CN102605042A - miR-378生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种miR-378生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用,该miR-378生物标志物的miRNA序列如SEQ ID NO.1所示;其检测的方法,包括:1)收集人血清样本;2)提取血清中总RNA;3)对miR-378生物标志物进行反转录和实时定量PCR反应,以U6snRNA作为内参,计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值;4)当样本中的miR-378生物标志物的PCR相对定量值小于或等于2.9时,则认为是非胃癌样本,大于2.9时,则认为是胃癌样本。利用该生物标志物可以简单、快捷地进行胃癌检测、诊断,以便更好的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种内源性非编码小RNA(MicroRNA,miRNA)作为生物标志物的应用,特别是涉及一种miR-378(miRNA-378)在胃癌检测和诊断中的应用。
背景技术
胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,每年约有100万个新发病例,男性胃癌的死亡率为各种肿瘤的第二位,女性则为第四位【Garcia M et al.2007.Global Cancer Facts & Figures 2007[online].Accessed Aug 20,2008.URL:www.cancer.gov】。而我国是胃癌的高发区,每年我国新发现40万胃癌患者,约占世界胃癌发病人数的42%左右。由于胃癌早期症状不明显,又缺乏特异的早期诊断方法【di Mario F et al.Non-invasive tests in gastric diseases.Dig Liver Dis 40:523-530(2008)】,现有的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度与特异性不高,对胃癌具较高特异性的CA72-4也通常在胃癌的III-IV期增高。胃癌的明确诊断通常在疾病的进展期才能做出,而此时病人的平均生存期只有7~9个月【Wagner AD et al.Chemotherapy in advanced gastric cancer:asystematic review and meta-analysis based on aggregate data.J Clin Oncol.24:2903-2909(2006)】。因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是胃癌研究的热点。
MicroRNA(miRNA)是在动植物体内发现的长度约为21~25个核苷酸的非编码RNA分子,主要通过切断降解和翻译抑制来完成它对靶基因的负调控【Reinhart BJ et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timingin Caenorhabditis elegans.Nature 403,901-906(2000);Brennecke J et al.Bantamencodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation andregulates the proapoptotic gene hid in Drosophila.Cell 113,25-36(2003);Zeng Y etal.Sequence requirements for microRNA processing and function in human cells.RNA 9,112-123(2003);Hake S et al.MicroRNAs:A role in plant development.Curr.Biol.13,R851-R852(2003)】。由于它的序列、结构、丰度和表达方式的多样性,使其在真核基因表达调控中有着广泛的作用。作为人类肿瘤信号通路积极的参与者,miRNA不仅扮演着原癌基因和抑癌基因的角色【Dews M et al.Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc-activated microRNA cluster.NatGenet.38,1060-1065(2006);He L et al.A microRNA polycistron as a potentialhuman oncogene.Nature 435,828-33(2005);Bonci D et al.The miR-15a-miR-16-1cluster controls prostate cancer by targeting multiple oncogenic activities.Nat Med.14,1271-1277(2008)】,与肿瘤的转移凋亡也有关联【Huang Q et al.ThemicroRNAs miR-373 and miR-520c promote tumor invasion and metastasis.Nat CellBiol.10,202-210(2008);Ma L et al.Tumour invasion and metastasis initiated bymicroRNA-10b in breast cancer.Nature 449,682-688(2007);Tavazoie SF et al.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis.Nature 451,147-152(2008)】。由于不同的肿瘤显示出特异性的miRNA表达谱【Lu J et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature 435,834-838(2005)】,miRNA在***固定的组织中有很高的稳定性【Xi Y et al.Systematicanalysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen andformalin-fixed paraffin-embedded samples.RNA 13,1668-1674(2007);Nelson PTet al.RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archivalhuman brain.RNA 12,187-191(2006)】,所以越来越多的科学家提出miRNA在血清和血浆中也能有稳定的表达,并可以作为潜在的新型肿瘤标志物。单个miRNA能够影响数百个蛋白质表达,21-25个核苷酸的长度也决定了miRNA没有复杂的结构与修饰过程,这些特点都预示了miRNA作为生物学标志的优越性。已有研究发现,miR-141在包括人***癌在内的上皮细胞性肿瘤患者血清中有明显的表达上调,提示miR-141可以作为判断肿瘤类型的生物学标志【Patrick S et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.PNAS.105,10513-10518(2008)】。缺乏明显临床症状及有效生物学标志的卵巢癌患者也可以用血清miRNA检测来提高早期诊断及早期治疗的可能性。科学家们发现并证实了miR-21,92,93,126和29a在肿瘤血清样本中有明显的过量表达,而miR-155,127及99b的表达却明显降低【Resnick KE et al.The detection ofdifferentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients usinga novel real-time PCR platform.Gynecol Oncol.112,55-59(2009);Taylor D et al.MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers ofovarian cancer.Gynecol Oncol.110,13-21(2008)】。此外在弥漫性大B细胞淋巴瘤血清中miR-21的表达明显增高,增高的miR-21还暗示了较好的无复发生存率【Lawrie CH et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs inserum of patients with diffuse large B-cell lymphoma.Br J Haematol.141,672-5(2008);Chin LJ et al.A truth serum for cancer-microRNAs have major potential ascancer biomarkers.Cell Res.18,983-984(2008)】。这一结果显示,检验miRNA的特异性表达不仅有助于肿瘤的早期诊断,还可用于病人的预后判断。这些研究都充分证实,血清及血浆miRNA的测定是一个检测癌症生物学标志物很有前途的领域。
现有的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度与特异性不高,对胃癌具较高特异性的CA72-4也通常在胃癌的III-IV期增高。胃癌的明确诊断通常在疾病的进展期才能做出,因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是胃癌研究的热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种miR-378生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用。利用该生物标志物可以简单、快捷地进行胃癌检测、诊断,以便更好的治疗。
为解决上述技术问题,本发明的一种用于胃癌检测的miRNA生物标志物,是如SEQ ID NO.1所示miRNA序列的miR-378。该miR-378在胃癌患者血清中特异性表达上调。
该生物标志物还可以应用于胃癌的诊断。
另外,本发明还提供了一种利用上述生物标志物进行胃癌检测的方法,具体包括以下步骤:
(1)收集人血清样本;
(2)提取血清中总RNA(包含miRNA);
(3)对miR-378生物标志物进行反转录和Real time-PCR(RT-PCR,实时定量PCR),并计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值;
(4)当样本中的miR-378生物标志物的PCR相对定量值小于或等于2.9时,则认为是非胃癌样本;大于2.9时,则认为是胃癌样本。
其中,步骤(1)收集人血清样本的具体操作为:将收集的血样本放入不含EDTA(乙二胺四乙酸)的试管中,静置凝固后,取上清在4℃下600g~900g离心5~15分钟后,再取上清并在4℃下12000g~16000g离心5~15分钟,取上清即得。
步骤(2)中的总RNA抽提,可按照商业化的RNA抽提试剂盒进行操作,并测量RNA的浓度。
步骤(3)中的反转录可按照商业化的反转录试剂盒进行;Real time-PCR反应也可按照商业化RT-PCR反应试剂盒进行操作,其中,Real time-PCR反应中,以U6snRNA作为内参,并自行设计U6snRNA的引物,以及使用2ΔCt公式来计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值,式中ΔCt=Ct生物标志物-CtU6,Ct是域值循环数,Ct生物标志物是miR-378生物标志物的Ct值,CtU6是U6snRNA的Ct值。反转录反应条件为:37℃1小时,95℃5分钟。Real time-PCR反应中U6snRNA的引物序列设计为ttcgtgaagcgttccatatttt(SEQ ID NO.2所示),miR-378生物标志物的引物序列为actggacttggagtcagaagg(SEQ ID NO.3所示),其Realtime-PCR反应条件为95℃15分钟,然后进行循环,循环条件为:94℃15秒,55℃30秒,70℃34秒,共40个循环。
