cas9蛋白，为了能够监测Cas9蛋白以及利于Cas9蛋白的入核，在其羧基端有一个HA标签和两个核定位信号(NLS)序列(SEQ NO.5～6)，由上海近岸科技合成。
Cas9 RNP与T细胞的电穿孔转化：
人CD4+或CD8+T细胞解冻后，用TCM培养24h；随后用含有30U/ml IL2的TCM培养基培养，同时用anti-CD3(10μg/mL,)和anti-CD28(5μg/mL,)刺激48h；
将化学合成的tracrRNA、靶向PD-1或LAG3外显子1的crRNA分别悬浮于10mM Tris-HClpH7.4，得到80μM tracrRNA和80μM crRNA；crRNA与tracrRNA按照1:1的比例混合， 置于37℃30min，得到40μM crRNA:tracrRNA混合的sgRNA；将等体积的40μM sgRNA 与40μM spCas9蛋白(冻存于20mM HEPES,150mM KCl,10％甘油,1mM TCEP)混合，得到 20μM Cas9 RNP；CD4+或CD8+T细胞悬浮于P3缓冲液(Amaxa P3Primary Cell Kit)中使其 细胞浓度为～3×105，得到T细胞悬液；将3μL 20μM Cas9 RNP加入到20μL细胞悬液中， 混匀；4D-Nucleofecter(Lonza)程序EH-115进行电穿孔转化；
随后提取T细胞基因组DNA，并利用设计好的PD-1引物(5’-tttcccttccgctcacctc-3’和5’ -cacctacctaagaaccatcctg-3’)和LAG3引物(5’-attccggcctctggtcatcc-3’和5’ -ggagaggcttcactaggtgag-3’)，进行PCR扩增，目的片段纯化回收；利用T7EN1酶切检测突变体，3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，如图3凝胶电泳图所示。将PCR产物用pMD18T载 体中，转化入TOP10大肠杆菌感受态细胞，随机挑取克隆进行测序，评估目标片段被切割后 碱基变化和切割效率。
构建CAR分子到慢病毒载体pCDH：
本发明中CAR分子是利用pCDH载体依次串联人EF1α、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区和T2A短肽连接的筛选基因CopGFP制备而成，其信号域为OX40-4-1BB-CD3ζ，其分子结构见图2慢病毒pCDH结构示意图；
首先化学合成CD19 FMC63核酸片段至pUC57载体中，Not I/Xba I双酶切得到FMC63片段； Not I/Xba I双酶切慢病毒载体pCDH；将线性pCDH载体与FMC63片段使用T4连接酶链接，室温1～2小时，随后转化入stb13感受态细胞，过夜培养后，挑取阳性单克隆扩增培养并提取质粒，测序验证其序列，正确的质粒命名为pCDH-EF1α-CSF2RA-CD19scFv(FMC63)-CD8hinge-CD8α-OX40-4-1BB-CD3ζ-T2A-CopGFP(以下简写为pCDH-CD19scFv)。
PD-1和LAG3基因敲除的CD 19 CAR-T(PD-1:LAG3-DKO CAR-T)细胞的构建：
CAR慢病毒的包装：首先使用无内毒素大提质粒试剂盒提取pCDH-CD19scFv以及慢病毒***辅助包装质粒pMD2.G和PSPAX2。转染前一天将2.0～3.0*107HEK 293T细胞铺至T75培养方瓶中，待细胞长至80％左右后用于转染。转染前将293T细胞培养基更换为10ml无血清培养基，使用转染试剂HQ(Polyplus,France)将质粒共转染到293T细胞中，转染24小时后将细胞培养基更换为完全培养基DMEM+10％FBS。转然后48小时后收集上清，并加入15ml完全培养基，72小时后再收集上清，弃掉细胞。上清用0.45μm滤膜过滤，5000g离心1min去除杂质，随后40000g离心2小时将病毒沉淀，用0.1ml PBS重悬病毒。置于-80℃冰箱，冻存备用；
PD-1和LAG3敲除T细胞转导：将电穿孔后的CD4+或CD8+ T细胞中加入80μL预热的TCM培养基，37℃30min；将细胞与anti-CD3+CD28(Invitrogen)抗体磁珠以1:1的比例混合，并且用TCM将细胞浓度调整为1×106/ml，培养2-4h；加入含有CD19 CAR的慢病毒，培养24-36h； 72h后利用流式细胞术检测GFP表达以检测CAR分子转导效率；磁珠在刺激4-6天后移除；将CD4+PD-1(-)LAG3(-)CD19 CAR-T细胞与CD8+PD-1(-)LAG3(-)CD19 CAR-T细胞按等浓度1:1比例混合，即可得到最终的PD-1和LAG3基因敲除的CD19 CAR-T细胞。
PD-1和LAG3基因敲除的CD 19 CAR-T细胞活性测定：
将PD-1和LAG3敲除CD19 CAR-T细胞与表达CD19(+)PD-1(-)LAG3(-)、 CD19(+)PD-1(+)LAG3(+)的肿瘤细胞系K652共孵育，结果显示PD-1和LAG3敲除CD19 CAR-T细胞能够在CD19(+)PD-1(-)LAG3(-)靶细胞刺激的情况下大量的产生IFN-γ；但是却不能与CD19(+)PD-1(+)LAG3(+)靶细胞共孵育时产生IFN-γ；同时非CD19靶向的T细胞不能够在CD19(+)靶细胞刺激下产生IFN-γ，如图5所示。该实施案例说明了PD-1和LAG3 双基因敲除的CAR-T细胞有良好的靶向性，能够在CD19靶点的刺激下将T细胞杀伤功能激活，并且能够解除PD-1和LAG-3免疫抑制剂对免疫的抑制效果。
PD-1和LAG3基因敲除的CD 19 CAR-T细胞杀伤CD19靶细胞的能力：
用5-竣基荧光素琥珀酰亚胺基(CFSE)将靶细胞染色，将PD-1(-)LAG3(-)CD19 CAR-T细胞或未敲除PD-1和LAG3的CAR-T细胞与K652、Raji细胞按以下效靶比混合培养：05:1,1:1,2:1,5:1。经过4小时共培养后，将细胞用PI试剂盒染色，同时设置对照组，对照组中的效应细胞为T淋巴细胞，空白组中不加任何效应细胞。使用流式细胞术对细胞杀伤进行检测。结果见图7A和图7B。无论是否敲除PD-1和LAG3，CAR-T细胞均能够有效杀伤K652和Raji 细胞，但是对照组中的T细胞没有能够有效杀伤细胞。该实施案例说明了CD CAR-T具备明确的肿瘤细胞杀伤活性，同时也表明电穿孔转化敲除PD-1和LAG3对CAR-T细胞的杀伤活性没有产生实质性的影响。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 杭州荣泽生物科技有限公司
<120> 一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法
<130> 2018.03.29
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<400> 7
tctagaatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60
ctcggatccg atattgtgct gacccagagc cccaagttca tgagcaccag cgtgggcgat 120
agagtgagcg tgacctgcaa ggcaagccag aacgtgggaa caaacgtggc ctggtaccaa 180
cagaaacccg gccaaagccc taagcccctg atttacagcg ccacctacag aaatagcggc 240
gtgcccgaca gatttacagg aagcggcagc ggaaccgatt tcacactgac catcaccaac 300
gtgcagagca aagacctggc cgactacttc tgccagcagt acaacagata cccctacacc 360
agcggaggag gaacaaagct ggagatcaag agaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc 420
tccggtggtg gtggttctca agtgcaactg caacagagcg gagccgaact ggtgagaccc 480
ggaagcagcg tgaagatcag ctgcaaggct tccggctacg cctttagcag ctactggatg 540
aactgggtga agcagagacc tggacaggga ctggaatgga tcggccagat ttaccctgga 600
gacggcgaca caaactacaa cggcaagttc aagggccaag ctacactgac cgccgacaaa 660
agcagcagca ccgcctatat gcagctgagc ggactgacca gcgaagatag cgctgtgtac 720
ttctgcgcca gaaagaccat cagcagcgtg gtggacttct acttcgacta ctggggacaa 780
ggcaccaccc tgacagtgag cagcgaattc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 840
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 900
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 960
cccctggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcgcc 1020
ctgtacctgc tccggaggga ccagaggctg ccccccgatg cccacaagcc ccctggggga 1080
ggcagtttcc ggacccccat ccaagaggag caggccgacg cccactccac cctggccaag 1140
atcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1200
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1260
tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1320
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1380
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgcggatc c 1611

Claims (8)

1.一种制备PD-1和LAG3敲除CD19 CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：
准备CD4+/CD8+ T细胞；
准备与用于敲除PD-1和LAG3基因的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白；
将准备的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白与电转试剂混合，加入CD4+/CD8+ T细胞中进行电转化；
准备CD19嵌合抗原受体慢病毒；
将准备的慢病毒用于感染电转化后的CD4+/CD8+ T细胞，antiCD3+CD28抗体激活T细胞扩增培养，通过荧光筛选实验以获得PD-1和LAG3敲除的CD19 CAR-T细胞。
2.如权利要求1所述方法，其中CD4+/CD8+ T细胞的获得是通过EasySeq试剂盒按说明书操作，制备而成。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述敲除PD-1和LAG3的sgRNA由tracrRNA和crRNA两部分组成，其中PD-1的crRNA靶向序列如SEQ ID No.1～2所示，LAG3的crRNA靶向序列如SEQ No.3～4所示。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述敲除PD-1和LAG3的Cas9蛋白为体外蛋白，羧基端有一个HA标签和两个核定位信号序列如SEQ No.5-6。
5.如权利要求1所述的方法，其中CD19 CAR是利用pCDH载体串联人EF1α启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞外抗体结合区、铰链区、跨膜区胞内信号传导区和T2A短肽连接的筛选基因CopGFP制备而成，其中CSF2RA-CD19 scFv-CD8α -OX40-4-1BB-CD3ζ序列如SEQ No.7。
6.如权利要求5所述的方法，其中胞外抗原结合区为CD19单链抗体scFv FMC63，铰链区为CD8 Hinge，跨膜区为CD8α跨膜域，信号传导区为OX40-4-1BB-CD3ζ，其中OX40和4-1BB为共刺激因子。
7.一种用于制备PD-1和LAG3敲除CD19 CAR-T细胞的装置，包括
CD4+/CD8+细胞准备***；
Cas9/RNP体外tracrRNA、crRNA和Ca9蛋白***；
Amaxa电穿孔转化试剂盒；
用于激活T细胞的偶联CD3+CD28抗体磁珠；以及
筛选培养***，用于筛选并培养转后的T细胞用以获得PD-1和LAG3敲除的CD19 CAR-T细胞。
8.如权利要求1～7之一所述的利用Cas9/RNP制备PD-1和LAG3敲除CAR-T的方法，以及获得的分离的T细胞或细胞系或其次代培养物。
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