CN1299411A - 用于基因治疗的高温诱导表达载体及其使用方法 - Google Patents

用于基因治疗的高温诱导表达载体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了在靶细胞中转基因的表达的方法和组合物。提供了使用可诱导扩增***来驱动治疗基因或其它所关注的哺乳动物宿主细胞的基因的表达构建体以及相应的方法。在生理性条件下的高层次上的转基因的可诱导表达来自于相对于宿主细胞的基础温度的高温条件下的诱导。

Description

用于基因治疗的高温诱导表达载体 及其使用方法
本发明所属技术领域
本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及提高转基因表达的方法和组合物。
与本发明相关的现有技术
人们期望基因治疗可被广泛应用于治疗一系列癌症和大量的其它疾病。病毒载体是目前使用的一种转基因载体。人们已经构建了许多病毒表达***并对它们把外源基因转入体细胞的能力进行了评估。特别的，对于基于反转录病毒和腺病毒的载体***，人们已经进行了十年以上的深入研究。最近，腺相关病毒(AAV)已经向人们展示了代替目前更常用的反转录病毒和腺病毒载体的可能性。包括阳离子脂和脂质体在内的脂载体也可以用来转化含有治疗基因的质粒DNA。
基因治疗疾病和病变的过程包括基因转入和新遗传信息稳定的或暂时的***细胞。通过把以想要得到的功能编码的基因的正常等位基因重新转入体内来校正基因的遗传缺陷的试验表明，基因治疗这种方法在临床上是可行的(Rosenberg等，New Eng.J.Med_323:570(1990))。实际上，目前进行的覆盖范围很广的关于遗传疾病的前期临床和临床研究为解决基因转化效率、基因表达调控、使用病毒载体的潜在危险等基因治疗的相关难题奠定了基础。大部分用病毒为载体的基因治疗试验是先在体外作转化靶细胞试验，然后再进行体内试验。病毒载体也可以直接进行体内试验，但是反复使用会诱导出中性抗体。
潜在临床基因治疗面临的一个主要问题是如何使外源基因在人体的特定细胞组织中的大量临床表达。基因调剂元素为解决这个问题提供了一个可能的方法。基因调剂元素如启动子和增强子，抑制细胞特定性活性，它们能被一些特定因子通过相应元素激活。应用调剂元素如启动子来启动基因表达，使外源基因在载体构建体中的控制性和选择性表达变得容易起来，例如可以通过热激使热激启动子表达外源基因。
美国专利5,614,381;5,646,010，以及PCT公开专利申请WO89/00603是关于使用高于42℃的热激来诱导转基因表达。这个温度在人类基因治疗中是不可行的，因为持续这个温度一段时间而不对人体造成伤害是不可能的。
基因治疗可以和其它一些包括细胞毒性药物和放射性治疗等传统的癌症治疗方法联合使用。有研究表明(Harisiadis等，Cancer,41:2131-2142(1978))，高温能增强射线的细胞杀伤作用，特别是在动物体内的肿瘤细胞，这改进了随机临床试验中的结果。然而，高温治疗面临的主要问题是它不能有效的热激大型的和深入体内的肿瘤。
因此，开发能在42℃或更低温度下使用的载体，通过在身体部位有选择的诱导治疗基因的表达，对病人进行***的或定位的治疗，将是很有用的。
本发明概述
本发明提供了如何控制多肽在细胞中的诱导表达的方法。它还特别提供了控制哺乳动物细胞中多聚核甘酸的诱导表达的方法中的热激启动子的使用。本发明通过提供可以在42℃或更低温度使用的热激控制载体，克服了前面相关技术中提到的缺陷。这些方法通过治疗基因的诱导表达来治疗病人。
在根据本发明的一个实施例中，提供了一种控制转基因在哺乳动物细胞中的表达方法。该方法首先提供一个表达载体，该载体包括两部分：(ⅰ)与一个编码反向激活因子相连的可诱导启动子，和(ⅱ)与所选多聚核甘酸(治疗基因)连接的第二启动子。第二启动子由同一个构建体表达的反向激活因子激活。该方法还包括了把表达构建体转入细胞的步骤。最后，使细胞处于诱导启动子被激活的状态并开始表达所选蛋白质。
根据本发明的一个优选实施例，先诱导的启动子是一个热激启动子，它的激活条件是高温。该高温的范围是从基本温度到大约42℃。在使用过程中，基本温度定义为细胞处于自然状态的温度，例如，哺乳动物的表皮细胞的基本温度是33℃，然而肺可能是39℃。在特殊情况下，高温诱导载体的使用包括把细胞的温度从基本温度升高，最常用的是从37℃升高到大约42℃。高温状态可以从37℃到大约41℃，或者从39℃到大约40℃。热激启动子是从一组热激蛋白启动子HSP70,HSP90,HSP27,HSP27,HSP73,HSP25,HSP28中衍生出来的。该通用启动子也可以在表达构建体中用作诱导启动子。一个从热激启动子HSP70演化来的最小启动子和包括大约400bp的HSP70B启动子可被选用于本发明中。
在根据本发明的另一个实施例中，诱导启动子包括一个低氧反应元素(HRE)。该反应元素至少包括一个低氧诱导因子-I(HIF-Ⅰ)的结合位点。
在根据本发明的一个实施例中，第二个启动子可以从一组包含人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)启动子和人类免疫缺陷病毒-2(HIV-2)启动子中筛选。在根据本发明的其它实施例中，反式激活因子是一个转录激活因子(TAT)。
特定多聚核甘酸可以编码一个蛋白或一段多肽。例如，选择的多聚核甘酸可以编码以下任何一个蛋白，鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白，p53,p16，神经分化因子，白细胞介素-1(IL1)，白细胞介素-2(IL2)，白细胞介素-4(IL4)，白细胞介素-7(IL7)，白细胞介素-12(IL12)，白细胞介素-15(IL15)，FLT-3配体，粒细胞巨噬细胞刺激因子(CM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，γ-干扰素(IFNγ)，α-干扰素(IFNα)，肿瘤坏死因子(TNF)，单纯苞疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，I-CAM1，人白细胞抗原-B7(HLA-B7)，或金属蛋白酶组织抑制子(TIMP-3)。在这种情形下，特定核甘酸位于由第二个启动子控制的敏感起始区内。
另一种情形下，所选核甘酸的表达只有转录而没有翻译，它产生核酶。在这种情形下，所选核甘酸也是位于由第二个启动子控制的敏感起始区内。
在又一种情形下，所选核甘酸的表达只有转录而没有翻译，它产生作为反义核算发挥功能的RNA分子。在这种情形下，所选核甘酸可以是靶基因或者功能片段，它位于与所述第二个启动子相关的反义起始区中的表达构建体内。
表达构建体还可以包含一个对筛选标志进行编码的基因，如潮莓素抗性，新莓素抗性，嘌呤莓素抗性，赤莓素，gpt,DHFR,绿色荧光蛋白或组氨醇。表达构建体也可以包含(ⅰ)与第二启动子连接的第二特定多聚核甘酸，以及(ⅱ)位于第一和第二启动子之间的内部核糖体结合位点。
靶细胞可以是肿瘤细胞，位于肿瘤内部的细胞，或者哺乳动物体内的细胞。把表达构建体入细胞可以在体内或体外完成。在一个实施例中，构建体的导入是由转运工具控制的，该转运工具是从脂质体，反转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，豆状病毒，单纯苞疹病毒，或痘病毒中筛选出来的。
在根据本发明的另一个实施例中，提供了使转入基因表达达到治疗要求的方法。该方法首先提供了一个第一表达构建体，它包括一个和反式转录激活因子相连的诱导启动子，该方法还提供了一个第二表达构建体，该构建体包含和第二特定多肽相连的第二启动子，该第二启动子由第一表达构建体中编码的反式激活因子激活。第一和第二表达构建体同时转入靶细胞中，同时使靶细胞处于诱导启动子激活的状态，这样特定的核甘酸就开始诱导表达。在一个优选实施例中，第一和第二表达构建***于同一个载体上。而且诱导启动子通常是一个热激启动子，它的激活条件是低于42℃而高于正常体温的诱导温度。
把一个或者两个表达构建体转入细胞可以在体内或体外完成。所选核甘酸的表达产物对靶体内的病原体有毒害作用，这些病原体包括病毒、细菌、真菌、或寄生虫。在一些情况下，表达产物可以抑制靶细胞的生长。在本发明的另一个实施例中，表达产物代替了靶体内的缺陷蛋白。表达产物有时还可以刺激神经的再生。
在根据本发明其它的实施例中，提供了治疗包括人在内的哺乳动物癌症的方法，它的步骤包括：(a)提供一个表达构建体，该构建体包括(ⅰ)诱导启动子，通常是热激启动子，它和编码反式激活因子的基因相连，(ⅱ)与所选核甘酸连接的第二启动子，它由反式激活因子激活；(b)把该表达构建体导入肿瘤细胞；以及(c)使肿瘤细胞处于诱导启动子激活的状态，使所选多核苷酸以足够高的数量表达以抑制肿瘤细胞的生长。如果诱导启动子是一个热激启动子，那么它的诱导条件是低于42℃而高于正常体温的温度。
该治疗方法可以和一些已知的治疗癌症的方法联合使用，这些方法包括：外部射线疗法，近距放射治疗，化学疗法和手术。可以治疗的癌症包括：脑，肺，肝，脾，肾，淋巴，小肠，胰脏，血细胞，胃，***，子宫，***，睾丸，口腔，***，皮肤，头和颈，食管，骨髓，和血癌等。
在本发明的一个特定实施例中，特定的基因是鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白。在使细胞处于诱导启动子激活的状态后，用抗辐射药物WR-33278或WR-1065处理肿瘤细胞，最后，用射线来杀死肿瘤细胞。
本发明也提供了激活哺乳动物，例如人的免疫反应的方法。激活的免疫反应包括体液免疫和细胞免疫。在一个实施例中，该方法包含：(a)提供一个表达构建体，该构建体包含(ⅰ)诱导启动子，通常是热激启动子，它与一个编码反式激活因子的基因相连；以及(ⅱ)与特定核甘酸连接的第二启动子，它由反式激活因子激活；(b)把表达构建体导入哺乳动物细胞；以及(c)调节细胞状态激活诱导启动子，使特定基因高效表达来激活哺乳动物的免疫***。如果该诱导启动子是一个热激启动子，那么它的激活条件是一个高于基础温度而低于42℃的温度。
在另一个实施例中，激活的免疫反应是杀死那些含有表达构建体的哺乳动物细胞。这种方法也涉及一些成熟的治疗癌症的方法，这些方法包括：化学疗法，外部射线疗法，近距放射治疗，和手术。
在另一个实施例中，提供了一个表达构建体，该构建体包括：(a)一个对反式激活因子编码的基因；(b)一个与该基因连接的诱导启动子；(c)一个所选多聚核甘酸；以及(d)与该核甘酸连接的第二启动子。构建体中的第二启动子由反式激活因子激活。在一个优选实施例中，诱导启动子是一个热激启动子，所选多聚核甘酸可以在高温状态下被诱导表达，该高温介于37℃和42℃之间。在一个可选实施例中，诱导启动子还包括低氧反应元素。该表达构建体也可以包括一个第二所选多聚核甘酸，该第二所选多聚核甘酸也与第二启动子连接，并被一个IRES将其与第一所选多聚核甘酸隔开。
本发明提供了包含表达构建体的细胞。所提供的表达构建体可以用在改变哺乳动物的遗传物质的方法中。
本发明的其它目的、特性和优点将在下面的章节详细阐述。应该理解的是，关于本发明的实施例的描述仅仅是一种阐述，在掌握本发明的精髓和范围的基础上，对本发明的适当的变化和修改仍然属于本发明的范畴。附图的简要说明
以下图解是本说明的一部分，它进一步阐述本发明的一些特性。人们可以结合图解和以下的对实施例的详细解释来更好地了解本发明。
图1示出了关于定量分析热激启动子活性的基本载体。该质粒包含一个从HSP70B启动子演化来的最小启动子。把一个报告基因，如增强荧光蛋白(EGFP)，β-gal，或IL-2***到多克隆位点中，以使它的表达受基本HSP70B启动子的控制。该质粒也包含新莓素抗性和安苄青莓素抗性基因，它们对于该质粒在哺乳动物细胞系和标准的细菌培养体系中的筛选是必要的。S8质粒包含与***多克隆位点的EGFP一起显示的质粒。
图2显示了稳定的转入了S8质粒的DU-145细胞的荧光激活细胞分拣(FACS)柱形图。荧光从左到右增强，上面的柱形图是转入了S8的DU-145细胞，但没有经过热激。下面的柱形图是在42℃下热激一个小时的转入成功的DU-145细胞。
图3示出了三个不同的S8转染的MCF7细胞系的FACS柱形图。转入了S8构建体的MCF7细胞根据FACS分类。原始细胞系来自一个多克隆选择的细胞系。激活的细胞系(即表达EGFP的细胞)和非激活细胞系分开。在分离一次后，培养阳性菌株并对它再次筛选以得到更纯的阳性细胞系。在这个例子中，多克隆阳性细胞系MCF7-S8-PS2是在MCF7-S8-P基础上两次筛选的产物。
图4显示的是通过FACS分析的不同细胞系中EGFP的表达情况。细胞系首先转入S8质粒，克隆细胞系或者培养多克隆细胞系。在一些情形下，通过FACS分析EGFP的表达来分选。对总的荧光平均值定量并作图。
图5显示了两次热激筛选的稳定转入的DU-145细胞系(DU-S8-PS2)的EGFP的表达情况。DU-S8-PS2细胞系在40℃或42℃热激并恢复几次，然后由FACS分析细胞。
