CN106999578A - 针对epha4的人类单克隆抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新型完全人类EphA4单克隆抗体，其具有不同结合特征。还披露这些抗体的抗原结合片段、这些抗体的双特异性形式以及这些抗体的结合物。此外，披露编码这些抗体、抗原结合片段、双特异性抗体和结合物的核酸。这些单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物、核酸和载体可用于鉴别和治疗患有与异常EphA4介导的信号传导有关的疾病或病状的个体。

Description

针对EPHA4的人类单克隆抗体和其用途
美国政府利益声明
本发明是在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)、国家癌症研究所(National Cancer Institute)的计划号ZIA BC 010701下，在政府支持下进行。美国政府具有本发明中的某些权利。
相关申请案
本申请案要求2014年7月31日申请的美国临时专利申请案第62/031,793号的优先权，其内容以全文引用的方式并入本文中以用于所有目的。
背景技术
本申请涉及结合EphA4的单克隆抗体(mAb)和抗原结合片段或它们的其它衍生物，以及这些抗体/片段/衍生物用语诊断和治疗与EphA4信号传导失调有关的疾病和病状(如肿瘤、神经变性病症和情绪障碍)的用途。
受体的产生红血球生成素的肝细胞(Eph)家族是受体酪氨酸激酶，其结合细胞膜锚定配位体并且至少在大脑、心脏、肺、肌肉、肾脏、胎盘、胰腺(Fox等人,《癌基因(Oncogene)》(1995)10:897)和黑色素细胞(Easty等人,《国际癌症杂志中表达(Int.J.Cancer)》(1997)71:1061)Eph受体基于序列类似性和其对糖基化磷脂酰肌醇连接的艾普瑞林-A(ephrin-A)配位体或跨膜结合艾普瑞林-B(ephrin-B)配位体的结合亲和力分成两个子类，EphA和EphB(分别由称为EPHA和EPHB 15的基因座编码)。人类中存在九种EphA(EphA1-8和EphA10)。配位体与EphA4的结合引起酪氨酸磷酸化并且产生具有Src同源性2/3(SH2/SH3)结构域的蛋白质的结合区。
EphA4与若干种病变有关并且已鉴别这一受体是有前景的药物目标。已在治疗不同病理学病状时考虑EphA4-艾普瑞林结合的调节。
举例来说，EphA4在人类血小板表面上表达，其在所述表面促进血栓稳定(Prevost等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》(2005)102:9820-9825)。其已在不同类型的癌细胞(Ashida等人,《癌症研究(Cancer Res)》(2004)64:5963-5972)以及肿瘤内皮细胞(Yamashita等人,《生物化学杂志(J.Biol Chem)》(2008)283:18926-18936)中检测到。已证实EphA4在乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌中上调(Miyazaki等人,《生物医学中心临床病理学(BMC Clin Pathol)》(2013)13:19；Giaginis等人,《生物医学中心临床病理学》(2014)14:8)。
还研究通过干扰EphA/艾普瑞林-A***来治疗中枢神经***(CNS)疾病。举例来说，Carmona等人(Carmona,M.A.等人,《美国国家科学院院刊》(2009)106:12524-9)检验EphA4抑制对谷氨酸传递的影响。其它研究已鉴别EphA4抑制剂是用于治疗肌肉萎缩性侧索硬化(Van Hoecke,A.等人,《自然医学(Nat Med)》(2012)18:1418-1422)和脊髓损伤(Goldshmit,Y.等人,《科学公共图书馆综合卷(PLoS One)》(2011)6:e24636)的潜在治疗性候选物。Eph受体对于突触发育和突触可塑性的调节也是重要的(Klein,R.,《自然神经科学(Nat Neurosci)》(2009)12:15-20；Pasquale,E.B.,《细胞(Cell)》(2008)133:38-52)。尽管EphB通过其与NMDA受体的相互相用增强突触发育(Sheffler-Collins,S.I.和Dalva,M.B,《神经科学趋势(Trends in Neurosciences)》(2012)35:293-304；Dalva,M.B.