CN113293207B

CN113293207B - 外周血miRNA在制备作为心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途

Info

Publication number: CN113293207B
Application number: CN202110694215.8A
Authority: CN
Inventors: 俞作仁; 赵倩; 郭悦凡; 刘中民
Original assignee: Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Current assignee: Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2041-06-22
Also published as: CN113293207A

Abstract

本发明提供了一种外周血miRNA在制备作为心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途，所述的外周血miRNA的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了一种联合外周血miRNA在制备作为心衰辅助诊断或者预后的生物标志物中的用途，所述的外周血miRNA的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。实验证明，外周血2个miRNA（miR‑654‑5p和miR‑30a‑5p）组建模型，优于单一miR‑654‑5p或者miR‑30a‑5p，双miRNA模型在诊断心衰中具有更高的特异性和准确性。

Description

外周血miRNA在制备作为心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种非编码基因，具体来说是一种外周血miRNA在制备作为心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途。

背景技术

早期心衰的临床表现并不典型，没有特异性，与肺部疾病、胸膜疾病和大血管疾病容易混淆，仅靠临床表现容易造成误诊和漏诊。如果心衰早期患者不能得到及时、准确的诊断和治疗，易产生质性病变，最终形成难治性终末期心衰。因此，心衰的早期诊断及防治对降低心脏病死亡率具有重要意义。生物标志物是一类与疾病发生、发展等有关的生化指标，能反映机体病理进程及治疗手段的安全性和有效性，在疾病早期诊断及预防、治疗靶点确定及预后等方面发挥重要作用。本发明旨在发现心衰预警、早诊、预后、治疗效果的外周血生物标志物，制备拥有自主知识产权的临床检测新手段，有助于实现心衰患者早发现、早用药、早治疗，从而降低心脏病患者死亡率。

miRNA是一类长度约在20-22碱基的具有调控功能的非编码RNA，主要参与基因转录后水平的调控。miRNA具有成为多种疾病生物标志物的潜力，原因在于：1)miRNA具有组织特异性和阶段特异性，在不同组织、不同发育阶段有特异性表达谱，具备理想的疾病标志物特征。2)与其他RNA相比，miRNA在新鲜或***固定组织和体液中具有较高的化学稳定性，增加了其作为生物标记物的潜力。3)miRNA可由健康细胞或疾病细胞释放并进入体液(如血液、尿液或痰液等)，成熟的miRNA在体液中非常稳定，并且在不同疾病、疾病不同进程中具有极高的特异性。以上均增加了其作为非侵入性生物标记物的可行性。4)miRNA具有高度的进化保守性，提高了其由动物实验水平转化到临床应用阶段的成功率。5)miRNA检测手段无创、检测成本低，在其他早期检测方法不可用、昂贵甚至对患者有损的情况下，基于miRNA的生物标志物检测具有在常规临床实践中建立的机会。6)RNA分子输送技术的不断提高使得基于miRNA的疾病治疗方案变得更加现实。7)一些针对miRNA的靶向治疗已由实验室进入临床开发阶段，证实了miRNA作为肿瘤等疾病标志物的可行性。

miRNA调控心肌细胞发育早有报道。美国Gladstone心血管疾病研究所研究人员发现miR-1有助于胚胎发育早期心脏祖细胞(干细胞)的分化。我国中科院李培峰研究员最新发现miR-499对于条件诱导的心肌梗塞严重程度及心肌细胞凋亡的影响，证实miR-499水平与细胞凋亡及心肌梗塞程度密切相关。哈佛大学Hosoda T等人研究结果进一步证实心肌干细胞中，miR-499能抑制其目的基因SOX6和Rod11的表达，提高离体情况下心脏成肌和在体情况下心肌梗死后的心肌重建效率。来自美国得克萨斯州大学西南医学中心的研究人员搜寻了在心脏肥大和心力衰竭过程中受到调节的miRNA，发现12个miRNA与心脏病有关。其中心脏肥大过程中被上调的miR-195，过表达能够导致转基因小鼠发生病态的心脏生长和心力衰竭。这些发现揭示了miRNA在控制心肌肥大、心室重塑以及心力衰竭中发挥重要作用，并提示miRNA可能成为治疗心脏病的一类基因药物或者作用靶标。