图6显示了经过热激后恢复16小时的稳定转化细胞系DU-145的EGFP表达情况。其中一个细胞系(DU-S8-PS2)转入了S8质粒，另一个细胞系(DU-V9-PS2)转入了V9质粒，V9质粒和S8质粒的区别在于V9质粒的是和CMV启动子相连而不是和HSP70B(见图7)相连。细胞系用不同的温度热激并使它恢复16小时。没有转入质粒的DU-145细胞系作为对照。
图7显示了含有与增强荧光蛋白(EGFP)相连接的MCV启动子的V9质粒的分析柱形图。
图8显示的是包含放大热激效应的第二启动子的基本载体。该质粒包含一个受HSP70B调控的多克隆位点(MCS)，而且它还包含一个由第二启动子控制的治疗基因。该质粒还包含有新莓素抗性，氨苄青霉素抗性基因和在细菌中生长的标准元素。在pC8质粒中，它的第二启动子是HIV-1的长末端重复片段(LTR)，治疗基因是IL2。在质粒pf12中，MCS中***了tat基因，第二启动子是HIV-Ⅰ的LTR，治疗基因是IL2。另一个启动子p007除了第二启动子是用HIV-2的LTR外，其它部分与pf12是一致的。
图9显示的是一个扩增构建体，它的治疗基因是IL2，由HIV-1或HIV-Ⅱ启动子调控。扩增部分由调控TAT表达的CMV或HSP70启动子控制。该质粒也含有新霉素抗性基因和在细菌中生长所必须的元素。这样的构建体被用于例2和3的扩增分析。图9A包含CMV-TAT-HIV-1-IL2表达序列的质粒X14。图9B包含CMV-TAT-HIV-2-IL2表达序列的质粒Y15。图9C包含HSP-TAT-HIV-1-IL2表达序列的质粒pf12。图9D包含HSP-TAT-HIV-2-IL2表达序列的质粒p007。
图10示出了StressGen Biotechnology Corp公司的p173OR质粒中包含BamH1-HindⅢ片段的DNA序列。这个片段包括大约400bp最小、HSP70B启动子片段，该片段常常用于特殊构建体中，如下面将要提到的例1和例3。
优选实施例的叙述
1．本发明介绍
基因治疗面临两个主要的技术难题：如何调控和增强治疗基因在体内的表达。本发明通过把高温处理和诱导性表达构建体整合起来解决了这两个难题。发明者已经证实了能够提高特定的诱导性表达基因的表达效率。
高水平地表达治疗基因和有效控制表达水平是基因治疗发展中的两个重要课题。但是发明者已经发明了一组新的高效表达载体来克服这两个难题，发明者使用扩增策略来控制目的基因的表达。这些放大子由人的HSP70B启动子组成，该启动子启动控制其它启动子的反式转录激活因子的表达，反过来这些反式转录因子又启动报告基因的表达。这些额外的启动子和与它们相连的报告基因包含在具有HSP70B启动子元素和对反式激活蛋白编码的同一个载体中。
在使用人的IL-2作为报告基因的哺乳动物细胞转染研究中，发明者已经表明，和由组成型CMV启动子或HSP70B单独启动的报告基因表达率相比(见下面特定例子，例3)，扩增构建体在所有试验的温度中，报告基因的表达都有大幅度提高。同时含有HSP70B启动子，人类免疫缺陷病毒(HIV)上游，tat基因和HIV1或HIV2长末端重复序列，白介素-2基因上游的构建体，展示了在高温下启动子的活性比37℃下有大幅度提高。哺乳动物细胞共转染试验表明，启动子表达构建体HSP,HSP/HIVⅠ和HSP/HIV2的表达效率分别是CMV表达启动子的0.4,6.9,83.3倍。这些数据表明：虽然最小热激启动子的表达效率比CMV启动子要低，但它可以和第二个启动子联合来显著的放大表达效率，同时还保存一定程度的对温度的依赖。
早期的研究都是用热激启动子来启动反式激活因子表达，从而激活其它启动子(Schweinfest等，Gene,71(1):207-210,1988;EPO01 18393;WO 89/00603，美国专利5,614,381，美国专利5,646,010;EP 0 299 127)。本发明提出了不同于早期的方法，例如：1)不同的热激启动子(Schweinfest等，使用Drosophila启动子)；2)不同的转运方式(本发明已经把两个启动子整合到一个简单的构建体中-其它的方法还在使用共转染)；3)不同的诱导温度(早期的研究工作使用的温度高于42℃，而本发明可以在42℃和更低的温度下操作)；4)适用于基因治疗而不是工业生产。还有，本发明能够使用HIV-1或HIV-2启动子并且显示出两者的表达水平有明显差异。
本发明的一个优选的方面是通过适用热激诱导元素来控制转基因在哺乳动物细胞中的表达，热激序列是用来启动反式激活因子基因的表达的，因此当表达构建体被给予高温诱导时，反式因子开始表达。反式激活因子启动第二启动子，进而启动治疗基因的表达。在一个特殊的实施例中，还使用了从HSP70启动子演化来的启动子，该启动子的一个特别有用的特性是它在正常的环境温度下表达水平很低并且是诱导启动子。本发明还提供了使治疗基因的表达达到治疗要求的水平的方法来抑制细胞生长或激活免疫***。
下面将要详细讨论与本发明有关的组合物和方法。
2．热激反应
热激或者刺激反应广泛存在于从植物到哺乳动物的组织中，它不仅仅是热激的结果，而且也是其它包括局部缺血，缺氧，葡萄糖缺乏，离子化葡萄糖和氨基酸类似物，乙醇，过渡系金属(transitionseries metals)，药物，激素，细菌和病毒感染等刺激的结果。还有证据表明热激蛋白的过量表达与细胞增生和肿瘤细胞刺激有关。(Finch等，Cell Growth and Differentiation 3(5):269-278,1992)。热激反应的主要特征是合成一族序列高度保守但分子量不等的蛋白质，这些蛋白质的诱导条件和定位是不同的。这些蛋白质在种属之间是高度保守，它们是依据其分子量来划分的。
当环境变化或身体受到伤害时，蛋白基因转录的激活能在数分钟内发生，这么快的反应速度归因于大部分热激蛋白的基因缺乏内含子，缺乏内含子使热激蛋白能够在高温下绕过内含子对基因的封闭。这样可以使热激蛋白高效率表达，同时经常会使其它蛋白的表达率下降。
应激基因的激活是由热激转录因子(HSF)的构相转变来调节的，在受到刺激时，已经存在的蛋白由非活性构相转变成活性构相。这个DNA结合蛋白的分子量的种属差异巨大(例如，人的是83kDa而酵母是150kDa)。热激元素是HSP70的保守上游调控序列，HSF是和它结合起作用的。虽然热激蛋白的主要功能是帮助蛋白折叠和防止蛋白凝聚，但是有证据表明它们在组织对外界的刺激的保护性反应和创伤恢复中起作用。
和大部分真核生物的序列特定性转录因子相似，HSF通过和热激基因上游以多拷贝存在的高度保守的反应元素结合而起作用。热激反应元素由三个连续的反向重复5碱基序列组成，该碱基序列为nGAAn，但更通常的是AGAAn。HSF的调节作用主要是活性的转变而不是合成和稳定性的改变。
3．高温治疗
很多临床研究表明高温作为放射治疗和化学治疗的辅助方法对很多恶性疾病是有效的(Hahn,G.M.Hyperthermia and Cancer，第二版，New York,Plenum,1982;Scott等，Int.J.Rad.Oc.Biol,Phys.10(11)2219-2123,1984;Lindhol等，Rec.Res in Cancer Res.107:152-156.1988)。热激应用，适应和禁忌的理论是在热激应用可以产生显著生理作用的试验证据和对照临床研究的基础上发展起来的。Lehman提出了关于热激治疗在其它领域的应用的论证(Therapeutic Heat and Cold,Rehabilitation Medicine Library,Williams & Wilkins出版，1990，在此引入本文作为参考)。读者特别注意第九章，在其中讨论了热激在内科和外科治疗中的应用。
“高温”通常是指高于试验体所处环境温度的温度。这里使用的高温温度通常是介于37℃和42℃之间。在一些特别实施例中，该温度可以从38℃到42℃，在另一些实施例中，是39℃至41℃，还有一些实施例中，这个温度大约是40℃。在目前所能得到的技术帮助下，高温作为辅助治疗应用，可以使温度保持在与42℃相差0.5℃的范围内。因此，本发明的治疗处理可以在37.0℃,37.2℃,37.4℃,37.6℃,37.8℃,38.2℃,38.4℃,38.6℃,38.8℃,39.2℃,39.4℃,39.6℃,39.8℃,40.2℃,40.4℃,40.6℃,40.8℃,41.2℃,41.4℃,41.6℃,41.8℃,或42℃。在本发明之前，有效的高温治疗要求肿瘤中的温度保持在43℃以上30到60分钟，而正常组织的安全温度是42℃以下，而仅仅在肿瘤细胞内使温度保持在42℃以上是很困难的，经常很难做到。
可以用一系列的技术来热激哺乳动物中的细胞，这些技术包括超声，电磁技术，电磁技术又包括传导波(如微波)，抗性(如辐射)或诱导性(如辐射或电磁波)产生器(Hahn,G.M_Hyperthermiaand Cancer,第二版，New York,Plenum,1982;Lehman,L.B_Postgard Med_88(3):240-243,1990；在此引入本文作为参考)：在一些简单的应用中，组织温度可以用循环的热水或热空气来加热。
LeVeen的美国专利4,230,129(在此引入本文作为参考)，该文提到一种在闪烁记数器的帮助下加热身体组织和检测肿瘤细胞内部温度变化的方法。该方法是使放射(RF)能量和身体耦合以避免脂肪组织过量吸收放射性热量，通过一种治疗器械作轨道运动使放射性能量不是集中于身体内的某一区域而集中于肿瘤细胞。LeVeen的美国专利4,230,129(在此引入本文作为参考)，该文中提到一种方法是把带有肿瘤细胞的人体部分置于一个放射性电磁区域来加热肿瘤细胞，而不伤害和肿瘤细胞相连的正常组织。
在本发明常用的实施例中，高温处理是和基因治疗载体联合使用的，用高温来诱导转入了肿瘤部位治疗基因的表达。而且高温/基因治疗处理方法也可以和其它传统的治疗方法如下面要讨论的化学疗法和射线疗法等联合使用，以取得更好的效果。其它的高温诱导治疗方法见技术章节。关于高温治疗法的区域或***应用方法和工具见相关技术简介章节，同时也可以在下列美国专利文献中找到相关的叙述：美国专利5,284,144;4,230,129;4,186,729;4,346,716;4,848,362;4,815,479;4,632,128，在此均引入本文作为参考。
4．工程表达构建体
在一些特殊的实施例中，本发明包括了对遗传物质进行操作得到克隆有治疗基因的表达构建体的方法。这些方法的步骤包括：使用含有编码治疗蛋白的外源DNA的载体和它表达的途径，然后在辅助细胞中复制该载体以获得病毒颗粒，然后再用重组的病毒去感染细胞。该外源基因一般是一个治疗基因，如杀死癌细胞的基因，抗病毒感染的免疫调节基因或代替体内缺陷的基因。在病毒载体中，治疗基因是外源的，也就是说它不是来自构成载体骨架的病毒基因组。最后，病毒可以作为活的疫苗并表达抗原以刺激特定抗体的表达。外源基因可以来自原核或真核生物，如细菌，病毒，酵母，寄生虫，植物或者动物，也可以来自不止一条途径如多克隆基因构建体或一个融合蛋白，外源DNA也可以包含一段与自身来源不同的调节序列。a)治疗基因
本发明中的所选多聚核甘酸可以作为治疗基因发挥作用。任何来源广泛的治疗基因都适用于本发明中的载体和方法。本发明可以将治疗基因用于特殊病变，医疗事故，或与本发明相关的疾病的治疗。
在本发明的一个实施例中，特定的多聚核甘酸是编码鸟氨酸脱羧梅(ODC)抗酶蛋白，该酶是细胞内多胺的一个重要反馈调节因子(Hayashi等，Trends in Biochemical Sciences 21(1):27-30,1996)。该蛋白的表达水平与细胞内的多胺水平直接相关，它可以刺激该蛋白的表达。抗酶蛋白作用于鸟氨酸脱羧梅，它是多胺合成中的第一个酶，经常也是限速酶来降解多胺。这个蛋白也抑制多胺的摄入。因此低水平的多胺导致低水平的抗酶蛋白表达，而低水平的抗酶蛋白又导致通过ODC合成和摄入的多胺最高水平的合成。相反，高水平的多胺导致高水平的抗酶蛋白表达，高水平的抗酶蛋白使多胺以最低水平合成。
辐射防护剂WR-33278(N,N″-(dithiodi-2,1-ethanediyl)bis-1,3-propanediamine)含有二锍键的多氨类似物，细胞可以通过多氨转运子吸收它(Mitchell等，Carcinogenesis,16:3063-3068,1995)，该转运子被抗酶抑制。WR-33278动物试验模型表明至少某些正常组织可以比一些肿瘤吸收更多的WR-33278(Ito等，InternationalJournal of Radiation Oncology,Biology,Physics 28:899-903,1994)象WR-33278这样的试剂已经应用于临床放射性治疗，它能保护剂量限制的正常组织而同时不减小对肿瘤细胞的放射治疗效果。(Spencer and Goa,Drugs,50(6):1001-31,1995,在此引入本文作为参考)。关于WR-33278吸收的差异理论可以归结为增生的肿瘤细胞比非增生正常细胞含有更多的多氨，因此肿瘤细胞要比正常组织中表达更高水平的抗酶。
