CN114540422A - 靶向受损部位递送rna药物的间充质干细胞外泌体的制备与应用 - Google Patents

靶向受损部位递送rna药物的间充质干细胞外泌体的制备与应用 Download PDF

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CN114540422A CN202210245129.3A CN202210245129A CN114540422A CN 114540422 A CN114540422 A CN 114540422A CN 202210245129 A CN202210245129 A CN 202210245129A CN 114540422 A CN114540422 A CN 114540422A
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Abstract

本发明提供一种靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备与应用，通过慢病毒转染细胞而后得到特别性质的外泌体从而建立靶向性更强的运载体系，用于基因引起疾病的靶向治疗。所述外泌体的制备包括过表达质粒的构建、慢病毒包装、制备目的蛋白高表达间充质干细胞、外泌体提取和制备装载siRNA的外泌体的步骤。本发明构建了具有高靶向性的外泌体，从而实现RNA药物的高效递送。以肿瘤细胞为例，改造后外泌体表面趋向因子蛋白表达提高八倍，表现出高靶向性及良好的受损部位聚集效果，实现高效的药物释放，在体外和体内都表现出极好的药物靶向递送效果且具有优良的生物安全性，是一种安全性高，靶向性高，适用范围广的药物运载体系。

Description

靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备与 应用
技术领域
本发明涉及一种生物医药技术领域，尤其是涉及一种靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备和应用，该干细胞外泌体可精准靶向受损部位递送RNA药物。
背景技术
基因治疗已在多种疾病中得到运用，并逐步成罕见病治疗领域中最引人注目的前沿热点。当前基因治疗过程中使用的载体存在安全性差、递送效率低下等问题，迫切需要开发新型的基因治疗递送载体。由于外泌体良好的稳定性、生物安全性，利用其作为药物载体进行新型核酸治疗开展的如火如荼，显现出巨大的临床应用前景。间充质干细胞具有天然的归巢性，可自发向机体的损伤部位、炎症部位甚至肿瘤部位聚集。这一特性归功于其表面表达的多种趋向因子，特别是CXCR4可与肿瘤表面高表达的SDF-1特异性结合，这对于间充质干细胞向肿瘤部位的聚集至关重要。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备与应用。
本文的研究工作首先通过基因工程的手段改造间充质干细胞，获得可高表达CXCR4的间充质干细胞来源的外泌体作为靶向递送RNA药物的载体，随后通过电转的方式荷载Survivin基因从而获得新型基因药物递送载体(CXCR4high-Exo/Survivin)并开展相关的体内、体外实验。我们观察到该新型递送载体可向肿瘤部位高效聚集并在胞内释放出siRNA药物，实现对体内肿瘤细胞的Survivin基因沉默，从而抑制了肿瘤的生长。该新型基因药物递送载体具有很好的临床转化价值，为罕见病的临床治疗提供了一种新的途径。
第一方面，本发明提供了一种靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
S1、过表达质粒的构建：将载体质粒与PCR扩增的目的蛋白的DNA片段进行重组反应，得到载体与目的蛋白的DNA片段的连接产物；再将连接产物加入感受态细胞中，热击处理后筛选得到过表达质粒；
S2、慢病毒包装：将过表达质粒与Lentiviral Mix质粒、转染试剂进行共转染293T细胞，然后收集病毒液；
S3、制备目的蛋白高表达间充质干细胞：将步骤S2收集的病毒液加入干细胞中，再加入聚凝胺(polybrene)培养，然后筛选获得稳定感染的细胞株；
S4、外泌体提取：将步骤S3获得的细胞株培养后第一次离心，所得上清液再加入缓冲层后进行第二次离心，收集靠近缓冲层的溶液；再将收集的溶液加入缓冲层后进行第三次离心，收集缓冲层中的颗粒，即得外泌体；
S5、制备装载siRNA的外泌体：将siRNA与步骤S4获得的外泌体混合后，进行电转，然后孵育，即得装载siRNA的外泌体。
优选地，步骤S1中，所述载体质粒为含PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-puro载体质粒；
所述目的蛋白为CXCR4蛋白，PCR扩增所述目的蛋白的DNA片段所采用的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
优选地，步骤S1中，所述重组反应的反应体系以总体积为20μl计，包括以下含量的各组分：
组分 含量
5×CE Buffer 4μl
载体质粒 50～200ng
目的蛋白的DNA片段 20～200ng
Exnase 2μl
ddH<sub>2</sub>O 补足到20μl
所述载体质粒在反应体系中的浓度为2.5-10ng/μl，目的蛋白的DNA片段的浓度为1-10ng/μl；
所述反应条件为50℃水浴反应10-30min。
优选地，步骤S1中，所述热击处理的条件为：42℃水浴中热击90S；
所述筛选的具体步骤为：将热击处理后的感受态细胞先加入不含抗生素的SOC培养基中振荡培养，再加入到含有载体上对应抗性组分的培养基中倒置培养，然后测试得到正确的过表达质粒；
所述过表达质粒为含PGMLV-CMV-H_CXCR4-PGK-puro质粒。
