WO2019208868A1 - 세포에서의 자가포식작용 억제용 조성물, 및 이를 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용, 또는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

세포에서의 자가포식작용 억제용 조성물, 및 이를 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용, 또는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2019208868A1
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polypeptide
autophagy
polypeptides
threonine
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전도용
문창훈
정지은
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주식회사 엘베이스
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Definitions

  • the present invention was made by the task number '1415154568' under the support of the Ministry of Trade, Industry and Energy, the research and management institution of the project is the Korea Institute of Industrial Technology Promotion, the research project name "promoting the use of technical performance", the research title is "T790M mutation resistant Development of oligopeptide low molecular weight drugs to overcome the resistance of the induced non-small cell lung cancer ", the host organization is ELBASE Co., Ltd., the research period is 2017.06.01 ⁇ 2018.05.31.
  • the present invention relates to a polypeptide having an autophagy inhibitory activity in a cell, a composition for inhibiting autophagy comprising the same as an active ingredient, and a pharmaceutical composition comprising the same, more specifically autophagy To a cell containing a polypeptide that inhibits the regulation mechanism of the active ingredient, in particular a composition for inhibiting autophagy in tumor cells, and a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neoplastic diseases, or the inhibition of anticancer drug resistance About
  • Autophagy is the process of removing unnecessary or lost organelles and proteins from cells, helping to maintain cell homeostasis and is a cell survival mechanism.
  • autophagy plays a large role in various diseases such as cancer, inflammatory disease, neurodegenerative disease, immune disease, etc.
  • diseases such as cancer, inflammatory disease, neurodegenerative disease, immune disease, etc.
  • many studies play a complex role depending on the stage, type and genotype of cancer. It is known to be closely related to.
  • cancer When cancer is formed by increasing the number of cells, the cells become starved because they are not properly supplied with nutrients from the surrounding environment. At this time, they are fed with nutrients by recycling harmful protein deposits and damaged organelles through autophagy. When cancer growth is energized by autophagy in an adverse environment, cancer cell survival is promoted.
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • the mTOR (mammalian target of rapamycin) is a serine / threonine protein kinase belonging to the PI3K-related kinase family and is known to regulate cell growth and proliferation, survival, migration, protein synthesis and transcription, and to inhibit autophagy. Many studies have reported that the mTOR mechanism is involved in various diseases such as metabolic diseases, neurodegenerative diseases and cardiovascular diseases as well as cancer.
  • Beclin1 is a protein encoded by the BECN1 gene and is an autophagy inducer. Beclin1 plays an important role in tumor suppression, and this tumor suppressor function is known to be associated with proliferative cell death of autodigestion.
  • the present inventors have tried to develop a polypeptide that can regulate autophagy, which plays an important role in cancer, and as a result, comprising a polypeptide that inhibits the mechanism of autophagy (autophagy) as an active ingredient,
  • a pharmaceutical composition for inhibiting autophagy in cells, in particular in tumor cells, and for preventing or treating a tumorous disease comprising the same, or for inhibiting anticancer drug resistance it activates mTOR that inhibits autophagy and autophages.
  • the present invention activates mTOR that inhibits autophagy and inhibits autophagy through inactivation of AMPK and Beclin1, which induces autophagy, thereby inhibiting the promotion of tumor development by autophagy and reducing anticancer drug resistance. It is an object to provide a polypeptide having autophagy inhibitory activity in a number of cells, in particular tumor cells.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neoplastic diseases using the polypeptide.
  • the present invention provides a polypeptide having an activity of inhibiting autophagy in a cell represented by the following general formula.
  • K is lysine
  • X1 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, methionine, proline and valine;
  • X2 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, threonine, cysteine, asparagine, proline, glutamine and serine;
  • X3 is one or more amino acids selected from the group consisting of alanine, glutamine, threonine, threine, serine, asparagine and glycine, or absent)
  • Autophagy is induced in cells that are stressed by cell survival mechanisms, which suppress tumors during cancer development before cancer progresses, but contribute to tumor cell survival after cancer is produced. Therefore, it is thought that the inhibition of autophagy mechanisms in tumor-producing tumor cells can reduce the activity of tumor cells.
  • the present inventors have invented a polypeptide for inhibiting autophagy in cancer-producing cells, particularly tumor cells, and in the case of a polypeptide represented by the general formula, autophagy is suppressed by inhibiting autophagy. It was confirmed that it is possible to suppress the tumor development promotion by the anti-cancer agent, and to reduce the anticancer drug resistance, to complete the present invention.
  • the cell is characterized in that the tumor cell.
  • tumor cells' of the present invention may refer to tumor cells after cancer is generated, and may refer to solid cancer.
  • tumor cell may be a tumor cell resistant to anticancer agents.
  • X1 may be an amino acid having a non-polar and aliphatic R group
  • X2 may be an amino acid having a non-polar and non-charged R group, preferably Is characterized in that the alanine (alanine).
  • X1 may be an amino acid having a non-polar and aliphatic R group, preferably proline, and X2 is polar and vision. It may be an amino acid having an R group, preferably characterized in that threonine (threonine).
  • X1 may be an amino acid having a non-polar and aliphatic R group, preferably isoleucine, and X2 is polar It may be an amino acid having an uncharged R group, and is preferably characterized as threonine.
  • X3 is characterized in that glutamine (glutamine) and threonine (threonine).
  • polypeptide having the activity of inhibiting autophagy of the present invention X3 is characterized in that the serine (serine).
  • X3 is characterized in that it is glycine, asparagine and threonine.
  • Polypeptides having an activity of inhibiting autophagy of the present invention may be expressed by one or more proteins selected from the group consisting of p-AMPK, ATG5-ATG12, Beclin1, p-Beclin1, LC3-I and LC3-II. By reducing autophagy in cells.
  • arsenic having a resistance to the anticancer agent compared to the non-small cell lung cancer cell line
  • the expression of p-AMPK, ATG5 and ATG5-ATG12 was increased in the cell lung cancer cell line, and the expression of p62 protein was decreased.
  • p-AMPK is a factor that increases tumor development and anticancer resistance by autophagy
  • ATG5 is a factor that promotes tumors
  • ATG5-ATG12 plays an essential role in forming autophagosomes in autophagy.
  • increased p-AMPK, ATG5 and ATG5-ATG12 protein expression means that the polypeptides according to the invention are involved in cancer cell resistance (see Example 1 and Figures 1-3). That is, according to one embodiment of the present invention, it means that increased p-AMPK, ATG5 and ATG5-ATG12 protein expression is involved in cancer cell resistance (see Example 1 and Figures 1 to 3).