本发明把缺失了多氨依赖性调控必须的序列的抗酶cDNA置于人热激启动子HSP70B的调控之下，本发明用该构建体转化由人***癌细胞演化来的DU-145细胞系并且筛选出了有热激诱导多氨吸收的克隆系(表明有热诱导抗酶活性)。该基因治疗方法(HSP70B启动子调控抗酶的表达)将来可以用于***癌患者的临床试验，该方法可以与WR-33278和定位辐射联合治疗***患者。当肿瘤细胞内的抗酶被定位高温激活表达的时候，和癌细胞相邻的正常的剂量限制细胞不会在高温下表达抗酶蛋白从而吸收抗辐射剂WR-33278，同时肿瘤细胞由于在高温下表达抗酶蛋白而不能吸收抗辐射剂。这种方法允许对***部位进行高剂量的辐射照射从而杀死***肿瘤细胞。
在另一个实施例中，细胞保护药物ethol(也叫amifostine,WR-2721，或S-2-(3-aminopropylamino)ethylphosphorothioic酸)其它代谢产物也可以和本文中介绍的表达构建体联合使用，例如，WR-1065(2-(3-aminopropylamino)乙硫醇)也可以用作辐射保护剂。
还有其它很多的基因也可以用本发明的载体转化，例如，试验证明本发明中的载体可以用来转入肿瘤抑制子，反义原埃基因和像HSV-TK基因之类的前药激活子(Rosenfeld等，Annals of Surgery,225:609-618,1997;Esandi等,Gene Therapy,4:280-287,1997)等来治疗癌症。其它能够利用本发明的表达构建体转入的基因包括p53,p16,p21,p27,C-CAM,HLA-B7(Gleich等，Arch Otolaryngol HeadNeck Surg,124:1097-104,1998；Heo等，Hum.Gene Ther.9:2031-8,1998；Nabel等，Proc.Nat.Acad.Sciences USA,90:15388-15393,1996；Stopeck等，Journal of Clinical Oncology,15:341-349,1997),IL2(O’Malley等，Molecular Endocrinology,11:667-673,1997;Otova等，Folia Biologica,43:25-32,1997),IL4(Kling,Nature Biotechnology,15:316-317,1997),IL7(Toloza等，Annals of Surgical Oncology,4:70-70,1997);Sharma等，Cancer Gene Therapy,3:303-313,1996),IL12(Hiscox and Jiang,InVivo,11:125-137,1997;Chen等，Journal ofImmunology,159:351-359,1997),GM-CSF(Kreitman and Pastan,Blood,90:252-259,1997;Homick等，Blood,89:4437-4447,1997;Lanza等，Haematologica,82:239-245,1997),IFNγ(Noguchi等，Mclinical Infectious Diseases,24:992-994,1997;Kanemaru等，European Archibes of Oto-Rhino-Laryngology,254:158-162,1997;Tanaka等，Journal of Gastroenterology and Hepatology,11:1155-1160,1996;Imai等，Liver,17:88-92,1997),I-CAMI和TNF(Corcione等，Annals of the New York Academy of Sciences,815:364-366,1997)。(在此均引入本文作为参考。)
p53近来被人们认为是一个肿瘤抑制基因(Montenarh,Crit.Rev.Oncogen,3:233-256,1992)。在许多被化学致癌物质，紫外线照射和SV40的恶性病毒转化的细胞中发现了有高水平的突变p53表达。P53基因在很多人肿瘤中是突变失活的，它也是人类癌症中最容易突变的基因，它在超过50％的人类NSCLC和很多其它肿瘤中也是突变的。
P16INK4属于一个新的CDK-抑制蛋白族，该蛋白家族包括p16B,p21WAFⅠ,CIPⅠ,SDⅡ和p27KIP1。p16INK4基因位于染色体的9p21区域，在很多肿瘤细胞中该区域是被删除的。P16TNK4基因的同源删除和突变在很多人肿瘤细胞系中是很普遍的，它表明该基因是一个肿瘤抑制因子。然而该推论随着人们发现在原始的非培养肿瘤细胞中该基因的改变几率远比培养肿瘤细胞系中要低而改变。用含有野生型p16INK4基因的质粒表达载体转染一些人癌细胞中可以减少转化细胞克隆。(Okamoti等，Proc,Natl,Acad.Sci,USA,91:11045-11049,1994:Arap等，Cancer Res_55:1351-1354,1995,在此均引入本文作为参考)。
C-CAM在所有的上皮细胞中都是有效表达的，其分子量大约为105kD，最初是用抗血细胞凝聚的特定抗体从大鼠肝细胞质膜上纯化出来的。最近的研究表明在结构上C-CAM是属于免疫球蛋白(Ig)超家族，其序列和癌胚抗原(CEA)是高度同源的，C-CAM的第一个Ig结构域对它的细胞黏附活性是必须的。
细胞黏附分子(CAM)参与了调节组织发育和细胞分化的复杂分子作用网络(Edelman,Annu.Rev.Biochem_54:135-169,1985)。最近的试验数据表明CAM的异常表达与恶性肿瘤的发生有关，例如E-cadherin(在上皮细胞中有显著表达)表达水平的降低和某些肿瘤的发生有关。Giancotti和Ruoslahti(Giancotti和Ruoslahti,Cell,60:849-859,1990)证明在体外通过基因转入提高整合蛋白α5β1的表达可以减少中华仓鼠卵巢细胞的肿瘤发生。C-CAM能在体外和体内抑制肿瘤细胞的生长。
其它肿瘤抑制因子也可以在本发明中应用。例如，所选多聚核甘酸可以是下列基因中的任何一个：成视网膜细胞瘤基因(Rb)；腺瘤多孔结肠基因(APC)；缺陷的结肠癌基因(DCC)；神经纤维瘤基因1(NF-1)；神经纤维瘤基因2(NF-2)；Wilm的肿瘤抑制基因(WT-1)；一型多内分泌肿瘤基因(MEN-1)；二型多内分泌肿瘤基因(MEN-2);BRCA1;von Hippel-Lindau综合症基因(VHL)；缺失结肠癌基因(DCC);p16;p21;p57;p27和BRCA2。
在本发明的另一个实施例中，它提供了通过刺激生长因子和细胞因子的表达来启动再生过程(如神经再生)的方法和载体。在这个实施例中，特定核甘酸可以是一个神经因子。例如可以编码睫状神经营养因子(CNTF)，脑演化来的神经因子(BDNF)，胶质细胞系演化来的神经因子(GDNF)(Mitsumoto等，Science,265:1107-1110,1994;Cash等，Ann.Neurol_44(3 suppl 1):s121-125,1998，在此均引入本文作为参考)。表达载体中的特定核甘酸也可以编码酪氨酸羟化酶，GTP环化水解酶1，芳香性L-氨基酸脱羧梅(Kang,Mov,Disord_13 supp 11:59-72,1998，在此均引入本文作为参考)。在另一个实施例中，治疗表达构架体可以表达一个生长因子，如类胰岛素生长因子1(IGF-1)(Webster,Mult.Scler_3:113-120,1997，在此均引入本文作为参考)。
本发明不仅仅能用于治疗高增生型的疾病和病变，还可以通过转入如编码血管发生抑制因子或细胞周期抑制因子的治疗基因用于其它如类风湿关节炎或(尤指心瓣手术后)再狭窄(renstenosis)等疾病的治疗。b)反义构建体
诸如ras,myc,neu,raf,erb,sec,fins,jun,trk,ret,gsp,hst,bcl，和abl等原癌基因都是合适的治疗基因。然而为了取得好的治疗效果，这些原癌基因是以反义核酸的形式表达来抑制原癌基因的表达的。“反义核酸”是指与原癌基因编码的DNA或RNA互补的核甘酸序列，当反义核酸在靶细胞中表达的时候，它特定的与靶核酸序列结合干扰转录、RNA合成、转运或者翻译，当它和双链DNA结合的时候形成三螺旋构相，和RNA结合的时候双链构相。
反义构建体可以设计成和一个基因的启动子和其它调控区域，外显子，内含子，甚至外显子-内含子连接区结合的形式来封闭基因的表达。无论在体外或者包括人在内的体内试验，反义RNA构建体或编码RNAS的DNA构建体可以用来抑制宿主细胞的转录或翻译或两者都抑制。包括互补核甘酸在内的核酸序列是能在标准的Wstson-Crick原则下配对的。该原则是，稍大的嘌呤和稍小的嘧啶配对，在DNA中形成G:C和A:T配对形式，在RNA中形成A:U的配对形式。
在此处提到的“互补序列”或“反义序列”是指核酸序列在整个序列上是稳定互补的，并且很少有错配。例如，一段有15个碱基的核酸序列如果它有13或14个(一个或两个错配)碱基与另一段序列配对才能称为互补。通常情况下，“完全互补”的核酸序列是在整个片段上完全互补和没有错配的。
所有的或者部分基因序列可以用于反义构建体中，统计表明任何一段17碱基长的序列在基因组中只会出现一次，这足以保证它只有唯一的一个靶序列。虽然短核酸序列容易制备和在体内容易转入，但还有其它很多的因素影响其杂交特定性。通过对长度为8,9,1O,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或者更多碱基的核甘酸序列被用于试验分析，核甘酸的结合特定性和序列特定性是随其长度增加而增加的。通过体外试验中分析表达构建体是否影响相应的内源基因功能或者含有互补序列的相关基因的表达是否受到影响，我们可以很容易判断反义核酸是否能在靶细胞中起作用。
在一些特殊实施例中，人们希望反义构建体中包括其它元素，例如C-5丙基嘧啶。试验证明含有尿嘧啶和胞嘧啶的C-5丙基类似物的多聚核甘酸能与RNA高亲和度结合，是一个潜在的基因表达反义抑制剂(Wagner等，Science,260:1510-1513,1993，在此引入本文作为参考)。c)核酶构建体
核酶可以用来替代反义构建体。“核酶”是能识别并切割NDA通常是RNA分子中的特定碱基序列的RNA分子。在本发明中，核酶被导入细胞并在细胞中表达核酶RNA。核酶的靶序列和反义核酸的靶序列是相同的。
很多核酶能在生理条件下催化磷酸二脂键的水解。本发明中的核酶能催化对另一个核酸分子的特定序列性切割，通常是一段转录的mRNA分子，也可以是原癌基因转录的mRNA。通常情况下核酶通过位于其酶活位点侧面的结合位点和靶RNA结合，然后酶活位点切割RNA。对靶RNA的删除能够直接或间接地破坏它编码蛋白的能力。当核酶切割完成后，它从靶RNA上释放出来并寻找下一个靶体。
在本发明的一个优选实施例中，应用的核酶是脑锤骨核酶，它是一个从植物病毒演化来的小分子RNA(Symons,Ann.Rev.Biochem.61:641-671,1992;Clouet-D’Orval和Uhlenbeck,RNA,2:483-491,1996;Haseloff和Gerlach,Nature 334:585-591,1988;Jeffries和Symons,Necleic Acids Res,17:1371-1377,1989;Uhlenbeck,Nature,328:596-600,1987；在此均引入本文作为参考)。
在其它实施例中，核酶可以是第一组内含子，发卡核酶，VSRNA，肝炎Delta病毒核酶或者Rnase P-RNA核酶(与一段RNA引导序列有关)。关于发卡的作用见文章Hampel等，Nuclei Acids Res.18:299,1990以及Hampel和Tritz,Biochemistry 28:4929,1989；肝炎delta病毒见Perrotta和Been的文章，Biochemistry 31:16,1992;Yuan等的美国专利5,624,824描述了RNAsep的示例；在Sabulle和Collins的文章,Cell 61:685-696,1990,Saville和Collins的文章，Proc.Natl.Acid.Sci.US A 88:8826-8830,1991,Collins和Olive的文章，Biochemsitry 32:2795-2799(1993)描述了脉孢菌VS核酶RNA。第一组内含子的描述见Ceth等的文章，美国专利5,354,855。本发明不仅仅局限于上面提到的核酶，含有和靶mRNA互补的底物结合位点的核酶均可以应用于本发明中，该核酶也含有一个切割RNA分子的酶活位点，它位于底物结合位点的内部或在其周围。d)选择性标记
