CN107326090B - 用于非小细胞肺癌诊断的血小板LncRNA的定量检测方法 - Google Patents

用于非小细胞肺癌诊断的血小板LncRNA的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于非小细胞肺癌诊断的血小板LncRNA的定量检测方法，属于肿瘤分子生物学领域。目前肺癌的诊断主要依赖于有创伤的肿瘤组织临床病征、放射影像、生化检测和病检等方面,且存在组织异质性。为了解决此问题，本发明证实NSCLC患者血小板长链非编码RNA MAGI2‑AS3、ZFAS1的表达低于正常人，基于此制备出用于非小细胞肺癌诊断的实时荧光定量PCR的试剂盒。通过联合MAGI2‑AS3和ZFAS1实时荧光定量PCR扩增获得的表达量数据，建立了非小细胞肺癌诊断的Logistic回归拟合数据模型，该模型对非小细胞肺癌有较高的诊断效能和敏感性，具有深远的临床意义和推广性。

Description

用于非小细胞肺癌诊断的血小板LncRNA的定量检测方法
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及检测血小板长链非编码RNA MAGI2-AS3和ZFAS1表达量的试剂在制备用于非小细胞肺癌诊断试剂中的应用。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居各种肿瘤之首，其中80％的肺癌为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC又主要分为肺鳞癌(AD)、肺腺癌(SCC)。尽管非小细胞肺癌近几十年来在诊治和基础研究方面均取得了很大的进步，但总体而言，非小细胞肺癌的预后并没有得到显著的改善，其5年生存率仅为5％-20％。因而，对于肺癌的治疗，最重要的依旧是寻找有效的早期诊断标志物，为对抗癌细胞的侵袭和转移提供理论依据。
LncRNA作为一种参与癌症生物学的遗传分子，在近年来的科学研究中崭露头角。LncRNA 的转录本长度大于200nt，一般不编码蛋白或编码蛋白能力有限，它们通常以RNA的形式在多种层面上(表观遗传学调控、转录调控以及转录后调控等)调控靶基因的表达水平，在非小细胞肺癌发生过程中扮演重要的角色。LncRNA MALAT-1、LncRNA CCAT2在肺癌中高表达，诱导细胞迁移，刺激体内肿瘤的生长和侵袭；LncRNA MEG3在NSCLC癌组织中的表达比正常组织低，并与病理分期、肿瘤大小有关；此外，较低水平的MEG3表达患者预后相对较差；MEG3过度表达降低NSCLC的细胞增殖，在体外可以诱导细胞凋亡，在体内阻碍肿瘤的发生；LncRNAH19主要起促进肺癌生长的作用，干扰H19基因表达后可使肺癌细胞的集落形成能力和独立贴壁能力下降。随着越来越多的研究，LncRNA 对非小细胞肺癌的治疗和诊断有着重要意义。
用于肺癌的诊断主要依赖于传统的肿瘤组织临床病征、放射影像、生化检测和病检等方面,而且其中大部分方法是有创伤的,给患者带来痛苦,且存在组织异质性等局限性；为了降低获取肿瘤组织的局限性,基于血液的液体活检方法对组织样本分析成为近些年的流行趋势,目前主要包括血浆游离DNA、肿瘤血小板、外泌体和循环肿瘤细胞的检测。血小板，是外周血中第二丰富的细胞类型,来源于骨髓巨核细胞的循环无核碎片，虽然是一种无核的细胞碎片，但是血小板内却包含有丰富的RNA，而且血小板能够吸收肿瘤释放的一些肿瘤标记物。但现有技术中,还没有利用血小板中的标记物对肿瘤进行较为准确诊断的成熟技术。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足,本发明提供了一种将血小板LncRNAMAGI2-AS3和ZFAS1荧光定量PCR的结果联合用于NSCLC诊断的检测方法，该方法灵敏度、特异性较高；更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用的非小细胞肺癌诊断试剂盒。
本发明实现上述目的技术方案如下：
本发明第一方面，提供检测血小板长链非编码RNA MAGI2-AS3和ZFAS1表达量的试剂在制备用于非小细胞肺癌诊断试剂中的应用，其特征在于，所述的检测长链非编码RNAMAGI2-AS3和ZFAS1表达量的试剂为实时荧光定量PCR检测试剂；所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括根据长链非编码RNA MAGI2-AS3和ZFAS1的核苷酸序列设计并合成出特异性用于实时荧光定量PCR的检测引物，特异性引物如序列表中SEQ ID NO.1-4所示；
所述的血小板长链非编码RNA的检测方法包括样品RNA的提取、样品cDNA的制备、长链非编码RNA的扩增，具体步骤包括：
1)血小板RNA的提取：按照BioTeKe公司的血液总RNA快速提取试剂盒说明书要求的步骤提取血小板RNA；
2)cDNA的制备：采用TaKaRa试剂盒PrimeScriptTMRT reagent kit对提取的血小板RNA反转录合成cDNA；