  • a polypeptide having an activity of inhibiting autophagy of the present invention inhibition of autophagy in the tumor cells is characterized by autophagy in cells by increasing expression of p-mTOR or p62 protein. (autophagy) is suppressed.
  • polypeptide according to the present invention increases the factors that inhibit autophagy, thereby inactivating p-AMPK, Beclin1 and p-Beclin1, which induces autophagy, thereby reducing tumor development promotion by autophagy and Suggests that anticancer drug resistance can be reduced (see Example 4, FIG. 9).
  • the polypeptide is a chromophore, a radioisotope, a chromophore, a luminescent material, a fluorescer, a magnetic resonance imaging It is characterized by being labeled with one of the labeling material selected from the group consisting of a substance, super paramagnetic particles and superparamagnetic particles, but does not necessarily mean that it can be labeled with a labeling material.
  • the present invention provides a composition for inhibiting autophagy in a cell comprising a polypeptide represented by the following general formula as an active ingredient.
  • K is lysine
  • X1 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, methionine, proline and valine;
  • X2 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, threonine, cysteine, asparagine, proline, glutamine and serine;
  • X3 is one or more amino acids selected from the group consisting of alanine, glutamine, threonine, threine, serine, asparagine, and glycine, or absent)
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tumor diseases comprising a polypeptide represented by the following general formula as an active ingredient.
  • K is lysine
  • X1 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, methionine, proline and valine;
  • X2 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, threonine, cysteine, asparagine, proline, glutamine and serine;
  • X3 is one or more amino acids selected from the group consisting of alanine, glutamine, threonine, threine, serine, asparagine, and glycine, or absent)
  • the neoplastic disease is lung cancer, liver cancer, colon cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, breast cancer, ovarian cancer, kidney cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, esophageal cancer, prostate cancer, Brain cancer, skin cancer, osteosarcoma, soft tissue sarcoma, glioma, lymphoma, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, adrenal cancer, colon cancer, ureter cancer, gallbladder cancer, bladder cancer, testicular cancer, cervical cancer, endometrial cancer, chorionic cancer, head and neck cancer, malignant melanoma , Leukemia, complex myeloma, chronic myeloid leukemia, neuroblastoma, and at least one neoplastic disease selected from the group consisting of aplastic anemia, preferably characterized in that lung cancer or breast cancer, but is not limited thereto.
  • aplastic anemia preferably characterized in that lung cancer or breast cancer, but is not limited thereto.
  • the composition may be used as a pharmaceutical composition of a disease that can be prevented or treated by inhibiting autophagy, but is preferably a tumorous disease. It is characterized by preventing or treating.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting anticancer drug resistance comprising a polypeptide represented by the following general formula as an active ingredient.
  • K is lysine
  • X1 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, methionine, proline and valine;
  • X2 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, threonine, cysteine, asparagine, proline, glutamine and serine;
  • X3 is one or more amino acids selected from the group consisting of alanine, glutamine, threonine, threine, serine, asparagine and glycine, or absent
  • the composition may have resistance to any anticancer agent used to treat tumorous diseases, preferably erlotinib, celastrol Resistance to one or more anticancer agents selected from the group consisting of cisplatin, docetaxel, docetaxel, tagrisso, taxol, pemetrexed, pemetrexed, and tamoxifen. It is done.
  • the composition is characterized by inhibiting anticancer drug resistance by inhibiting autophagy.
  • polypeptide of the present invention can inhibit (reduce) anticancer drug resistance by inhibiting autophagy in anticancer drug resistant cancer cell lines.
  • the present invention provides a use for the preparation of a pharmaceutical composition for preventing or treating tumor loss of the polypeptide represented by the following general formula.
  • K is lysine
  • X1 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, methionine, proline and valine;
  • X2 is at least one amino acid selected from the group consisting of alanine, threonine, cysteine, asparagine, proline, glutamine and serine;
  • X3 is one or more amino acids selected from the group consisting of alanine, glutamine, threonine, threine, serine, asparagine and glycine, or absent
  • the 'subject' may be a mammal including a human, but is not limited thereto.
  • compositions according to the invention can be provided by formulating them in a suitable form with a pure form of the polypeptide or with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable” refers to a nontoxic composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic or similar reaction, such as gastrointestinal disorders, dizziness, etc. when administered to a human.
  • the carrier may include all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes, biodegradable nanoparticles, and the like, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated with a suitable carrier depending on the route of administration.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited thereto, but may be administered orally or parenterally.
  • Parenteral routes of administration include, but are not limited to, various routes, such as, for example, transdermal, nasal, abdominal, muscle, subcutaneous, or intravenous.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in powder, granule, tablet, pill, dragee, capsule, liquid, gel according to a method known in the art together with a suitable oral carrier. It may be formulated in the form of a syrup, a suspension, a wafer, and the like, but is not limited thereto.
  • compositions of the invention can be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • compositions formulated in such a manner can be administered in a effective amount via several routes, including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular.
  • an 'effective amount' refers to an amount of substance that allows the tracking of a diagnostic or therapeutic effect when administered to a patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be appropriately selected according to the route of administration, the subject to be administered, the target disease and its severity, age, sex weight, individual difference, and disease state.
  • the pharmaceutical composition comprising the polypeptide of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the extent of the disease, but usually 1 mg to 1000 mg effective at a single dose based on an adult The dose may be repeated several times a day.
  • the polypeptide according to the present invention is effective in inhibiting anticancer drug resistance as well as preventing or treating tumor diseases by inhibiting autophagy in tumor cells.
  • Cancer cell lines (PC9) used in the present invention were cultured in a minimum essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum and antibiotics in a conditioned incubator (37 ° C.).
  • the anticancer drug resistant cancer cell line (PC9-ER) was produced to be resistant to prolonged exposure to Erlotinib as an anticancer agent.
  • the anticancer drug-resistant cell line (PC9-ER) was found to increase the expression of p-AMPK, ATG5, ATG5-ATG12 protein compared to the PC9 cell line, which is an autophagy inhibitory molecule It was confirmed that the expression of the p62 protein is lowered.
  • PC9 and PC9-ER cell lines were fixed at room temperature with 4% formaldehyde. Then, the cells were reacted with PBS containing 0.1% BSA at room temperature for 30 minutes to prevent inaccurate binding of the antibody, followed by reaction with LC3 antibody (Cell signaling) for 24 hours at 4 ° C. After removing the antibody, washed with PBS and reacted with Alexa 488 fluorescent secondary antibody (Thermo Fisher) for 1.5 hours at room temperature. After the reaction, the cells from which the antibody was removed were washed with PBS, and then stained with DAPI (Thermo Fisher) for 1 minute. Fluorescence staining was confirmed by confocal microscopy (Confocal microscopy), the results are shown in FIG.