在本发明的某些实施例中，无论在体内或体外，表达载体中的治疗基因的表达可以通过载体内部的一个标记物来鉴定。这样一些标记可以使转入了该表达载体的细胞发生显著变化而容易和其它细胞分开。通常在表达构建体和选择转化体中都含有一个药物选择标记。例如：表达载体中可以使用抗新莓素，嘌呤莓素，潮霉素，DHFR,GPT,zeocin和组氨醇的基因作为选择标记。当然象单纯苞疹病毒胸嘧啶激梅等酶和免疫球蛋白也可以用作筛选标记。只要和治疗基因同时表达，那么选择什么样的选择标记就显得不十分重要。其它更多的选择性标记包括EGFP,β-gal，和氯莓素乙成转移酶(CAT)。e)复合基因构建体和内核糖体结合位点(IRES)
在本发明的一些特殊实施例中，应用了内部核糖体结合位点(IRES)元素来产生复合基因或多顺反子信使。IRES元素可以使核糖体在翻译时摆脱对5′-甲基化帽子的依赖而可以从内部位点开始翻译。来自病毒家族picanovirus的两个成员(polio和encephalomyocarditis)的IRES元素(Pelletier和Sonenber,Nature,334:320-325,1988)和来自哺乳动物信使基因中的IRES(Macejak和Sarnow,Nature,353:90-94,1991)已经被阐述清楚。IRES元素可以与异源基因的开放阅读框架连接。多重阅读框架可以通过中间***IRES元素而连在一起转录产生多顺反子信使。在IRES元素的帮助下，每个阅读框架都可以和核糖体结合进行有效的翻译，这样就可以通过一个简单的启动子/增强子来转录复合基因，产生单一信使。
任何外源的开放阅读框架都可以和IRES元素连接使用。这些基因包括编码分泌蛋白的基因，独立基因编码的多亚基蛋白，细胞内蛋白或膜连蛋白和选择标记基因。f)调控区域
为了使控制表达载体中的治疗基因的转录表达，必须把它置于启动子和多腺苷酸信号的调控之下。“启动子”是指能被宿主细胞的合成***或导入的合成***识别的DNA序列，它是启动基因转录所必需的。多腺苷酸信号是指能被宿主细胞内的合成***或者导入的合成***识别的DNA序列，它对mRNA转录结束时给它加上一系列的核甘酸是必需的和介导了mRNA从核到细胞质的转移。“转录调控”是指启动子位于和特定核甘酸有关的准确的位点，调控RNA聚合酶的起始和表达。
启动子在这里是指一组位于RNA聚合酶Ⅱ起始位点周围的转录调控分子。关于转录时启动子是如何组织的这个问题的很多理论是通过对几个病毒启动子的分析研究得出的，其中包括HSV胸嘧啶激酶(tk)和SV40的早期转录单元。这些研究(最近更多的工作增加其论证)表明启动子是由一些不连续的功能子组成的，其中每个功能子含有大约7-20个碱基，一个或多个转录激活因子或抑制子结合位点。
在每一个启动子中至少有个一个功能子的功能是确定RNA合成的起始位点。最著名的例子就是TATA box，但有一些启动子缺乏TATA box，如哺乳动物末端脱氧核酸转移酶和SV40的晚期基因启动子，TATA box是一个不连续的自身覆盖起始位点的元素，它决定RNA聚合酶的转录起始位点。
其它的启动子元素调节转录启动的频率。一般情况下这些启动子元素位于起始位点上游30-110bp的区域，但最近的研究表明很多启动子含有位于起始位点下游的功能元素。启动子元素之间的序列是柔性和可变的，因此当这些元素倒置或改变相对位置时不影响启动子的功能。在tk启动子中，当启动子元素间的距离增大得到50bp是启动子的活性才开始下降。在启动子中，启动子元素似乎可以协同或单独激活转录。
当靶细胞是人体细胞时，首先要把治疗基因的编码区域和能在人体细胞中表达的启动子连接并在它的调控之下。通常情况下，这类启动子包括人或病毒的启动子。表1是一些启动子列表。
              表1
    启动子
    免疫球蛋白重链
    免疫球蛋白轻链
    T-细胞受体
    HLA DQα和DQβ
    β-干扰素
    白细胞介素-2
    白细胞介素-2受体
    MHC ClassⅡ5
    MHC ClassⅡHLA-DRα
    β-机动蛋白
    肌肉机酸激梅
    前清蛋白(Transthyretin)
    弹性蛋白酶Ⅰ
    金属硫蛋白
    胶原酶
              (续前页)
    白蛋白基因
    α-胎蛋白
    τ-珠蛋白
    β-珠蛋白
    c-fos
    c-HA-ras
    胰岛素
    神经细胞黏附分子(NCAM)
    α1-抗胰蛋白酶
    H2B(TH2B)组蛋白
    Mouse或typeⅠ胶原
    葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)
    大鼠生长激素
    人血清淀粉状蛋白(SAA)
    肌钙蛋白Ⅰ(TNI)
    血小版衍生的生长因子
    管状肌肉营养不良
    SV40
    多瘤(Polyma)
    反转录病毒
    ***病毒
    B型肝炎病毒
    人类免疫缺陷病毒
    细胞肥大病毒
    Gibbon Ape白血病病毒
对用于控制治疗基因表达的特殊启动子的要求不是很挑剔，只要它能被诱导启动子控制的基因产物激活就可。在本发明的优选实施例中，反式激活蛋白是tat，和治疗基因相连的启动子是HIV-1或HIV-2的长末端重复序列。例如，含有AP-1位点的启动子元素可受诱导表达的c-jun或c-fos蛋白的调控，其它适合的反式激活因子/启动子组合模式详见该技术中。
控制反式激活因子基因表达的启动子必须是一个诱导启动子。诱导启动子在没有诱导底物存在的情况下没有活性或者活性相对较低。本发明中应用的启动子包括(但不局限于)MTII,MMTV胶原酶，stromelysin,SV40，鼠MX基因,α-2-巨球蛋白，I型MHC基因h-2kb，增值蛋白，肿瘤坏死因子，甲状腺激素刺激α基因。该基因相关的刺激因子见表2。Egr-1启动子和多重药物抗性基因(MDR1)启动子也是合适的诱导启动子。通常情形下诱导启动子是热激诱导的，它是从下列启动子中的一个演化来的：HSP70,HSP90,HSP60,HSP27,HSP72,HSP73,HSP25，泛激素和HSP28。在另一种常用实施例中，诱导启动子包括一个低氧反应元素，如HIF-1。应当明了的是任何一个诱导启动子都可以在本发明中应用，所有这样的启动子都不超出本发明的核心思想和范围。
                  表2
    启动子元素     诱导物
    MTII     负离子脂(TPA)，重金属
    MMTV(鼠***状肿瘤病毒)     糖皮质激素
    β-干扰素     Poly(rl)X,poly(rc)
    腺病毒5E2     Ela
    C-jun     负离子酯(TPA),H2O2
    胶原酶     负离子酯(TPA)
    Stromelysin     负离子酯(TPA)，IL-1
                     (续前页)
    SV40     负离子酯(TPA)
    鼠MX基因     干扰素，新城疫病毒
    GRR78基因     A23187
    α-2巨球蛋白     IL-6
    Vimentin     血清
    I型MHC基因H-2kB     干扰素
    HSP70     Ela,SV40大T抗原
    多育曲菌素(Proliferin)     负离子脂-TPa
    肿瘤坏死因子     FMA
    糖皮质刺激激素α基因     糖皮质激素
在一些特殊实施例中，反式激活因子是tat蛋白。HIV-1和HIV-2病毒的基因组和猴免疫缺失病毒(SIVS)的基因组有很高的同源性，都对他们进行了深入的研究。研究发现除了gag,env,pol基因在所有的翻转录病毒中是相同以外，还有许多在病毒的转录起重要作用的调节基因也是相同的。病毒蛋白tat就是这样一个调节因子，它能显著地提高HIV-1和HIV-2启动子的活性。(Sodroski等，J.Virol_55(3):831-835,1985a;Sodroski等，Science,229(4708):74-77,1985b;Sodroski等，Science,228(4706):1430-1434,1985c;Sodroski等,Science,227(4683):171-173,1985d；在此均引入本文作为参考)。Tat蛋白被认为是和HIV LTR中的反式激活元素(TAR)结合并提高稳定的HIV特定的RNA水平。也有证据表明tat不仅仅像其它的传统反式激活因子一样起作用，它还能和其它反式激活因子相互作用。Tat和腺病毒反式激活因子ELA能显著的提高稳定RNA的水平。(Laspis等，Genes Dev_4(12B):2397-2408,1990)。这样，一个可以进一步提高HIV-LTR/TAT构建体活性的方法是把EIA整合到该构建体中。
在构建体***cDNA的地方，通常要含有一个多腺苷酸信号区以便能控制转录基因的正常多聚腺苷酸化。在本发明的实际应用中，多聚腺苷酸信号区的特性并不重要，任何这样的序列都可以用于本发明中。像来自SV40，牛生长激素，单纯苞疹病毒胸嘧啶激酶基因的多腺苷酸信号区已经成功应用于很多细胞中。
5．基因转入方式
要控制细胞中转基因的表达，首先要把本发明中的治疗基因表达构建体导入或转入细胞中，这样的转入方式可以是病毒或非病毒介导的。这一部分将要讨论基因转入的方法和组合物。A．非病毒转入方式
在本发明的优选实施例中，不同的基因表达构建体必须转入细胞才能起作用。在某些情形下，表达构建体的转入是通过非病毒形式进行的。本发明提供了几种将表达构建体转入哺乳动物细胞的非病毒介导转移方法。这些方法包括磷酸钙沉淀法(Graham和Van Der Eb,Vriology,52:456-467,1973;Chen和Okayama,Mol.Cell.Biol_7:2745-2752,1987;Reppe等,Mol.CellBiol_10:689-695,1990)DEAE-葡聚糖法(Gopal,Mol.Cell.Biol,5:1188-1190,1985),电穿孔法(Tur-Kaspa等，Mol.Cell.Biol_6:716-718,1986;Potter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.81:7161-7165,1984,)，直接显微注射法(Harlandand Weintraub,Mol.Cell.Bio1_101:1094-1099,1985),DNA填充脂质体法(Nicolau和Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982;Fraley等,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,76:3348-3352,1979),细胞声处理法(Fechheimer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:8461-8467,1987),高速基因枪弹法(Yang等，Proc,Natl.Acad.Sci.USA,87:9568-9572,1990),受体介导转移法(Wu和Wu,J.Biol.Chem_262:4429-4432,1987;Wu和Wu,Biochemistry,27:887-892,1988，以上文献章节均在此引入本文作为参考)。
一旦编码治疗基因转入细胞，它可被定位于不同的位点表达。在某些情形下，治疗基因可以成功地整合到细胞基因组中。这些整合位点可以是同源位点和同源重组(gene replacement)起始位点，也可以是随机，非特定位点。然而在一些实施例中，转入的核酸可以以独立的、游离的DNA片段稳定存在于细胞中。这些核酸片段或“游离子”含有使自己独立于或者应用细胞合成体系保持和复制自己的信息。如何把表达构建体转入细胞以及它位于细胞内部何处取决于表达构建体。
在本发明的一些特殊实施例中，表达构建体可以包埋在脂质体中转入。脂质体是泡状结构体，它的特点是含有双层磷脂膜和膜内部的水相介质。多层脂质体是由水相分开多脂层组成的，当磷脂悬浮于过量的水溶液中是它会自发形成。脂成分在形成闭合结构以前先自我排列，然后把双脂层之间的水和溶质包埋起来形成脂质体。当把DNA加入到阳离子脂质体中时，脂质体可以向具有旋光性的流动脂体-晶体压缩球状结构转变，这种DNA-脂质体复合物是一种潜在的非病毒基因治疗载体。
脂质体介导的核酸转化和外源DNA在细胞中的表达的体外试验是非常成功的。Wong等人(Wong等，Gene,10:87-94,1980，在此引入本文作为参考)通过使用β-半乳糖苷酶作为报告基因证明脂质体介导的外源基因在体外培养的鸡胚细胞，Hela细胞，肝细胞中的转化和表达是容易可行的。Nicolau等人(Methods Enzymol,149:157-176,1987，文献中列举)通过体内注射，成功的完成了将脂质体包埋的基因转入小鼠。本发明中也包含了涉及“脂转染”技术的一些商业方法。