更优选地，所述载体上对应抗性组分选自氨苄或卡那，但不限于此。
优选地，步骤S2中，所述慢病毒包装的具体步骤为：先将过表达质粒与LentiviralMix质粒、转染试剂混匀于无血清DMEM培养基后，常温孵育；然后将孵育后的混合物加到293T细胞中混匀，培养4-6h，吸弃上清；再加入新的DMEM完全培养基继续培养，48h后收集的上清液离心或过滤后即得病毒液。
所述过表达质粒与Lentiviral Mix质粒、转染试剂的质量比为1：1：6；所述转染试剂为HG TransgeneTM Reagent；所述孵育时间为5-10min；
所述293T细胞为培养至细胞融合度达到80％的293T细胞。
更优选地，所述收集的上清液离心的条件为1500rpm离心8min；所述收集的上清液过滤的条件为采用0.45μm的过滤器。
优选地，步骤S3中，所述干细胞为间充质干细胞第4-7代，所述干细胞的生长密度为50％；
所述病毒液的加入量为500μL-1mL(为10cm培养皿中的加入量)；所述聚凝胺的加入浓度为5-10μg/mL；
所述筛选的步骤具体为：将培养后的干细胞加入含有嘌呤霉素的干细胞专用培养基中筛选阳性克隆；所述嘌呤霉素的添加浓度为0.5-1μg/mL；
所述稳定感染的细胞株中表面目的蛋白表达量为起始的干细胞的200-1000倍。
优选地，步骤S4中，所述缓冲层为opti-prep形成的缓冲层，所述第二次离心中加入的opti-prep的体积为100-500μL/离心管，所述第三次离心中加入的opti-prep的体积为50μL/离心管；
所述收集靠近缓冲层的溶液体积为2-12mL；
所述第一次离心的条件具体为：温度4℃、转速为2000-10000g下离心30min；
所述第二次离心和第三次离心的条件具体各为：使用Beckman SW28转子、温度4℃、转速为12000g下离心60min。
更优选地，所述第一次离心可以分两步离心，也可以一步离心；
所述两步离心具体步骤为：先在温度4℃、转速为2000g下离心10min，再在温度4℃、转速为10000g下离心20min；
所述一步离心具体步骤为：在温度4℃、转速为10000g下离心30min。
优选地，步骤S5中，所述siRNA与泌体的混合质量比为1:10-20；所述混合的温度为0-4℃；
所述电转采用脉冲波电转，脉冲时间为10-15ms；
所述孵育为在冰上孵育0.5-2h。
第二方面，本发明提供了一种间充质干细胞外泌体，根据前述方法制备得到，所述间充质干细胞装载有siRNA,且能维持siRNA活性。
本发明制备的间充质干细胞外泌体表面有特征性蛋白CD9，CD63，CD81的表达，且有目的蛋白CXCR4的高效表达，其表达量是未改造外泌体表面目的蛋白表达的2-10倍。
第三方面，本发明提供了一种根据前述的间充质干细胞外泌体在制备靶向受损部位递送RNA药物中的应用，其特征在于，所述受损部位包括肿瘤部位。
优选地，所述肿瘤为肺癌、胃癌中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明上述的干细胞外泌体及其制备方法，可以提高外泌体RNA载药***对靶向部位的药物递送，是一种能精准靶向受损部位递送RNA药物的干细胞外泌体。
本发明上述的干细胞外泌体的制备方法，通过慢病毒转染改造外泌体来源细胞，从而建立趋向性更强的运载体系，利用外泌体特异性靶向肿瘤部位并促进癌细胞凋亡，用于癌症靶向治疗。
本发明上述的干细胞外泌体及其制备方法，通过优选外泌体表面趋向因子CXCR4蛋白的过表达(未改造外泌体表面蛋白表达量的近十倍)，本发明表面趋向因子CXCR4过表达的外泌体快速向受损部位聚集，在进入细胞到达溶酶体后，在酸性条件下，siRNA被释放，释放后外泌体实现在溶酶体的逃逸。释放的siRNA能降低肿瘤细胞内对应基因的表达。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为原始质粒及CXCR4表达质粒；
图2为改造前后MSCs上清液所提取的外泌体粒径分布图；
图3为改造后MSCs上清液所提取的外泌体表面特征性蛋白流式检测；
图4为改造前后MSCs上清液所提取的外泌体表面CXCR4蛋白流式检测；
图5为裸siRNA与外泌体装载siRNA进行RNase处理后条带检测；
图6为肿瘤细胞对改造前后外泌体的摄取；
图7为改造前后外泌体对肿瘤部位的富集效果；
图8为改造前后外泌体对肿瘤的治疗效果；
图9为外泌体改造及效果验证设计流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例中，所使用的主要材料和来源分别如下：
慢病毒包装试剂盒购于吉满生物；opti-prep购自STEMCELL；CD63、CD81、CD9抗体购自ABGENT(美国)；CXCR4抗体来自Abcam；裸鼠购于上海杰斯杰公司；含PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-puro载体质粒的菌液来自吉满生物；感受态细胞购自诺唯赞；MSC购自生工生物；siRNA购自生工生物；A549肺癌细胞购自生工生物；MGC803胃癌细胞购自生工生物。
外泌体改造及效果验证设计流程图如图9所示，将间充质干细胞用慢病毒感染以获得CXCR4high Exo。通过使用外泌体作为载体，可以实现RNAi的肿瘤靶向递送。该***通过抑制肿瘤细胞中Survivin的表达来有效抑制肿瘤生长。
实施例1
本实施例提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)过表达质粒的构建：
S101，设计PCR扩增片段引物，并在引物5’端引入线性化克隆载体末端的同源序列，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。