  • PC9-ER cell line was confirmed that the degree of LC3 puncta expression is higher than the PC9 cell line.
  • MTT assay was performed to confirm the resistance to anticancer drugs of PC9 and PC9-ER cell lines.
  • the anticancer agent was diluted by 1 / 10-fold for 24 hours and confirmed using MTT.
  • This experiment uses the principle that NADH present in the mitochondria of living cells reacts with MTT to form formazan. After dissolving formazan in DMSO, absorbance was measured at 570 nm to confirm cell growth. Is shown in FIG. 3.
  • polypeptides 1 and 2 were treated on PC9-ER cell lines, respectively, to express the degree of expression of Beclin1, p-Belclin1, ATG5-ATG12, LC3 I and LC3 II, which are autophagy-related proteins. The comparison was made, and the results are shown in FIG. 4.
  • the polypeptide 9 was treated with PC2-ER cell line for 24 hours, and then fixed at room temperature using 4% formaldehyde. Then, the cells were reacted with PBS containing 0.1% BSA at room temperature for 30 minutes to prevent inaccurate binding of the antibody, followed by reaction with LC3 antibody (Cell signaling) for 24 hours at 4 ° C. After removing the antibody, washed with PBS and reacted with Alexa 488 fluorescent secondary antibody (Thermo Fisher) for 1.5 hours at room temperature. After the reaction, the cells from which the antibody was removed were washed with PBS, and then stained with DAPI (Thermo Fisher) for 1 minute. Fluorescence staining was confirmed by confocal microscopy (Confocal microscopy), the results are shown in FIG.
  • each of the polypeptides (1 to 3) was treated with the same number of PC9-ER cell lines in 96 well cell culture plates for 24 hours. Thereafter, the anticancer agent was diluted 1/10 times and treated for 24 hours, and then confirmed using MTT.
  • This experiment uses the principle that NADH present in the mitochondria of living cells reacts with MTT to form formazan. After dissolving formazan in DMSO, absorbance was measured at 570 nm to confirm cell growth activity. Is shown in FIG. 6.
  • each polypeptide (1 to 3) in the PC9-ER cell line reduced resistance to the anticancer drug Erlotinib (Taceva).
  • Polypeptide 2 was labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) and transfected into a PC9-ER cell line according to a known method, as in the method of immunofluorescence staining according to Example 1 of the present invention. Is shown in FIG. 7.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the polypeptide 2 was to determine the anti-cancer activity of the polypeptide 2 in-vivo.
  • polypeptide 2 significantly reduced tumor volume.
  • p-mTOR and p62 protein expression showed a concentration-dependent increase in tumor tissue, and p-AMPK, Beclin1, and p-Beclin1. Protein expression showed a concentration-dependent decrease.
  • each of the polypeptides (1 to 3) was treated for 24 hours after dispensing H1975 cell lines into 96 well cell culture plates in the same number. Thereafter, the anticancer drug Osimertinib (Tagrisso) was diluted 1/10 times and treated for 24 hours, and then confirmed using MTT.
  • This experiment uses the principle that NADH present in the mitochondria of living cells reacts with MTT to form formazan. After dissolving formazan in DMSO, absorbance at 570 nm was measured to confirm the cell growth activity. Is shown in FIG. 11.
  • each polypeptide (1 to 3) in the H1975 cell line reduces the resistance to the anticancer agent Osimertinib (Tagrisso).
  • polypeptide 1, polypeptide 2 and polypeptide 3 has anticancer activity through inhibiting autophagy.
  • the anticancer drug resistant cancer cell line (MCF7 R ) was made to be resistant to prolonged exposure to Celastrol as an anticancer agent.
  • the polypeptide 2 was treated with MCF7 R cell line for 24 hours, and then fixed at room temperature using 4% formaldehyde. Then, the cells were reacted with PBS containing 0.1% BSA at room temperature for 30 minutes to prevent inaccurate binding of the antibody, followed by reaction with LC3 antibody (Cell signaling) for 24 hours at 4 ° C. After removing the antibody, washed with PBS and reacted with Alexa 488 fluorescent secondary antibody (Thermo Fisher) for 1.5 hours at room temperature. After the reaction, the cells from which the antibody was removed were washed with PBS, and then stained with DAPI (Thermo Fisher) for 1 minute. Fluorescence staining was confirmed using a confocal microscopy (Confocal microscopy), the results are shown in FIG.
  • each of the polypeptides (1 to 3) was treated with the same number of MCF7 R cell lines in 96 well cell culture plates for 24 hours. After that, the anticancer agent was diluted 1/10 times and treated for 24 hours, and then confirmed using MTT.
  • This experiment uses the principle that NADH present in the mitochondria of living cells reacts with MTT to form formazan. After dissolving formazan in DMSO, absorbance was measured at 570 nm to confirm cell growth activity. Is shown in FIG. 14.
  • each polypeptide (1 to 3) in the MCF7 R cell line reduced resistance to various anticancer drugs such as Celastrol, Cisplatin, Docetaxel.
  • the polypeptide according to the present invention is effective in inhibiting anti-cancer drug resistance as well as preventing or treating tumor diseases by inhibiting autophagy in tumor cells, thereby preventing tumor diseases. Or as a composition for treatment.

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Abstract

본 발명은 세포에서 자가포식작용 (autophagy) 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드, 이를 유효성분으로 포함하는 세포에서, 특히 종양세포에서의 자가포식작용 (autophagy) 억제용 조성물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 자가포식작용(오토파지; autophagy)의 조절 기전을 억제하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포에서의 자가포식작용 억제용 조성물 및 이를 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용, 또는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 자가포식작용 (autophagy) 관련 단백질인 p-AMPK, ATG5-ATG12, Beclin1, p-Beclin1, LC3-I, LC3-II, p-mTOR 및 p62의 발현을 조절함으로써 자가포식작용 (autophagy)을 억제할 수 있으며, 이에 의하여 종양성 질환을 예방 또는 치료하는데 효과가 있을 뿐만 아니라 항암제 내성도 억제할 수 있다.

Description

세포에서의 자가포식작용 억제용 조성물, 및 이를 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용, 또는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물
본 발명은 대한민국 산업통상자원부 지원하에 과제번호 '1415154568'에 의해 이루어진 것으로, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국산업기술진흥원, 연구사업명은 "기술성과활용촉진", 연구과제명은 "T790M 돌연변이로 내성이 유발된 비소세포폐암의 내성 극복을 위한 올리고펩티드 저분자 의약품 개발", 주관기관은 (주)엘베이스, 연구기간은 2017.06.01 ~ 2018.05.31 이다.