在本发明的某些特定实施例中，脂质体可以和血细胞凝聚病毒(HVJ)混合使用，这样可以使复合物与细胞膜的融合和脂质体包埋的DNA进入细胞更容易。在其它一些实施例中，脂质体可以和细胞核内的非组蛋白-染色体蛋白(HMG-1)联合使用。还有一些实施例中，脂质体可以与HVJ和HMG-1两者共同使用。这些方法无论在体内或者体外试验中都能成功地将外源基因转入并在细胞中表达，因此对本发明而言都是可行的。
其它能用来将治疗基因转入细胞的载体转运***包括受体介导的转运体系。这种方法利用原理是在几乎所有的真核细胞中，受体能介导选择性吸收大分子的内吞作用。由于受体是具有细胞特定性，因此转运方法具有很高的特定性(Wuand Wu,Adv.Drug.Delivery Rev_12;159-167,1999)。
受体介导的基因转移运载工具包括两个组份：细胞受体-特定的配体和DNA结合物。好几个配体已经应用于受体介导的基因转化。应用最广泛的配体包括asialoorosomucoid(ASOR)(Wu和Wu,J.Biol.Chem_262:4429-4432,1987)和转运子(Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.87(9):3410-3414,1990)。近来，一个人工合成的新糖蛋白，其识别ASOR受体，被用于基因转入运载工具(Ferkol等，FASEB J_7:1081-1091,1993;Perals等，Proc,Natl.Acad.Sci.USA,91:4086-4090,1994)和表皮生长因子(EGF)也被用来将基因转入鳞片状肿瘤细胞中(Myers,EPO 0273085)。
在其它实施例中，转运工具可以由配体和脂质体组成。例如Nicolau等人(Methods Enzymal_149:157-176,1987)将乳糖神经酰胺，半乳糖末端-asialganglisside包埋于脂质体中转化细胞，可以观察到肝细胞吸收胰岛素基因水平提高。这样，在有或没有脂质体的帮助下，通过受体-配体体系可以很容易将治疗基因特定地转入***，上表皮或肿瘤等细胞。例如：人***特定的抗原(Watt等，Proc.Natl.Acad.Sci_83(2):3166-3170,1986)可用在受体介导体系中将治疗基因转入***组织中。
在本发明的另一个实施例中，表达载体仅仅由裸重组DNA或质粒组成。该表达载体的转化可以通过上面提到的以物理或者化学方法穿过细胞膜的任何一种方法。这个载体特别适合于体外转化，当然也可以应用于体内。Dubensky等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,81:7529-7533,1984)成功地将多性瘤病毒DNA以磷酸钙沉淀的形式注射到成年或新生小鼠的肝和脾细胞中，观察到了活性病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(Proc,Natl.Acad.Sci.USA,83:9551-9555,1986)也证明了在皮下注射磷酸钙沉淀的质粒能导致它在细胞中的表达。也有试验表明编码CAM的基因也可以通过相似的方法转入体内并表达CAM。
本发明中将裸DNA表达载体转入细胞中的方法包括基因枪弹颗粒。该方法是把包被了DNA的微型枪弹颗粒加速到一个很高的速度，使它能穿过细胞膜而进入细胞但不杀死细胞(Klein等，Nature,327:70-73,1987，在此引入本文作为参考)。已经发展了几种加速这些微型颗粒的方法。其中一种方法是依靠高电压放电产生电流，电流反过来产生推力(Yang等，Proc,Natl.Acad.Sci.USA,87:9568-9572,1990)使用的微型枪弹由生物惰性物质如钨或金珠组成。B．病毒载体介导的转化
另一种实现基因转化的方法是通过以具感染性的病毒粒子作为传输工具的基因转导，例如，本发明中以下所描述的以腺病毒为载体的转化。反转录病毒牛***瘤病毒也可以作为替代的载体，二者皆能将目的基因永久地转入宿主细胞中。因此，在一例子中，病毒感染的细胞被用来将治疗用的有效基因转入细胞中。典型地，在生理条件下病毒被简单地暴露给合适的细胞，使细胞引入病毒。虽然此处以腺病毒作为例子，本方法可同样有助于使用在其它病毒载体上，如以下所描述的。本发明领域的一般技术人员都很熟悉这些方法。a)腺病毒
腺病毒由于其中等大小的基因组，易于操作，高滴定度，广宿主范围，以及高感染性，特别适于用作基因转化载体。其全长36kB病毒基因组两端以100-200碱基(bp)长的反向末端重复序列(ITR)为边界，其中含病毒DNA复制与包裹所必需的顺式作用元素。按病毒DNA复制模式，基因组中所含的不同转录单位被分为早期(E)与晚期(L)基因区。
E1区(E1A和E1B)编码的蛋白负责病毒基因以及一些细胞基因转录的调控。E2(E2A和E2B)区的表达产生病毒复制所需蛋白。包括病毒DNA复制，晚期基因表达以及宿主细胞的封闭(Renan,1990)。晚期基因的产物(L1,L2,L3,L4与L5)包括主要的病毒外壳蛋白，只在由晚期基因启动子(MLP)引起的一个单一初级转录的有效加工后表达。MLP(位于16.8染色体图距)在感染晚期特别的活跃，所有由其引出的mRNA带有一个5′端的三叶草前端序列(TL)，使其优先被翻译。
为了使腺病毒适于基因治疗，需要使其具有最大的搭载容量以便包裹最大量的DNA片段。并且十分有必要减低某些腺病毒产物所带来的毒性与免疫反应。这两个目的均可由删除相应的腺病毒基因来实现。在本发明的实际操作中，能够达到这些目的同时使治疗构建体保留相应简单的操作性。
大量的DNA替换是可能的，病毒复制所必需的顺式元素都位于线性病毒基因组两端的反向重复序列(ITR)(100-200)中。含有ITR的质粒能在未失活的腺病毒存在下复制。因此，在腺病毒载体中含有这个元素使复制能够实现。
另外，病毒的包装信号位于病毒基因组左端194-385 bp(0.5-1.1图距)处。这个信号类似于λ噬菌体DNA中的蛋白识别位点，一个靠近左末端但位于粘性末端序列之外的特殊序列，介导结合到将DNA***头结构中所必需的蛋白上。E1缺失的腺病毒已表明位于病毒基因组左末端的一个450 bp(0-1.25图距)能引导在293细胞中的包装。
之前已表明腺病毒基因组的某些区能掺入到哺乳动物细胞中并表达所携带的基因。这些细胞系能使这些基因失效的腺病毒载体得以复制。也有报导表明复制失活的腺病毒载体能在帮助载体，如野生型病毒或条件致变的突变体，存在下得到互补的复制能力。
复制缺陷的腺病毒载体能反式地通过帮助病毒得到互补功能，这个发现并不能独自地实现复制缺陷的载体的分离。相反地，由于必需的提供复制功能的帮助载体的存在会引起制备上的污染。因此一个附加的元素必需用来引入复制缺陷载体复制或包装上的特定性。本发明所提供的这个元素由腺病毒的包装功能中得到。
已指出在常规的腺病毒基因图的左端存在一个腺病毒的包裹信号。近一步的研究表明，基因组E1A(194-358bp)区缺失的的突变体即使在能提供互补的早期(E1A)功能的细胞系中也生长得很缓慢。当重组一段腺病毒的补偿DNA(0-353)到突变体的右末端时，病毒能正常地包装。进一步突变分析，在基因组Ad5的左末端得到一短的重复与位置有关的元素。发现这个重复序列的一个单拷贝如果存在于基因组的任意一端都能引起足够有效的包装，但不能被移入Ad5 DNA的内部。
使用不同的突变的包装信号就有可能得到具有不同包装效率的帮助病毒。一般地，这些突变为点突变或缺失突变。当低包装效率的帮助病毒在帮助细胞中生长时，尽管与野生型相比效率降低，仍能得到包装，使得帮助病毒的繁殖能够实现。当这些帮助病毒与含野生型包装信号的病毒一起在细胞中生长时，野生型的包装信号相对突变的优先被选择。在有限的包装因子存在的条件下，含野生型信号的病毒相对帮助病毒被选择性地包装。如果选择性足够高，就能达到均一的产品。b)逆转录病毒
逆转录病毒是一类单链的RNA病毒，以其能在感染细胞中将它们的RNA通过逆转录过程转变成双链的DNA为特征。DNA产物稳定地整合到细胞染色体上成为原病毒，引导病毒蛋白的合成。整合结果使病毒基因在受主细胞及其后代中保留下来。逆转录病毒含三类基因gag,pol和env-分别编码外壳蛋白，聚合酶蛋白与包膜蛋白。在gag基因上游找到的一个序列，记为ψ，起将基因组包装入病毒粒子的信号的功能。病毒基因组的5′和3′末端有两个长的末端重复序列(LTR)，含有强的启动子与增强子序列，也是整合入宿主细胞中所必须的。
为构建一个逆转录病毒载体，一个编码启动子的核酸序列被***到病毒基因组的适当位置，得到一复制失活的病毒。为得到病毒粒子，构建了一个含gag,pol，和env基因但不含有LTR和ψ部分的包裹细胞系。当带有人的cDNA与逆转录病毒的LTR和ψ序列的重组的质粒被引入到此细胞系中(如用磷酸钙沉淀法)，ψ序列使重组质粒转录得的RNA被包装入病毒粒子，再被分泌到培养基中。含重组逆转录病毒的培养基被收集，适当浓缩，用于基因转化。逆转录病毒载体能感染广范围的细胞类型。但许多逆转录病毒的整合与稳定表达要求宿主细胞的***。
最近通过基于向逆转录病毒包膜上化学性加入半乳糖残基的化学修饰方法，实现了使逆转录病毒感染特定目标的设计。这种修饰与欲期的一样，允许经由脱唾液酸糖蛋白受体介导感染特定的细胞，如肝细胞。
另一个实现特定导向重组逆转录病毒设计是通过一个生物素化的抗逆转录病毒包膜蛋白及抗特定细胞受体的抗体。抗体与生物素的结合通过使用链霉抗生物素蛋白(Roux等，Proc.Natl Acad.Sci.USA,86:9079-9083,1989)。通过用抗主要组织复合物Ⅰ和Ⅱ抗原的抗体，已在体外展示了用嗜亲性病毒感染一系列不同的带有这些表面抗原的人细胞。c)腺伴随病毒
AAV是一大约4700bp长的线性、单链DNA病毒。两侧为反向重复末端。其基因组中有两个基因，能产生若干不同的基因产物。其一为cap基因，产生三个不同的毒粒蛋白(VP)，记为VP-1,VP-2,VP-3。另一为rep基因，编码四个非结构蛋白(NS)。一个或多个rep基因的产物负责AAV转录的反式激活。
AAV中的三个启动子按其在基因组上位置，以图距为单位分类。自左到右为p5、p19、和p40。转录得六个转录产物，每一个启动子启动两个转录，其中之一被剪切加工。位于图距42-46的剪切位点对每一个转录是相同的。四个非结构蛋白由较长的转录得到，三个毒粒蛋白由最小的转录得到。
AAV并不与人的任何病理阶段相关联。令人注意的是，AAV要得到有效的复制，需要有其它病毒提供的“帮助”功能，如单纯疱疹病毒Ⅰ和Ⅱ，巨细胞病毒，假狂犬病毒，以及如其名所述的腺病毒。腺病毒是特征了解得最清楚的帮助病毒，并且其许多早期功能表明是用于协助AAV的复制。已确信AAV中rep蛋白的低水平表达能中止AAV组成性的表达，帮助病毒的感染能除去这种抑制。
AAV载体的末端重复序列能通过用限制性内切酶切割AAV或象p201一样含一修饰过的AAV基因组(Sarnulski等，J.Virol_61(10):3096-3101,1987，参照下文附件)的质粒而得到。或者由其它已知的工艺技术方法得到，包括基于已发表的AAV序列用化学或酶法合成末端重复序列，以及不限于此的其它方法。这些常规的合成工艺与熟知的方法如缺失突变分析一样能检测AAV的ITR序列，发挥其诸如稳定和位点专一性整合功能所必需的最小部分。以及能检测出此序列在保持其稳定和位点专一的整合功能的范围内所能允许的微小修饰。
以AAV为基础的载体已在体外被证明是一安全面高效的基因传输工具。并且这类载体在体内及体内衍生系中正应用于广范围的有治疗潜力的基因进行临床前及临床期的检测。
在肺中AAV介导的有效的转化与表达已经在囊性纤维化的治疗中进入了临床试验(Carter和Flotte,Ann.N.Y.Acad Sci.700:79-90,1995;Flotte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:10613-10617,1993)。类似的，预期中的用AAV介导将肌营养不良蛋白基因传输到骨骼肌中以治疗肌肉萎缩症，及将酪氨酸羟化酶传输入大脑中以治疗帕金森病，将因子Ⅸ基因传输入肝中以治疗血友病B，以及很具潜力的将血管内皮生长因子基因导入心脏中以治疗心肌梗塞，由于最近实验表明AAV介导的转基因能在这些器官中很高效率的表达，已经显得是可行的。(Fisher等，J.Virol,70:520-532,1996;Flotte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:10613-10617,1993;Kaplitt等，Nat.Genet_8:148-153,1994；Kaplitt等，Arm Thord.Surg_62:1669-1676,1996;Koeberl等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:1426-1431,1997；McCown等，BrainRes_713:99-107,1996;Ping等，Micro circulation,3:225-228,1996;Xiao等,J.Virol_70:8098-8108,1996)d)其它病毒载体