3)长链非编码RNA的扩增：使用CW BIO的Ultra SYBR Mixture试剂盒,按照其说明书所规定的操作步骤以步骤2)反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
实时荧光定量PCR扩增获得待测样本中目的Lnc RNA表达量相对于内参基因GAPDH变化的表达倍数2-ΔCt，代入公式Y＝12.330*(MAGI2-AS3)+11.876*(ZFAS1)-3.675，式中(MAGI2-AS3)、(ZFAS1)是MAGI2-AS3和ZFAS1在血小板中的表达量2-ΔCt，其中ΔCt＝目的基因的Ct值-内参基因GAPDH的Ct值，Ct值为用实时荧光定量PCR检测到的各基因的Ct值；当Y值小于0.370时判定为非小细胞肺癌阳性，反之为阴性。
本发明第二方面，提供一种用于非小细胞肺癌诊断的实时定量PCR检测试剂盒，包含根据长链非编码RNA MAGI2-AS3和ZFAS1的核苷酸序列设计的特异性用于实时荧光定量PCR的检测引物，特异性引物如序列表中SEQ ID NO.1-4所示。
利用本发明的检测制剂可以检测长链非编码RNA MAGI2-AS3和ZFAS1在血小板中的表达水平，联合血小板MAGI2-AS3和ZFAS1的定量表达结果，建立了非小细胞肺癌诊断的Logistic回归拟合数据模型，该模型对非小细胞肺癌有较高的诊断效能和敏感性，具有深远的临床意义和推广性。
附图说明
图1本发明的工作流程图；
图2本发明中血小板MAGI2-AS3、ZFAS1表达量
AD-肺腺癌；SCC-肺鳞癌；Control-健康对照组；Relative expression用2-ΔCt表示，多组间比较用非参数检验，*P<0.05，**P<0.01***p<0.001,****p<0.0001
A：目的基因MAGI2-AS3在非小细胞肺癌血小板中的表达情况
B：目的基因ZFAS1在非小细胞肺癌血小板中的表达情况；
图3本发明中血小板目的基因MAGI2-AS3、ZFAS1诊断ROC曲线图
其中，Sensitivity-敏感性，specificity-特异性
A：血小板中MAGI2-AS3在肺腺癌、肺鳞癌的ROC曲线
B：血小板中ZFAS1在肺腺癌、肺鳞癌的ROC曲线
C：血小板中MAGI2-AS3和ZFAS1在肺腺癌、肺鳞癌联合诊断的ROC曲线；
图4本发明中血小板目的基因与临床病理参数的关系分析图
A：NSCLC血小板ZFAS1与TNM(肿瘤分期)关系分析图
B：NSCLC血小板MAGI2-AS3与TNM(肿瘤分期)关系分析图
C：NSCLC血小板MAGI2-AS3与N(区域***受累情况)关系分析图
D：NSCLC血小板MAGI2-AS3与M(远处转移情况)关系分析图；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】
采用101例NSCLC(68例腺癌+33例鳞癌)肿瘤患者及60例健康对照组的血小板，对MAGI2-AS3、ZFAS1进行检测及模型建立，其工作流程见图1所示，
具体检测方法,包括以下步骤：
1.血小板的采集与保存
采集受试者静脉血于4ml抗凝管中，室温环境下在12h内离心分离血小板。首先于室温120g离心20min,分两层，吸取上层富含血小板血浆转移至新的EP管(注意吸取的时候留部分血浆，不吸全)，360g离心20min，沉淀即为血小板，用PBS洗涤两次,加300μl DEPC水后提取RNA。
2.血小板RNA提取(血液总RNA快速提取试剂盒，BioTeKe)
1)血小板悬液中加入900μl裂解液RLS，吹打裂解；
2)4℃条件下，12000rpm离心10min，取上清入新的无酶EP管；
3)加入180μl氯仿，盖紧EP管盖，振荡15s在室温下孵育10min；
4)4℃条件下，12000rpm离心10min,取550μl上层水相；
5)加入等体积70％乙醇，颠倒混匀，转入吸附柱RA中；
6)1000rpm离心3min后弃废液；
7)加入500μl去蛋白液RE，12000rpm离心3min，弃废液；
8)加入700μl去漂洗液RE，12000rpm离心3min，弃废液；
9)加入500μl去漂洗液RE二次漂洗，12000rpm离心3min，弃废液；
10)12000rpm离心4min，甩掉剩余残液；
11)吸附柱RA放入新的无酶EP管，加入已56℃水浴的RNase free water
30μl，12000rpm离心3min收集血小板RNA；
12)RNA浓度和纯度测定后-80℃保存。
3.cDNA合成(PrimeScriptTMRT reagent kit，Takara)
1)去除基因组DNA：
Figure BDA0001387309940000041
混匀，离心后置于PCR仪42℃2min,4℃保存。
2)反转录：
Figure BDA0001387309940000051
混匀，离心后置于PCR仪37℃15min，85℃5s，4℃保存。
4.LncRNA的筛选：利用三个GEO数据库GSE19188、GSE30219、GSE27262筛选出在肺腺癌、肺鳞癌中与正常组织有明显表达差异的长链非编码RNA MAGI2-AS3、ZFAS1。