본 발명은 세포에서 자가포식작용 (autophagy) 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드, 이를 유효성분으로 포함하는 자가포식작용 억제용 조성물 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 자가포식작용 (autophagy)의 조절 기전을 억제하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포, 특히 종양세포에서의 자가포식작용 억제용 조성물, 및 이를 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용, 또는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다
자가포식작용(autophagy)은 세포에서 불필요하거나 기능을 잃은 세포소기관과 단백질을 제거하는 과정으로, 세포의 항상성을 유지하는데 도움이 되며 세포 생존 메커니즘이다.
자가포식작용은 특히 암, 염증질환, 퇴행성 신경질환, 면역질환 등의 여러 질병에서 많은 역할을 한다는 것이 알려져 있으며, 특히, 많은 연구들에서 암의 진행 단계, 종류, 유전자형 등에 따라 복잡한 역할을 하여 암과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
격한 세포수 증가에 의해 암을 형성하게 되면 세포들은 주변 환경으로부터 영양분을 제대로 공급받지 못해 기아상태가 되고, 이때 자가포식작용을 통해 유해한 단백질 침전물과 손상을 입은 세포소기관을 재활용하여 영양분을 공급받기 때문에 암의 성장이 불리한 환경에서 자가포식작용에 의해 에너지 공급을 받게 되면 암세포의 생존이 촉진된다.
이러한 환경에서 세포 생존에 관여하는 것으로 알려진 단백질이 AMPK (AMP-activated protein kinase)인데, AMPK는 에너지 고갈, 세포외 기질 이탈, 활성 산소 증가 및 저산소 상황에서 활성화되어 대사 작용을 유도하는데 중요한 역할을 수행하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 활성화된 AMPK는 자가포식 신호체계에서 mTOR 작용을 억제하는 것으로 알려져 있다.
mTOR(mammalian target of rapamycin)는 PI3K-related kinase family 에 속하는 serine/threonine protein kinase로 세포의 성장과 증식, 생존, 이동, 단백질 합성, 전사를 조절하며, 자가포식작용을 억제한다고 알려져 있다. 이러한 mTOR 기전은 암뿐만 아니라 대사성 질환, 퇴행성 신경질환 및 심혈관 질환 등 다양한 질병에 관여한다는 많은 연구결과들이 발표되고 있다.
Beclin1은 BECN1 유전자로 암호화 되는 단백질로서, 자가포식유도자이다. Beclin1은 종양 억제에 있어 중요한 역할을 하는데, 이러한 종양 억제 기능은 자가 소화 작용의 예정세포사와 관련되어 있다고 알려져 있다.
최근, 자가포식작용이 종양의 형성, 성장 및 치료에 중요한 역할을 한다는 연구결과들에 관심이 증가하고 있다. 암에서 자가포식작용의 역할은 매우 복잡하여 종양억제인자이거나 종양촉진인자로서 두 가지 상반되는 기능을 한다고 알려져 있다. 그러므로 암의 여러 조건에 따라 자가포식작용의 역할을 구별하고, 적절하게 조절하는 것이 암 치료의 새로운 전략적 방법이 되고 있으며, 치료에 있어 큰 문제인 항암제 내성과 관련해 자가포식작용의 저해가 다양한 항암 요법으로 인한 항암제의 내성을 감소시킨다는 연구 결과들이 발표되고 있다 (2017, Nature Reviews Cancer 17, 528-542).
이에, 본 발명자들은 암에서 중요한 역할을 하는 자가포식작용을 조절할 수 있는 폴리펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, 자가포식작용 (오토파지; autophagy)의 조절 기전을 억제하는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 세포에서, 특히 종양세포에서의 자가포식작용 억제용 조성물 및 이를 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용, 또는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물의 경우, 자가포식작용을 억제하는 mTOR을 활성화하고 자가포식작용을 유발하는 AMPK 및 Beclin1의 비활성화를 통한 자가포식작용을 억제함으로써, 자가포식작용에 의한 종양 발달 촉진을 억제하고, 항암제 내성을 감소시키는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 자가포식작용을 억제하는 mTOR를 활성화하고 자가포식작용을 유발하는 AMPK 및 Beclin1의 비활성화를 통한 자가포식작용을 억제함으로써, 자가포식작용에 의한 종양 발달 촉진을 억제하고, 항암제 내성을 감소시킬 수 있는 세포, 특히 종양세포에서의 자가포식작용(autophagy) 억제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드를 이용한 세포, 특히 종양세포에서의 자가포식작용 억제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드를 이용한 종양성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 자가포식작용 억제용 조성물을 이용한 항암제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 서열 일반식으로 표시되는, 세포에서 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
[일반식]
X3-X1-T-X1-K-X2
(상기 서열 일반식에서 T는 트레오닌(threonine)이고,
상기 K는 라이신(lysine)이며;
상기 X1은 알라닌(alanine), 글라이신(glycine), 이소류신(Isoleucine), 류신(leucine), 메티오닌(Methionine), 프롤린(proline) 및 발린(valine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
상기 X2는 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 아스파라긴(asparagine), 프롤린(proline), 글루타민(glutamine) 및 세린(serine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
X3는 알라닌(alanine), 글루타민(glutamine), 트레오닌(threonine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine) 및 글라이신(glycine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산, 또는 부재임)
자가포식작용(오토파지; autophagy)은 세포 생존 메커니즘으로 스트레스를 받는 세포에서 유도되는데, 암이 진행되기 전, 암이 발달하는 동안에는 종양을 억제하나, 암이 생성된 후에는 종양세포의 생존에 기여하기 때문에 암이 생성된 종양세포에서의 자가포식작용 기전을 억제할 경우, 종양세포의 활성을 감소시킬 수 있을 것으로 생각된다.
이에, 본 발명자들은 암이 생성된 세포에서, 특히 종양세포에서의 자가포식작용을 억제하기 위한 폴리펩타이드를 발명하였으며, 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 경우, 자가포식작용을 억제함으로써 자가포식작용에 의한 종양 발달 촉진을 억제하고, 항암제 내성을 감소시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드에 있어서, 상기 세포는 종양 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 용어 '종양 세포에서'는 암이 생성된 후의 종양 세포를 의미할 수 있으며, 고형암을 일컬을수 있다. 또한, 상기 용어 '종양 세포'는 항암제에 대한 내성을 갖는 종양 세포일 수 있다.