再者,本发明还提供一种用于胃癌检测的miR-378生物标志物检测试剂盒,该检测试剂盒包括:常规实时定量PCR试剂(包括:Taq酶、dNTP试剂、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC处理水等)、内参U6snRNA的检测引物(SEQ ID NO.2所示)、miR-378的检测引物(SEQ ID NO.3所示)。其中,该检测试剂盒的操作方法可参照利用上述生物标志物进行胃癌检测的方法进行。
本发明的实验数据显示不同的肿瘤样本都具有特异性的血清miRNA表达谱。本发明中的miR-378在正常人和胃癌患者血清中存在差异表达,在胃癌血清中有显著的表达上调。另外,本发明以miR-378生物标志物的PCR相对定量值取2.9为临界值作为判断胃癌的依据是根据具体的实验数据所得,其中,实验数据包括以下具体实施例中的实施例1和实施例2。因此,可以成为胃癌检测诊断、病理分级、临床分期、治疗疗效判断的有效工具,具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1是实施例1中的24个血清样本的miRNA表达谱聚类图。横排代表miRNA,纵排代表样本。从左到右,左侧区域显示的是10个正常样本,中间区域显示的是7个结直肠癌样本,右侧区域显示的是7个胃癌样本。
图2是实施例1中的胃癌样本与正常样本中miR-378表达量的比值,其中,左侧显示的是芯片结果,右侧为RT-PCR的验证结果。
图3是实施例2中的正常血清样本和胃癌血清样本中的miR-378表达丰度的比较图,其中,纵坐标为miR-378的PCR相对定量值。
图4是实施例2中的正常血清样本和胃癌血清样本中的miR-378表达丰度的比较图(箱图),其中,纵坐标为miR-378的PCR相对定量值。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明:
实施例1用于胃癌检测的生物标志物组合的建立
1.收集血清样本
采集10个正常人、7个结直肠癌、7个胃癌各病期病人术前外周血2mL(采血时间一般为早晨或上午),其中,这24个血清样本的具体临床数据如表1所示。将采集的2mL外周血迅速转入不含EDTA的普通试管中,在22~25℃(室温)静置15~30分钟至完全凝固。取0.6ml~1mL上清转至洁净的1.5mL离心管中,在1小时(室温条件下)或2小时(4℃条件下)内进行以下操作:4℃下820g离心10分钟;再次吸取上清转至洁净的1.5mL离心管中,4℃下16000g离心10分钟,小心吸取上清到新的离心管中,置于-80℃保存备用。
表1 24个血清样本的具体临床数据
2.血清中总RNA(包含miRNA)抽提
每份样本取400μL血清,使用Applied Biosystem公司的mirVanaTMPARISTM试剂盒,按照说明书步骤抽提总RNA,并取1μLRNA,使用NanoDrop ND-1000Spectrophotometer仪器按说明书步骤测量RNA浓度后置于-80℃保存。
3.基因芯片杂交
取100ng所抽提的血清RNA,使用Agilent Technologies公司的miRNAComplete Labeling and Hyb试剂盒,按照说明书步骤进行样本标记和浓缩,使用Agilent Technologies公司的人microRNA表达谱芯片进行杂交。使用芯片扫描仪进行图像扫描以后,把数据导入GeneSpring GX11.0软件进行数据的标准化处理及后续的分析,将芯片归一化后的有效数据应用Pearson correlation进行聚类分析。
分析发现,来源于胃癌的样本和来源于结直肠癌的样本都各自聚集到了一起(图1),提示血清miRNA表达谱可以区分不同来源的肿瘤,而且正常血清miRNA的表达谱也明显与肿瘤血清miRNA表达谱不同,提示血清miRNA表达谱也能区分正常与肿瘤样本。
利用倍数分析、t检验、聚类分析等生物信息学手段进行差异基因表达分析,探寻可能的差异基因,最终筛选出在胃癌中特异性表达上调的miRNA-miR-378(序列如SEQ ID NO.1所示)。
4.反转录和Real time-PCR(RT-PCR)反应验证芯片结果
取60ng所抽提的RNA使用Qiagen公司的miScript Reverse Transcription反转录试剂盒进行反转录反应。20μL反应体系:60ng所提取的RNA+Rnase free water(RNA和Rnase free water的总和为15μL),5×miScript RT Buffer 4μL,miScriptReverse Transcriptase Mix 1μL。在热循环仪上进行反转录反应,反应条件如下:37℃1小时,95℃5分钟。
取1.5μL的反转录产物作为实时定量PCR反应的模板,使用Qiagen公司的miScript SYBR Green PCR试剂盒进行实时定量PCR反应。定量PCR以U6snRNA为内参,并设计该内参的引物。20μL反应体系:1.5μL反转录产物,2×QuantiTectSYBR Green PCR Master Mix 10μL,10×miScript Universal Primer 2μL,miR-378或内参U6snRNA的特异性引物(浓度为20μM)2μL,Rnase free water 4.5μL。miR-378的引物序列为SEQ ID NO.3所示,U6snRNA的引物序列为SEQ ID NO.2所示。反应在Applied Biosystem公司的7300定量PCR仪上进行,条件为95℃预热15分钟,然后进行循环,循环条件为:94℃15秒,55℃30秒,70℃34秒,共40个循环的PCR反应。
利用RT-PCR反应对芯片结果进行验证,发现芯片结果显示miR-378在胃癌血清中的表达是正常样本中的2.8倍,而RT-PCR结果中,胃癌血清中miR-378的相对定量值是正常样本的3.9倍,即miR-378在胃癌血清中有显著的表达上调,该RT-PCR结果与芯片结果显示一致(图2)。
实施例2应用miR-378生物标志物进行胃癌检测的方法
1.收集血清样本
采集13例初发胃癌患者的术前外周血2mL,并匹配13例正常人血样本,26例血清样本的临床数据如表2所示。按照实施例1中的“收集血清样本”步骤进行操作,但其中的离心条件改为:4℃下600g离心15分钟;再次吸取上清转至洁净的1.5mL离心管中,4℃下12000g离心15分钟,小心吸取上清到新的离心管中,最后得到的血清于-80℃保存备用。
表2 26个血清样本的具体临床数据
2.血清中总RNA(包含miRNA)抽提
如同按照实施例1进行操作。
3.反转录和Real time-PCR(RT-PCR)反应
如同按照实施例1中的“反转录和Real time-PCR(RT-PCR)反应”进行操作。
miR-378生物标志物的PCR相对定量使用2ΔCt公式来计算,其中ΔCt=Ct生物标志物-CtU6。结果显示胃癌血清样本中的miR-378的表达量明显上调,平均miR-378的PCR相对定量值为5.52,而正常样本的平均miR-378的PCR相对定量值仅为1.98,差异有显著性(p=0.003)(图3)。
4.以miR-378作为胃癌检测的生物标志物
以miR-378的PCR相对定量值取2.9为临界值,小于等于2.9认为是非胃癌样本,大于2.9认为是胃癌样本。
以miR-378的PCR相对含量为诊断标准,本实施例中的26个样本的诊断结果如下:胃癌血清样本中>2.9有9例,≤2.9的有2例;正常血清样本中>2.9有4例,≤2.9的有9例,具体如表3所示。miR-378作为诊断标准的特异性为73.33%(11/15),敏感性为84.62%(11/13)(图4)。
表3miR-378为生物标志物进行胃癌诊断的结果
实施例3检测试剂盒及应用
本实施例中的用于胃癌检测的miR-378生物标志物检测试剂盒,除含有常规实时定量PCR试剂之外,还包括内参U6snRNA的检测引物(SEQ ID NO.2所示)和miR-378的检测引物(SEQ ID NO.3所示)。其中,常规实时定量PCR试剂包括Taq酶、dNTP试剂、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水(Rnase free water)。
利用上述检测试剂盒进行检测时,其具体的操作方法可参照实施例2的操作方法进行样本的检测和胃癌的判断,其中,“收集血清样本”步骤中的离心条件还可以为:4℃下900g离心5分钟;再次吸取上清转至洁净的1.5mL离心管中,4℃下16000g离心5分钟。
应用本实施例中的检测试剂盒可以简单、快速、便利地进行miR-378生物标志物的检测,以判断胃癌情况,便于治疗。
Claims (9)
1.一种用于胃癌检测的miRNA生物标志物,其特征在于:所述miRNA生物标志物是如SEQ ID NO.1所示miRNA序列的miR-378。
2.如权利要求1所述的用于胃癌检测的miRNA生物标志物,其特征在于:所述miR-378在胃癌患者血清中的特异性表达上调。
3.如权利要求1或2所述的miR-378生物标志物还应用于胃癌的诊断。
4.如权利要求1所述的应用于miR-378生物标志物的实时定量PCR反应中的内参,其特征在于:所述内参为U6snRNA,其引物序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求1所述的利用miR-378生物标志物进行胃癌检测的方法,包括步骤:
(1)收集人血清样本;
(2)提取血清中总RNA;
(3)对miR-378生物标志物进行反转录和实时定量PCR反应,并计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值;
(4)当样本中的miR-378生物标志物的PCR相对定量值小于或等于2.9时,则认为是非胃癌样本;大于2.9时,则认为是胃癌样本。
6.如权利要求5所述的利用miR-378生物标志物进行胃癌检测的方法,其特征在于:所述步骤(1)收集人血清样本的具体操作为:将收集的人血样本放入不含EDTA的试管中,静置凝固后,取上清在4℃下600g~900g离心5~15分钟后,再取上清,并在4℃下12000g~16000g离心5~15分钟,取上清即得。
7.如权利要求5所述的利用miR-378生物标志物进行胃癌检测的方法,其特征在于:所述步骤(3)中的实时定量PCR反应中,以U6snRNA作为内参,该内参的引物序列如SEQ ID NO.2所示,miR-378生物标志物的引物序列如SEQ ID NO.3所示;并使用2ΔCt公式来计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值,式中ΔCt=Ct生物标志物-CtU6。
8.如权利要求1所述的用于胃癌检测的miR-378生物标志物检测试剂盒,其特征在于:所述检测试剂盒包括:常规实时定量PCR试剂、如SEQ ID NO.2所示的内参U6snRNA的检测引物、如SEQ ID NO.3所示的miR-378生物标志物的检测引物。
9.如权利要求8所述的用于胃癌检测的miR-378生物标志物检测试剂盒,其特征在于:所述常规实时定量PCR试剂包括:Taq酶、dNTP试剂、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC处理水。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120725 |