其它病毒载体在本发明中可作为表达组件而被应用到。包括由牛痘病毒衍生得的载体(Ridgeway,In:Vectors:Asurvey of molecularcloning vectors and their uses,Rodriguez RL,Denhardt DT.Ed_Stoneham:Butterworth,pp.467-492,1988；Baichwal和Sugden,In:Gene Transfer,Kucherlapati R,ed_NewYork,PlenumPress,pp.117-148,1986;Coupar等，Gene,68:1-10,1988)，及由雀痘病毒、慢性病毒、疱疹病毒所得的载体。
6．目标细胞
本发明所涉及的方法及质粒可以以哺乳动物中的一系列细胞、器官、及组织作为靶目标。
在一些实施例中，本文描述的表达构建体被用于癌症治疗。靶细胞或者为肿瘤细胞，或者为肿瘤内部的细胞或附近的细胞。肿瘤则可位于大脑、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、膀胱、淋巴节、小肠、胰脏、直肠、胃、***、子宫、***、睾丸、阴门、子宫颈、卵巢、皮肤、头颈部、食管、骨髓、或血液中。本发明领域的一般技术人员可以很容易地检出在给定的肿瘤类型中所要表达的适于治疗用的基因。
在另一些实施例中，应用于治疗非癌的药理情况。例如，本发明提供的高效的蛋白替代疗法。在这例子中，特定类型的细胞、组织及器官可作为在患者体内表达某种蛋白的靶目标，尤其是这种蛋白的活性仅仅被限制于这种特定的细胞、组织、或器官中。同样的，本发明领域的一般技术人员都很可以很容易地检出哪些细胞最适于作为靶目标。
可通过体外、来自体内、或体内的方法将表达构建体引入到所感兴趣的细胞中。由于转染或转导分离的细胞一般来说要有效得多，现在许多基因治疗采用了来自体内的方法。导入方法以及特定传输载体的选择将依据靶目标细胞、组织、或器官的类型。本发明领域的一般技术人员可以简单地指导选择过程。
由于本发明中的表达构建体需要经诱导才能被激活，在许多例子中表达构建体能被转入到患者身体的一较大范围的部位中，而不是设想的仅仅是特定的细胞、组织、或器官。要限制将患者暴露于诱导表达构建体表达的激活条件下，以得到特定性的表达。在许多例子中，这是最好的。例如，将患者暴露于射线中进行治疗时，要限制于只有那些需要照射的部位。热温疗法的应用也必须限制其范围。在其它一些实施例中，活性条件就是靶细胞本身所特定具有的。举例来说，肿瘤所具有的低氧环境能激活具有含可诱导的低氧反应元素启动子的表达构建体的表达。在这样的例子中，所导致的表达将十分自然地实现区域化，尽管表达构建体的引入可能并不是区域化的。
7．配合治疗
本发明所涉及的表达构建体具有可与一种或多种其它传统的治疗方法相结合的优点。现今癌症治疗的一个目标就是寻找能提高化疗及放疗效率的途径。其一即可将传统的治疗与基因治疗相结合。例如，单纯疱疹胸腺嘧啶核苷激酶(HS-tk)基因，当其经逆转录病毒载体***被引入脑瘤中后，能成功地诱导出对抗病毒试剂鸟嘌呤的感受性。但基因治疗配合其它传统疗法的效率仍被基因转入到目标细胞后所需达到的临床有效表达量所局限。
要杀死细胞，遏制细胞生长及新陈代谢，减小肿瘤的大小，或者是逆转或降低肿瘤细胞恶性扩增的表现型，用本发明提供的方法及组件，就可一般性地将本发明的表达构建体导入目标细胞中并通过应用热激或其它能激活可诱导启动子的条件获得诱导表达。这种基因治疗可与其它含有对癌症治疗有效的试剂的组合物配合使用。这些组合物应使用相应的剂量以便能有效地杀死或抑制细胞的扩增。这个过程可以采用将表达构建体与对应药剂或因子同时导入细胞。可通过让细胞接触单一的含有二者的组合物或药用药方，或者将细胞同时暴露给两不同的组分或药方，其一含表达构建体，另一个含其它用到的药剂。
另外基因治疗/热激治疗也可以超前或滞后于其它药剂治疗，间隔可从几分钟到几周。在一些实施例中，其它药剂与表达构建体被分开来应用到细胞上，其一一般地能保持足够长的作用时间以保证在每一个导入的间隔间不失效，因此药剂与表达构建体仍能实现对细胞配合治疗的优点。在这些例子中，可以设想其一若要作用于在12-24小时、或更可取的6-12小时内同时含有两种作用模式的细胞时，采取仅12小时的延迟时间是首选的。在某些情况下，可预期治疗期间可延长至每个单独的用法之间间隔上几天(2、3、4、5、6、或7)，甚至是几周(1、2、3、4、5、6、7、或8)。
同样也可以设想，可预期表达构建体与药剂间有多于一种的使用方法。各种可能的配合方式都可能应用到，如以“A”表示表达构建体，以“B”表示另一药剂，可举例如下：
A/B/A    B/A/B  B/B/A  A/A/B  B/A/A  A/B/B  B/B/B/A  B/B/A/B
A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A  B/A/B/A  B/A/A/B  B/B/B/A
A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A  A/B/B/B  B/A/B/B  B/B/A/B
同样地，其它配合方式也是可预期的。再一次说明，要达到杀死细胞的目的，二者要用能杀死细胞的有效配合剂量导入细胞。
适于配合治疗的药剂或因子有：任何应用到细胞上时能诱导DNA损伤的化学药剂或治疗方法。这样的药剂或因子包括能诱导DNA损伤的放射线或电磁波，如γ-射线、X-射线、紫外照射、微波、电子射线等。
在本发明的一个实施例中，与基因治疗配合的放射治疗由外部的射线束组成。外部射线束一般为携高能的射线，如高能x-射线束。
另一可与基因治疗配合使用的途径为内部放射，或短暂治疗。进行短暂治疗的方法包括内腔或间质放置放射性源，灌注胶质溶液，非肠道的或口部服用等。封闭性的源包裹于金属、导线、管子、针、或其它类似物中。非封闭的放射源制备成悬浮溶液。
包裹好的放射元素被放置于体腔中，或用适当装置直接***组织中。装置一般用外科方法放入体腔或组织中或是使用荧光的方法。这些装置一般为塑料或金属小管，可被缝合进并维持在靠近肿瘤的位置。放射性的同位素稍后才被放入装置中(后装载)。放射性植入用于治疗位于舌头，唇部，***，***，子宫颈，子宫，直肠，膀胱，及脑部的癌症。包裹好的源也可以留在病人体内作为永久性的植入。植入由放射性物质组成的小球是治疗区位性***癌，及区位性但不适于手术的肺癌的一个途径。
一系列具诱导DNA损伤功能的化学物质，也被描述作化学治疗剂，都可与本文提出的方法一起用于配合治疗。设想可用化合物包括有如，阿霉素，5-氟尿嘧啶(5FU)，鬼臼亚乙苷(VP-16)，喜树碱，放线菌素-D，丝裂霉素C，顺式铂氨(CDDP)，以及甚至可用到的过氧化氢。本发明同样地包括了同时配合使用一种或多种DNA损伤试剂，不管是基于射线的或是真正的化合物，例如将X-射线与顺式铂氨一起使用，或同时使用顺式铂氨与鬼臼亚乙苷。
举例来说，依本发明在治疗癌症时，我们可以让肿瘤细胞接触药剂，同时附加上表达构建体并通过热激诱导基因的表达。这可以通过对肿瘤部位进行局部热激或对个体的全身热激来实现。这个过程可以与对肿瘤的放射性照射配合进行，可用的射线有诸如X-射线、紫外光、γ-射线、以至微波。肿瘤细胞接触其它的药剂，也可是通过让病人服用有治疗效力的一定量的药用组分，包括的化合物有阿霉素，5-氟尿嘧啶，鬼臼亚乙苷，喜树碱，放线菌素-D，丝裂霉素C，及更常取的顺式铂氨。这些药剂可以被制备成类似配合治疗组分或试剂盒的方式，并如所描述的与用于治疗的表达构建体配合着使用。
那些能导致核酸尤其是DNA交连的药剂也被设想用于辅助DNA损伤以得到配合本发明的表达构建体的共同的抗肿瘤效果。这样的药剂有如顺式铂氨与其它的DNA烷化剂。顺式铂氨不能通过口服吸收，因此必须通过向静脉、皮下、肿瘤内、或腹膜内注射来传输。
其它能损伤DNA的药剂还包括能干扰DNA复制、有丝***、染色体分离的化合物。这些化疗物质包括阿霉素，鬼臼亚乙苷，异博定，鬼臼毒素，以及其它类似物。在广泛的临床***时，这些化合物的摄入通过大剂量静脉注射，剂量可从阿霉素的每隔21天的25-75mg/m2到鬼臼亚乙苷的100mg/m2或通过口服两倍的该剂量。
干扰核苷酸前体合成或可靠性的试剂也能导致DNA的损伤。如此开发了许多核苷酸的前体。那些已经得到广泛测试并易于得到的前体尤其有用。这样的药剂有如5-氟尿嘧啶(5-FU)，由于肿瘤细胞偏向于优先选择使用5-FU，使得其特别有利于应用到肿瘤细胞上。尽管5-FU具强毒性，其仍被多方面地应用，甚至包括常用的剂量范围为450-1000mg/m2/天的静脉摄入。
其它广范应用的能引起DNA损伤的因子包括有熟知的诸如γ-射线、X-射线及直接导入放射性同位素到肿瘤细胞中。还可设想到的因子有微波、紫外光等。很有可能地，所有这些因子，作用产生广范围的DNA,DNA前体，DNA复制和修复，以及染色体的组装和维护上的损伤。X-射线的照射剂量可从每天50-200伦琴地持续一段时间(3到4周)到一次性地照射2000-6000伦琴的剂量。放射性同位素的使用剂量范围较广，主要依同位素的半衰期、放射线的种类及强度、及肿瘤细胞的吸收情况。
涉及的技术可参照“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，第15版，33章，主要在624-652页。使用剂量必须依患者对象的条件作相应的改变。在所有情况中每个人的服用反应容许情况决定了每个患者的合适剂量。更重要的，应用于人体时，制备物在无菌、热源性、安全性及纯度上要达到FDA的官方生物标准。
向癌症病人局部导入本发明的用于治疗的表达构建体是导入抗所针对的临床疾病的治疗有效基因的可优先选择的方法。类似地，化学和放射治疗方法可被导向患者特定的受影响的部位。另外，全身性地导入表达构建体及药剂在某些情况下是合适的，例如当已经发生肿瘤的全身扩散时。
在基因治疗配合化疗与放疗之外，也可以设想多基因配合治疗的优越性。例如，同时导入p53和p16突变基因能获得加强的抗癌效果。所有其它肿瘤相关基因都可设想用此方式导入，包括有：p21,Rb,APC,DCC,NF-1,NF-2,BRCA2,p16,FHIT,WT-1,MEN-1,MEN-Ⅱ,BRCA1,VHL,FCC,MCC,ras,myc,neu,raf,erb,src,fms,jun,trk,ret,gsp,hst,bcl,和abl。
8．药用组合物与摄入路径
本发明用于治疗的组合物可设想的摄入方式有经由体外的，自体内的，及体内的。因此要依各可能应用方式将组合物制备成相应合适的药用组合物。一般地，这要求制备的药用组合物必须要无热源物质，及其它有可能伤害到人或动物的不纯物质。同样也会用到合适的盐与缓冲液以保持组合物的稳定及使目标细胞摄入此组合物。
本发明的组合物包括一定数量的有效的表达构建体或由病毒载体或脂质体携带的表达构建体，其溶解或分散于一药用的可接受的载体或水溶液中。这些组合物也可以通过接种的方式提供。“药用的”或“药理上可接受的”是指分子整体及组合物当正确地摄入到人或动物中时不会产生相反有害的、过敏的、或其它不期望的反应。本文中“药理上可接受的载体”包括任何及全部的溶液，分散介质，外包衣壳，抗菌及抗真菌药剂，等渗的和吸收延迟试剂，以及其它类似的载体。本发明领域的一般技术人员都很熟悉这些介质及试剂的应用。除了那些与活性成分不兼容的常规介质与试剂，将它们用作治疗组合物是可预期的。具有辅助活性的成分也可以加入到组合物中。
碱或药理上可接受的盐可加入到与表面活性剂，如羟丙基纤维素，适当混合的水中以制备活性组合物的溶液。组合物的分散也可在甘油，聚乙二醇液体，其它类似混合物，以及油中进行。在常规条件下保存与使用时，这些制备物含有抑制剂以抑制微生物的生长。
本发明所提及的治疗组合物还可包括经典的主导治疗上的药用制备以及人体摄入。本发明所提及的治疗组合物的摄入可经由任何常规的途径，只要通过此途径可到达目标组织或细胞。这包括经由口部，鼻部，颊部，直肠，***，和局部的。其它的摄入有同位的、皮内的、皮下的、肌肉内的、腹膜内的、或静脉的注射。这些组合物通常以药用可接受的方式被摄入，包括生理可接受的载体、缓冲液、或其它赋形剂。应用于抗肿瘤时，可设想直接向肿瘤内部注射、或切除过的肿瘤灶、区域性(例如淋巴的)或全身性地。也可以设想实行向病灶，如肿瘤或肿瘤灶，通过导管连续地灌注上几小时到几天。
本发明的治疗组合物利于以水溶液或悬浮液的可注射的方式摄入；也可以制备成适于溶解或悬浮于注射液的固体方式。制备形式也可以为乳浊液。典型地，用于此目的的组合物包括药用可接受的载体。例如，该组合物可为含大约100mg每毫升的磷酸盐缓冲液。其它药用可接受的载体有水溶液，无毒赋形剂，以及盐，防腐剂，缓冲液，和其它类似物都有可能被用到。非水性的例子有丙二醇，聚乙二醇，蔬菜油，及可注射用的有机酯如乙基油酸酯。水性载体包括水，乙醇/水溶液，盐溶液，非肠道用的载体如氯化钠及林格氏葡萄糖液等。静脉运载载体包括有流质及营养补充物。防腐剂包括抗生素，抗氧化剂，螯合剂，和隋性气体。各种药用组合物的组成的pH值与具体浓度调整到熟知的常数。