等人,(2000)《细胞》103,945-956)，但EphA4(其主要在成年人海马区中表达)充当神经传递和海马突触可塑性的负调节剂(Murai,K.K.和Pasquale,E.B.，《神经胶质(Glia)》(2011)59:1567-1578)。EphA4由其配位体艾普瑞林的活化通过诱导受体集群和自体磷酸化来触发正向信号传导(Pasquale,E.B.,《自然评论：分子细胞生物学(Nat Rev Mol Cell Biol)》(2005)6:462-475)。这通过细胞周期素依赖性激酶5(Cdk5)依赖性RhoA活化和细胞粘着降低引起树突状脊状***的收缩(Fu,W.Y.等人,《自然神经科学》(2007)10,67-76)。EphA4还在动态平衡可塑性期间引起突触和表面AMPA受体的移除，动态平衡可塑性是确保神经元输出端在最佳范围内，由此提供神经元网络的稳定性的可塑性形式(Chen,Y.,Fu,A.K.Y.和Ip,N.Y.,《细胞信号传导(Cellular Signalling)》(2012)24:606-611；Fu,A.K.等人,《自然神经科学》(2011)14:181-189)。引起关注的是，患有轻度认知缺陷的个体呈现EphB和EphA4表达失调(Simon,A.M.等人,《阿尔茨海默病杂志(J Alzheimers Dis)》(2009)17:773-786)。最近，已研究EphA4信号传导与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease；AD)中Aβ诱导的突触失效之间的关系。EphA4介导AD中的海马突触功能障碍并且证实EphA4的配位体结合域的阻断可逆转AD小鼠模型中的突触损伤(Fu,A.K.等人,《美国国家科学院院刊》(2014)111:9959-9964)。
因此，将EphA4视为CNS的疾病和病症以及身体中多种癌症的重要治疗目标。本发明披露可结合人类EphA4的抗体。这些抗体可用于诊断和治疗患有神经退化性疾病(AD、PD、ALS、MS等)、情感障碍(如抑郁症)以及各种癌症形式(包括CNS癌症)的个体。一些这些适应症在下文更详细地描述。这些疾病代表迫切的全球性需求，因为当前不存在可治疗这些病状的有效治疗性干预。
阿尔茨海默病(AD)的特征在于学***均寿命，这一数字在2050年将显著上升到1亿。不存在治愈并且疾病的病理生理学仍相对未知。存在仅四种获FDA批准的可用于AD患者的药物，但这些药物仅缓解症状而非改变疾病病理学(其无法逆转病状或防止进一步恶化)并且在严重病状中无效。因此，早期治疗性干预在AD的管理中是重要的。研究证实AD在记忆力丧失或认知衰退的实际症状实际显现之前很久就已经影响大脑。然而，不存在用于早期检测的诊断工具并且在使用当前方法(其涉及主观临床评估)诊断患者患有AD时，病理学症状已处于晚期状态。
帕金森病(PD)是继AD之后的全世界第二流行的神经退化性疾病。PD是主要影响运动***的神经退化性病症。疾病的运动症状由黑质(中脑区域)中产生多巴胺的细胞的死亡引起。最显而易见的疾病症状与动作有关，其包括动作的抖动、僵硬、缓慢，以及行走和步态困难。随着疾病发展，思维和行为受到影响，其中痴呆通常在疾病晚期发生。抑郁症是最常见的与所述疾病相关的精神症状。所述疾病的主要病理学标志是α-突触核蛋白聚集到神经元中称为路易小体(Lewy bodies)的内含物中，以及黑质中产生多巴胺的细胞的死亡。当前，通过临床症状来诊断PD，所述症状包括震颤、动作迟缓、僵硬和姿势不平衡，因为尚无可用于PD的可靠诊断测试或标记物。据估记全世界有约7百万人患有PD。此外，预计病例数目将由于老龄化人群而显著增长。在美国，预计PD患者的数目几乎翻倍；但预计最大增长将在亚洲的发展中国家(如中国)出现，预计到2030年将有据估计5百万病例。然而，PD的实际发病率难以估计，因为由于诊断方法的局限性，所述疾病通常直到疾病进行到晚期状态才会被诊断。
肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)，也称为葛雷克氏病(Lou Gehrig's disease)是最常见的运动神经元病，其发病率是每100,000人中1-2例并且终生风险是1:800。ALS的特征在于运动神经元从脊髓、脑干和大脑皮层的进行性损失，最终在诊断后的两到五年内引起麻痹和死亡。患有ALS的个体由于肌肉萎缩和肌肉痉挛、说话(发音困难)、吞咽(吞咽困难)和呼吸(呼吸困难)困难而患有快速进行性衰弱。尽管症状次序和速率在个体间不同，但最终大部分患者不能行走或使用其手掌和手臂，并且其失去说话和吞咽其食物的能力。大部分患有ALS的人死于呼吸衰竭，通常在症状发作的三到五年内。从发作到死亡的中值存活时间是约三年，并且仅4％的患有这一病状的患者存活超过10年。约百分之十的ALS病例是由高渗透单基因疾病引起突变的家族形式引起。已鉴别一些与ALS的这些形式相关的特异性基因，包括超氧化歧化酶1基因SOD1中的许多已知突变(Pasinelli和Brown,《自然神经科学综述(Nat Rev Neurosci)》(2006)7:710-23)。也发现EPHA4基因中的功能损失突变与肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)患者的更长存活期相关(van Hoecke等人,《自然医学》(2012)18(9):1418-22)。
多发性硬化(MS)是发炎性退化疾病，其中CNS的大脑和脊髓中的髓鞘保护性神经细胞受到免疫***攻击并且破坏，因此阻止CNS内的神经细胞通信。所述疾病的特征在于多种症状，其可包括视力模糊、平衡缺失、协调性差、语言不清、震颤、麻木、极度疲劳、记忆力和注意力问题、麻痹以及失明。不存在MS的已知的治愈病例，而临床介入旨在改良发作之后的功能和预防新的发作。然而，当前药物的效力有限并且具有不良副作用。在全世界，估计约230万人受MS影响。然而，通常基于病征和症状来诊断MS，并且甚至与支持性医学影像和实验室测试组合，从而难以诊断。这在症状不可见或与其它医学病状类似时的早期尤其常见。
临床抑郁症是严重的衰弱性病症。根据世界卫生组织(World HealthOrganization)，估计全世界有约3亿5千万人患有严重抑郁症并且其已变成世界范围内的功能障碍的起因。还估计在一生中，临床抑郁症将影响17％的人群至少一次。根据许多研究，平均发作年龄是将近30岁并且女性中报导临床抑郁症的数目是男性的约两倍。抑郁症是可治疗的，但大部分人不接受其所需的护理和支持。此外，若干种获FDA批准的药物可用于改善抑郁症状。然而，病患对药物的反应变化并且需要更有效的治疗。
鉴于与EphA4信号传导有关的疾病和病状的高发病率，存在研发可以高亲和力和所需作用来结合人类EphA4的新型抗体(例如借助于其与EphA4的结合来增强或抑制EphA4介导的信号传导)的显著需要。这些抗体是用于诊断和/或治疗与EphA4信号传导失调有关的多种疾病和病状的有价值的工具。这类疾病和病症包括不同类型的癌症、神经变性病(如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、多发性硬化(MS)、肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)和情感障碍，如抑郁症)。本发明解决这些和其它相关需要。
发明内容
本发明提供新型单克隆抗体，其以高亲和力和不同作用特异性结合EphA4。还披露这些抗体的抗原结合片段、这些抗体的双特异性形式以及抗体或其片段的衍生物，如这些抗体与效应分子的结合物，包括多种融合蛋白，其包含所述抗体或片段之一。此外，披露编码这些抗体、抗原结合片段、双特异性抗体和呈融合蛋白形式的结合物的核酸。在一些实施例中，披露包括这些核酸的表达盒和载体，以及包括这些载体或盒的宿主细胞。在其它实施例中，医药组合物包括这些单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物、核酸和载体。在其它实施例中，这些单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物、核酸和载体具有用于鉴别和治疗患有肿瘤的个体的用途。在其它实施例中，这些单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物、核酸和载体具有用于鉴别和治疗患有神经退化性病症(如AD、PD、MS或ALS)的个体的用途。
在一些实施例中，经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括：a)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；b)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括SEQ ID NO:7的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或c)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100，其中单克隆抗体或抗原结合片段特异性结合EphA4。
