CN109457033B

CN109457033B - 用于结肠癌筛查的标志物

Info

Publication number: CN109457033B
Application number: CN201811641665.5A
Authority: CN
Inventors: 姜书梅; 司峻岭; 王仁本
Original assignee: Shandong Institute of Cancer Prevention and Treatment
Current assignee: Shandong Institute of Cancer Prevention and Treatment
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109457033A

Abstract

本发明公开了用于结肠癌筛查的标志物，属于分子诊断领域。本发明开发了用于结肠癌筛查诊断的新的分子标志物hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569，所述标志物单一circRNA的诊断价值均较高，ROC曲线分析显示其可以较好地区分筛查结肠癌患者，具有良好的灵敏性和特异性；3个circRNA联合起来组成的分子标记物表达谱在诊断结肠癌方面比单个circRNA分子的诊断效能更高，有望成为应用于结肠癌临床诊治评估的重要指标。

Description

用于结肠癌筛查的标志物

技术领域

本发明属于生物医学及分子生物学技术领域，具体涉及结肠癌的临床筛查领域，更具体的，本发明涉及新发现的用于结肠癌筛查的标志物以及用于结肠癌筛查的分子试剂盒。

背景技术

需要说明的是，本部分内容仅是本发明设计部分的参考内容和发明背景，其并不必然构成相对于本发明的现有技术的公开。

结肠癌是消化系主要的恶性肿瘤之一，近年来，随着我国人民生活水平的提高、饮食结构的改变、人口老龄化的加剧，结肠癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势，严重威胁着人们的健康。结肠癌的病因虽未完全明了，但部分因素如环境、饮食结构、生活习惯(饮酒吸烟)等可能诱发结肠癌，另外，家族性息肉、溃疡性结肠炎以及家族性肿瘤遗传病史等也是发生结肠癌的高危因素。

结肠癌患者的生存和预后取决于肿瘤的检出时间，结肠癌早期本身无特异性症状，加之患者体检、及时就诊意识不高，导致部分结肠癌发现时已是晚期，给治疗带来极大困难，预后相对较差。数据统计超过57％的患者确诊时癌细胞已转移，而早期结肠癌患者5年生存率可达到90％,但晚期的和转移性患者的5年总生存率仅为15％。为了提高结肠癌患者的生存率,临床上着手研究制定早期结肠癌的诊断方法和诊断标准，目前结肠癌诊断主要依赖于肠镜、影像学以及大便潜血等检查，但仍缺乏相应的便捷性、敏感性和特异性。

随着分子生物学技术的快速发展和结直肠癌机制研究的不断深入，越来越多的相关生物标志物被不断地发现和报道。从非编码RNA的研究进展来看，一些miRNA、lncRNA、circRNA，都有作为疾病生物标志物的应用前景。环状RNA(CircularRNA,circRNA)是一类广泛存在于生物体内的单链非编码RNA，最早发现于20世纪70年代的RNA病毒中,与传统的线性RNA不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解；在功能上，circRNA分子富含microRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；通过与疾病关联的miRNA相互作用,circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。

目前也发现了多种circRNA与结肠癌有关。Weng W等分析了两组独立的结直肠癌患者中ciRS-7表达对预后的影响，发现高ciRS-7表达与总体低存活率有关；Dou Y等研究了KRAS突变与结肠癌细胞的关系，发现circRTN4在结肠癌细胞DLD-1的外泌体中处于高表达水平，而在细胞内则处于下调状态；除此之外，circ-ITCH、hsa_circ_0014717、circHIPK3、circCCDC66、hsa_circ_0001649、circ-KLDHC10、hsa_circ_0000567、hsa_circ_000984、circRNA0003906、has_circ_0020397、circCCDC66、hsa_circ_0000069、hsa_circ_001569、hsa_circ_001988、circ-BANP、hsa_circRNA_103809、hsa_circRNA_104700、hsa_circ_0126897等也被发现参与结肠癌的发生发展、侵袭转移过程、作为结肠癌预后标志物或影响结肠癌放化疗敏感性等。不过针对结肠癌筛查检测，还需要进一步探索新的有效的标志物，并探索其特异性和准确性。

发明内容

基于上述内容，本发明经过研究获得了用于结肠癌筛查的circRNA标志物，并基于此开发了用于结肠癌筛查的相关产品。

具体的，本发明公开了以下技术方案：

首先，本发明公开了hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628、hsa_circ_0086569中的一种或几种组合作为标志物在制备用于结肠癌筛查的产品中的应用。