另外也设想了适合于口部摄入的处方。口服处方包括了经典的赋形剂，例如药用级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠盐，纤维素，碳酸镁，及其它类似物。组合物的存在形式为溶液、悬溶液、药片、药丸、胶囊、持续释放的粉剂处方。当采取经典途径时，形式可为乳剂、油膏、药膏、或喷雾剂。
治疗药剂的有效剂量的决定要基于所期望的目标，例如：(ⅰ)抑制肿瘤细胞扩增，(ⅱ)除去或杀死肿瘤细胞，或者(ⅲ)转化一个短期或长期表达的治疗基因。术语“单位剂量”指适于在患者上使用的物理上的分离单位。每一单位含一预先设定好的治疗组分的数量，用于计算产生预期的反应，这些反应如上所讨论的与摄入方法如合适途径与主导治疗相关联。所需用的量要依据治疗的次数与单位剂量，也要依据被治疗的患者、患者的状态以及期望的结果。本发明也设想了多基因治疗的影响。
在一实施例中，一个编码一治疗基因的载体被用来治疗癌症病人。用于治疗癌症的病毒载体的典型数量为106-1015PFU/剂(如，106,107,108,109,1010,1011,1012,1013,1014,和1015)，此剂量被分成几份向固性肿瘤内的不同部位注射。治疗方式也涉及若干周期地摄入转化基因，间隔期间为3-10周。为得到连续性治疗的益处，更长时间地摄入载体也是需要的，持续时间可为几个月到几年。
在本发明的另一个实施例中，一个编码一治疗基因的病毒载体可被用来给人或哺乳动物接种。典型地，在本接种实施例中，人或哺乳动物要摄入用于产生预期效果的一定数量病毒粒子，以保持转化基因的一长期表达，使得宿主能产生免疫反应。可预期需一系列的注射，例如，用一初级免疫注射，接着两次加强免疫注射以使得能足够诱导一长期的免疫反应。典型的剂量依所期望的结果可为106到1015PFU/注射。低剂量的抗原通常诱导强的细胞介导反应，而高剂量抗原通常诱导抗体介导的免疫反应。治疗组分的精确量也依每个特定实践者进行判断。
9．例子
以下各具体例子只是用于阐述本发明，而不是对权利要求范围的限制。
                  例一
热激启动子诱导报导基因的表达
载体结构：为研究HSP70启动子诱导基因表达的能力，将一最小化的HS启动子(热激，heatshock,HS)或一最小化的CMV启动子***到一报导基因的上游区，报导基因位于一带新霉素和青霉素选择标记的质粒上。质粒M5的碱基设计如图1所示，其在由HSP70所得的启动子的操作位点上含一多克隆位点。M5的构建是将pcDNA3.0质粒(Invitrogen,Inc.)上的CMV启动子用一最小化的HSP70B启动子(SEQ ID NO:1，图10)替代，是一由人的热激蛋白70B(HSP70B)启动子得到的长0.4kb片段(HindⅢ-BamHⅠ)，自StressGen,Inc.处得到。
HS和CMV启动子的活性通过其随S8质粒转染人的癌细胞，人乳腺癌细胞MCF7与***癌细胞DU145来判定。S8质粒由M5载体(见图1)衍生得，含有连接到编码加强的绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescence Protein,EGFP)的HSP70B最小化启动子。S8的构建是将pEGFP-1质粒(Clonetech,Inc.)上的EGFP基因***到M5上的多克隆位点(multiple cloningsite,MCS)。
细胞培养基与转染：用如上所述的S8质粒转染人的DU-145***癌衍生细胞与MCF-7乳腺癌衍生细胞。为分离到S8转染细胞，培养基用标准的磷酸钙沉淀法转染。含有整合质粒的细胞以其能在新霉素存在下生长的能力被筛选出来。热激通过将培养瓶完全浸没到水浴控制器中(±0.1℃)中来实现。
用遗传霉素自MCF7细胞转染中筛选得一阳性克隆，克隆4，和一多克隆系。自DU-145细胞转染中筛选得一多克隆系。(每一例中，细胞用遗传霉素筛选2周)筛选得的细胞系用FACS分析与筛选。
阳性细胞系的分离：在热激反应下表达高水平EGFP的细胞通过用传统的系列稀释法与荧光激活细胞分选法(FACS)得到。用流动细胞计数定量EGFP的表达。强绿色荧光蛋白(EGFP)在490nm处被激活，使得其能在荧光显微镜下被观察或用FACS分析。表达EGFP的细胞与不表达EGFP的细胞用FACS法分选。这步骤是对遗传霉素筛选得的细胞系进行。必须这样做的理由是，在一多克隆细胞系中，有一部分是S8质粒会以一种干扰报导基因表达的方式被整合。排除这部分经分选的细胞，只留下纯的阳性部分用于进一步分析。
如图2所示，用含最小化热激启动子驱动的EGFP质粒(S8)稳定转化的DU-145细胞在37℃中生长时，平均荧光量为近似10相对荧光单位。当细胞暴露于42℃热激1小时的4小时后，平均相对荧光有7-9倍的提高。相应的基因表达同时可由测量稳定转染细胞中相对荧光变化所定量。用FACS法分选S8质粒转染的MCF7细胞如图3所示。
动力学研究：高温暴露存活研究被用来得到加热MCF7细胞而不引起细胞大量死亡的最适的时间/温度。在40℃与42℃下，长到1小时时细胞死亡仅为可忽略的小于3％。在44℃时，仅需30分几乎50％的细胞就已经死亡。
使用如上的最适存活时间，进行了初步的动力学研究。用FACS法检测，在40℃和42℃下热激转染的MCF7细胞1小时，热激1小时比仅30分可产生更多的EGFP。细胞热激后的最适的恢复时间为4小时。增加任意的恢复时间不会导致EGFP表达水平的提高。在44℃热激30分后，要更长的8小时以达最高的恢复。
不同细胞系在37℃-44℃下EGFP的表达：
以下所用的热激/恢复时间与动力学研究中的相同，用以检测在所有由发明组转染得的细胞系中HSP70-衍生启动子驱动的EGFP的可诱导性。
40℃-1小时热激，4小时恢复
42℃-1小时热激，4小时恢复
44℃-30分热激，8小时恢复
应用这些温度与时间，检测了以下细胞系的EGFP的表达。
MCF7：源自乳腺癌细胞的细胞系。
DU145：源自***癌细胞的细胞系。
MCF7-S8-P：S8质粒转染的MCF7细胞，多克隆细胞系。
MCF7-S8-PS1：经FACS分选EGFP表达一次的MCF7-S8-P细胞系。
MCF7-S8-PS2：经FACS再分选EGFP表达的MCF7-S8-P1细胞系。
MCF7-S8-4：MCF7 S8转染的克隆4。
MCF7-S8-4S1：分选一次用于EGFP表达的MCF7-S8-4细胞系。
DU145-S8-P：S8质粒转染的DU145细胞，多克隆细胞系。
用HSP70衍生启动子驱动的EGFP转染的细胞系的表达数据如图4所示。当温度提高时相应的EGFP含量也得到提高。这些数据表明发明组的热激启动子的确对热激有反应。虽然，在37℃时也仍有EGFP的表达。
稳定转染的DU-145细胞热激后EGFP的表达：内源热激启动子的诱导是暂时性的而且是温度相关的。当用最小化热激启动子驱动的EGFP稳定转染的并经FACS两次筛选的DU-145细胞(DU-145-PS2细胞)用一系列不同时间和温度热激后，报导基因的表达是温度依赖的，并只是暂时性地在诱导压后维持15-24小时的最大表达(图5)。这些结果表明，此启动子只是在此处用到的条件下短暂地保持激活，而且EGFP是不稳定的，细胞中的荧光在15-24小时后开始降低。在40℃热激1小时或2小时后最小化的热激启动子的活性暂时性地增加了近似3倍。在42℃热激1或2小时后启动子活性分别增加了13和25倍。
HS启动子与CMV启动子控制下的EGFP表达比较：图6的数据表明在DU-S8-PS2细胞中最小化的热激启动子的活性在37-43℃范围内是依温度变化而变化的。相比较下，用V9质粒，用CMV启动子驱动EGFP表达的载体(图7)，稳定转染的DU-145细胞，具有比用最小化热激启动子转染并在43℃下热激诱导的相同细胞高出50％的启动子活性。CMV启动子的活性在这些细胞中显然不受温度的影响。最小化的HS启动子的温度依赖性并不是对DU-145细胞所特有的。
                 例二
用一构建体中的HIV启动子与tat扩增IL-2的表达
初始化扩增研究：此处进行了涉及新的能扩增治疗基因表达的构建体的研究。为阐明扩增子的原理，构建了几个构建体。构建体在热激可诱导启动子外还包含一组成性启动子，一CMV启动子。这些构建体被记为质粒L-27,X14,RR13,Y15与SS10。下表3显示了每一质粒所带的启动子/基因以及IL-2的表达量。其中的四个质粒是由一个含有两个多克隆位点的质粒衍生得到。在这四个质粒中，CMV启动子被***到tat基因或一个多克隆位点(MCS)的上游区，以及将HIV1与HIV2其一的长末端重复序列(LTRs)***到鼠干扰素-2基因(IL-2)的上游区。质粒X14与Y15的结构如图9A与9B所示。L-27质粒用作参照物。用IL-2EASIA试剂盒(Medgenix Diagnostics,Fleurus,Belgium)通过用ELISA检测组织培养上清的方法来测量IL-2含量。试剂盒的灵敏度预估为0.1IU IL-2/ml。在本研究中，用Dosper脂来转染SW480细胞(参见例三中的转染方案，见后)。
                   表3
质粒 启动子/基因 IL-2量，单位I.U.
仅有脂存在时 Dosper 4.8
L-27 CMV/IL-2 15.63
RR13 HIV1/IL-2CMV/多克隆位点 17.56
X14 HIV1/IL-2CMV/TAT 173.7
SS10 HIV2/IL-2CMV/多克隆位点 12.83
Y15 HIV2/IL-2CMV/TAT 440.55
从本研究可以看出完整的扩增构建体能够提高CMV启动子后基因的表达。同时反式激活因子TAT蛋白的表达也是提高表达所必需的。
                  例三可热激诱导的扩增子
载体构建：为判断第二个启动子应用是否能提高最小化的热激启动子的活性，用一系列不同的载体暂时性地转染MCF-7细胞，载体包括pC8,pf12，与p007(图8与图9)。通过应用一含两个多克隆位点的质粒，最小化的热激启动子被***到tat基因或一多克隆细胞位点的上游区，及将HIV1或HIV2的长末端重复序列(LTRs)***到鼠干扰素-2(IL-2)基因的上游区。每个质粒同时带有新霉素与氨苄青霉素选择标记。
首先将自质粒C5上切出的含干扰素-2(IL-2)编码区(见GenBank数据库文件，no.577834)的长0.5kb的EcoRⅠ片段***到M5载体(参见上文例一所述之例)的EcoRⅠ位点中得质粒f11。质粒C8的构建是将自质粒B4527(参见Tsang等，Biotechniques 20:51-52,1996与Tsang等，Biotechniques 22:68,1997，二者在本文中列于参考文献中)MCS位点上游区切出的一含0.4kb长的HSP70B片段的长为1kb的BamHⅠ片段***到质粒DNP-1(Tsang等,1996,与Tsang等,1997)上的BamHⅠ位点中，DNP-1上的IL-2编码区上游含有HIV1的LTR序列。接着将含HIV tat基因的0.4kb长NotⅠ片段播入到C8上的NotⅠ位点得载体fl2(图9)。中介载体D10的构建是将一含最小化HSP70B启动子的1kb长的BamHⅠ片段***到质粒MNP-7(Tsang等，1996与Tsang等，1997)，MNP-7上IL-2编码区的上游带有HIV2的LTR序列。质粒007(图9)的构建是将一编码tat基因的0.4kb长的NotⅠ片段***到D10的NotⅠ位点中。
转染方案：转染过程依照一已发表的方案(Stopeck等，CancerGene Therapy,5:119-126,1998)。MCF-7细胞被放于一6孔或12孔培养板中培养。第二天，细胞用Hanks盐缓冲溶液漂洗后加入1ml转染液。转染液为含质量比为4∶1的脂与DNA的无血清OptiMEM(来自Gibco BRL)，脂为Dosper(1,3-双-油羧基-2-(6-羧基-精团基)-丙基酰胺，来自Boehringer Mannheim)或Dmrie C(1,2-双十四烷氧基丙基-3-双甲基-羟基溴化乙基铵，来自GibcoBRL)，质粒DNA为1.25μg或2.5μg。立即向每孔中加入牛胎盘血清(FBS)到终浓度10％(体积/体积)。经检测DmrieC要优于Dosper。细胞在检测IL-2含量之前要在热激前培养24小时与热激后24小时。热诱导的扩增研究：在一套实验中，分析了pC8,pf12，或p007质粒转染的细胞的IL-2表达活性。IL-2的量通过使用IL-2 EASIA试剂盒(Medgenix Diagnostics,Belgium)用ELISA法检测组织培养上清得到。试剂盒的灵敏度预估为0.1IUIL-2/ml。从此套实验得到的数据如下表四所示。此表显示了MCF7细胞中IL-2的表达水平，MCF7细胞用Dosper转染后加热24小时，在转染的49小时后再用ELISA分析。质粒L-27(用于作为CMV启动子驱动的IL-2表达的参照质粒)，007,f12，和C8都被检测了。
                          表4
IL-2活性，单位I.U.