在其它实施例中，披露经分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包括：a)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；b)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括SEQ ID NO:7的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或c)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQ IDNO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100。
因此，在第一方面中，本发明提供抗EphA4抗体，尤其单克隆抗体，其具有如上文所描述的重链(VH)和轻链(VL)可变域(例如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:4和SEQID NO:7；或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)，尤其具有如上文指定的VH和VL CDR，或所述抗体的重链或轻链、所述抗体的结合片段、包含这类结合片段的双特异性抗体或其衍生物，如融合蛋白或具有另一个功能性部分的结合物，例如以便有助于检测或提供具体生物活性。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是完全人类抗体。在一些实施例中，抗体是IgG。在一些实施例中，抗原结合片段是scFv、Fv、Fab或F(ab)2抗原结合片段。在一些实施例中，本发明的抗体是双特异性抗体，其包含本文中所描述的抗体或抗原片段。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或其双特异性抗体与效应分子结合，所述效应分子可以是可检测标记，如荧光标记、放射性标记、抗生物素蛋白、生物素或酶，或其可以是毒素或化学治疗剂，如绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)。
在第二方面中，本发明提供多核苷酸序列，其编码抗体或抗原结合片段或其双特异性抗体或融合多肽结合物。任选地，聚核苷酸编码序列可操作地连接于启动子，尤其异源启动子。在一些实施例中，提供表达盒，其包含上述多核苷酸序列。在一些实施例中，聚核苷酸编码序列或表达盒作为载体(如病毒载体)的一部分存在。在一些实施例中，载体或表达盒以短暂或永久方式存在于宿主细胞中。
在第三方面中，本发明提供检测生物样品中的艾普瑞林EphA4的方法。所述方法包含这些步骤：使样品在足以形成免疫复合物的条件下与本文中所描述的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或结合物接触；和检测存在或不存在免疫复合物，其中存在免疫复合物表明生物样品中存在EphA4。在一些实施例中，样品来自人类个体或来自鼠类个体。在一些实施例中，样品与本文中所描述的结合物接触。
在第四方面中，本发明提供检测个体中存在肿瘤的方法。所述方法包含这些步骤：使来自怀疑患有肿瘤的个体的生物样品与有效量的本文中所描述的单克隆抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或结合物接触；和检测所述单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体的结合，其中单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与对照物相比的结合增加表明个体患有肿瘤。在一些实施例中，对照物是参考标准或单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体与来自未患有肿瘤的健康个体的样品的结合。在一些实施例中，肿瘤是乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。在一些实施例中，样品是血液、血清、血浆、痰液或活组织检查样品。