其次，本发明公开了一种用于结肠癌筛查的产品，该产品能够通过检测患者结肠组织中的hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达水平来筛查结肠癌，检测结果显示hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达较正常组织显著上调。

进一步的，本发明公开了用于结肠癌筛查的circRNA标志物的荧光定量PCR引物组，所述引物组分别用于扩增hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569。

此外，本发明还公开了结肠癌筛查的方法，通过hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569的相对表达量来判断罹患结肠癌的风险。

进一步的，本发明也提供了hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569中的一种或几种组合在制备结肠癌预后或治疗的药物中的应用。

基于本发明的技术方案，本发明至少取得了以下技术效果：

(1)本发明开发了用于结肠癌筛查诊断的新的分子标志物hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569，为结肠癌的筛查提供了新的参考；

(2)本发明所述标志物hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569中，单一circRNA的诊断价值均较高，ROC曲线分析显示其可以较好地区分筛查结肠癌患者，三者的曲线下面积分别为0.906、0.853、0.961，均具有良好的灵敏性和特异性；进一步的，3个circRNA联合起来组成的分子标记物表达谱在诊断结肠癌方面比单个circRNA分子的诊断效能更高，有望成为应用于结肠癌临床诊治评估的重要指标。

附图说明

图1为hsa_circ_0036847在亲本基因中的功能注释

图2为hsa_circ_0064628在亲本基因中的功能注释

图3为hsa_circ_0086569在亲本基因中的功能注释

图4为hsa_circ_0036847在正常组织和结肠癌组织中的相对表达量统计

图5为hsa_circ_0064628在正常组织和结肠癌组织中的相对表达量统计

图6为hsa_circ_0086569在正常组织和结肠癌组织中的相对表达量统计

图7为hsa_circ_0036847用于诊断的ROC曲线

图8为hsa_circ_0064628用于诊断的ROC曲线

图9为hsa_circ_0086569用于诊断的ROC曲线

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的阐释。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

在本发明公开的一个或一些典型的实施方式中，公开了hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628、hsa_circ_0086569中的一种或几种组合作为标志物在制备用于结肠癌筛查的产品中的应用。

hsa_circ_0036847的序列如SEQ ID NO:1所示(spliced seq)，其基因组中的位置为chr15:91083270-91157720，其在亲本基因中的功能注释如图1所示；

hsa_circ_0064628的序列如SEQ ID NO:2所示，其基因组中的位置为chr3:28373179-28382113，其在亲本基因中的功能注释如图2所示；

hsa_circ_0086569的序列如SEQ ID NO:3所示，其基因组中的位置为chr9:20923658-20926416，其在亲本基因中的功能注释如图3所示。

具体的实施方式中，用于结肠癌筛查的产品包括检测患者结肠组织中的hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达水平的试剂或药物。

一些典型的实施例中，所述用于结肠癌筛查的产品包括：通过实时定量PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达水平以诊断结肠癌的产品。

在本发明公开的一个或一些典型的实施方式中，公开了一种用于结肠癌筛查的产品，该产品能够通过检测患者结肠组织中的hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达水平来筛查结肠癌，检测结果显示hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达较正常组织显著上调。

在结肠癌患者中，有结肠息肉者，其结肠癌发生率通常是无结肠息肉者的5倍，在本发明的具体实施方式中，患者结肠组织可以选自结肠息肉或其他组织(如结肠上皮细胞等)。

在本发明具体实施方式中，公开了用于结肠癌筛查的circRNA标志物的荧光定量PCR引物组，所述引物组分别用于扩增hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569。

具体的实施方式中，用于扩增hsa_circ_0036847的引物组序列包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；用于扩增hsa_circ_0064628的引物组序列包括SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；用于扩增hsa_circ_0086569的引物组序列包括SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。

在本发明的具体实施方式中，公开了用于结肠癌筛查的circRNA标志物的试剂盒，包括上述荧光定量PCR引物组。

具体的实施方式中，还可以具体包括扩增内参基因的引物组，例如内参基因可以是GAPDH；用于扩增GAPDH的引物组序列包括SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。

在本发明公开的一个或一些典型的实施方式中，公开了结肠癌筛查的方法，通过hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569的相对表达量来判断罹患结肠癌的风险。

在本发明具体实施方式中，通过检测患者结肠组织中的hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达水平来筛查结肠癌，检测结果显示hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达较正常组织显著上调，则表示罹患结肠癌。

在本发明公开的一个或一些典型的实施方式中，通常结肠癌组织circRNA的相对表达量差异也与结肠癌患者的预后或治疗有关，因此本发明亦公开了hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569中的一种或几种组合在制备结肠癌预后或治疗的产品中的应用。

