CN112625097B - 灵芝免疫调节蛋白突变体及应用 - Google Patents

灵芝免疫调节蛋白突变体及应用 Download PDF

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Abstract

一种灵芝免疫调节蛋白突变体，包括：FIP‑gluMN31S、FIP‑gluMT36N和FIP‑gluMN31S/T36N，其中：FIP‑gluMN31S的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示；FIP‑gluMT36N的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示；FIP‑gluMN31S/T36N的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。本发明能够解决FIP‑glu在应用对细胞毒性较大的问题，经过改造的突变体对细胞产生的毒性相较于灵芝免疫调节蛋白(FIP‑glu)有显著性降低，可以有效提高其利用价值。

Description

灵芝免疫调节蛋白突变体及应用
本申请为：申请号[201910792979.3]申请日[2019/8/27]名称[灵芝免疫调节蛋白突变体及应用]之分案申请。
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种灵芝免疫调节蛋白突变体。
背景技术
真菌免疫调节蛋白(fugal immunomodulatory protein，FIP)最初分离于高等担子菌，是一种具有免疫调节功能的小分子蛋白质。1989年Kino等人从灵芝(Ganodermaspp.)中分离出第一种FIP(LZ-8或FIP-glu)后，研究人员陆续从多种食药用菌中发现了更多的FIP。它们构成了一个新的蛋白质家族——FIP。FIP家族的蛋白质具有抗肿瘤、抗过敏、刺激免疫细胞产生多种细胞因子等多种免疫调节作用，具有良好的临床应用前景和药用保健价值。真菌免疫调节蛋白由110～140个氨基酸组成，分子量约为13kD，其中缺乏组氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸，富含天冬氨酸和缬氨酸。其N末端的氨基酸均为乙酰化氨基酸。绝大多数的FIP是以同型二聚体的形式存在的。此外，FIP与免疫球蛋白重链可变区具有很大的相似性。
研究发现，FIP对多种癌细胞均表现出明显的生长抑制活性。例如，在大肠杆菌中表达的重组FIP-gts可在内体和体外抑制人肺癌细胞A549的生长(Chien-Huang Liao，Yi-Min Hsiao， Chung-Ping Hsu，Meei-Yn Lin，James Chun-Huan Wang，&Yu-Lu Huang，etal.(2006). Transcriptionally mediated inhibition of telomerase of fungalimmunomodulatory protein from ganoderma tsugae in a549 human lungadenocarcinoma cell line.Molecular Carcinogenesis，45.)，是通过下调端粒酶催化亚基(hTERT)的转录调节，抑制端粒酶活性来造成对细胞的抑制生长。此外，从酵母中获得的重组FIP-glu明显抑制人白血病细胞NB4(Lin，J.W.，Hao，L.X.， Xu，G.X.，Sun，F.，Gao，F.，&Zhang，R.，et al.(2009).Molecular cloning and recombinant expression of a geneencoding a fungal immunomodulatory protein fromganoderma luciduminpichiapastoris.World Journal of Microbiology&Biotechnology，25(3)， 383-390.)、人肺癌细胞A549和Lewis肺癌细胞LLC1(Wu，C.T.，Lin，T.Y.，Hsu，H.Y.， Sheu，F.，Ho，C.M.，&Chen，I.T..(2011).Lingzhi-8mediates p53-dependent growth arrest of lung cancercells proliferation via the ribosomal protein s7-mdm2-p53pathway.Carcinogenesis，32(12)，1890-1896.)的生长和增殖。我们还曾发现重组FIP-gat具有抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的作用(Xu，H.，Kong，Y.Y.，Chen，X.，Guo，M.Y.，&Zhou，X..(2016).Recombinantfip-gat，a fungal immunomodulatory protein fromganoderma atrum，induces growth inhibition and cell death in breast cancercells.Journal of Agricultural and Food Chemistry，64(13).)，通过芯片分析，发现经重组FIP-gat处理， MDA-MB-231中有669个差异表达的基因，它们的倍数变化至少在2倍以上，与细胞凋亡相关的基因，如TNFSF8、DRD1、SMPD1和BCL-2也均发生了上调。据研究发现，通过基因工程手段，利用酵母表达***生产的重组FIP-glu在一定的范围内对鼠源巨噬细胞RAW264.7具有毒性，该研究结果进一步使得FIP在医药领域的应用受到了极大的限制。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种灵芝免疫调节蛋白突变体，能够解决 FIP-glu在应用对细胞毒性较大的问题，经过改造的灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMN31S、 FIP-gluMT36N和FIP-gluMN31S/T36N对细胞产生的毒性相较于灵芝免疫调节蛋白(FIP-glu)有显著性降低，可以有效提高其利用价值。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一类灵芝免疫调节蛋白突变体，包括：FIP-gluMN31S、FIP-gluMT36N和FIP-gluMN31S/T36N，其中：FIP-gluMN31S的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.4所示；FIP-gluMT36N的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示； FIP-gluMN31S/T36N的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。
本发明涉及上述突变体的制备方法，以核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的灵芝免疫调节蛋白(FIP-glu)的核苷酸序列为模板，通过采用对应的引物序列经过 PCR扩增后得到。
所述的对应的引物序列是指：
①采用SEQ ID NO.9～12所示的引物，PCR扩增得到FIP-gluMN31S；
②采用SEQ ID NO.9、12、13、14所示的引物，PCR扩增得到FIP-gluMT36N；
③采用SEQ ID NO.9、10、12、15所示的引物，PCR扩增得到FIP-gluMN31S/T36N。
所述的PCR扩增，其采用的载体包括但不限于质粒、噬菌体或病毒载体，优选为真核表达载体pPIC9K。
所述的制备方法，进一步优选扩增后得到的核苷酸序列克隆至载体，通过构建重组载体和转化至工程菌后，经诱导表达并纯化。
所述的工程菌优选为酵母菌。
本发明涉及上述灵芝免疫调节蛋白突变体的应用，用于制备***的药物。
所述的肿瘤包括：肾上腺肿瘤、胆管肿瘤、***、血液肿瘤、骨和***肿瘤、脑和中枢神经***肿瘤、乳腺肿瘤、***、结肠直肠肿瘤(结直肠肿瘤)、子宫内膜肿瘤、食管肿瘤、胆囊肿瘤、头颈部肿瘤、霍奇金氏(Hodgkin's)淋巴瘤、下咽肿瘤、肾脏肿瘤、喉肿瘤、白血病、肝肿瘤、肺肿瘤、淋巴瘤、纵隔肿瘤、黑色素瘤(恶性黑素瘤)、间皮瘤、多发性骨髓瘤、鼻腔肿瘤、鼻咽肿瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、口腔肿瘤、食道肿瘤、口咽肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、鼻窦肿瘤、甲状旁腺肿瘤、***肿瘤、垂体肿瘤、***肿瘤、涎腺肿瘤、肉瘤、皮肤肿瘤、脊柱肿瘤、胃肿瘤、睾丸肿瘤、甲状腺肿瘤、尿道肿瘤、子宫肿瘤、***肿瘤和外阴肿瘤。
所述的药物，包含药物载体和分散于其中的治疗有效量的本发明的灵芝免疫调节蛋白突变体。所述组合物可以是固体或液体。通常根据所使用的施用类型选择药物载体，并且药物载体可以是固体或液体。本发明的灵芝免疫调节蛋白突变体可以与药物载体处于相同或不同的相。
所述的药物，采用片剂、包衣片、硬或软明胶胶囊、溶液、乳液、悬液、栓剂或注射液的形式。
技术效果
与现有技术相比，本发明突变体获得方式、表达方法、纯化过程简单，制备得到的灵芝免疫调节蛋白突变体相比野生型灵芝免疫调节蛋白具有更低的细胞毒性和更高的生物学活性。
附图说明
图1为实施例重组灵芝免疫调节蛋白检测示意图；
图中：A：SDS-PAGE检测；B：Western Blot检测；
图2为实施例细胞毒性检测示意图；
图3为实施例TNF-α转录水平检测示意图。
具体实施方式
实施例1
灵芝免疫调节蛋白(FIP-glu)的获得
1)提取赤芝基因组DNA。灵芝菌种(Ganoderma lucidium 50044)，由上海交通大学植物生物技术研究中心保存。灵芝RNA提取方法参照天根(TIANGEN)RNA提取试剂盒。
2)通过PCR对灵芝免疫调节蛋白基因FIP-glu进行扩增，并将扩增后的目的基因进行回收纯化。
3)对pPIC9K载体和扩增的FIP-glu基因PCR产物用EcoR I和Apa I双酶切，回收酶切后的质粒及目的基因。将回收后的质粒及目的基因用T4 DNA连接酶连接后，转入感受态E.coli DH5α细胞。上述pPIC9K载体及感受态E.coli DH5α细胞由复旦-交大-诺丁汉植物生物技术研发中心实验室保存；上述EcoR I酶、Apa I酶和T4 DNA连接酶由宝生物工程(大连)有限公司购买。
4)经上海生工生物工程有限公司测序后，获得正确序列的重组表达载体，即pPIC9K-glu。提取pPIC9K-glu质粒，将该质粒用限制性内切酶Sac I线性化后，转入毕赤酵母GS115。经PCR 鉴定后，获得阳性酵母转化子。上述限制性内切酶Sac I从New EnglandBio-labs(NEB)公司购买；毕赤酵母GS115由复旦-交大-诺丁汉植物生物技术研发中心实验室保存。
5)使用BMMY培养基，诱导酵母转化子产生重组FIP-glu蛋白。经过SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定，结果如图1中A和B的泳道1所示。
实施例2
灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMN31S的获得
以SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列为模板，分别以P1和P2以及P3和P4为引物(序列如SEQ ID NO.9～12所示)进行PCR扩增反应。将所得产物混合后，再进行一次PCR反应，从而获得灵芝免疫调节蛋白突变体基因FIP-gluMN31S序列。重组灵芝免疫调节蛋白突变体 FIP-gluMN31S的获得方式与实施例1相同，其表达产物经过SDS-PAGE和Western Blot鉴定，确定所得蛋白为灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMN31S，鉴定结果如图1中A和B的泳道2所示。
表1用于本实施例的引物序列
Figure BDA0002870337340000041
实施例3
灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMT36N的获得
以SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列为模板，分别以P1和P5以及P6和P4为引物(序列如SEQ ID NO.9、12、13、14所示)，进行PCR扩增反应。将所得产物混合后，再进行一次PCR 反应，从而获得灵芝免疫调节蛋白突变体基因FIP-gluMT36N序列。重组灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMT36N的获得方式与实施例1相同，其表达产物经过SDS-PAGE和Western Blot鉴定，确定所得蛋白为灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMT36N，鉴定结果如图1中的A和B的泳道3 所示。
表2用于本实施例的引物序列
Figure BDA0002870337340000042
Figure BDA0002870337340000051
实施例4
灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMN31S/T36N的获得
以SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列为模板，分别以P1和P2以及P7和P4为引物(序列如SEQ ID NO.9、10、12、15所示)，进行PCR扩增反应。将所得产物混合后，再进行一次PCR 反应，从而获得灵芝免疫调节蛋白突变体基因FIP-gluMN31S/T36N序列。重组灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMN31S/T36N的获得方式与实施例1相同，其表达产物经过SDS-PAGE和WesternBlot 鉴定，确定所得蛋白为灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMN31S/T36N，鉴定结果如图1中的A和B 的泳道4所示。
表3用于本实施例的引物序列
Figure BDA0002870337340000052
实施例5
活性测定
1.细胞毒性实验
用亚甲基蓝吸收法测定FIP-glu、FIP-gluMN31S、FIP-gluMT36N和FIP-gluMN31S/T36N对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7活力的影响。分别用10μg/mL的FIP-glu、FIP-gluMN31S、FIP-gluMT36N和FIP-gluMN31S/T36N处理RAW264.7细胞。24小时后弃去上清液，每孔加入50μL 0.6％亚甲蓝染色细胞。将细胞板在37℃条件下孵育60分钟后，吸取上清。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，风干后加入50μL洗脱缓冲液(体积比：乙醇︰PBS︰乙酸＝50︰49︰1)，孵育20分钟后，使用酶标仪(BIO-TEK，USA)测量570nm处吸光值。结果如图2所示，重组灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMN31S、FIP-gluMT36N和FIP-gluMN31S/T36N对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性显著小于FIP-glu。
2.细胞因子检测
将小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7分别与10μg/mL FIP-glu、FIP-gluMN31S、FIP-gluMT36N和FIP-gluMN31S/T36N共培养6小时后，提取总RNA，用qRT-PCR检测TNF-αmRNA的产量，其中TNF-α的正向引物为5’-TTCTATGGCCCAGACCCTCA-3’，反向引物为 5’-ACAAGGTACAACCCATCGGC-3’；内参β-actin的正向引物为5’-ATCGTGCGGGACATCAAGG-3’，反向引物为5’-TCGTTGCCGATGGTGATGAC-3’。qRT-PCR使用Roche Light Cycler 96进行。反应程序如下：将样品加热至95℃持续1分钟，在95℃下变性20秒，在55℃下退火20秒，在72℃下延伸20秒，并循环45次。细胞因子TNF-α的mRNA检测结果如图3所示，经重组灵芝免疫调节蛋白突变体FIP-gluMN31S、FIP-gluMT36N和FIP-gluMN31S/T36N处理的巨噬细胞 RAW264.7所产生的TNF-αmRNA水平显著高于经FIP-glu处理的巨噬细胞RAW264.7所产生的TNF-αmRNA水平。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 灵芝免疫调节蛋白突变体及应用
<130> fnc307e
<141> 2019-08-27
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gggaagaggt aacccatcta acttcatcga caccgttacc ttcccaaag 49
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
atgatgatgg ggcccgttcc attgagcaat gatgaagtcg 40
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gaagttgttt gggttacctc ttccc 25
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gggaagaggt aacccaaaca attcatcgac aacgttacct tcccaaag 48
<210> 15
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gggaagaggt aacccatcta acttcatcga caacgttacc ttcccaaag 49

Claims (5)

1.一类灵芝免疫调节蛋白突变体，其特征在于，具体为FIP-gluMT36N，其氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述突变体的制备方法，其特征在于，以SEQ ID NO.7所示的灵芝免疫调节蛋白FIP-glu的核苷酸序列为模板，通过采用对应的引物序列经过PCR扩增后得到；
所述的引物序列是指：采用SEQ ID NO.9、12、13、14所示的引物，PCR扩增得到FIP-gluMT36N。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增，其采用的载体包括质粒、噬菌体或病毒载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的载体为真核表达载体pPIC9K。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，在PCR扩增后得到的核苷酸序列克隆至载体，通过构建重组载体和转化至工程菌后，经诱导表达并纯化。
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