5.实时荧光定量PCR：
使用CW BIO的Ultra SYBR Mixture，按照试剂盒说明所规定的操作步骤：20μl体系含10μl SYBR mix、1.6μl primer、2μl cDNA、6.4μl ddH2O,反应程序：95℃预变性5min，(95℃ 30sec、63.3℃ 30sec、72℃30sec)42个循环，根据2-ΔCt的方法计算血小板中两条目的基因的表达量。下表1为所使用的引物。
表1 引物序列
基因名称 基因序列 上游引物 下游引物
MAGI2-AS3 NR_038343 GAGCAGAAATAGCGGGACCT TCTCTTGGATGCAAACGGCA
ZFAS1 NR_003604 ACGTGCAGACATCTACAACCT TACTTCCAACACCCGCAT
GAPDH NM_002046 GGTCTCCTCTGACTTCAACA GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT
6.结果分析
1)MAGI2-AS3、ZFAS1表达量：
采用2-ΔCt对两目的基因定量数据分析，ΔCt＝目的基因的Ct值-内参基因的Ct，目的基因Ct值为用实时荧光定量技术检测到的目的基因MAGI2-AS3、ZFAS1的Ct值，结果如附图2所示，MAGI2-AS3、ZFAS1在肺腺癌、肺鳞癌患者血小板的表达水平低于健康对照组，且差异有显著性。
2)ROC诊断效能分析：
ROC分析血小板中目的基因MAGI2-AS3、ZFAS1分别在非小细胞肺癌的诊断价值；结果如附图3和表2所示，血小板中MAGI2-AS3比ZFAS1诊断效能好，但当两种LncRNA联合诊断时，诊断效能明显高于单独的LncRNA的诊断效能，敏感性和特异性都达到80％以上，表明联合血小板的MAGI2-AS3和ZFAS1的表达量能较好的诊断NSCLC。
表2 各种诊断的灵敏度、特异性
Figure BDA0001387309940000061
3)LncRNA与临床病理参数关系分析：
用非参数检验分析MAGI2-AS3、ZFAS1与病理类型、性别、年龄、TNM分期、T(肿瘤原发灶的情况)、N(区域***受累情况)、M(远处转移情况)的关系，图4展示了有表达差异的分析结果,用2-ΔCt表示Relative expression，TNM表示非小细胞肺癌分期，N表示区域***受累情况,M表示远处转移情况；结果表明ZFAS1仅与非小细胞肺癌的TNM分期呈负相关，分期越大，ZFAS1表达越低；而MAGI2-AS3除跟非小细胞肺癌的分期呈负相关，还与N、M呈负相关，即***受累情况越严重、发生远处转移，MAGI2-AS3表达越低。
7.Logistic回归拟合数据模型建立：
Y＝12.330*(MAGI2-AS3)+11.876*(ZFAS1)-3.675；其中(MAGI2-AS3)、(ZFAS1)是MAGI2-AS3和ZFAS1在血小板中的表达量2-ΔCt，当Y值小于0.370时判定为阳性(NSCLC患者)，反之为阴性(非NSCLC患者)。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 用于非小细胞肺癌诊断的血小板LncRNA的定量检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
gagcagaaat agcgggacct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
tctcttggat gcaaacggca 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 3
acgtgcagac atctacaacc t 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 4
tacttccaac acccgcat 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 5
ggtctcctct gacttcaaca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 6
gtgagggtct ctctcttcct 20

Claims (1)

1.联合检测血小板长链非编码RNA MAGI2-AS3和ZFAS1表达量的试剂在制备区别健康人与肺腺癌或者肺鳞癌患者的试剂中的应用，其特征在于，所述联合检测血小板长链非编码RNA MAGI2-AS3和ZFAS1表达量的试剂为实时荧光定量PCR检测试剂；所述实时荧光定量PCR检测试剂包括根据长链非编码RNA MAGI2-AS3和ZFAS1的核苷酸序列设计并合成出的特异性检测引物，所述特异性检测引物如序列表中SEQ ID NO:1~4所示。
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