一些典型的实施例中，所述结肠癌预后或治疗的产品包括：通过实时定量PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达水平的产品。

为了更加清楚地显示本发明公开的技术方案，以下本发明将结合具体的实施例详细说明公开的实施方案和技术内容。

实施例

本发明基于课题组前期通过结肠癌筛选，选取少数几例结肠癌患者组织与癌旁组织(正常组织)之间RNA-seq的深度测序研究，从中筛选出了几组新的高表达差异性良好的环状RNA分子以作筛查验证分析。本发明选取了hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628和hsa_circ_0086569，通过结肠癌患者组织与正常组织之间的表达情况研究，结合统计学分析和验证，以用于结肠癌的筛查。

研究对象和样本

选取山东省肿瘤医院2017年6月-2018年5月收治的结肠癌患者共计60例，其中，男性36例，女性24例，均经病理学检查确诊，组织病理类型的判断参照WHO病理分期；术中获取结肠癌组织及癌旁组织样本，并采取适当方法保存(避免RNA降解)。

RNA抽提

取癌组织/癌旁组织，采用液氮法研磨后转至1.5ml的离心管中，750μl的TRIzolLS Reagent试剂和20μl冰醋酸，手动剧烈振荡管体至混匀。

匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟。

每750μl的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2-3分钟。

4℃下12000×g离心15分钟。离心后混合液体分为下层的红色酚氯仿相，中间层和上层的无色水相。RNA全部被分配于水相中。

将水相转移到新离心管中。加0.5ml的异丙醇(1ml TRIZOL试剂)，水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA。

混匀后15到30℃孵育10分钟，于4℃12000×g离心10分钟。

移去上清液，每1ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7500×g离心5分钟。

去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。

获得的RNA溶液保存于-70℃。

cDNA合成

PCR管中配置：RNA1-2μg，0.5μg/μl N6(随机引物)1μl，dNTPs Mix(10mM)1μl，加无RNA酶的H₂O至总体积13.7μl；混合液在70℃温浴5分钟，然后迅速冰浴放置2分钟。

准备反转录体系，在离心管中依次加入RT反应液5X First-Strand Buffer 4μl，0.1M DTT 1μl，RNase Ihibitor 0.3μl，SuperScript III RT 1μl，进行反转录，反应条件42℃1h，70℃20min，冰浴保存cDNA或置于-20℃放置。

实时荧光定量PCR

Realtime PCR反应体系。体系配置表1所示，采用的引物组如表2所示。

表1 Realtime PCR反应体系

表2实时荧光定量PCR引物

将PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，30秒)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按95℃，10秒；60℃，30秒；95℃，15秒程序进行；GAPDH做为内参。使用2^-△△Ct法计算。

统计及结果分析

本发明采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 5(San Diego，CA)进行统计学分析。Student t检验用于分析两组之间的差异。circRNA与临床病理因素之间采用单因素方差分析。以手术切除的结肠癌组织病理报告为金标准，接受者操作特征曲线(ROC)分析用于确定circ RNA的诊断价值。P<0.05被认为具有统计学意义。

表3三个circRNA与结肠癌患者临床病例参数关系分析

根据统计分析，hsa_circ_0036847与hsa_circ_0086569的表达水平与癌组织分化有一定关系，3个circRNA表达情况与性别、年龄、肿块大小、淋巴转移状况以及TNM分期无关(组别间无差异性)。

实时定量PCR数据显示，本发明所采集样本中，相较正常组织，结肠癌组织中3种circRNA(hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628、hsa_circ_0086569)表达均明显上调，参见图4-图6(P<0.05)。

通过ROC曲线分析并计算受试者工作特征曲线下面积(AUC)来检测差异表达的circRNA的诊断性能。hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628、hsa_circ_0086569的AUC分别为0.906、0.853、0.961，95％CI分别为0.853-0.971、0.677-0.912、0.901-0.988(图7-图9)。结果显示，3种circRNA均可用于作为结肠癌诊断的标志物。

3个circRNA联合起来组成的分子标记物表达谱AUC为0.975，用于结肠癌的诊断效能更高，此外，还可以结合临床上常用的结肠造影，以进一步提高结肠癌的早期筛查和预防的效率。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省肿瘤防治研究院（山东省肿瘤医院）