并送公司合成引物。PCR扩增片段引物序列如下：
Primer-F(SEQ ID NO.1)：
CGCGAATTCGAAGTATACCTCGAGGCCACCATGGAGG
Primer-R(SEQ ID NO.2)：
CGATCGCAGATCCTTGGATCCTTAGCTGGAGTGAAAACTTGAAGACTCAGA
S102，将含PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-puro载体质粒(图1中的原始质粒)的菌液过夜培养，并取新鲜菌液5ml使用质粒小提试剂盒提取载体质粒。
S103，将1μg载体质粒，3μL green buffer，1.5μL XhoI和1.5μL BamHI混匀于23μLddH2O，37℃水浴酶切3h。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，切胶回收载体质粒。
S104，将1-2μg模板(购自吉满生物)与步骤S101中合成的引物各2μL混合，加入25μL PCR Mix，ddH2O补足至50μL，设定程序进行PCR，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结束后切胶回收片段。
S105，用nanodrop测定酶切后载体质粒(步骤S103)回收浓度(浓度为10-100ng/mL)及片段(步骤S104)回收浓度(浓度为10-100ng/mL)，使用Hieff CloneTM重组反应20μL体系，4μL 5×CE Buffer，2μL Exnase，100ng回收后载体与200ng回收后片段混匀于ddH2O，50℃水浴酶切20min，得载体与目的片段的连接产物。
S106，将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μl连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。之后于42℃水浴中热击90S。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。加入500μL不含抗生素的SOC培养基于37℃,225rpm振荡培养45min。3000rpm离心2min，弃掉900μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性组分氨苄(含量为100mg/mL)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀(涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体)，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养；送测以筛选正确的CXCR4表达质粒(即含PGMLV-CMV-H_CXCR4-PGK-puro质粒)。如图1所示，该步骤制备的CXCR4表达质粒具备CXCR4基因序列以及Zsgreen荧光蛋白，有利于后续外泌体在细胞内的定位，实现外泌体在细胞内的可视化。
(2)慢病毒包装：
S201,在10cm培养皿中接种293T细胞(接种量为1×106个)，培养于DMEM完全培养基，待细胞融合度达到80％进行慢病毒包装。
S202,将10μg CXCR4表达质粒，10μg Lentiviral Mix，60μg HG TransgeneTMReagent混匀于1ml无血清DMEM培养基后，常温孵育5min，均匀滴加到步骤S201的293T细胞培养皿中，轻柔混匀。在37℃，5％CO2培养箱中培养6h，吸弃上清，加入全新的DMEM完全培养基。
S203，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养步骤S202处理后的293T细胞，48h后收集上清液到离心管中，1500rpm，8min。离心后上层清液即病毒液，将其转移到干净的离心管。
(3)制备目的蛋白高表达间充质干细胞：
将第4-7代的MSC接种于10cm细胞培养皿中(接种量为2×105)，待细胞融合度达到50％时吸弃培养基，加入全新的干细胞专用培养基(购自上海朴茂生物科技有限公司，商品名为干细胞培养基)，均匀滴加500μL步骤(2)得到的病毒液感染MSC干细胞，加入polybrene至10μg/mL，培养24h后吸弃培养基，加入含有0.5μg/mL嘌呤霉素的全新干细胞专用培养基筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。
(4)外泌体提取：
S401,将步骤(3)得到的稳定感染的细胞株培养48h后，将培养基离心管进行离心(离心条件：4℃，2000g，10min)除去死细胞，再离心(离心条件：4℃，10000g，20min)去细胞碎片，丢弃沉淀，取上清液。
S402,取洁净的超离管，在底部加入500μL opti-prep形成缓冲层，上层加入步骤S401所得上清液，使用Beckman SW28转子，4℃，120000g，60min条件下进行离心。
S403，离心使外泌体迁移并浓缩到opti-prep缓冲层附近，然后收集靠近缓冲层的液体部分2mL。
S404，将步骤S403收集到的液体加入PBS，加入新的含有50μL opti-prep缓冲垫的洁净超离管，Beckman SW28转子，4℃，120000g，60min条件下超速离心后收集缓冲垫中所有颗粒(具体收集步骤为：离心去除上层液体，余50-500μL液体在管底，然后加入无菌PBS补足至1mL)，颗粒悬浮于1mL无菌PBS中即得到外泌体溶液(CXCR4high Exo)。每150-300mL步骤S401所得上清液可得1μg外泌体颗粒。所提取得到的外泌体形态呈碗状，大小为100-160nm。