在第五方面中，本发明提供用于测定患有肿瘤的个体的预后的方法。所述方法包含这些步骤：使来自怀疑患有肿瘤的个体的生物样品与有效量的本文中所描述的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或结合物接触；和检测所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与样品的结合，其中所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与对照物相比的结合增加表明患有肿瘤的个体的较差预后。在一些实施例中，对照物是参考标准或单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体与来自未患有任何肿瘤的健康个体的样品的结合。在一些实施例中，肿瘤是乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。在一些实施例中，样品是血液、血清、血浆、痰液或活组织检查样品。
在第六方面中，本发明提供用于治疗患有肿瘤的个体的方法，其包含向个体投与治疗有效量的本文中所描述的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或结合物，从而***。在一些实施例中，肿瘤是乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。在一些实施例中，所述治疗包含减小肿瘤体积或减少转移。
在第七方面中，本发明提供用于检测个体中存在神经退化或情感障碍或评估个体中产生神经退化或情感障碍的风险的方法。所述方法包含这些步骤：使来自个体的生物样品与有效量的本文中所描述的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或结合物接触；和检测单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体或结合物与EphA4的结合，其中所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与对照物相比的与生物样品中EphA4的结合增加表明个体患有神经退化或情感障碍或具有升高的发生神经退化或情感障碍的风险。在一些实施例中，对照物是参考标准或单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与来自未患有神经退化或情感障碍或不具有发生神经退化或情感障碍的风险的健康个体的样品中EphA4的结合。在一些实施例中，神经退化是AD、PD、MS或ALS，其可以是家族性或偶发性。在一些实施例中，情感障碍是抑郁症。
在第八态样中，本发明提供用于测定个体中神经退化或情感障碍的预后的方法。所述方法包含这些步骤：使来自患有神经退化或有效病症的个体的生物样品与有效量的本文中所描述的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或结合物接触；和检测抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与生物样品中EphA4的结合，其中所述抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物相比对照物与EphA4的结合增加表明个体的较差预后。在一些实施例中，对照物是参考标准或所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与来自未患有神经退化或情感障碍的健康个体的样品中EphA4的结合。在一些实施例中，神经退化是AD、PD、MS或ALS。ALS可以是家族性或偶发性。在一些实施例中，样品是血液、血清、血浆、痰液或活组织检查样品。在一些实施例中，情感障碍是抑郁症。
在第九态样中，本发明提供用于治疗患有神经退化或情感障碍的个体的方法。所述方法包括向个体投与治疗有效量的本文中所描述的抗体或抗原结合片段或双特异性抗体或结合物的步骤，从而治疗神经退化或有效病症。在一些实施例中，神经退化是AD、PD、MS或ALS(包括家族性或偶发性ALS)。在一些实施例中，情感障碍是抑郁症。在一些实施例中，单克隆抗体是IgG1 m105。
在第十态样中，本发明提供一种医药组合物，其包含治疗有效量的本文中所描述的抗体或抗原结合片段或结合物、编码所述抗体的核酸、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物以及医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，医药组合物经配制用于持续释放。在一些实施例中，医药组合物包含单克隆抗体IgG1 m101、IgG1 m105或IgG1 m119。
附图说明
图1.来自文库、第1轮、第2轮和第3轮淘选的噬菌体的多克隆噬菌体ELISA。将噬菌体添加到经小鼠EphA4或人类EphA4涂布的孔中。使用HRP结合的抗M13-噬菌体Ab进行检测。
图2.通过ELISA测量的IgG1s E1(m101)、E2、E5(m105)和E19(m119)与小鼠和人类EphA4的结合。将连续稀释的IgG1添加到经EphA4涂布的孔中。使用HRP结合的抗FLAG Ab进行检测。
图3.通过ELISA测量的IgG1 m101、m105和m119与小鼠和人类EphA4的结合。将连续稀释的IgG1添加到经EphA4涂布的孔中。使用HRP结合的抗Fab Ab进行检测。
图4.IgG1 m101、m105和m119识别人类EphA4配位体结合域(LBD)。将EphA4LBD重组蛋白纯化并且经历使用所示IgG1进行的西方印迹(Western blot)分析。
图5.IgG1 m101、m105和m119呈现针对EphA4LBD的强结合亲和力。通过在细胞中将20μM Eph LBD蛋白质与1μM抗体一起培育来进行等温滴定量热法(ITC)实验。(A)人类IgG未展示结合；(B)m101展示结合亲和力，其中Kd＝约83.0nM；(C)m105展示强结合亲和力，其中Kd＝约8.6nM；(D)m119展示结合亲和力，其中Kd＝约16.8nM。
图6.IgG1 m101、m105和m119阻断艾普瑞林-A1/EphA4相互相用。曲线指示3种IgG1能够在纳摩尔范围(IC50：m101＝0.71nM；m105＝0.35nM；并且m119＝1.81nM)内阻断小鼠EphA4细胞外结构域与小鼠艾普瑞林-A1之间的相互相用。
图7.IgG1 m105展示阻断EphA4-配位体相互相用的特异性。不同配位体对小鼠EphA4的抑制由IC50值指示(麦普瑞林(mEphrin)-A1：0.34nM；麦普瑞林-A5：22.69nM；艾普瑞林-B2：1.81nM)。m105未能识别小鼠EphB2和阻断其与艾普瑞林-B2的相互相用。
图8.IgG1 m101与表现EphA4的细胞的结合。将293T细胞或经小鼠EphA4转染的293T细胞与IgG1 m101或天然EphA4配位体艾普瑞林-A5-Fc一起培育。使用FITC结合的抗人类IgG Ab进行检测。
图9.IgG1 m119诱导所培养的皮层神经元中EphA4的酪氨酸磷酸化。用2μg/mlm101(101)、m105(105)、m119(119)和作为阳性对照的艾普瑞林-A1(A1)处理DIV 7皮层神经元。收集细胞并且经历免疫沉淀和使用所示抗体进行的西方印迹分析。
图10.IgG1 m105抑制由艾普瑞林-A1诱导的EphA4活化。(A)m105以剂量依赖性方式减弱艾普瑞林-A1诱导的EphA4磷酸化。(B)在免疫沉淀之后EphA4的P-Tyr的定量；单向ANOVA和事后t检验，相对于IgG+Fc，***p<0.001；相对于IgG+A1，###p<0.001。(C)EphA4的Tyr602磷酸化的定量；单向ANOVA和事后t检验，相对于IgG+Fc，*p<0.05，相对于IgG+A1，#p<0.05。
图11.Aβ减少经m105标记的EphA4受体与PSD-95的共定位。如所指示，荧光影像展示在不同时间点时用500nM Aβ处理的所培养的海马神经元(约18-20DIV)。细胞用IgG1m105和PSD-95抗体免疫染色。图式展示与PSD-95共定位的EphA4的减少。NEphA4(n)表示通过超分辩率成像获得的共定位数目(或定位计数)。这一数字仅反映EphA4(N)的相对丰度，但其不是蛋白质的精确数目或甚至荧光标签的数目，因为每个染料分子在成像期间可切换多次。
图12.m105抑制EphA4介导的信号传导的生物功能。m105以剂量依赖性方式消除所培养的海马神经元中艾普瑞林-A1诱导的EphA4集群。m105在抑制Ehrin-A1介导的EphA4丛集中的IC50是4.16μg/ml。
图13.由m105抗体进行的EphA4信号传导的阻断可缓解Aβ(1-42)寡聚物介导的神经传递损伤。m105抗体(其阻断内源性EphA4与艾普瑞林-A的相互相用)缓解Aβ(1-42)寡聚物(500nM)介导的mEPSC出现率降低。所培养的海马神经元(22DIV)用2μg/ml m105处理30分钟，接着用500nM Aβ(1-42)处理24小时。