<120> 用于结肠癌筛查的标志物

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 481

<212> DNA

<213> hsa_circ_0036847

<400> 1

gttcaatttc agaagcttca gcaactgcgc cttacacagt accatggagg atccttacca 60

aatgtgagcc agctgcggag cagtgcgtca gagtttcagc cgtcatttca ccaagctgat 120

aatgttcggg gaacccgcca tcacgggctg gtggagaggc catccaggaa ccgcttccac 180

cccctccacc gaaggtctgg ggacaagcca gggcgacaat ttgatggtag tgcttttgga 240

gccaattatt cctcacagcc tctggatgag agttggccaa ggcagcagcc tccttggaaa 300

gacgaaaagc atcctgggtt caggctgaca tctgcactta acaggaccaa ttctgattct 360

gctcttcaca cgagtgctct gagtaccaag ccccaggacc cctatggagg agggggccag 420

tcggcctggc ctgccccata catgggtttc tgtgatggtg agaataatgg acatggggaa 480

g 481

<210> 2

<211> 918

<212> DNA

<213> hsa_circ_0064628

<400> 2

ttgtcatgga tgcactggta gaagatgata tctgtattct gaatcatgaa aaagcccata 60

agagagatac agtgactcca gtttcaatat attcaggaga tgaatctgtt gcttcccatt 120

ttgctcttgt cactgcatat gaagacatca aaaaacgact taaggattca gagaaagaga 180

actctttgtt aaagaagaga ataagatttt tggaagaaaa gctaatagct cgatttgaag 240

aagaaacaag ttccgtggga cgagaacaag taaataaggc ctatcatgca tatcgagagg 300

tttgcattga tagagataat ttgaagagca aactggacaa aatgaataaa gacaactctg 360

aatctttgaa agtattgaat gagcagctac aatctaaaga agtagaactc ctccagctga 420

ggacagaggt ggaaactcag caggtgatga ggaatttaaa tccaccttca tcaaactggg 480

aggtggaaaa gttgagctgt gacctgaaga tccatggttt ggaacaagag ctggaactga 540

tgaggaaaga atgtagcgat ctcaaaatag aactacagaa agccaaacaa acggatccat 600

atcaggaaga caatctgaag agcagagatc tccaaaaact aagcatttca agacagagta 660

tctgtagcac agcctggagt gcagtggcgc aatcatggga tagcatgaat tttgaggact 720

gttccctctt cgcataagaa tagaagtagc catcagagtt catatacttt ttcaaccctt 780

tttcctcaaa tacgtatcat ttttacttaa gtaacttcaa ttctgtgttt taagctatct 840

aataattgtt gtttctacta tgttaagata gcctctctac attgttaccc tccatccaat 900

aaaaaatact gatctgac 918

<210> 3

<211> 226

<212> DNA

<213> hsa_circ_0086569

<400> 3

ggagagtccg gtagtgaaag gcaatgcgct gttagctcta agcagccttg ctgtcgtcgt 60

atctagacat gaagccagcc tctcctcaga ctctgacggg ctcctggagg ttcaacctaa 120

tttcctttca atgaaagagt gggtttccat ggtacttgat acactcttgg tcattgtgga 180

tagccattac caacccagag ggcaacttct ctcctggttt tattat 226

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 4

agacgaaaag catcctgggt 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

tctgaaattg aaccttcccc a 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

tctacattgt taccctccat cca 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 7

gcagtgacaa gagcaaaatg g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 8

ggatagccat taccaaccca g 21

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物

<400> 9

ggagcccgtc agagtctg 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 10

ctcacagttg ccatgtagac 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物

<400> 11

gctcaattta tagaaacc 18

Claims

1.hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628、hsa_circ_0086569中的一种或几种组合作为标志物在制备用于结肠癌筛查的产品中的应用；

所述用于结肠癌筛查的产品包括检测患者结肠组织中的hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达水平的试剂或药物；

用于结肠癌筛查的产品，该产品能够通过检测患者结肠组织中的hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达水平来筛查结肠癌，检测结果显示hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569表达较正常组织显著上调；

所述患者结肠组织选自结肠息肉。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于结肠癌筛查的产品为用于结肠癌筛查的circRNA标志物的荧光定量PCR引物组，所述引物组分别用于扩增hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569；

用于扩增hsa_circ_0036847的引物组序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；用于扩增hsa_circ_0064628的引物组序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；用于扩增hsa_circ_0086569的引物组序列为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于结肠癌筛查的产品为用于结肠癌筛查的circRNA标志物的试剂盒，包括分别用于扩增hsa_circ_0036847、hsa_circ_0064628或hsa_circ_0086569的荧光定量PCR引物组以及扩增内参基因的引物组；

用于扩增hsa_circ_0036847的引物组序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；用于扩增hsa_circ_0064628的引物组序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；用于扩增hsa_circ_0086569的引物组序列为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；

所述内参基因是GAPDH，用于扩增GAPDH的引物组序列为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。