본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드에 있어서, 상기 X1은 비극성이면서 지방족 R기를 갖는 아미노산일 수 있으며, X2는 비극성이면서 비전하 R기를 갖는 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 알라닌(alanine)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드에 있어서, 상기 X1은 비극성이면서 지방족 R기를 갖는 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 프롤린(proline)이고, X2는 극성이면서 비전하 R기를 갖는 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 트레오닌(threonine)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드에 있어서, 상기 X1은 비극성이면서 지방족 R기를 갖는 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 이소류신(Isoleucine)이고, 상기 X2는 극성이면서 비전하 R기를 갖는 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 트레오닌(threonine)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드에 있어서, 상기 X3는 글루타민(glutamine) 및 트레오닌(threonine)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드에 있어서, X3는 세린(serine)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드에 있어서, 상기 X3는 글라이신(glycine), 아스파라긴(asparagine) 및 트레오닌(threonine)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드는 p-AMPK, ATG5-ATG12, Beclin1, p-Beclin1, LC3-I 및 LC3-II로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현을 감소시킴으로써 세포에서의 자가포식작용 (autophagy)을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 비소세포폐암 세포주 및 항암제에 내성을 갖는 비소세포폐암 세포주 사이의 자가포식작용 기전에 관여하는 단백질의 관련성을 확인한 결과, 비소세포폐암 세포주 대비 항암제에 내성을 갖는 비소세포폐암 세포주에서 p-AMPK, ATG5 및 ATG5-ATG12 의 발현이 증가하였으며, p62 단백질 발현은 감소하는 것을 확인하였다.
p-AMPK는 자가포식작용에 의한 종양의 발달 및 항암제 내성을 증가시키는 인자이고, ATG5는 종양을 촉진시키는 인자이며, ATG5-ATG12는 자가포식작용에서 자가소화포(autophagosome)를 형성하는데 필수적인 기능을 담당하는 인자이므로, p-AMPK, ATG5 및 ATG5-ATG12 단백질 발현 증가는 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 암세포 내성에 관여함을 의미한다(실시예 1 및 도 1 내지 3 참조). 즉, 본원발명의 일 실시예에 따르면, p-AMPK, ATG5 및 ATG5-ATG12 단백질 발현 증가가 암세포 내성에 관여함을 의미한다(실시예 1 및 도 1 내지 3 참조).
본 발명의 폴리펩타이드를 항암제에 내성을 갖는 비소세포폐암 세포주에 농도 별로 처리한 결과, 자가포식작용의 개시자로 알려진 Beclin1, p-Beclin1, ATG5-ATG12, LC3-I 및 LC3-II 단백질의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 상기 자가포식작용의 활성제로 알려진 단백질의 발현을 감소시켜 자가포식작용을 억제함으로써 종양 발달 촉진을 억제하고, 항암제 내성을 감소시킬 수 있음을 시사한다(실시예 2, 도 4 내지 도 6 참조).
본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드에 있어서, 상기 종양 세포에서의 자가포식작용 (autophagy)의 억제는 p-mTOR 또는 p62 단백질의 발현을 증가시킴으로써 세포에서 자가포식작용 (autophagy)을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본원발명의 일 실시예에 따르면, in-vivo에서 본 발명의 폴리펩타이드의 자가포식작용 억제 효과, 항종양 효과 및 항암제 내성 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 폴리펩타이드를 농도별로 마우스에 주입한 경우에 종양 조직이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(실시예 4, 도 8 참조).
또한, 상기 종양 조직에서의 자가포식작용에 관여하는 인자들의 발현 정도를 확인한 결과, 자가포식작용을 억제하는 역할을 하는 p-mTOR 및 p62 단백질의 발현이 증가하였고, 자가포식작용의 활성제인 p-AMPK, Beclin1 및 p-Beclin1 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
이러한 결과는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 자가포식작용을 억제하는 인자들을 증가시켜 자가포식작용을 유발하는 p-AMPK, Beclin1및 p-Beclin1을 비활성화 시킴으로써 자가포식작용에 의한 종양 발달 촉진의 감소 및 항암제 내성을 감소시킬 수 있음을 시사한다(실시예 4, 도 9 참조).
본 발명의 자가포식작용(autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 표지 물질 중 하나로 표지되는 것을 특징으로 하나, 반드시 표지 물질로 표지될 수 있음을 의미하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포에서의 자가포식작용(autophagy) 억제용 조성물을 제공한다.
[일반식] X3-X1-T-X1-K-X2
(상기 서열 일반식에서 T는 트레오닌(threonine)이고,
상기 K는 라이신(lysine)이며;
상기 X1은 알라닌(alanine), 글라이신(glycine), 이소류신(Isoleucine), 류신(leucine), 메티오닌(Methionine), 프롤린(proline) 및 발린(valine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
상기 X2는 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 아스파라긴(asparagine), 프롤린(proline), 글루타민(glutamine) 및 세린(serine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
X3는 알라닌(alanine), 글루타민(glutamine), 트레오닌(threonine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine), 및 글라이신(glycine) 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산, 또는 부재임)
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[일반식]
X3-X1-T-X1-K-X2
(상기 서열 일반식에서 T는 트레오닌(threonine)이고,
상기 K는 라이신(lysine)이며;
상기 X1은 알라닌(alanine), 글라이신(glycine), 이소류신(Isoleucine), 류신(leucine), 메티오닌(Methionine), 프롤린(proline) 및 발린(valine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
상기 X2는 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 아스파라긴(asparagine), 프롤린(proline), 글루타민(glutamine) 및 세린(serine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
X3는 알라닌(alanine), 글루타민(glutamine), 트레오닌(threonine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine), 및 글라이신(glycine) 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산, 또는 부재임)
본 발명의 종양성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서, 종양성 질환은 폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 부갑상선암, 식도암, 전립선암, 뇌암, 피부암, 골육종, 연부조직육종, 신경교종, 림프종, 비인두암, 후두암, 부신암, 결장암, 요관암, 담낭암, 방광암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 두경부암, 악성흑색종, 백혈병, 복합 골수종, 만성 골수성 백혈병, 신경아종 및 재생불량성 빈혈로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 종양성 질환일 수 있으며, 바람직하게는 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 종양성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 자가포식작용 (autophagy)을 억제함으로써 예방 또는 치료할 수 있는 질환의 약학적 조성물로 이용될 수 있으나, 바람직하게는 종양성 질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
[일반식] X3-X1-T-X1-K-X2
(상기 서열 일반식에서 T는 트레오닌(threonine)이고,
상기 K는 라이신(lysine)이며;
상기 X1은 알라닌(alanine), 글라이신(glycine), 이소류신(Isoleucine), 류신(leucine), 메티오닌(Methionine), 프롤린(proline) 및 발린(valine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
상기 X2는 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 아스파라긴(asparagine), 프롤린(proline), 글루타민(glutamine) 및 세린(serine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
X3는 알라닌(alanine), 글루타민(glutamine), 트레오닌(threonine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine) 및 글라이신(glycine) 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산, 또는 부재임
본 발명의 항암제 내성 억제용 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 종양성 질환을 치료하기 위해 사용되는 어떠한 항암제에 대한 내성을 가질 수 있으며, 바람직하게는 에를로티닙(erlotinib), 셀라스트롤(celastrol), 시스플라틴 (cisplatin), 도세탁셀(docetaxel), 타그리소(tagrisso), 탁솔(taxol), 페메트렉시드, (Pemetrexed) 및 타목시펜(tamoxifen)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이 상의 항암제에 대한 내성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항암제 내성 억제용 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 자가포식작용 (autophagy)을 억제함으로써 항암제 내성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 다양한 항암제에 대하여 내성을 갖는 암세포주인 PC9-ER, H1975 및 MCF7 R에서 본원발명의 폴리펩타이드를 처리한 결과, 세포 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 6, 도 11 및 도 14 참조).
