CN102206680B - 基于短链核酸片段的基因电转染缓冲液及其制备和应用方法 - Google Patents

Abstract

一种基因输送技术领域的基于短链核酸片段的基因电转染缓冲液及其制备和应用方法，将鲑鱼精DNA经超声处理后回收DNA片段，再用生理盐水配制成含短链核酸片段DNA的电转染缓冲液；将外源基因溶解于短链核酸片段DNA电转染缓冲液后制成基因电转染液，用于目标细胞的电转染输送。本发明通过使用含短链核酸片段的基因电转染缓冲液，能够明显提高外源基因在目标细胞的基因电转染效果并消除毒副作用，通过这种作用一方面可以直接提高基因的电转染输送效果，另一方面可以减少外源基因的使用量或使用相对较低的电压达到同样的基因输送效果。

Description

基于短链核酸片段的基因电转染缓冲液及其制备和应用方法

技术领域

本发明涉及的是一种基因输送技术领域的转染介质及其制备和应用方法，具体是一种基于短链核酸片段的基因电转染缓冲液及其制备和应用方法。

背景技术

基因治疗是通过基因水平的操纵和干预来预防或抑制疾病的发生和发展过程。目前已经有多种类型的基因药物，如表达治疗基因的质粒DNA或病毒载体、DNA疫苗、反义核酸、核酶、小干扰RNA等都已被广泛用于基因治疗的研究。相关的体内外研究都取得了很好的结果，显示这些基因治疗策略有望成为遗传疾病、肿瘤、病毒感染等疾病的有效治疗手段。

不过，应用基因进行基础研究和疾病治疗的主要障碍是缺乏有效的基因输送方法和载体。目前常用的载体可以分为病毒载体和非病毒载体两类，病毒载体是非常有效的转基因载体，但是病毒载体的容量有限，可能会导致免疫反应或细胞毒性，另外还可能会产生致病的缺损型病毒或整合到宿主基因组中引起致癌反应，而且重复使用病毒载体也会因诱导的免疫反应而削弱转基因的表达效果，考虑到这些局限性，对非病毒载体的研究愈来愈引起人们的关注。目前研究常用的非病毒载体包括脂质体、阳离子聚合物、壳聚糖、微球等。相对于病毒载体，这些非病毒载体具有大的装载容量，低免疫原性等特点，但较低的转染效果同样也限制了它们的使用。目前最简单的方法是将基因直接导入靶细胞内，特别在一些组织如肌肉，注射裸DNA质粒并结合其他的方法如基因枪、电穿孔、声致孔等则取得了很好的效果。

电穿孔是一种采用机械方法将极性分子通过细胞膜引入宿主细胞的方法，由于它高效率、快速、易于执行、组织特异性好、价格便宜等优点，该技术已经成为相当有效的非病毒基因转移技术，并在生物学研究和医疗领域广泛使用。这种基于电脉冲的高效DNA导入可能与电脉冲导致的细胞膜通透性提高和DNA电泳效果有关，因此转染相关的参数如电脉冲强度和持续时间、电极类型和***方式、DNA的浓度、转染缓冲液的成分及浓度等都会影响基因电转染的效果，对这些参数的优化有助于提高基因电转染的效果，减小毒副作用，提高其在基础研究和临床应用中的可行性。

经过对现有技术的检索发现，F.Nicol，M.Wong，F.C.MacLaughlin，J.Perrard，E.Wilson，J.L.Nordstrom，L.C.Smith，Poly-L-glutamate，ananionicpolymer，enhancestransgeneexpressionforplasmidsdeliveredbyintramuscularinjectionwithinvivoelectroporation，GeneTher，(2002)1351-1358【一种阴离子聚合物：聚-L-谷氨酸，提高了质粒在骨骼肌内电穿孔转基因表达】中记载了在DNA的电转染溶液中添加一种阴离子聚合物：聚谷氨酸可以明显提高外源基因电转染后在相应组织里的表达量。但是该技术使用的聚谷氨酸需要化学合成或发酵制备，临床使用对其聚合度的控制和纯度都有很高的要求。另外，其对组织和细胞的毒性及在体内的降解清除都需要考虑。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于短链核酸片段(shortsequenceDNA，ssDNA)的基因电转染缓冲液及其制备和应用方法，通过在电转染过程中使用该电转染缓冲液，促进外源基因进入细胞及在细胞内的表达，提高在目标细胞的基因电转染效果并消除毒副作用，通过这种作用一方面可以直接提高基因的电转染输送效果，另一方面可以减少外源基因的使用量或使用相对较低的电压达到同样的基因输送效果。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过首先将鲑鱼精DNA经超声处理后回收DNA片段，再用生理盐水配制成短链核酸片段DNA电转染缓冲液；然后将需要转染的外源基因溶解于短链核酸片段DNA电转染缓冲液中配制成基因电转染液，用于目标细胞的电转染输送。