温度 37℃ 39℃ 41℃ 42℃ 44℃
热激持续时间 持续 持续 1小时 1小时 0.5小时
仅脂存在L-27007F12C8 2.0314.2336.768.409.19 0.509.88318.496.888.03 0.415.95334.0249.9311.74 0.539.88373.7460.028.73 0.537.80389.2788.1316.37
从此研究中可以看出pf12对热激有反应，并且产生的热激扩增子构建的IL-2比pC8或pL-27产生的多得多。在37℃下，pf12比CMV驱动的参照质粒，L-27，多产生5倍的IL-2。当细胞在39℃下热激过夜，pf12比37℃的CMV驱动对照多表达7倍的IL-2。在41℃或42℃下热激处理1小时，能使扩增子构建体的表达相较CMV驱动载体在37℃下的表达有多达26倍的提高。(p007质粒在37℃时已几乎达其最大的活性，因此热激并不能显著地提高表达量)。pf12在37℃时也处于一个高水平的活性状态。这些结果表明扩增子的方案在大约37℃与大约42℃间能提高基因表达的水平。
在另一套不同的实验中，通过用一携带上游为CMV启动子的β-半乳糖苷酶基因的控制质粒共转染的方法，阐明了转染有效体中的变化。这些实验的一般方案为，转代培养细胞24小时后转染细胞，再培养24小时后热激培养基，更换培养基并培养24小时后测量IL-2的表达水平。如下表5所示，CMV启动的活性仅受到热激的很小影响。最小化的热激启动子在细胞保持在37℃时仅有非常低的活性，42℃热激后能诱导到20倍的提高。如在稳定转染的细胞中所见，最小化的热激启动子的活性仅有CMV启动子的一半。
                               表5
               干扰素-2(IL-2)表达量*载体    启动子    37℃    42℃**   提高倍数(42/37)    相对比率***L27    CMV-IL2    82.6    93.4          1.1             1.0C8     HSP-MCS    84.7    70.6          0.8             1.9
   HIV1-IL2f11    HSP-IL2     2.3    54.0         23.7             0.4(1)f12    HSP-TAT   107.6   347.4          3.2             6.9(17)
   HIV1-IL2007    HSP-TAT    747.5 1642.9          2.2            83.3(208)
   HIV2-IL2                                                   
*：    数值表示24小时中产生的每mg细胞蛋白中IL-2量，以IU为单位
**：   热激1小时
***：  基于42℃的数值，CMV-β-gal共转染
HIV1启动子在无tat表达时，类似于CMV启动子并且几乎不受热激影响。但是当最小化的热激启动子被用来表达tat时，报导基因的表达在42℃热激后急剧地提高。当暂时性地用热激启动子/tat与HIV1/IL-2转染时，IL-2的表达与用热激启动子/MCS与HIV1/IL-2转染的细胞在37℃培养时类似。这个活性在42℃热激后，相对自身提高了超过3倍并且几乎达到CMV启动子的7倍多。
HS启动子/tat与HIV/IL-2转染的细胞维持在37℃时或42℃热激后都显示了实质性的报导基因的表达。以IL-2作度量的相对启动子活性比CMV启动单独存在时高出80多倍。温度调控有所降低，42℃热后报导基因的表达是同一细胞维持37℃培养表达量的近似2倍。
温度依赖的报导基因表达不受第二个启动子存在的影响。如下表六所示，在用含最小化热激启动子/tat与HIV2/IL-2的质粒暂时性转染的细胞中的报导基因表达，在37℃到44℃间以一种温度依赖型的方式提高。这些结果在数值上与在图4与图6中所见的仅用最小化热激启动子稳定转染的细胞的数值相似。
                      表6
                  IL-2表达量(IU/ml)* 载体    启动子    37℃  39℃  40℃ 41℃  42℃ 44℃C8     HSP-MCS    7.2   9.3   6.0  4.8   5.3  7.0
   HIV1-IL2f12    HSP-TAT    40.6   --    --   --   133.1 --
   HIV1-IL2007    HSP-TAT    224   222   230  250   375  470
   HIV2-IL2                                    
用所示载体暂时性转染MCF7乳腺癌细胞；24小时后热激1小时；热激后24小时收集培养基并检测IL2
                         例四动物体研究
在组织学上的特征与转移潜能上类似于人肿瘤的人类癌症的鼠模型，可以用本发明所提供的治疗组合物来治疗。在本发明的一个实施例中，用报导构建体稳定转染的人肿瘤细胞注射SCID小鼠，报导构建体含HSP70B启动子驱动表达的TAT以及HIV-1或HIV-2启动子驱动表达的EGFP或IL-2。当肿瘤生长到合适的可检测的大小时，如直径1cm，用超声加热肿瘤到温度42℃。在热激后的不同时间定量基因的表达，方法为切除肿瘤制备组织切片，检测来自EGFP的荧光，或者用ELISA法检测肿瘤组织中的IL-2水平。应用本发明的另一实施例，人肿瘤细胞被注射到SCID小鼠中。肿瘤生长到合适的可检测的大小时注射DNA-脂复合物。用超声热激肿瘤，热激后检测基因表达。治疗的有效性由肿瘤尺寸的减小，转移活性的降低，细胞扩增的降低以及肿瘤生长的中止表明，作为摄入本发明治疗组合物的效果。
在不违背本发明范围与精神的情况下，本发明领域的一般技术人员可得到本发明的各种修饰体与变体。尽管本发明在描述时与一些特定的参考实施例相联系，应该理解本发明的权利要求不应被限制于这些特定的实施例中。实际上，所描述的实现此发明的各种方式显然囊括在所附权利要求的范围之内。
                    序列表<110>Tsang,Tom
 Gerner,Eugene W.
 Harris,David T.
 Hersh,Evan<120>用于基因治疗的高温诱导表达载体及其使用方法<130>15907-0016<140><141><150>US 60/064,088<151>1997-11-03<160>1<170>Patent In Ver.2.0<210>1<211>469<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ggatcctcca cagccccggg gagaccttgc ctctaaagtt gctgcttttg cagctctgcc 60acaaccgcgc gtcctcagag ccagccggca ggagctagaa ccttccccgc gtttctttca 120gcagccctga gtcagaggcg ggctggcctt gcaagtagcc ccccagcctt cttcggtctc 180acggaccgat ccgcccgaac cttctcccgg ggtcagcgcc gcgctgcgcc gcccggctga 240ctcagcccgg gcgggcgggc gggaggctct cgactgggcg ggaaggtgcg ggaaggttcg 300cggcggcggg gtcggggaga gaaaccgcag ggagagcctc actgctgagc gcccctcgac 420gcgggcggca gcagcctccg tggcctccag catccgacaa gaagcttac             469

Claims (46)

1．一种在哺乳动物细胞中有效表达所选多聚核苷酸的方法，其特征在于所述方法包括：
(a)提供一种表达构建体，该表达构建体包括(ⅰ)适当地连接到编码反式激活因子的基因的可诱导启动子；以及(ⅱ)适当地连接到所述所选多聚核苷酸的第二个启动子，其中，该第二启动子由所述反式激活因子激活；
(b)导入所述表达构建体到所述细胞中；以及
(c)将该细胞放置于能激活所述可诱导启动子的条件中，其中，所述条件导致所述所选多聚核苷酸的表达。
2．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于所述可诱导启动子为热激启动子，并且激活该启动的条件为高温条件。
3．根据权利要求2所述的方法，其特征还在于所述高温条件包括所述细胞的大约的基础温度到大约42℃之间的温度。
4．根据权利要求3所述的方法，其特征还在于所述高温条件包含大约37℃与大约42℃间的温度。
5．根据权利要求4所述的方法，其特征还在于所述高温条件包含大约38℃与大约41℃间的温度。
6．根据权利要求5所进的方法，其特征还在于所连高温条件包含大约39℃与大约40℃间的温度。
7．根据权利要求2所述的方法，其特征还在于所述的热激启动子由HSP70,HSP90,HSP60,HSP27,HSP72,HSP73,HSP25，泛素，与HSP28启动子之一所衍生得到。
8．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于所述的可诱导启动子包括低氧反应元素。
9．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于所述的第二启动子选自HIV-1启动子与HIV-2启动子之一，并且所述的反式作用因子为tat。
10．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于其中所述的多聚核苷酸的表达产生一多肽、蛋白质、核酶，或是一段反义核苷酸。
11．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于所述所选多聚核苷酸对蛋白编码，该蛋白选自含鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白，p53,p16,neu,IL1,IL2,IL4,IL7,IL12,IL15,FLT-3配体,GM-CSF,G-CSF,IFNγ,IFNα,TNF,HSV-TK,I-CAM1,HLA-B7，与TIMP-3之一。
12．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于所述的表达构建体还包括编码选择标记的基因。
13．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于所述的表达构建体还包括(ⅰ)适当地连接到所述第二启动子上的第二个所选多聚核苷酸；以及(ⅱ)位于所述第一所选多聚核苷酸与第二所选多聚核苷酸间的内部核糖体识别位点。
14．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于所述细胞为肿瘤细胞。
15．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于，其中，将所述表达构建体导入到所述细胞中是由以下传输载体之一所介导：脂质体，逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，雀痘病毒，单纯疱疹病毒，和牛痘病毒。
16．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于，其中，将所述表达构建体导入到所述细胞中是在体外进行。
17．根据权利要求1所述的方法，其特征还在于，其中，将所述表达构建体导入到所述细胞中是在体内进行。
18．一种提供所选多聚核苷酸的具治疗有效剂量的表达产物的方法，包括：
(a)提供第一个表达构建体，该构建体包括可诱导的启动子，其合适地连接到一个编码反式激活因子的基因上；
(b)提供第二个表达构建体，该第二个表达构建体包括第二个启动子，其合适地连接到所述的所选多聚核苷酸，其中，该第二启动子由所述反式激活因子激活；
(c)将所述第一与第二表达构建体导入到被治疗对象中；以及
(d)将所述细胞置于能激活所述可诱导启动子的条件，其中，该条件能诱导所述所选多聚核苷酸的表达。
19．根据权利要求18所述的方法，其特征还在于所述的可诱导启动子为热激启动子，并且激活该可诱导启动的条件包括从大约的基础温度到大约42℃之间。
20．根据权利要求19所述的方法，其特征还在于所述的第一与第二表达构建***于同一载体上。
21．根据权利要求20所述的方法，其特征还在于，其中，采用来自体内的方法将所述表达构建体导入到所述细胞中。
22．根据权利要求18所述的方法，其特征还在于，其中将所述表达构建体导入到所述细胞中是在体内进行。
23．根据权利要求18所述的方法，其特征还在于，其中所述所选多聚核苷酸的表达产物对某一病原体有伤害作用，其中，该病原体包括病毒，细菌，真菌，与寄生虫。
24．根据权利要求18所述的方法，其特征还在于，其中所述所选多聚核苷酸的表达产物能抑制所述细胞的生长。
25．根据权利要求18所述的方法，其特征还在于，其中所述所选多聚核苷酸的表达产物能替代缺陷蛋白。
26．根据权利要求18所述的方法，其特征还在于，其中所述所选多聚核苷酸的表达产物促进神经纤维的再生。
27．治疗哺乳动物癌症的方法，其特征在于包括如下步骤：
(a)提供表达构建体，该表达构建体包括(ⅰ)合适地连接到编码反式激活因子的基因的可诱导启动子上；及(ⅱ)合适地连接到所选多聚核苷酸上的第二启动子，其中，该第二启动子由所述反式激活因子激活；
(b)将该表达构建体导入到肿瘤细胞中；以及
(c)将该肿瘤细胞置于能激活所述可诱导启动子的条件中，此处该条件导致所述所选多聚核苷酸的表达并且所选多聚核苷酸表达产物的量足够有效地抑制该肿瘤细胞的生长。
28．根据权利要求27所述的方法，其特征还在于其中所述可诱导启动子为热激启动子并且激活该可诱导启动子的条件为高温条件，包括大约的基础温度到大约42℃之间的温度。
29．根据权利要求27所述的方法，其特征还在于进一步包括：用至少一种已建立的治疗癌症的方法来治疗所述肿瘤细胞，所述方法选自外部射线束治疗，内置放射源，化疗，及外科方法之
30．根据权利要求27所述的方法，其特征还在于进一步包括：
(d)在将所述肿瘤细胞置于高温条件下后用射线保护器WR-33278或WR-1065治疗该细胞；以及
(e)在最后一步，用放射治疗法治疗所述肿瘤细胞，其中所述的所选多聚核苷酸对鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白进行编码。
31．根据权利要求27所述的方法，其特征还在于其中所述哺乳动物包括人类。
32．根据权利要求27所述的方法，其特征还在于所述癌症选自以下部位的癌症：大脑，肺，肝，膀胱，脾，肾，***，小肠，胰，血细胞，直肠，胃，乳腺，子宫，***，睾丸，卵巢，皮肤，阴门，子宫颈，头颈部，食道，骨髓，以及血液。
33．一种在哺乳动物中刺激某一免疫反应的方法，其特征还在于包括：
(a)提供表达构建体，该表达构建体包括(ⅰ)合适地连接到编码反式激活因子基因上的可诱导启动子；与(ⅱ)合适地连接到一所选多聚核苷酸上的第二启动子，其中，该第二启动子由所述反式激活因子激活；
(b)将该表达构建体导入到一哺乳动物细胞中；及
(c)将该细胞放置于能激活所述可诱导启动子的条件中，所述的条件导致所述所选多聚核苷酸的表达，并且产物的表达量足够有效地在该哺乳动物中引起免疫反应，该免疫反应选自体液免疫反应与细胞免疫反应之一。
34．根据权利要求33所述的方法，其特征还在于所述的可诱导启动子为热激启动子并且激活该启动子的条件为高温条件，包括大约的基础温度到大约42℃之间的温度。
35．根据权利要求33所述的方法，其特征还在于所述的免疫反应目的是抗所述细胞。
36．根据权利要求35所述的方法，其特征还在于进一步包括：用至少一种已建立的治疗癌症的方法来治疗所述细胞，方法由选自：化疗，外部射线束治疗，内置放射源，及外科方法。
37．根据权利要求33所述的方法，其特征还在于所述的哺乳动物为人类。
38．一种改变哺乳动物基因材料的方法，其特征还在于包括：
(a)提供表达构建体，该表达构建体含有(ⅰ)合适地连接到编码反式激活因子基因上的可诱导启动子；与(ⅱ)合适地连接到一所选多聚核苷酸上的第二启动子，其中，该第二启动子由所述反式激活因子激活；
(b)将该表达构建体导入到一哺乳动物细胞中。
39．一种表达构建体包括：
(a)编码反式激活因子的基因；
(b)合适地连接到该基因上的可诱导启动子；
(c)选出的多聚核苷酸；以及
(d)合适地连接到所述所选的多聚核苷酸上的第二启动子，该第二启动子由所述反式激活因子激活。
40．根据权利要求39所述的表达构建体，其特征还在于所述的可诱导启动子为热激启动子并且所述所选的多聚核苷酸的表达由高温条件所诱导，该高温条件包括大约基础温度到大约42℃之间的温度。
41．根据权利要求40所述的表达构建体，其特征还在于所述的热激启动子由HSP70,HSP90,HSP60,HSP27,HSP72,HSP73,HSP25，泛素，与HSP28启动子之一所衍生获得。
42．根据权利要求39所述的表达构建体，其特征还在于所述的可诱导启动子包含低氧反应元素。
43．根据权利要求39所述的表达构建体，其特征还在于所述的第二启动子选自HIV-1启动子与HIV-2启动子，并且所述的反式作用因子选自tat。
44．根据权利要求39所述的表达构建体，其中所述的多聚核苷酸的表达产生多肽、蛋白质、核酶，或是一段反义核苷酸。
45．根据权利要求39所述的表达构建体，其特征还在于所述的表达构建体进一步包括(ⅰ)合适地连接到所述第二启动子上的第二个选定的多聚核苷酸；以及(ⅱ)位于所述第一与第二所选多聚核苷酸间的内部核糖体识别位点。
46．一种包含如权利要求39所述的表达构建体的细胞。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication