CN111500722B - 用于肺鳞癌诊断、预后和抗血管生成治疗的LncRNA - Google Patents

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Abstract

本发明一方面证实了LINC00173.V1在肺鳞癌中显著高表达且可以作为区分是否患肺鳞癌的工具；另一方面还明确了LINC00173.V1可作为肺鳞癌的预后判断工具。此外，沉默LINC00173.v1的试剂可用于制备抗血管生成剂，尤其适用于肺鳞癌的预防与治疗。以上结果为肺鳞癌的诊疗提供新的策略。

Description

用于肺鳞癌诊断、预后和抗血管生成治疗的LncRNA
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地涉及，LINC00173.V1在肺鳞癌诊断、预后和抗血管生成治疗的应用。
背景技术
肺癌是最常见的癌症，也是全球范围内癌症死亡的主要原因。根据2018年全球癌症统计数据显示，肺癌占癌症病例总数的11.6％，占癌症死亡总数的18.4％，据报道肺癌患者的5年生存率低于18％。病理上，肺癌有两种主要的组织学类型，包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC可以进一步分为鳞状细胞癌(SQC)和腺癌(ADC)。近期研究发现，肺鳞状细胞癌和腺癌患者在临床病理，化学治疗反应和预后方面存在显着差异。值得注意的是，与ADC患者相比，SQC患者的总体生存时间要差得多。此外，抗血管生成疗法在鳞状细胞癌中存在高风险的不良反应，尤其是严重咯血，因此抗血管生成疗法在SQC中的应用受到限制。因此，非常有必要确定找寻特异于SQC的靶标，尤其是能够靶向抗血管生成疗法的分子，这将有助于制定有效的SQC治疗策略，为SQC患者带来临床益处。
长非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非蛋白质编码RNA，涉及多个生物学过程，包括作为蛋白质和基因之间的支架蛋白，结合蛋白质的诱饵和增强剂以调节其转录靶基因。此外，lncRNA具有竞争性内源性RNA(ceRNA)的功能，作为“miRNA海绵”破坏miRNA介导的靶mRNA的降解。目前miRNA的失调已被广泛证明有助于肿瘤发生，发展。和转移在多种癌症类型中，包括肺癌。因此，寻找有效的lncRNAs靶标，对于开发新的SQC治疗方案非常有益。
发明内容
本发明的目的在于提出LINC00173.V1在肺鳞癌诊断、预后和抗血管生成治疗的应用。
本发明所采取的技术方案是：
特异性检测LINC00173.V1表达水平的试剂用于制备诊断试剂和/或预后判断试剂中的应用，所述诊断试剂通过检测来自受试者的样本，确定受试者是否患肺鳞癌；所述预后判断试剂通过检测来自肺鳞癌受试者的样本，预测肺鳞癌受试者的预后风险。
在一些实施方式中，所述预测肺鳞癌试者的预后风险包括预测肺鳞癌受试者的无进展生存时间或总体生存时间。
在一些实施方式中，所述预测肺鳞癌试者的预后风险包括预测stageI-III期的肺鳞癌受试者的局部无复发生存时间或无远处转移生存时间。
在一些实施方式中，所述特异性检测LINC00173.V1表达水平的试剂包括特异性检测LINC00173.V1的引物或探针。
沉默LINC00173.V1的药剂用于制备抗血管生成剂的应用。
在一些实施方式中，所述抗血管生成剂适于鳞状细胞癌，优选地，所述抗血管生成剂适于肺鳞癌。
在一些实施方式中，所述沉默LINC00173.V1的药剂是miR-511-5p的竞争性内源RNA。
在一些实施方式中，所述沉默的方式包括RNAi、反义寡核苷酸、CRISPRi或敲除。
沉默LINC00173.V1的药剂用于制备治疗或预防肺鳞癌药物的应用。
在一些实施方式中，所述沉默的方式包括RNAi、反义寡核苷酸、CRISPRi或敲除。
本发明的有益效果是：
本发明一方面证实了LINC00173.V1在肺鳞癌中显著高表达且可以作为区分是否患肺鳞癌的工具；另一方面还明确了LINC00173.V1可作为肺鳞癌的预后判断工具。此外，沉默LINC00173.v1的试剂可用于制备抗血管生成剂，尤其适用于肺鳞癌的预防与治疗。以上结果为肺鳞癌的诊疗提供新的策略。
附图说明
图1：各种亚型肺癌及肺肉芽肿中原位杂交检测LINC00173.V1的代表性图片；
图2：良性肺部病变、肺腺癌、肺鳞癌组织中LINC00173.V1的SI分布；
图3：LINC00173.v1的高表达预示着SQC患者差的无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)；LINC00173.v1的高表达预示着临床分期为stage I-III的SQC患者差的局部无复发生存期(LRFS)和远处无转移生存期(DMFS)；图中，L表示LINC00173.v1低表达，H表示LINC00173.v1高表达；
图4：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1，shLINC00173.V1#2)及其对照(vector)对肺鳞癌细胞中LINC00173.v1水平的影响；
图5：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1，shLINC00173.V1#2)及其对照(vector)对肺鳞癌细胞生长曲线的影响；
图6：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1，shLINC00173.V1#2)及其对照(vector)对肺鳞癌细胞周期的影响；
图7：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1，shLINC00173.V1#2)及其对照(vector)对肺鳞癌细胞集落形成的影响；
图8：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1，shLINC00173.V1#2)及其对照(vector)对肺鳞癌细胞迁移的影响；
图9：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1，shLINC00173.V1#2)及其对照(vector)对肺鳞癌细胞中HUVECs小管生成(上两图)及HUVECs迁移(下两图)的影响；
图10：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1，shLINC00173.V1#2)及其对照(vector)对肺鳞癌细胞中血管生成的影响(CAM实验)；
图11：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1)及其对照(vector)对H520细胞构建的小鼠模型中肿瘤组织中LINC00173.v1水平的影响；
图12：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1)及其对照(vector)对H520细胞构建的小鼠模型中肿瘤组织中LINC00173.v1水平的影响；
图12：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1)及其对照(vector)对H520细胞构建的小鼠模型中肿瘤外观(图A)、重量(图B)、体积(图C)的影响；
图13：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1)及其对照(vector)对H520细胞构建的小鼠模型中肿瘤组织CD31+LBV水平影响；
图14：沉默LINC00173.v1(shLINC00173.V1#1)及其对照(vector)对H520细胞构建的小鼠模型中肺部成瘤(图A)、肺部单位面积肿瘤数(图B)、肺部肿瘤坏死面积(图C)、累积生成率(图D)的影响；
图15：顺铂(Cis)联合LINC00173.v1 ASO、或贝伐珠单抗(Beva)或对照(PBS)处理H520细胞构建的小鼠肺鳞癌模型，检测各组肺部成瘤及H&E染色(图A)、肺部单位面积肿瘤数(图B)、累积生成率(图C)的影响；
图16：LINC00173.v1及其突变体与miR-511-5p作用位置预测；
图17：萤光素酶验证LINC00173.v1与miR-511-5p的关系；
图18：antagomir-miR-511-5p及其对照(NC)对肺鳞癌细胞HUVECs小管生成(图A)和血管生成的影响(CAM实验，图B)的影响。
具体实施方式
LNCRNA 00173是LNCRNA的一种，其具有两个完全不同的外显子序列的LINC00173转录本，分别为LINC00173.v1(LINC00173 transcript variant 1，序列参考NCBIReference Sequence:NR_027345.1)和LINC00173.v2(LINC00173 transcript variant 2，序列参考NCBI Reference Sequence:NR_027346.1)，本发明通过对大量临床样本进行分析并结合表达谱分析，最终意外地发现LINC00173.v1在肺鳞癌中特异性高表达，并且与疾病预后和病理密切相关，更可喜的是，沉默LINC00173.v1可以作为一种有效的抗血管生成剂，抗血管生成效率与贝伐珠单抗相当甚至稍优，有望替代贝伐珠单抗解决现有抗血管生成疗法无法适用肺鳞癌的问题。
在一些实施方式中，特异性检测LINC00173.V1表达水平的试剂用于制备诊断试剂和/或预后判断试剂中的应用。在一些实施方式中，所述诊断试剂通过检测来自受试者的样本，确定受试者是否患肺鳞癌；在一些实施方式中，所述受试者的样本为受试者的肺部病变组织或肺部肿瘤组织。在一些实施方式中，所述预后判断试剂通过检测来自肺鳞癌受试者的样本，预测肺鳞癌受试者的预后风险。在一些实施方式中，所述受试者的样本为受试者的肺部肿瘤组织。在一些实施方式中，所述预测肺鳞癌试者的预后风险包括预测肺鳞癌受试者的无进展生存时间或总体生存时间。在一些实施方式中，所述预测肺鳞癌试者的预后风险包括预测stageI-III期的肺鳞癌受试者的局部无复发生存时间或无远处转移生存时间。在一些实施方式中，所述特异性检测LINC00173.V1表达水平的试剂包括特异性检测LINC00173.V1的引物或探针。在一些实施方式中，所述诊断试剂为特异性检测LINC00173.V1的探针，通过原位杂交技术，评估受试者样本的LINC00173.V1染色指数，将评估的染色指数与设定的第一阈值相比较，若大于/等于设定的第一阈值，则判定受试者患肺鳞癌，在一些实施方式中，，所述诊断试剂为特异性检测LINC00173.V1的探针，通过原位杂交技术，评估受试者样本的LINC00173.V1染色指数，将评估的染色指数与设定的第二阈值相比较，若小于/等于设定的第二阈值，则判定受试者不患肺鳞癌。在一些实施方式中，所述预后判断试剂为特异性检测LINC00173.V1的探针，通过原位杂交技术，评估受试者样本的LINC00173.V1染色指数，将评估的染色指数与设定的第三阈值相比较，若大于/等于设定的第三阈值，则预测受试者差的预后；在一些实施方式中，所述预后判断试剂为特异性检测LINC00173.V1的探针，通过原位杂交技术，评估受试者样本的LINC00173.V1染色指数，将评估的染色指数与设定的第三阈值相比较，若大于/等于设定的第三阈值，则预测受试者短的无进展生存时间(或理解为高风险的肺鳞癌进展)或短的总体生存时间；在一些实施方式中，所述预后判断试剂为特异性检测LINC00173.V1的探针，通过原位杂交技术，评估受试者样本的LINC00173.V1染色指数，将评估的染色指数与设定的第三阈值相比较，若大于/等于设定的第三阈值，则预测stageI-III期的肺鳞癌受试者的短的局部无复发生存时间(或理解为高风险的局部复发)或短的无远处转移生存时间(或理解为高风险的远处转移)。在一些实施方式中，阈值不限于第一阈值、第二阈值，第三阈值，可根据大量样本的结果进行设定多个阈值。
在一些实施方式中，沉默LINC00173.V1的药剂用于制备抗血管生成剂的应用。在一些实施方式中，所述抗血管生成剂适于鳞状细胞癌，在一些实施方式中，所述抗血管生成剂适于肺鳞癌。在一些实施方式中，所述沉默LINC00173.V1的药剂是miR-511-5p的竞争性内源RNA。在一些实施方式中，所述沉默的方式包括RNAi、反义寡核苷酸、CRISPRi或敲除。在一些实施方式中，沉默LINC00173.V1的药剂用于制备治疗或预防肺鳞癌药物的应用。在一些实施方式中，所述沉默的方式包括RNAi、反义寡核苷酸、CRISPRi或敲除。
实验例1、LINC00173.V1在肺鳞癌显著高表达
组织样本来自手术或穿刺活检期间收集的439份冰冻切片和肺存档样本，包括43例肺肉芽肿(Granuloma，属于良性肺部病变)，248例肺鳞癌(SQC)，122例肺腺癌(ADC)和26种其他亚型肺癌。需要说明的是，其他亚型肺癌是指除SQC和ADC以外的肺癌，如腺鳞癌(ASC)，大细胞神经内分泌癌(LCNE)，未分化癌(UDC)，表皮样癌(EPC)，肉瘤样癌(SARC)和多形性癌(PMC)等，以上组织由江门市中心医院提供。
利用原位杂交(ISH)的方法，检测LINC00173.V1在以上组织样本中的表达水平。简而言之，将冷冻切片的在37℃下用蛋白酶K(20μg/ml)消化10分钟，在室温下4％多聚甲醛中固定10分钟，然后用乙醇梯度脱水并风干。将切片用杂交变性缓冲液(Exon Biotechnology公司)在77℃下预杂交30分钟。由Exon Biotechnology设计和合成的生物素标记的LINC00173.v1探针，加入到77℃的杂交缓冲液中变性5分钟，然后立即在冰上冷却。每个切片用20-50μl稀释的探针覆盖，并在37℃的加湿杂交室中孵育过夜。37℃下将切片在含0.1％Tween-20的2×SSC中洗涤15分钟，然后室温下用封闭缓冲液(PBS，含0.05％Tween-20，1％BSA)封闭30分钟，并将样品与HRP偶联的链霉亲和素(Proteintech公司)在37℃孵育1h，在含0.05％Tween-20的PBS中洗涤3次后，将切片用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)底物增强液(Sigma-Aldrich公司)染色3分钟，用苏木精复染1分钟，然后用乙醇梯度脱水，密封。ISH代表性染色图谱如图1所示，LINC00173.v1的染色强度在肺鳞癌(SQC)组织中显著增强，且表达水平显著区分于其他分型，例如，肺肉芽肿(Granuloma)，肺腺癌(ADC)，腺鳞癌(ASC)、大细胞神经内分泌癌(LCNE)，未分化癌(UDC)组织。
进一步评估SQC、ADC、良性肺部病变组织中LINC00173.v1的染色指数(SI)。评估标准如下：根据两位独立研究人员评估的S1取均值，其中，肿瘤细胞比例评分如下：0(无阳性肿瘤细胞)；1(<10％阳性肿瘤细胞)；2(10-35％阳性肿瘤细胞)；3(35-70％阳性肿瘤细胞)和4(>70％阳性肿瘤细胞)。染色强度根据以下标准分级：0(无染色)；1(弱染色，浅黄色)；2(中等染色，黄棕色)和3(强染色，棕色)。SI计算为染色强度评分与阳性肿瘤细胞比例的乘积。基于这种评估方法，通过SI评估了肺肿瘤样品中LINC00173.v1的表达，得分为0、1、2、3、4、6、8、9或12。结果如图2所示，可见SQC组织中染色指数显著高于良性肺部病变，当染色指数SI≥8时，组织可以判定为SQC，当染色指数≤1时，组织可以判定为未发生SQC，可见，检测LINC00173.V1表达水平，可以辅助确定受试者是否患肺鳞癌。综上，特异性检测LINC00173.V1表达水平的试剂可用于制备辅助确定受试者是否患肺鳞癌的工具。
实验例2、LINC00173.V1高表达预示肺鳞癌患者差的预后
将肺鳞癌组织样本根据LINC00173.V1表达情况分为两群，以SI＞4为高表达组(H)，SI≤4为低表达组(L)，进一步进行Kaplan-Meier生存分析，结果如图3所示，LINC00173.v1的高表达预示着SQC患者差的无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)，而临床分期为stage I-III的SQC患者差的局部无复发生存期(LRFS)和远处无转移生存期(DMFS)。由此可见，LINC00173.V1可作为肺鳞癌患者的预后标志物，可用于预测肺鳞癌患者的无进展生存时间、总体生存时间，或预测stage I-III期的肺鳞癌患者局部无复发生存时间或无远处转移生存时间。综上，特异性检测LINC00173.V1表达水平的试剂可用于制备肺鳞癌的预后判断工具。
实验例3、沉默LINC00173.v1抑制肺鳞癌细胞的血管生成
采用肺鳞癌细胞系NCI-H520(简称H520，购自Procell)、NCI-H226(简称H226，获自中国科学院上海细胞研究所)构建沉默LINC00173.v1的细胞模型。材料和简要方法如下：细胞用含10％胎牛血清(购自Gibco)的RPMI-1640培养基(购自Gibco)培养，培养条件为37℃，5％CO2。将人LINC00173.v1的短发夹RNA(shRNA，分别设计了1#和2#)分别克隆到hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-嘌呤霉素慢病毒载体(GV493，Genechem)中，克隆引物sh-LINC00173.v1#-up:5’-CCGGCACCTTGCTCCGCTGTTCTTTCTCGAGAAAGAACAGCGGAGCAAGGTGTTTTTG-3’；sh-LINC00173.v1-1#-dn:5’-AATTCAAAAACACCTTGCTCCGCTGTTCTTTCTCGAGAAAGAACAGCGGAGCAAGGTG-3’；sh-LINC00173.v1-2#-up:5’-CCGGTGGGATGTCAGAGGTGTTGATCTCGAGATCAACACCTCTGACATCCCATTTTTG-3’；sh-LINC00173.v1-2#-dn:5’-AATTCAAAAATGGGATGTCAGAGGTGTTGATCTCGAGATCAACACCTCTGACATCCCA-3’；根据操作说明书，采用Lipofectamine 3000试剂(购自Invitrogen)将构建的2个shRNA载体和对照载体分别转染至HEK293T细胞，通过慢病毒感染NCI-H520、NCI-H226细胞，用0.5mg/L嘌呤霉素(购自Sigma-Aldrich)筛选10天，对稳转后的细胞采用实时定量PCR测定LINC00173.v1表达水平。实时定量PCR测定方法如下：使用RNAIsolater(购自Vazyme公司)从细胞中提取总RNA。按照操作说明书，使用HiScript III第一链cDNA合成试剂盒(购自Vazyme公司)对mRNA进行反转录。使用ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix(购自Vazyme公司)在ABI 7500Fast***(购自Thermo-Fisher)上扩增和定量cDNA。引物为LINC00173.v1-forward:5’-TTCTGGGTCCGAGGCTCC-3’；LINC00173.v1-reverse:5’-AGCTTTGCT CTTGCACTGAGATG-3’；GAPDH-forward:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’；GAPDH-reverse:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。引物由Biosune Biotechnology公司合成和纯化。根据操作说明书进行定量PCR，并将3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)用作mRNA的内源对照。相对表达量用比较阈值循环(2^-△△Ct)方法计算。结果如图4所示，转染了shLINC00173.v1 sh#1或shLINC00173.v1 sh#2的肺鳞癌细胞模型，LINC00173.v1的表达水平明显下降。
进一步评估以上构建的肺鳞癌细胞模型。采用CCK-8进行细胞计数，将500个细胞接种到96孔板中，加入CCK-8(Dojindo公司)在37℃条件下孵育1h，测定OD650nm。结果如图5所述，沉默LINC00173.v1不影响肺鳞癌细胞生长曲线。采用流式细胞仪进行细胞周期分析。将细胞用预冷PBS洗涤两次，并用预冷的75％乙醇过夜固定；然后将细胞轻轻重悬于预冷PBS中，并加入核糖核酸酶以降解RNA，并在37℃下孵育30分钟，然后用碘化丙啶(Dojindo公司)在室温下染色20分钟，流式分析细胞周期的汇总结果如图6所示，沉默LINC00173.v1不影响肺鳞癌细胞的细胞周期。测定细胞模型的集落形成能力，将500-1000个细胞接种到六个孔板中并培养7-10天，用10％甲醛将菌落固定15分钟，用1.0％结晶紫染色30s，然后用水冲洗。结果如图7所示，沉默LINC00173.v1不影响肺鳞癌细胞的集落形成。检测细胞模型的迁移形成能力，将细胞(4×104个)接种到24孔Transwell渗透室(购自Corning)的上层隔室中，并在Transwell的下室中充满完整的培养基，其中添加了10％FBS作为化学吸引剂。孵育24小时后，将移至小室底部的细胞用固定溶液甲醇：乙酸＝3：1)固定，用结晶紫染色，并通过在5个随机视野中计数来拍照和定量。结果如图8所示，沉默LINC00173.v1不影响肺鳞癌细胞的迁移能力。以上结果表明，沉默LINC00173.v1不影响肺鳞癌细胞的增殖和迁移能力。
令人意外的是，沉默LINC00173.v1能够抑制肺鳞癌细胞血管生成。材料与测试方法如下：人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)购自PromoCell，HUVEC在内皮细胞生长培养基BulletKit(购自EGM)中培养。HUVEC细胞小管形成试验方法：将预冷的Matrigel(购自Corning)添加到24孔板的孔中，并在37℃聚合30分钟。将HUVEC(2×104)悬浮于200μl介质并加入到各孔中，在37℃，5％CO2下培养6-12小时。在100倍视野显微镜下拍摄小管图像，并用Image View 3.7分析小管数目，同时采用前述迁移能力测定方法进行测试，结果如图9所示，沉默LINC00173.v1的肺鳞癌细胞抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成，而且抑制HUVEC的迁移能力。进一步在受精鸡蛋的第八天进行鸡胚绒膜***(CAM)分析。在蛋壳的气囊上开一个直径为1厘米的孔，并去除气囊底板上的真皮层表面以暴露CAM。将直径为0.5厘米的滤纸放在CAM顶部，100μl新鲜的含培养基的肺鳞癌细胞小心地添加到纸的中央，并用医用透气胶带密封。然后，将受精鸡蛋在37.8℃，60％至80％湿度下孵育5天。用固定溶液(甲醇：丙酮＝1：1)固定15分钟后，切出CAM并收集。使用数码相机拍摄CAM的图像，并通过Image View 3.7进行分析。结果如图10所示，沉默LINC00173.v1能够显著缩短CAM上培养的肺鳞癌细胞的第二和第三血管的长度。以上结果可见，沉默LINC00173.v1抑制血管生成，因此，沉默LINC00173.v1的试剂可用于制备抗血管生成剂；优选地，可适用于制备鳞状细胞癌的抗血管生成剂；更优选地，可适用于制备肺鳞癌的抗血管生成剂。
实验例4、沉默LINC00173.v1抑制肺鳞癌的肿瘤发生
利用转染了LINC00173.v1 sh#1或对照质粒(vector，简称Vec.)的H520细胞构建小鼠移植瘤模型，每组至少使用6或8只BALB/c-nu小鼠(4-6周龄；18-20g)，并随机分配每只体重不同的小鼠。用100μl PBS重悬(1-4)×10 6个上述细胞分别皮下接种到裸鼠的腹股沟处。每周两次监测小鼠，并根据存活时间通过颈脱位法处死小鼠。使用外部卡尺确定肿瘤体积，并使用公式(长×宽2)/2进行计算，将肿瘤切除，称重并储存在液氮罐中，最终所有组织进行石蜡包埋，并按照与实施例1相同的方法检测肿瘤组织中的LINC00173.v1，结果如图11所示，接种了LINC00173.v1 sh#1/NCI-H520细胞的小鼠的肿瘤组织在实验结束时表现出下调的LINC00173.v1水平。肿瘤外观、重量、体积结果如图12所示，沉默LINC00173.v1使肿瘤的重量和体积减小。对包埋的组织进行免疫组化测定CD31，简要步骤：***固定石蜡包埋切片的载玻片是通过微波加热将抗原在TE(pH 9.0)缓冲液中提取10分钟，分别用过氧化氢和山羊血清封闭，并在4℃的潮湿箱中与抗CD31抗体(Cell Signal Technology)一起稀释过夜。孵育后，将玻片在TBS/0.05％Tween-20中洗涤，分别与生物素偶联的二抗(Proteintech，中国)和过氧化物酶偶联的抗生蛋白链菌素(Proteintech，中国)在37℃孵育30分钟，用3,3′-二氨基联苯胺(DAB)增强底物液(购自Sigma-Aldrich)染色。结果如图13所示，沉默LINC00173.v1可以降低肿瘤组织中的淋巴或血管密度(CD31+LBV)。
进一步检查了LINC00173.v1对肺鳞癌细胞在肺部致瘤能力的影响，通过尾静脉注射将上述构建的H520肺鳞癌细胞注入小鼠体内，采用上述方法进行小鼠跟踪和处死，并且对组织切片进行H&E染色和生存曲线分析，结果如图14所示，沉默LINC00173.v1显着抑制NCI-H520细胞在肺部生长，减少肺部单位面积肿瘤数，增加肿瘤坏死面积，并延长了累积生存期。以上结果表明，沉默LINC00173.v1可以有效预防肺鳞癌的发生和抑制肺鳞癌的发展，可以作为预防或治疗肺鳞癌的药物。
实验例5、LINC00173.v1反义寡核苷酸对肺鳞癌的治疗作用