所述的鲑鱼精DNA的浓度为1mg/mL。

所述的回收DNA片段是指：采用1％琼脂糖凝胶进行电泳，根据电泳标签割胶回收300-500bp的DNA片段。

所述的生理盐水是指：经过灭菌的0.9％氯化钠溶液，用量为0.01mL-1mL。

所述的短链核酸片段为单链或双链的DNA或RNA片段；为通过合成、生物提取、或通过对其它核酸的扩增、酶切、超声或其它方法制备得到；其长度为从二十个碱基或碱基对到两千个碱基或碱基对。

所述的外源基因包括：动物、植物和微生物的细胞基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA或RNA、核酶、反义核酸、小干扰RNA或其它类型的核酸及其载体，该外源基因为从生物中直接分离得到或通过化学合成或采用分子克隆等技术制备得到。

所述的短链核酸片段与外源基因的比例为0.2∶1到8∶1。

所述的目标细胞包括：体外培养的植物细胞、动物细胞、微生物及动植物体内组织细胞。

本发明涉及上述方法制备得到的基于短链核酸片段的基因电转染缓冲液，其组分含量为：每毫升缓冲液含9mg氯化钠、0.4μg-40mg短链核酸片段，余量为无菌去离子水。

本发明将短链核酸片段应用到基因电转染过程中，明显提高了基因电转染的效果。其优点在于：短链核酸片段可以明显提高基因电转染的效率，其基因为各种类型和结构的核酸序列及其载体；短链核酸片段来源广泛、制备简单，不同来源、不同形态和长度的核酸片段对基因电转染效果都有促进作用；短链核酸片段本身作为生命体遗传物质的组成成分，在体内或细胞内容易被核酸酶快速降解，没有免疫原性和毒副作用；短链核酸片段对体外培养的植物细胞、动物细胞、微生物以及体内组织细胞的电转染效果都具有促进作用。

附图说明

图1短链核酸片段在组织细胞中对荧光素酶报道基因电转染效果的促进作用。

图2不同电场强度下短链核酸片段对荧光素酶报道基因电转染效果的促进作用。

图3不同含量的短链核酸片段对荧光素酶报道基因电转染效果的促进作用。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

短链核酸片段DNA电转染缓冲液(EP-buffer)的制备：

将1mg/mL的鲑鱼精DNA(Promega)超声(150W，40kHz，25℃，)20分钟后经1％琼脂糖凝胶电泳(60V，1hr)分离，根据电泳对照条带(marker)割取300-500bp片段处的凝胶，用Qiagen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化DNA片段，并用生理盐水配制成1mg/mL的短链核酸片段DNA电转染缓冲液(EP-buffer)备用。

生理盐水：灭菌的0.9％氯化钠溶液。

报道基因：荧光素酶(luciferase)质粒(pGL3-ControlVector)购买自Promega公司，将其转化感受态细胞DH5α后摇菌扩增，使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒(Gigakit)进行抽提，用生理盐水配制成1mg/mL的溶液备用。

基因电转染液的制备：

基因电转染液1：将3μl1mg/mL荧光素酶质粒，3μl1mg/mL的短链核酸片段DNA电转染缓冲液和44μl的生理盐水混匀制备成总体积为50μl的基因电转染溶液1(buffer1)。

基因电转染液2：将3μl1mg/mL荧光素酶质粒，6μl1mg/mL的短链核酸片段DNA电转染缓冲液和41μl的生理盐水混匀制备成总体积为50μl的基因电转染溶液2(buffer2)。

基因电转染液3：将3μl1mg/mL荧光素酶质粒，12μl1mg/mL的短链核酸片段DNA电转染缓冲液和35μl的生理盐水混匀制备成总体积为50μl的基因电转染溶液3(buffer3)。

实验动物：使用的小鼠为6-8周的健康雄性BALB/c，购于上海实验动物中心。

电脉冲仪和电极针：使用的电脉冲仪由上海TERESA科技公司提供。所用电极针为两针电极，针间距3mm，针长5mm。

实验过程包括如下步骤：

实验进行前，用40mg/mL的水合氯醛(Chloralhydrate)按体重的1％对小鼠进行腹腔注射麻醉，小鼠完全镇定后，在小腿胫前肌部位注射准备好的基因电转染液(buffer)50μl。注射结束1分钟内，跨注射点***两针电极并释放电脉冲，电脉冲参数为电压：60V或36V，脉冲个数：6，脉冲持续时间：50毫秒，脉冲间隔：1秒。电转染一天后取转染组织并匀浆，10000rpm，4℃离心10分钟后取上清使用荧光素酶检测试剂盒(Promega)和TD-20/20化学/生物发光检测仪(TurnerDesigns)检测荧光素酶的含量。

试验结果以及分析。

在使用60V电压(200V/cm)电转染过程中结合使用含300-500bp短链核酸片段的电转染缓冲液的实验组(buffer2)，其组织细胞内报道基因荧光素酶的表达水平达到3500，而不使用短链核酸片段DNA电转染缓冲液的对照组只有350，即使是转染三倍剂量的报道基因(9μgpGL3-ControlVector)，如果不使用短链核酸片段DNA电转染缓冲液，其表达值也只有1400(图1)，因此使用短链核酸片段DNA电转染缓冲液，能够使报道基因的电转染效果提高9倍以上，其表达水平比三倍剂量报道基因的表达值也要提高2.5倍左右，说明使用短链核酸片段DNA电转染缓冲液能够明显提高基因的电转染效果。

采用一个相对较低的电压：36V(120V/cm)进行电转染时，结果显示未使用短链核酸片段DNA电转染缓冲液组的报道基因表达约为100，而使用了短链核酸片段DNA电转染缓冲液的转染组，其报道基因在组织细胞里的表达可以达到1700(图2)。实验结果表明：在较低的电压下，短链核酸片段DNA电转染缓冲液对基因电转染效果的提高同样有很好的作用。

针对电转染缓冲液中不同含量的短链核酸片段对基因电转染效果的影响，我们制备了三种电转染液，其短链核酸片段对外源基因的比分别为1∶1(buffer1)，2∶1(buffer2)和4∶1(buffer3)，实验结果如图3所示：短链核酸片段对外源基因的比例为1∶1，荧光素酶质粒的转基因表达提高了约8倍，比例为2∶1时的促进作用最好，达到15倍左右；比例为4∶1时的作用虽然较1∶1和2∶1低，但荧光素酶的表达还是比对照组(不使用短链核酸片段DNA电转染缓冲液)高5倍以上。该实验结果说明我们制备的不同含量短链核酸片段的电转染缓冲液都能够很好的提高外源基因的电转染效果及在细胞内的表达水平。

Claims (4)

1.一种加入短链核酸片段的基因电转染缓冲液的制备方法，其特征在于，加入短链核酸片段的浓度为0.4μg-40mg/ml,长度为三百个碱基或碱基对到五百个碱基或碱基对。

2.根据权利要求1所述的加入短链核酸片段的基因电转染缓冲液的制备方法，其特征是，所述的短链核酸片段为单链或双链的DNA或RNA片段，该短链核酸片段通过合成、生物提取或对其它核酸的扩增、酶切、超声制备得到。

3.一种加入权利要求1所述短链核酸片段的基因电转染缓冲液，其特征在于，含有经超声处理后回收的鲑鱼精DNA片段以及生理盐水，且该缓冲液含有0.4μg-40mg/mL的短链核酸片段。

4.一种提高基因电转染效率的方法，其特征在于，通过在缓冲液中加入权利要求1所述短链核酸片段得以实现，所述方法用于非诊断、非治疗目的。