利用多个疾病特征性miRNA建立诊断或预后模型，可提高诊断或预后模型的准确性及特异性。Satoshi Nishiwada等利用4个公共数据和胰腺导管腺癌患者标本全基因组表达谱数据，确定了与***转移相关的miRNA特征，并建立了由6个miRNA(miR-155-5p,miR-196b-5p,miR-365a-5p,miR-629-5p,miR-675-3p,and miR-92b-3p)组成的诊断模型，利用该模型可以诊断胰腺导管腺癌转移到***的风险程度。Rui Sun等通过对诊断、缓解和复发不同阶段弥散性大B细胞淋巴瘤患者血清样本进行miRNA表达谱分析，确定了4个与复发及预后相关miRNA，并建立由以上4个miRNA(miR21、miR130b、miR155和miR28)组成的预后模型，预后模型显著预测了弥漫大B细胞淋巴瘤的临床结果，准确率优于单个miRNA。JianZhou等通过筛选、验证、模型建立、模型验证等过程，建立了由7个miRNA(miR-122,miR-192,miR-21,miR-223,miR-26a,miR-27a和miR-801)组成的乙型肝炎病毒相关肝癌诊断模型，此模型不仅具有诊断乙型肝炎病毒相关肝癌的高准确性，在疾病分期和区分肝癌、健康、慢性乙型肝炎、肝硬化方面同样具有高准确率。三阴性乳腺癌(TNBC)是所有乳腺癌中复发率最高、生存时间最短的一种，迫切需要一种风险评估方法来确定准确的治疗过程。Hsiao-ChinHong等利用公共数据集对TNBC组织特征性miRNA进行了筛选，并建立了由8个miRNA(miR-138-5p、miR-10b-5p、miR-486-5p、miR-455-3p、miR-107、miR-146b-5p、miR-324-5p和miR-20a-5p)组成的TNBC复发预测模型，模型AUC分别达0.80、0.89和0.90。Yvan Devaux等建立了一组由4个miRNA(miR-16、miR-27a、miR-101和miR-150)组成的模型，该模型可改善基于临床指标预测急性心肌梗塞后的左心室收缩力的准确性。新加坡国立大学卫生***心血管研究所Lee Lee Wong等建立了由8个miRNA(miR-503-5p、miR-454-3p、miR-551b-3p、miR-1280、miR-24-3p、miR-10b-5p、miR-598-3p、miR-193a-5p)组成的非急性心衰诊断模型，模型的AUC、特异性及准确度分别为0.96、0.88、0.89；8个miRNA模型与NT-proBNP相结合，在识别非急性心衰方面具有更高的区分度和更高的特异性和准确性。

本发明模型中miR-30a-5p在心脏循环标志物中的研究。Guangwen Long等对AMI患者于胸痛发作后4h、8h、12h血浆中miR-30a进行检测，发现miR-30a在以上三个时间点样本中均显著高表达于对照组，8h达到最高峰；三个miRNA(miR-30a、miR-195、let-7b)可区分AMI患者与健康对照组，发病8h时AUC值为0.93、敏感性为94％、特异性为90％，发病12h时AUC值为0.92、敏感性为90％、特异性为90％。Yan Yang等对AMI患者于胸痛发作后4h、24h、72h、1周血清中miR-30a进行检测，发现miR-30a在患者胸痛发作后4h样本中显著高表达于对照组，表达量呈现时间依赖性，24h达到最高峰，一周样本与对照组无显著差异；通过对血清外泌体进行检测发现miR-30a在AMI患者血清的外泌体中高度富集；体外实验证实缺氧心肌细胞的外泌体通过旁分泌方式传递miR-30a调控自噬。Agata Maciejak等收集急性心肌梗死患者第一天血浆和血清，对以上患者样本进行miRNA表达谱检测；根据6个月后是否发生左心室功能障碍，将患者分为发生左心室功能障碍组和未发生组，对两组miRNA表达特征进行分析，发现在AMI后6个月出现左室功能障碍和HF症状的患者中，miR-30a-5p在入院时显著升高。生物信息学分析表明，miR-30a-5p可能调控参与心血管发病的基因，提示循环miR-30a-5p对AMI后左室功能障碍和心衰症状的预后价值及其相关性。Dong-Sheng Zhao等通过对无症状对照组、慢性心衰患者静脉血清及独立分娩胎儿的脐静脉血清进行分析发现miR-30a在心衰及胎儿样本中的表达量均显著高于对照组，提示慢性心力衰竭患者血清中部分与心衰相关的miRNA表达水平趋向于恢复到胎儿水平。

本发明模型中miR-654-5p在心脏循环标志物中的研究未检索到相关文献。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种外周血miRNA在制备作为心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途，所述的这种外周血miRNA在制备作为心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途要解决现有技术中的对于心衰诊断依赖于心脏超声等影像学昂贵手段及评判心衰患者预后手段有限的技术问题。

本发明提供了一种外周血miRNA在制备作为心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途，所述的外周血miRNA的序列如SEQ ID NO.2所示。

具体的，所述的心衰诊断包括早期诊断。

本发明还提供了检测外周血miRNA的试剂在制备用于心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途，所述的检测外周血miRNA的上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述的外周血miRNA的序列如SEQ ID NO：2所示，所述诊断包含：检测来自患者的外周血miRNA生物标记物的水平。

本发明提供的,hsa-miR-654-5p在miRbase数据库(http://www.mirbase.org/)的登录号及具体序列如下：

Name	Sequence(5’-3’)	Assession	SEQ ID NO.
				hsa-miR-654-5p	uggugggccgcagaacaugugc	MIMAT0003330	2

本发明通过心衰临床患者入院时血液指标及心功能好转出院时血液指标，发现了一种血浆微小RNA，miR-654-5p，在心衰患者外周血含量显著降低。患者经治疗出院时，miR-654-5p在外周血含量显著回升。

本发明还提供了一种联合外周血miRNA在制备作为心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途，所述的外周血miRNA的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了联合检测外周血miRNA的试剂在制备用于心衰诊断或者预后的生物标志物中的用途，所述的第一检测外周血miRNA的上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述的第一外周血miRNA的序列如SEQ ID NO：2所示，所述的第二检测外周血miRNA的上游引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述的第二外周血miRNA的序列如SEQ ID NO：1所示，所述诊断包含：检测来自患者的第一外周血miRNA和第二外周血miRNA生物标记物的水平。

本发明提供的hsa-miR-30a-5p在miRbase数据库(http://www.mirbase.org/)的登录号及具体序列如下：

Name	Sequence(5’-3’)	Assession	SEQ ID NO.
				hsa-miR-30a-5p	uguaaacauccucgacuggaag	MIMAT0000087	1

实验证明，外周血2个miRNA(miR-654-5p和miR-30a-5p)组建模型，优于单一miR-654-5p或者miR-30a-5p，双miRNA模型在诊断心衰中具有更高的特异性和准确性。

本发明发现在同一心衰患者入院(心衰患者，心脏功能差)、出院(结果治疗心脏功能恢复，心衰症状减轻)外周血中，hsa-miR-30a-5p在入院患者外周血含量显著高于出院患者，hsa-miR-654-5p在入院患者外周血含量显著低于出院患者。

本发明结合正常人群样本和心衰患者样本验证，和正常对照相比，hsa-miR-30a-5p在心衰患者外周血中含量高，hsa-miR-654-5p在心衰患者外周血中含量低，AUC分别为0.9089、0.9867。

本发明由hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-654-5p组成的心衰诊断模型，诊断模型的准确率为95.6％，AUC为0.9978。其中心衰患者阳性准确率96.67％，正常对照阴性准确率93.33％。

本发明由hsa-miR-654-5p单独作为心衰诊断模型，诊断模型的准确率为93.3％，AUC为0.9867。其中心衰患者阳性准确率96.67％，正常样本阴性准确率86.67％

由hsa-miR-30a-5p单独作为心衰诊断模型，诊断模型的准确率为82.2％，AUC为0.9089。其中心衰患者阳性准确率83.33％，正常对照阴性准确率80.00％。

附图说明

图1显示了筛选阶段40例心衰患者入院、出院外周血中，和出院相比，hsa-miR-30a-5p在患者入院时外周血中含量高，在好转出院时外周血中含量降低，hsa-miR-654-5p在患者入院时外周血中含量低，在患者好转出院时含量升高。所选病例中，出入院标准是，患者入院纳入标准为NT-proBNP>450pg/ml(900pg/ml(50～75岁)、1800pg/ml(>75岁)，患者治疗后出院纳入标准NT-proBNP降幅≥30％。

图2显示了和15例正常对照样本相比，hsa-miR-30a-5p在30例心衰患者外周血中含量升高，hsa-miR-654-5p在心衰患者外周血中含量降低，AUC分别为0.9089、0.9867。

图3显示了由hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-654-5p组成的心衰诊断模型，诊断模型的准确率为95.6％，AUC为0.9978。其中心衰患者阳性准确率96.67％，正常对照阴性准确率93.33％。

图4显示了由hsa-miR-30a-5p单独作为心衰诊断模型，诊断模型的准确率为82.2％，AUC为0.9089。其中心衰患者阳性准确率83.33％，正常对照阴性准确率80.00％。

图5显示了由hsa-miR-654-5p单独作为心衰诊断模型，诊断模型的准确率为93.3％，心衰患者阳性准确率96.67％，正常样本阴性准确率86.67％，AUC为0.9867。

具体实施方式

实验方法

1、样本收集

1)患者纳入标准：使用年龄分层的NT-proBNP界值作为急性心衰入院患者纳入标准NT-proBNP>450pg/ml(900pg/ml(50～75岁)、1800pg/ml(>75岁)；患者治疗后NT-proBNP降幅≥30％，结合心脏超声影像学片段心功能的恢复，则考虑患者预后良好，作为出院纳入标准。

2)静脉抽取3ml出入院患者及正常人群血样至EDTA抗凝采血管，上下颠倒采血管，防止凝血，采血时避免溶血。

3)4℃，3000rpm，离心10min，取上层血浆，200uL/管分装至2ml无酶离心管，-80℃保存备用。

2、血浆RNA抽提

1)每200uL血浆加1mL Trizol，反复用移液枪吹打或剧烈震荡，室温裂解5-10min；

2)以上离心管中，每1mL Trizol加200uL氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，室温静置2-3分钟，4℃、12000g离心15min；

3)取上层水相于新EP管中，每1mL Trizol加500uL异丙醇，每管加1uL糖原，-20℃放置过夜；

4)第二天将以上EP管于室温下放置5-10min，4℃、12000g离心15min；

5)小心除去上清，按照每1ml Trizol加1ml预冷75％乙醇进行洗涤，4℃、7500g离心5min，弃上清；

6)重复步骤5)；

7)室温自然干燥沉淀；

8)用10uL Rnase-free water溶解RNA沉淀，检测RNA浓度及质量，-80℃保存备用。

2、miRNA cDNA链合成

1)DNA酶处理(Takara，2270A)

EP管中依次加入：5uL DNA酶I缓冲液(10X)，0.5uL DNA酶I(5U/μl)，3.5ug RNA样品，无酶水补足体积至50uL。37℃，放置30min。

EP管中加入1μl 0.5M EDTA。80℃，放置2min。

2)miRNA cDNA链合成(Clontech，638315)

EP管中依次加入：5uL mRQ缓冲液(2x)，1.25uL mRQ酶，0.25-8ug RNA，无酶水补足体积至10uL。37℃，放置1h。85℃，放置5min。-80℃保存备用。

3、miRNA实时荧光定量检测(Clontech，638316)

384孔中依次加入9uL ddH2O，12.5uL TB Green Advantage Premix(2X)，0.5uLROX Dye(50X)，0.5uL miRNA前引物，0.5uL mRQ 3’引物(10μM)，2uL cDNA。