이러한 결과는, 본원발명의 폴리펩타이드가 항암제내성 암 세포 주에서 자가포식작용 (autophagy)을 억제함으로써 항암제 내성을 억제(감소)시킬 수 있음을 시사한다.
또한, 본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 종양성 실환 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 치료학적 유효량의 하기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 종양성 질환의 치료 방법을 제공한다.
[일반식] X3-X1-T-X1-K-X2
(상기 서열 일반식에서 T는 트레오닌(threonine)이고,
상기 K는 라이신(lysine)이며;
상기 X1은 알라닌(alanine), 글라이신(glycine), 이소류신(Isoleucine), 류신(leucine), 메티오닌(Methionine), 프롤린(proline) 및 발린(valine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
상기 X2는 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 아스파라긴(asparagine), 프롤린(proline), 글루타민(glutamine) 및 세린(serine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
X3는 알라닌(alanine), 글루타민(glutamine), 트레오닌(threonine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine) 및 글라이신(glycine) 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산, 또는 부재임
발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 폴리펩타이드의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀, 생분해성 나노입자 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 물질량(amount of substance)을 말한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여 시 1 mg 내지 1000 mg의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본원발명에 따른 폴리펩타이드는 종양세포에서의 자가포식작용 (autophagy)을 억제함으로써 종양성 질환을 예방 또는 치료 효과가 있을 뿐만 아니라 항암제 내성을 억제하는데 효과적이다.
도 1 내지 3은 본원발명 실시예 1에 따른 결과를 나타낸다.
도 4 내지 6은 본원발명 실시예 2에 따른 결과를 나타낸다.
도 7은 본원발명 실시예 3에 따른 결과를 나타낸다.
도 8 및 도 9는 본원발명 실시예 4에 따른 결과를 나타낸다.
도 10 및 도 11는 본원발명 실시예 5에 따른 결과를 나타낸다.
도 12 내지 14은 본원발명 실시예 6에 따른 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 암 세포주에서 자가포식작용 기전 확인
본 발명에 사용된 암 세포주(PC9)는 조건화된 배양기 (37 ℃)에서 10% 소태아혈청 및 항생제가 보충된 최소 필수배지에서 배양 하였다. 항암약물내성 암 세포주 (PC9-ER)는 항암제로서 Erlotinib에 오랜 기간 노출시켜 저항성을 가지도록 제작하였다.
암 세포주 (PC9) 및 항암제내성 세포주 (PC9-ER)에서 자가포식작용 조절 기전 단백질이 관여하는지 알아보기 위해, AMPK(AMP-activated protein kinase), p-AMPK(phosphorylated AMPK), ATG5(자가포식-related genes 5), ATG5-ATG12 및 p62의 단백질 발현 정도를 웨스턴블럿 방법을 통해 비교하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 항암제내성 세포주 (PC9-ER)는 PC9 세포주 대비 p-AMPK, ATG5, ATG5-ATG12 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 자가포식작용 억제 분자인 p62 단백질의 발현은 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
또한, PC9 세포주 및 PC9-ER 세포주의 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 진행하였다.
구체적으로, PC9 및 PC9-ER 세포주를 4% 포름알데히드를 이용해 실온에서 고정하였다. 그 다음, 상기 세포를 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 이용해 항체의 부정확한 결합을 막기 위해 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, LC3 항체 (Cell signaling)와 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 항체를 제거한 후, PBS로 세척한 다음 Alexa 488 형광이 달린 2차 항체 (Thermo Fisher)와 실온에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 항체를 제거한 세포를 PBS로 세척한 후, DAPI (Thermo Fisher)로 1분 염색하였다. 형광 염색은 공초점형광현미경 (Confocal microscopy)을 이용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, PC9-ER 세포 주는 PC9 세포 주에 비해 LC3 puncta 발현 정도가 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, PC9 세포주 및 PC9-ER 세포주의 항암제에 대한 내성을 확인하기 위하여 MTT assay을 진행하였다.
구체적으로, PC9 및 PC9-ER 세포주를 동일한 수로 96 well 세포배양 플레이트에 배양한 후, 항암제를 1/10배씩 희석해 24시간 처리한 후 MTT를 이용해 확인하였다. 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 NADH가 MTT와 반응해 포마잔 (formazan)을 형성하는 원리를 이용하는 실험으로, 포마잔을 DMSO로 녹인 후 570nm에서 흡광도를 측정해 세포의 성장활성을 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 자가포식작용 조절 기전이 더 활성화 된 PC9-ER 세포 주는 PC9 세포 주에 비해 기지의 항암제들인 Docetaxel, Taxol에 대한 저항성이 높은 것을 확인하였다.
실시예 2: 폴리펩타이드의 자가포식작용 조절 효과 확인
항암제내성 암 세포주(PC9-ER)에서 자가포식작용에 관여하는 것으로 알려진 ATG5, ATG5-ATG12 단백질의 발현이 증가하는 결과를 바탕으로, SPTPKT(폴리펩타이드 1) 및 QTATAKA(폴리펩타이드 2) 의 자가포식작용 억제효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로, PC9-ER 세포주에 상기 폴리펩타이드 1 및 폴리펩타이드 2를 각각 처리하여 자가포식작용 기전 관련 단백질인 Beclin1, p-Belclin1, ATG5-ATG12, LC3 I 및 LC3 II의 발현 정도를 웨스턴블럿 방법을 통해 비교하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 폴리펩타이드 1 및 폴리펩타이드 2를 처리하였을 때, 자가포식작용 개시자로 알려진 Beclin1, p-Beclin1 및 자가포식작용 활성분자인 ATG5-ATG12, LC3 I 및 LC3 II 단백질의 발현이 낮아지는 것을 확인하였다.