(5)制备装载siRNA的外泌体：
取8μL siRNA(si-Survivin)与步骤S404所得外泌体溶液80μg在0-4℃下混合，加入电转缓冲液，放入电转杯，使用脉冲波进行电转(脉冲时间为10-15ms)，电转后在冰上孵育2h，即得到载有siRNA的外泌体(CXCR4high Exo/siRNA)。
效果验证：
对本实施例制备的载有siRNA的外泌体CXCR4highExo/siRNA(对应图5中的Exo/siRNA)以及裸siRNA(对应图5中的Naked siRNA)分别进行RNase酶处理一定时间，确定外泌体CXCR4highExo/siRNA对siRNA的保护作用。结果如图5所示，经过RNase酶处理30-60min后，外泌体包裹的siRNA仍具有明显条带，说明外泌体CXCR4highExo/siRNA能有效保护siRNA，在经历较长时间后仍能保持siRNA活性。
对本实施例制备所得的CXCR4highExo、载有siRNA的外泌体CXCR4highExo/siRNA以及与采用普通MSC代替上述S401步骤中采用的稳定感染的细胞株制备得到的普通外泌体Normal Exo用NTA进行粒径大小的检测，并用TEM观察形态大小。结果如图2所示：改造前后外泌体大小体积相近，说明改造MSC不会造成其释放的外泌体形态等改变。
利用流式细胞仪检测表面标志性蛋白CD81，CD63，CD9。通过流式细胞仪进行表面CXCR4蛋白检测。具体方法为：将10ug改造后的外泌体CXCR4highExo、普通外泌体Normal Exo分别与醛/硫酸胶乳珠共同孵化过夜，以1700rpm离心3分钟。然后吸出上清液，注意避免去除沉淀。用1毫升PBS洗涤下部沉淀物，将相应的流动抗体加入100ul沉淀悬液中，在室温下避光孵育15分钟。孵化后每管加入400ul PBS，以2000rpm离心3分钟。丢弃上清液，用400ulpbs清洗下部沉淀物，并转移到流式细胞仪上进行检测。结果用FlowJo进行分析。如图3和图4所示，改造后的外泌体CXCR4highExo仍具有其特征性，表面有CD81，CD63，CD9等特征性蛋白的表达；改造后的外泌体CXCR4highExo表面CXCR4表达量约为普通外泌体Normal Exo的5-10倍，有利于外泌体向肿瘤部位聚集。
实施例2
本实施例提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)过表达质粒的构建：
S101，设计PCR扩增片段引物，并在引物5’端引入线性化克隆载体末端的同源序列，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。并送公司合成引物。PCR扩增片段引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
S102，将含PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-puro载体质粒的菌液过夜培养，并取新鲜菌液5ml使用质粒小提试剂盒提取载体质粒。
S103，将1μg载体质粒，3μL green buffer，1.5μL XhoI和1.5μL BamHI混匀于23μLddH2O，37℃水浴酶切3h。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，切胶回收载体质粒。
S104，将1-2μg模版与步骤S101中合成的引物各2μL混合，加入25μL PCR Mix，ddH2O补足至50μL，设定程序进行PCR，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结束后切胶回收片段。
S105，用nanodrop测定酶切后载体质粒(步骤S103)的回收浓度为10-100ng/mL)及片段(步骤S104)回收浓度(浓度为10-100ng/mL)，使用Hieff CloneTM重组反应20μL体系，4μL 5×CE Buffer，2μL Exnase，100ng回收后载体与150ng回收后片段混匀于ddH2O，50℃水浴酶切20min，得载体与目的片段的连接产物。
S106，将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μl连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。之后于42℃水浴中热击90S。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。加入500μL不含抗生素的SOC培养基于37℃,225rpm振荡培养45min。3000rpm离心2min，弃掉900μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性组分氨苄(含量为100mg/mL)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养；送测以筛选正确的CXCR4表达质粒。该CXCR4表达质粒经检测具备CXCR4基因序列以及GFP荧光蛋白。
(2)慢病毒包装：
S201,在10cm培养皿中接种293T细胞(接种量为1×106个)，培养于DMEM完全培养基，待细胞融合度达到80％进行慢病毒包装。
S202,将10μg CXCR4表达质粒，10μg Lentiviral Mix，60μg HG TransgeneTMReagent混匀于1ml无血清DMEM培养基后，常温孵育10min，均匀滴加到步骤S201的293T细胞培养皿中，轻柔混匀。在37℃，5％CO2培养箱中培养4h，吸弃上清，加入全新的DMEM完全培养基。
S203,在37℃，5％CO2培养箱中继续培养293T细胞，48h后收集上清液到离心管中，1500rpm，8min条件下离心后所得上层清液即病毒液，将其转移到干净的离心管。
(3)制备目的蛋白高表达间充质干细胞(MSC)：
将第4-7代的MSC接种于10cm细胞培养皿中(接种量为2×105)，待细胞融合度达到50％吸弃培养基，加入全新的干细胞专用培养基，均匀滴加1mL步骤(2)得到的病毒液感染MSC干细胞，加入polybrene至5μg/mL，培养24h后吸弃培养基，加入含有1μg/mL嘌呤霉素的全新干细胞专用培养基筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。
(4)外泌体提取：
S401,将步骤(3)得到的稳定感染的细胞株培养48h后，将培养基加入离心管进行离心(离心条件：4℃，2000g，10min)除去死细胞，再离心(离心条件：4℃，10000g，20min)细胞碎片，丢弃沉淀，取上清液。
S402，取洁净的超离管，在底部加入200μL opti-prep形成缓冲层，上层加入步骤S401所得上清液，使用Beckman SW28转子，4℃，120000g，60min条件下进行离心。
S403，离心使外泌体迁移并浓缩到opti-prep缓冲层附近，然后收集靠近缓冲层的液体部分1mL。
S404,将步骤S403收集到的液体加入PBS，加入新的含有100μL opti-prep缓冲垫的洁净超离管，Beckman SW28转子，4℃，100000g，70min条件下超速离心后收集缓冲垫中所有颗粒(具体收集步骤为：离心去除上层液体，余50-500μL液体在管底，然后加入无菌PBS补足至1mL)，颗粒悬浮于1mL无菌PBS中即得到外泌体溶液(CXCR4highExo)。每150-300mL步骤S401所得上清液可得1μg外泌体颗粒。所提取得到的外泌体形态呈碗状，大小为100-160nm。
(5)制备装载siRNA的外泌体：
取4.8μL si-Survivin与步骤S404所得外泌体溶液80μg在0-4℃下混合，加入电转缓冲液，放入电转杯，使用脉冲波进行电转(脉冲时间为10-15ms)，电转后在冰上孵育2h，即得到载有si-Survivin的外泌体(CXCR4highExo/si-Survivin)。
效果验证：
对载有si-Survivin的外泌体进行RNase酶处理60min，确定其对si-Survivin的保护作用。结果显示经过RNase酶处理60min后，外泌体包裹的siRNA仍具有明显条带。
对所得载有siRNA的外泌体用NTA进行粒径大小的检测，并用TEM观察形态大小。与实施例1的图2结果相似。
利用流式细胞仪检测表面标志性蛋白CD81，CD63，CD9。通过流式细胞仪进行表面CXCR4蛋白检测。具体方法为：将10ug外泌体CXCR4highExo与醛/硫酸胶乳珠共同孵化过夜，以1700rpm离心3分钟。然后吸出上清液，注意避免去除沉淀。用1毫升PBS洗涤下部沉淀物，将相应的流动抗体加入100ul沉淀悬液中，在室温下避光孵育15分钟。孵化后每管加入400ul PBS，以2000rpm离心3分钟。丢弃上清液，用400ul pbs清洗下部沉淀物，并转移到流式细胞仪上进行检测。结果用FlowJo进行分析。结果表明：本实施例制备的外泌体CXCR4highExo仍具有其特征性，表面有CD81，CD63，CD9等特征性蛋白的表达；本实施例制备的外泌体CXCR4highExo表面CXCR4表达约为普通外泌体Normal Exo的5-10倍。
实施例3
本实施例提供一种靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)过表达质粒的构建：
S101，设计PCR扩增片段引物，并在引物5’端引入线性化克隆载体末端的同源序列，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。并送公司合成引物。PCR扩增片段引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
S102，将含PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-puro载体质粒的菌液过夜培养，并取新鲜菌液5ml使用质粒小提试剂盒提取载体质粒。
S103，将1μg载体质粒，3μL green buffer，1.5μL XhoI和1.5μL BamHI混匀于23μLddH2O，37℃水浴酶切3h。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，切胶回收载体质粒。
S104，将1-2μg模版与步骤S101中合成的引物各2μL混合，加入25μL PCR Mix，ddH2O补足至50μL，设定程序进行PCR，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结束后切胶回收片段。
S105，用nanodrop测定酶切后载体质粒(步骤S103)回收浓度(浓度为10-100ng/mL)及片段(步骤S104)回收浓度(浓度为10-100ng/mL)，使用Hieff CloneTM重组反应20μL体系，4μL 5×CE Buffer，2μL Exnase，100ng回收后载体与100ng回收后片段混匀于ddH2O，50℃水浴酶切20min，得载体与目的片段的连接产物。
S106，将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μl连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。之后于42℃水浴中热击90S。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。加入500μL不含抗生素的SOC培养基于37℃,225rpm振荡培养45min。3000rpm离心2min，弃掉900μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性组分卡那(含量为100mg/mL)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养；送测以筛选正确的CXCR4表达质粒。该CXCR4表达质粒经检测具备CXCR4基因序列以及GFP荧光蛋白。
(2)慢病毒包装：
S201,在10cm培养皿中接种293T细胞(接种量为1×106个)，培养于DMEM完全培养基，待细胞融合度达到80％进行慢病毒包装。
S202，将10μg CXCR4表达质粒，10μg Lentiviral Mix，60μg HG TransgeneTMReagent混匀于1ml无血清DMEM培养基后，常温孵育5min，均匀滴加到步骤S201的293T细胞培养皿中，轻柔混匀。在37℃，5％CO2培养箱中培养4h，吸弃上清，加入全新的DMEM完全培养基。
S203,在37℃，5％CO2培养箱中继续培养293T细胞，48h后收集的上清液经过0.45μm过滤器过滤后即得到病毒液。
(3)制备目的蛋白高表达间充质干细胞：
将第4-7代的MSC接种于10cm细胞培养皿中(接种量为2×105)，待细胞融合度达到50％吸弃培养基，加入全新的干细胞专用培养基，均匀滴加1mL步骤(2)得到的病毒液感染MSC干细胞，加入polybrene至10μg/mL，培养24h后吸弃培养基，加入含有1μg/mL嘌呤霉素的全新干细胞专用培养基筛选阳性克隆，扩增稳定感染的细胞株。
(4)外泌体提取：
S401,将步骤(3)得到的稳定感染的细胞株培养48h后，将培养基加入离心管进行离心(离心条件：4℃，10000g，30min)除去死细胞和细胞碎片，丢弃沉淀，取上清。
S402，取洁净的超离管，在底部加入400μL opti-prep形成缓冲层，上层加入步骤S401所得上清液，使用Beckman SW28转子，4℃，120000g，60min条件下进行离心。
S403，离心使外泌体迁移并浓缩到opti-prep缓冲层附近，然后收集靠近缓冲层的液体部分3mL。
S404，将步骤S403收集到的液体加入PBS，加入新的含有100μL opti-prep缓冲垫的洁净超离管，Beckman SW28转子，4℃，120000g，60min条件下超速离心后收集缓冲垫中所有颗粒(具体收集步骤为：离心去除上层液体，余50-500μL液体在管底，然后加入无菌PBS补足至1mL)，颗粒悬浮于1mL无菌PBS中即得到外泌体溶液(CXCR4highExo)。每150-300mL步骤S401所得上清液可得1μg外泌体颗粒。所提取得到的外泌体形态呈碗状，大小为100-160nm。
(5)制备装载siRNA的外泌体：
取4.8μL si-Survivin与步骤S404所得外泌体溶液60μg在0-4℃下混合，加入电转缓冲液，放入电转杯，使用脉冲波进行电转(脉冲时间为10-15ms)，电转后在冰上孵育2h，即得到载有si-Survivin的外泌体。
效果验证：
对载有si-Survivin的外泌体进行RNase酶处理90min，确定其对si-Survivin的保护作用。结果显示经过RNase酶处理90min后，外泌体包裹的si-Survivin仍具有明显条带。
对所得载有si-Survivin的外泌体用NTA进行粒径大小的检测，并用TEM观察形态大小。与实施例1的图2结果相似。
利用流式细胞仪检测表面标志性蛋白CD81，CD63，CD9。通过流式细胞仪进行表面CXCR4蛋白检测。具体方法为：将10ug外泌体CXCR4highExo与醛/硫酸胶乳珠共同孵化过夜，以1700rpm离心3分钟。然后吸出上清液，注意避免去除沉淀。用1毫升PBS洗涤下部沉淀物，将相应的流动抗体加入100ul沉淀悬液中，在室温下避光孵育15分钟。孵化后每管加入400ul PBS，以2000rpm离心3分钟。丢弃上清液，用400ul pbs清洗下部沉淀物，并转移到流式细胞仪上进行检测。结果用FlowJo进行分析。结果表明：本实施例制备的外泌体CXCR4highExo仍具有其特征性，表面有CD81，CD63，CD9等特征性蛋白的表达；本实施例制备的外泌体CXCR4highExo表面CXCR4表达约为普通外泌体Normal Exo的5-10倍。
基于上述实施例得到的干细胞外泌体，以下对其在制备靶向肿瘤部位递送基因药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
应用实施例一、对A549肺癌细胞的共培养及皮下瘤的治疗
将A549细胞汇合度控制在60-70％，在加入运载siRNA的CXCR4高表达外泌体CXCR4high Exo/si-Survivin(即实施例1制备的CXCR4high Exo/siRNA)之前，先对A549细胞进行换液，换上新的培养液后，按20ug/ml的浓度将运载si-Survivin的CXCR4高表达外泌体CXCR4high Exo/si-Survivin加入到培养液中，分别在2h、4h、12h、48h后进行外泌体定位检测，同时按相同浓度将CXCR4normalExo/siRNA(其为将实施例1的步骤S202中采用的CXCR4表达质粒替换为原始质粒后，经步骤4得到CXCR4normalExo，再经步骤5得到CXCR4normalExo/siRNA)、CXCR4highExo+siRNA(其为同时添加CXCR4high Exo和siRNA到培养液进行相应检测)、CXCR4normalExo+siRNA(其为同时添加经电穿孔后的CXCR4normal Exo和siRNA到培养液)分别加入到培养液中进行相同的外泌体定位检测。如图6显示：A549细胞对于CXCR4high Exo的摄取量远远大于对于CXCR4normal Exo的摄取量。且从图6中可以看到改造后外泌体在较短时间就实现了在肿瘤细胞的富集并有效释放siRNA，并在较长的作用时间后，仍具有将siRNA在肿瘤细胞内释放的能力。
采用常规方法构建肺癌的皮下瘤小鼠模型，当小鼠模型的皮下瘤体积到达100mm3后，进行治疗，按2g/kg(注射药物用量与小鼠体重的比例)对小鼠进行尾静脉注射各实验组(2-裸siRNA组、3-CXCR4normal Exo组、4-CXCR4high Exo组、5-CXCR4normal Exo/si-Survivin(即前述的CXCR4normal Exo/siRNA)组、6-CXCR4high Exo/si-Survivin(即前述的CXCR4highExo/siRNA)组)和空白对照组(1-PBS组)的药物，每7天注射一次，注射后进行小动物成像，结果如图7所示，图中显示2h内改造后外泌体(6-CXCR4high Exo/si-Survivin组)就实现了在肿瘤部位的聚集，而未改造的外泌体(5-CXCR4normal Exo/si-Survivin组)靶向肿瘤部位并释放siRNA所需要的时间长，且不能长时间有效释放。改造后外泌体在长时间的体内循环后仍显示出优秀的肿瘤靶向能力及siRNA释放效率。治疗3周的结果如图8所示，与其余实验组和对照组相比，CXCR4normal Exo/si-Survivin实验组对肿瘤生长的抑制没有CXCR4highExo/si-Survivin实验组强。21天后，CXCR4high Exo/si-Survivin实验组的肿瘤体积大小约为对照组的20％以下，而CXCR4normal Exo/si-Survivin实验组的肿瘤则增长到约400mm3。令人鼓舞的是，在治疗21天后，CXCR4high Exo/si-Survivin实验组的肿瘤体积仍在200mm3以下。由此可得CXCR4高表达的外泌体CXCR4highExo/si-Survivin具有更强的抗肿瘤效果。
应用实施例二、对MGC803胃癌细胞的共培养及皮下瘤的治疗
将MGC803细胞汇合度控制在60-70％，在加入运载siRNA的CXCR4高表达外泌体CXCR4high Exo/si-Survivin之前，先对MGC803细胞进行换液，换上新的培养液后，按20ug/ml运载siRNA的CXCR4高表达外泌体CXCR4high Exo/si-Survivin(即实施例1制备的CXCR4highExo/siRNA)加入到培养液中，24小时后进行活性检测。结果显示：MGC803细胞对于CXCR4highExo的摄取量远远大于对于CXCR4norma Exo的摄取量。
采用常规方法构建胃癌的皮下瘤小鼠模型，当小鼠模型皮下瘤体积到达100mm3后，进行治疗，按2g/kg(注射药物用量与小鼠体重的比例)对小鼠进行尾静脉注射各实验组(裸siRNA组、CXCR4normal Exo组、CXCR4high Exo组、CXCR4normal Exo/si-Survivin组、CXCR4highExo/si-Survivin组)和空白对照组(PBS组)的药物，每7天注射一次，治疗3周。结果如图8所示，与其余实验组和对照组相比，CXCR4normal Exo/si-Survivin实验组对肿瘤生长的抑制没有CXCR4high Exo/si-Survivin实验组强。21天后，CXCR4high Exo/si-Survivin实验组的肿瘤体积大小约为对照组的20％以下，而CXCR4normal Exo/si-Survivin实验组的肿瘤则增长到接近400mm3。令人鼓舞的是，在治疗21天后，CXCR4high Exo/si-Survivin实验组的肿瘤体积仍小于200mm3。由此可得出CXCR4高表达的外泌体CXCR4high Exo/si-Survivin具有更强的抗肿瘤效果。
需要说明的是，上述实施例2和3制备的CXCR4高表达的外泌体CXCR4high Exo/si-Survivin也同样具有与实施例1制备的CXCR4高表达的外泌体相同的抗肿瘤效果。
本发明上述实施例，通过慢病毒转染改造外泌体来源细胞，从而建立趋向性更强的运载体系，利用外泌体特异性靶向受损部位，高效低送RNA治疗药物用于癌症靶向治疗。本发明构建了具有高趋向性及高siRNA装载效率的外泌体，从而实现特异部位的高效治疗。改造后外泌体表面CXCR4蛋白提高5-10倍，表现出高趋向性及良好的聚集效果，2小时内即可通过溶酶体途径释放内容物，持续作用48小时，而后实现逃逸，在体外和体内都表现出显著的抑制肿瘤细胞生长的效果且具有优良的生物安全性，是一种安全性高，靶向性高，适用范围广的药物运载体系。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备与应用
<130> SHJX1730I
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcgaattcg aagtatacct cgaggccacc atggagg 37
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgatcgcaga tccttggatc cttagctgga gtgaaaactt gaagactcag a 51

Claims (10)

1.一种靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、过表达质粒的构建：将载体质粒与PCR扩增的目的蛋白的DNA片段进行重组反应，得到载体与目的蛋白的DNA片段的连接产物；再将连接产物加入感受态细胞中，热击处理后筛选得到过表达质粒；