反应程序：预变性：95℃，10sec；扩增40个循环：95℃，5sec，60℃，20sec；溶解曲线：95℃，60sec，55℃，30sec，95℃，30sec。

hsa-mir-30a-5p检测用上游引物序列：5’tgtaaacatcctcgactggaag 3’(SEQ IDNO.3所示)，下游引物源自试剂盒通用引物(Clontech公司，货号638316，mRQ 3’引物)。

hsa-mir-654-5p检测用上游引物序列：5’tggtgggccgcagaacatgtgc 3’(SEQ IDNO.4所示)，下游引物源自试剂盒通用引物(Clontech公司，货号638316，mRQ3’引物)。

本发明采用的hsa-miR-30a-5p和hsa-miR-654-5p荧光定量PCR检测上游引物序列如下：

基因名	序列(5’-3’)	用途	SEQ ID NO.
				hsa-miR-30a-5p	tgtaaacatcctcgactggaag	PCR上游引物	4
hsa-miR-654-5p	tggtgggccgcagaacatgtgc	PCR上游引物	3

4、实验方案

1)对40对入院与出院心衰患者外周血miRNA检测，并进行成对样本T检验分析，筛选得到具有统计学差异的miR-30-5p和miR-654-5p，作为可预测心衰或评判心衰治疗效果的候选miRNAs。

图1显示了hsa-miR-30a-5p在患者入院时外周血中含量高，hsa-miR-654-5p在患者入院时外周血中含量低，差异具有统计学意义。

2)进一步收集15例正常对照血样，及30例心衰患者血样，检测hsa-miR-30a-5p及hsa-miR-654-5p在15例正常人群及30例心衰患者外周血中的表达，发现hsa-miR-30a-5p在心衰患者外周血中异常高表达，hsa-miR-654-5p在心衰患者外周血中异常低表达，差异具有统计学意义。hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-654-5p AUC分别为0.9089、0.9867。(图2)

3)hsa-miR-30a-5p在心肌病患者外周血含量升高，已经有文献报道，但hsa-miR-654-5p在心衰及心脏病患者的异常表达，尚未见文献报道。

4)以外周血hsa-miR-654-5p单独作为指标，诊断心衰患者，准确率为93.3％，AUC为0.9867，敏感性为96.7％，特异性为86.7％。

5)以外周血hsa-miR-30-5p单独作为指标，诊断心衰患者，准确率为82.2％，AUC为0.9089，敏感性为83.3％，特异性为80％。

5)以外周血hsa-miR-654-5p和hsa-miR-30-5p联合建立心衰诊断模型，准确率为95.6％，AUC为0.9978，敏感性为96.7％，特异性为93.3％。

6)从上述实验数据可见，作为心衰诊断模型，hsa-miR-654-5p联合hsa-miR-30-5p优于hsa-miR-654-5p单独，hsa-miR-654-5p单独优于hsa-miR-30a-5p单独。

序列表

<110> 上海市东方医院（同济大学附属东方医院）

<120> 外周血miRNA在制备作为心衰诊断及预后的生物标志物中的用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uguaaacauc cucgacugga ag 22

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uggugggccg cagaacaugu gc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtgggccg cagaacatgt gc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtaaacatc ctcgactgga ag 22

Claims

1.检测外周血miRNA的试剂在制备用于心衰诊断的试剂中的用途，检测外周血miRNA的上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，外周血miRNA的序列如SEQ ID NO：2所示，诊断包含：检测来自患者的外周血miRNA生物标记物的水平。

2.联合检测外周血miRNA的试剂在制备用于心衰诊断的试剂中的用途，第一检测外周血miRNA的上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，第一外周血miRNA的序列如SEQ ID NO：2所示，第二检测外周血miRNA的上游引物序列如SEQ IDNO：4所示，第二外周血miRNA的序列如SEQ ID NO：1所示，诊断包含：检测来自患者的外周血第一miRNA和外周血第二miRNA生物标记物的水平。