또한, PC9-ER 세포주에서 폴리펩타이드 2를 처리 후, 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 진행하였다.
구체적으로, PC9-ER 세포주에 폴리펩타이드 2를 24시간 처리한 후, 4% 포름알데히드를 이용해 실온에서 고정하였다. 그 다음, 상기 세포를 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 이용해 항체의 부정확한 결합을 막기 위해 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, LC3 항체 (Cell signaling)와 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 항체를 제거한 후, PBS로 세척한 다음 Alexa 488 형광이 달린 2차 항체 (Thermo Fisher)와 실온에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 항체를 제거한 세포를 PBS로 세척한 후, DAPI (Thermo Fisher)로 1분 염색하였다. 형광 염색은 공초점형광현미경 (Confocal microscopy)을 이용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이, 폴리펩타이드 2를 처리하였을 때, PC9-ER 세포 주에서 LC3 puncta 발현 정도가 낮아지는 것을 확인하였다.
또한, PC9-ER 세포주에서 폴리펩타이드 1, 폴리펩타이드 2 및 GNTITIKT(폴리펩타이드 3) 를 각각 처리한 후, 항암제에 대한 내성을 확인하기 위하여 MTT assay을 진행하였다.
구체적으로, PC9-ER 세포주를 동일한 수로 96 well 세포배양 플레이트에 깐 후 각각의 폴리펩타이드(1 내지 3)를 24시간 처리하였다. 그 후, 항암제를 1/10배씩 희석해 24시간 처리한 후 MTT를 이용해 확인하였다. 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 NADH가 MTT와 반응해 포마잔 (formazan)을 형성하는 원리를 이용하는 실험으로, 포마잔을 DMSO로 녹인 후 570nm에서 흡광도를 측정해 세포의 성장 활성을 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, 도 6에서 확인할 수 있듯이, PC9-ER 세포주에서 각각의 폴리펩타이드(1 내지 3)는 항암제인 Erlotinib(Taceva)에 대한 저항성을 감소시킨 것을 확인하였다.
이러한 결과는, 항암제내성 암 세포주에서 폴리펩타이드 1, 폴리펩타이드 2 및 폴리펩타이드 3에 의한 자가포식작용 억제효과를 보여준다.
실시예 3: 폴리펩타이드의 세포 내 발현 확인
본원발명 실시예 1에 따른 면역형광염색의 방법과 같이 폴리펩타이드 2를 녹색형광 (FITC; fluorescein isothiocyanate)으로 표지하여 기지의 방법에 따라 PC9-ER 세포주에 트랜스펙션 (Transfection) 시켰으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 도 7에서 확인할 수 있듯이, FITC- 폴리펩타이드2는 시간 의존적으로 세포 내로 전달되어짐을 알 수 있다.
실시예 4: 폴리펩타이드의 종양형성 억제 효과 확인
폴리펩타이드 2가 in-vitro 조건에서 자가포식 억제를 통한 항암작용을 나타낸 결과를 바탕으로 in-vivo에서 폴리펩타이드 2의 항암작용 확인하고자 하였다.
구체적으로, 무흉선 누드 마우스 (BALB/C nude, 5 ~ 6 주령 암컷)에 PC9-ER (2×10 6개/마리) 세포주를 쥐의 옆구리에 피하 주사하여 종양을 유도한 후, 종양의 부피가 150mm 3정도가 되었을 때 폴리펩타이드 2를 총 5번 꼬리정맥을 통해 주사하여 종양의 크기 변화를 조사하였다. 종양의 부피는 캘리퍼스로 직접 측정하여 다음 식에 의해 계산 하였다(길이×폭×높이×0.5). 종양 형성 억제력에 대한 폴리펩타이드 2의 효과를 확인하기 위해 펩타이드(0, 50, 100, 200 μg/mouse)를 세포 주입 25일부터 3일 간격으로 5회 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 41일 째 되는 날, 종양을 분리하여 종양 부피를 측정하고, 종양조직에서 각 표기된 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 실행하였으며, 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이, 폴리펩타이드 2는 종양 부피를 유의하게 감소시켰다.
또한, 도 9에서 확인할 수 있듯이, 종양 조직에서는 p-mTOR와 p62 단백질 발현이 농도-의존적 증가하는 양상을 보였으며, p-AMPK, Beclin1, p-Beclin1 단백질 발현은 농도-의존적 감소하는 양상을 보였다.
이는 폴리펩타이드 2가 자가포식작용 기전의 억제를 통한 항암 작용을 보여주는 결과이다.
실시예 5: 폴리펩타이드의 자가포식작용 조절 효과 확인
실시예 1 내지 4와 상이한 비소세포폐암 세포주인 H1975에서 폴리펩타이드 1 및 폴리펩타이드 2의 자가포식작용 조절 단백질을 통한 항암활성 효과에 대한 영향을 알아보기 위해, H1975 세포에서 각 표기된 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 실행하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
그 결과, 도 10에서 확인할 수 있듯이, 폴리펩타이드 1 및 폴리펩타이드 2 각각 처리하였을 때, 암 조절 기전에 관여하는 것으로 알려진 p-AMPK와 자가포식작용 조절 기전 단백질인 p-Beclin1, ATG5, ATG5-ATG12, LC3 I 및 LC3 II의 단백질 발현이 낮아지는 것을 확인하였다.
또한, H1975 세포주에서 폴리펩타이드 1, 폴리펩타이드 2 및 폴리펩타이드 3를 각각 처리한 후, 항암제인 Osimertinib (Tagrisso)에 대한 내성을 확인하기 위하여 MTT assay을 진행하였다.
구체적으로, H1975 세포주를 동일한 수로 96 well 세포배양 플레이트에 분주한 후 각각의 폴리펩타이드(1 내지 3)를 24시간 처리하였다. 그 후, 항암제인 Osimertinib (Tagrisso)를 1/10배씩 희석해 24시간 처리한 후 MTT를 이용해 확인하였다. 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 NADH가 MTT와 반응해 포마잔 (formazan)을 형성하는 원리를 이용하는 실험으로, 포마잔을 DMSO로 녹인 후 570nm에서 흡광도를 측정해 세포의 성장활성을 확인하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
그 결과, 도 11에서 확인할 수 있듯이, H1975 세포주에서 각각의 폴리펩타이드(1 내지 3)는 항암제인 Osimertinib (Tagrisso)에 대한 저항성을 감소시키는 것을 확인하였다.
이는 폴리펩타이드 1, 폴리펩타이드 2 및 폴리펩타이드 3이 자가포식작용 억제를 통한 항암활성을 갖는다는 것을 보여주는 결과이다.
또한, 폴리펩타이드 2를 농도를 다르게 하여 처리하였을 때, H1975 세포주에서 항암제인 Osimertinib (Tagrisso)에 대한 저항성이 농도-의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.
실시예 6: 폴리펩타이드의 항암 활성 효과 확인
항암약물내성 암세포 주 (MCF7 R)는 항암제로서 Celastrol에 오랜 기간 노출시켜 저항성을 가지도록 제작하였다.
항암제내성 세포주 (MCF7 R)에서 폴리펩타이드 1 및 폴리펩타이드 2의 자가포식작용 조절 기전 단백질에 대한 영향을 확인하기 위하여, MCF7 R 세포주에서 각 표기된 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 실행하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 12에서 확인할 수 있듯이, 폴리펩타이드 1 및 폴리펩타이드 2를 각각 처리하였을 때, 자가포식작용 억제분자인 p62 단백질의 발현은 증가되었고, 자가포식작용 활성분자인 p-Beclin1, ATG5, ATG5-ATG12, LC3 I 및 LC3 II 단백질의 발현은 감소하였다.
또한, MCF7 R 세포주에서 폴리펩타이드 2를 처리 후, 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 진행하였다.
구체적으로, MCF7 R 세포주에 폴리펩타이드 2를 24시간 처리한 후, 4% 포름알데히드를 이용해 실온에서 고정하였다. 그 다음, 상기 세포를 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 이용해 항체의 부정확한 결합을 막기 위해 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, LC3 항체 (Cell signaling)와 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 항체를 제거한 후, PBS로 세척한 다음 Alexa 488 형광이 달린 2차 항체 (Thermo Fisher)와 실온에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 항체를 제거한 세포를 PBS로 세척한 후, DAPI (Thermo Fisher)로 1분 염색하였다. 형광 염색은 공초점형광현미경 (Confocal microscopy)을 이용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
그 결과, 도 13에서 확인할 수 있듯이, MCF7 R 세포주에서 폴리펩타이드 2를 처리하였을 때, LC3 puncta 발현 정도가 낮아지는 것을 확인하였다.
또한, MCF7 R 세포주에서 폴리펩타이드 1, 폴리펩타이드 2 및 폴리펩타이드 3를 각각 처리한 후, 항암제에 대한 내성을 확인하기 위하여 MTT assay을 진행하였다.
구체적으로, MCF7 R 세포주를 동일한 수로 96 well 세포배양 플레이트에 깐 후 각각의 폴리펩타이드(1 내지 3)를 24시간 처리하였다. 그 후, 항암제를 1/10배씩 희석해 24시간 처리한 후 MTT를 이용해 확인하였다. 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 NADH가 MTT와 반응해 포마잔 (formazan)을 형성하는 원리를 이용하는 실험으로, 포마잔을 DMSO로 녹인 후 570nm에서 흡광도를 측정해 세포의 성장 활성을 확인하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
그 결과, 도 14에서 확인할 수 있듯이, MCF7 R 세포주에서 각각의 폴리펩타이드(1 내지 3)는 Celastrol, Cisplatin, Docetaxel등 다양한 항암제에 대한 저항성을 감소시켰다.
전술한 바와 같이, 본원발명에 따른 폴리펩타이드는 종양세포에서의 자가포식작용 (autophagy)을 억제함으로써 종양성 질환을 예방 또는 치료 효과가 있을 뿐만 아니라 항암제 내성을 억제하는데 효과적이므로, 종양성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물로 이용할 수 있다.

Claims (18)

  1. 하기의 서열 일반식으로 표시되는, 세포에서 자가포식작용 (autophagy)을 억제하는 활성을 갖는 폴리펩타이드.
    [일반식] X3-X1-T-X1-K-X2
    (상기 서열 일반식에서 T는 트레오닌(threonine)이고,
    상기 K는 라이신(lysine)이며;
    상기 X1은 알라닌(alanine), 글라이신(glycine), 이소류신(Isoleucine), 류신(leucine), 메티오닌(Methionine), 프롤린(proline) 및 발린(valine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
    상기 X2는 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 아스파라긴(asparagine), 프롤린(proline), 글루타민(glutamine) 및 세린(serine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이며;
    상기 X3는 알라닌(alanine), 글루타민(glutamine), 트레오닌(threonine), 세린(serine), 아스파라긴(asparagine) 및 글라이신(glycine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산, 또는 부재임)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 X1 및 X2는 알라닌(alanine)인 것인,
    폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 X1은 프롤린(proline)이고,
    상기 X2는 트레오닌(threonine)인 것인,
    폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 X1은 이소류신(Isoleucine)이고,
    상기 X2는 트레오닌(threonine)인 것인,
    폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 X3는 글루타민(glutamine) 및 트레오닌(threonine)인 것인,
    폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 X3는 세린(serine)인 것인,
    폴리펩타이드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 X3는 글라이신(glycine), 아스파라긴(asparagine) 및 트레오닌(threonine)인 것인,
    폴리펩타이드.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 p-AMPK, ATG5-ATG12, Beclin1, p-Beclin1, LC3-I 및 LC3-II로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현을 감소시킴으로써 세포에서 오토피지(autophagy)를 억제하는 것인,
    폴리펩타이드.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 p-mTOR 또는 p62 단백질의 발현을 증가시킴으로써 세포에서의 오토피지(autophagy)를 억제하는 것인,
    폴리펩타이드.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 표지물질 중 하나로 표지된 것인,
    폴리펩타이드.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 종양 세포인 것인,
    폴리펩타이드.
  12. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양 세포에서의 자가포식작용 (autophagy) 억제용 조성물.
  13. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 종양성 질환은 폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 부갑상선암, 식도암, 전립선암, 뇌암, 피부암, 골육종, 연부조직육종, 신경교종, 림프종, 비인두암, 후두암, 부신암, 결장암, 요관암, 담낭암, 방광암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 두경부암, 악성흑색종, 복합 골수종, 만성 골수성 백혈병, 및 신경아종으로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
    종양성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 억제용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 에를로티닙(erlotinib), 셀라스트롤(celastrol), 시스플라틴 (cisplatin), 도세탁셀(docetaxel), 타그리소(tagrisso), 탁솔(taxol), 페메트렉시드(Pemetrexed) 및 타목시펜(tamoxifen)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 항암제에 대한 내성을 갖는 것인,
    항암제 내성 억제용 약학 조성물.
  17. 제1항의 폴리펩타이드의 종양성 실환 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조를 위한 용도.
  18. 치료학적 유효량의 제1항의 폴리펩타이드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 종양성 질환의 치료 방법.
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