S2、慢病毒包装：将过表达质粒与Lentiviral Mix质粒、转染试剂进行共转染293T细胞，然后收集病毒液；
S3、制备目的蛋白高表达间充质干细胞：将步骤S2收集的病毒液加入干细胞中，再加入聚凝胺培养，然后筛选获得稳定感染的细胞株；
S4、外泌体提取：将步骤S3获得的细胞株培养后第一次离心，所得上清液再加入缓冲层后进行第二次离心，收集靠近缓冲层的溶液；再将收集的溶液加入缓冲层后进行第三次离心，收集缓冲层中的颗粒，即得外泌体；
S5、制备装载siRNA的外泌体：将siRNA与步骤S4获得的外泌体混合后，进行电转，然后孵育，即得装载siRNA的外泌体。
2.根据权利要求1所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述载体质粒为含PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-puro载体质粒；
所述目的蛋白为CXCR4蛋白，PCR扩增所述目的蛋白的DNA片段所采用的引物序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述重组反应的反应体系以总体积为20μl计，包括以下含量的各组分：
组分 含量 5×CE Buffer 4μl 载体质粒 50～200ng 目的蛋白的DNA片段 20～200ng Exnase 2μl ddH<sub>2</sub>O 补足到20μl
所述载体质粒在反应体系中的浓度为2.5-10ng/μl，目的蛋白的DNA片段的浓度为1-10ng/μl；
所述反应条件为50℃水浴反应10-30min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述热击处理的条件为：42℃水浴中热击90S；
所述筛选的具体步骤为：将热击处理后的感受态细胞先加入不含抗生素的SOC培养基中振荡培养，再加入到含有载体上对应抗性组分的培养基中倒置培养，然后测试得到正确的过表达质粒；
所述过表达质粒为含PGMLV-CMV-H_CXCR4-PGK-puro质粒。
5.根据权利要求1所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述慢病毒包装的具体步骤为：先将过表达质粒与LentiviralMix质粒、转染试剂混匀于无血清DMEM培养基后，常温孵育；然后将孵育后的混合物加到293T细胞中混匀，培养4-6h，吸弃上清；再加入新的DMEM完全培养基继续培养，48h后收集的上清液离心或过滤后即得病毒液。
所述过表达质粒与Lentiviral Mix质粒、转染试剂的质量比为1：1：6；所述转染试剂为HG TransgeneTM Reagent；所述孵育时间为5-10min；
所述293T细胞为培养至细胞融合度达到80％的293T细胞。
6.根据权利要求1所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述干细胞为间充质干细胞第4-7代，所述干细胞的生长密度为50％；
所述病毒液的加入量为500μL-1mL；所述聚凝胺的加入浓度为5-10μg/mL；
所述筛选的步骤具体为：将培养后的干细胞加入含有嘌呤霉素的干细胞专用培养基中筛选阳性克隆；所述嘌呤霉素的添加浓度为0.5-1μg/mL；
所述稳定感染的细胞株中表面目的蛋白表达量为起始的干细胞的200-1000倍。
7.根据权利要求1所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述缓冲层为opti-prep形成的缓冲层，所述第二次离心中加入的opti-prep的体积为100-500μL/离心管，所述第三次离心中加入的opti-prep的体积为50μL/离心管；
所述收集靠近缓冲层的溶液体积为1-12mL；
所述第一次离心的条件具体为：温度4℃、转速为2000-10000g下离心30min；
所述第二次离心和第三次离心的条件具体各为：使用Beckman SW28转子、温度4℃、转速为10000-12000g下离心60-70min。
8.根据权利要求1所述的靶向受损部位递送RNA药物的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述siRNA与泌体的混合质量比为1:10-20；所述混合的温度为0-4℃；
所述电转采用脉冲波电转，脉冲时间为10-15ms；
所述孵育为在冰上孵育0.5-2h。
9.一种间充质干细胞外泌体，其特征在于，根据权利要求1-8任一项方法制备得到，所述间充质干细胞装载有siRNA,且能维持siRNA活性。
10.一种根据权利要求9所述的间充质干细胞外泌体在制备靶向受损部位递送RNA药物中的应用，其特征在于，所述受损部位包括肿瘤部位。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113106070A (zh) * 2021-02-02 2021-07-13 蚌埠医学院第一附属医院 一种能够靶向并阻断趋化因子受体的外泌体及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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SHUYUE XU ET AL.: "Engineered mesenchymal stem cell-derived exosomes with high CXCR4 levels for targeted siRNA gene therapy against cancer", NANOSCALE, pages 1 *

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