目前的抗血管生成疗法对肺鳞癌患者有较大的不良反应，比如贝伐珠单抗(Bevacizumab，商品名Avastin)是抗血管生成疗法的代表之一，其会引起肺鳞癌患者严重咯血，被排除用于肺鳞癌患者治疗。考虑到本发明的成果之一是：沉默LINC00173.v1的试剂可以作为抗血管生成剂，因此对比贝伐珠单抗测试其有效性。在肺癌的临床治疗中通常将抗血管生成疗法与化学疗法药物(例如顺铂)组合使用，因此利用LINC00173.v1反义寡核苷酸(ASO)和顺铂的联合作用进行测试。采用尾静脉注射的方法将H520细胞注射至小鼠中构建肺鳞癌小鼠模型，接种7天后，每周两次腹膜内用顺铂(简称cis，5mg/kg)处理小鼠，每周一次注射LINC00173.v1ASO(反义寡核苷酸，antisense LNATMGapmeRs)、贝伐珠单抗(Beva)、阴性对照(PBS)，期间跟踪生存情况，最后对小鼠进行肺组织进行H&E染色和生存分析，结果如图15所示，在治疗肺鳞癌上，LINC00173.v1反义寡核苷酸能实现与贝伐珠单抗(Beva)相当甚至稍优的效果，由此证明了沉默LINC00173.v1是有效的抗血管生成治疗策略，可以有效治疗肺鳞癌。
实验例6、LINC00173.v1作为miR-511-5p的竞争性内源RNA
为了初步探究LINC00173.v1作为抗血管生成剂的机理，通过研究发现LINC00173.v1作为miR-511-5p的竞争性内源RNA。通过使用miRanda算法(图16)，发现miR-511-5p在LINC00173.v1上具有潜在的识别序列。采用双萤光素酶报告实验进行鉴定，将细胞(5×105)铺在60mm细胞培养皿中，培养24小时后增殖至60-80％汇合度，然后使用Lipofectamine3000将报告基因构建体转染到细胞中，孵育36h后，收获细胞并用PBS洗涤，并用裂解缓冲液裂解。使用Synergy 2微孔板***(购自BioTek)分析细胞裂解液。使用Renilla-Lumi荧光素酶报告基因测定试剂盒(购自Beyotime)测量荧光素酶和海肾荧光素酶。将每种裂解物的荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。相对转录活性被转化为高于对照组值的诱导倍数。其中，Agomir-511-5p(mir-511-5p模拟物)，antagomir-511-5p(mir-511-5p拮抗剂)及其相对对照是由RiboBio公司设计、合成和纯化；报告基因构建体：从基因组DNA扩增人LINC00173.v1结合位点活性，并将其克隆到pmirGLO载体(购自Promeg)中，同时构建突变型报告基因。结果如图17所示，上调miR-511-5p被抑制，而miR-511-5p沉默则增强LINC00173.v1的萤光素酶报道分子活性，但不增强突变型LINC00173.v1的萤光素酶报道分子活性，由此可见，LINC00173.v1作为miR-511-5p的竞争性内源RNA。进一步利用antagomir-511-5p进行抗血管生成实验，参照实施例3，结果如图18所示，antagomir-511-5p逆转了LINC00173.v1下调表达对H226和H520细胞中血管生成的抑制作用。因此，这些发现表明LINC00173.v1通过将miR-511-5p作为ceRNA来促进肺鳞癌细胞的血管生成。
以上所述仅为本发明的示例性说明，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替代，都应涵盖在本发明保护范围之内。

Claims (2)

1.沉默LINC00173.V1的药剂用于制备治疗肺鳞癌药物的应用，其特征在于，所述药剂为sh-LINC00173.v1-1#或sh-LINC00173.v1-2#,sh-LINC00173.v1-1#-up:5’-CCGGCACCTTGCTCCGCTGTTCTTTCTCGAGAAAGAACAGCGGAGCAAGGTGTTTTTG-3’,sh-LINC00173.v1-1#-dn:5’-AATTCAAAAACACCTTGCTCCGCTGTTCTTTCTCGAGAAAGAACAGCGGAGCAAGGTG-3’;sh-LINC00173.v1-2#-up:5’-CCGGTGGGATGTCAGAGGTGTTGATCTCGAGATCAACACCTCTGACATCCCATTTTTG-3’,sh-LINC00173.v1-2#-dn:5’-AATTCAAAAATGGGATGTCAGAGGTGTTGATCTCGAGATCAACACCTCTGACATCCCA-3’。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述沉默的方式包括RNAi、反义寡核苷酸、CRISPRi或敲除。
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