定义
投药：通过所选择的途径将组合物引入个体。举例来说，如果所选择的途径是静脉内，那么通过将组合物引入个体的静脉来投与组合物。
肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)：一种疾病，也被称为葛雷克氏病(Lou Gehrig'sDisease)、马恰病(Maladie de Charcot)或运动神经元病，其是由运动神经元的变性引起的进行性、致死性、神经退化性疾病。病症引起全身肌肉衰弱和萎缩，因为上部和下部运动神经元退化和死亡，使得其不再神经支配肌肉。肌肉逐渐衰弱、萎缩并且由于去神经而发生肌束震颤(抽搐)。最终，大脑完全丢失其发起和控制自主运动的能力。疾病未必使患者的精神功能衰弱。通常，疾病晚期的个体保留与其在疾病发作之前所具有的相同的记忆、人格和智力。ALS分类成两组，家族性ALS和偶发性ALS。“迟发型”ALS在年龄超过60岁的个体中发生。“早发型”ALS在年龄小于60岁的个体中发生。
ALS的最早症状可包括肌肉抽搐、痉挛或僵硬；影响手臂或腿部的肌肉衰弱；和/或含糊不清和鼻音。这些一般不适接着发展成更明显的衰弱或萎缩。受ALS的早期症状影响的身体部分取决于身体中哪些肌肉首先受到损坏。约75％的人经历“手臂发作型”ALS。通常，在“手臂发作型”ALS中，症状首先在手臂中出现。在一些个体中，症状最初影响一条腿，并且患者在行走或跑步时发生不协调或其发现其更频繁地绊跌或绊脚。其它手臂发作型患者首先发现疾病影响手或手臂，因为其在需要手工灵巧性的简单任务(如扣衬衫或书写)时遇到困难。约25％的ALS病例是“延髓发作型”ALS。这些患者首先发现明显的说话困难；其语音变混乱和含糊不清。鼻音和音量损失通常是最初症状；随后出现困难吞咽，和舌部移动性丧失。最终发生完全失声和在吞咽时不能保护呼吸道。
与身体中首先受疾病影响的部分无关，肌肉衰弱和萎缩随着疾病发展而扩散到身体的其它部分。患者出现移动、吞咽(吞咽困难)和说话或成词(发音困难)困难增加。涉及的上部运动神经元的症状包括绷紧的和僵硬的肌肉(痉挛)以及过度反射(反射过强)，包括过度的反射。通常称为巴氏病征(Babinski's sign)的反射异常(在足底受刺激时大脚趾朝上伸展)也表示上部运动神经元损害。下部运动神经元变性的症状包括肌肉衰弱和萎缩、肌肉痉挛和可在皮下发现的肌肉短暂抽搐(肌束震颤)。约15-45％患者经历假延髓病影响，也称为“情绪不稳”，其由不可控制的大笑、哭泣或微笑组成。
RILUZOLETM(力如太(Rilutek))用于治疗ALS。相信这种药物通过减少谷氨酸释放来较少对运动神经元的损害。ALS患者的临床试验表明利鲁唑(riluzole)使存活期延长若干个月，并且可使延髓发作患者具有更大的存活福利。药物还延长患者需要通气支持之前的时间。
扩增：核酸分子(如DNA或RNA分子)的扩增指使用可增加样品中核酸分子的拷贝数的技术。扩增的实例是聚合酶链反应，其中从个体收集的生物样品在允许引物与样品中的核酸模板杂交的条件下与一对寡核苷酸引物接触。引物在适合的条件下扩展、从模板分离并且接着再结合、扩展和分离以扩增核酸的拷贝数。扩增产物可由电泳、限制性核酸内切酶裂解模式、寡核苷酸杂交或接合和/或使用标准技术的核酸测序表征。其它扩增实例包括链置换扩增，如美国专利案第5,744,311号中所披露；无转录型等温扩增，如美国专利案第6,033,881号中所披露；修复链反应扩增，如WO 90/01069中所披露；连接酶链式反应扩增，如EP-A-320 308中所披露；间隙填充连接酶链式反应扩增，如美国专利案第5,427,930号中所披露；以及NASBATMRNA无转录型扩增，如美国专利案第6,025,134号中所披露。
动物：活的多细胞脊椎动物生物体，包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语哺乳动物包括人类和非人类哺乳动物。类似地，术语“个体”包括人类和家畜个体。
抗体：一种多肽配位体，其包含至少一个特异性识别并且特异性结合抗原的抗原决定基(如人类EphA4和/或小鼠EphA4或其片段)的轻链或重链免疫球蛋白可变区。免疫球蛋白分子由重链和轻链组成，其中每一者具有可变区，称为可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区。总体而言，在原生抗体中，VH区和VL区结合由抗体识别的抗原。在一些实施例中，仅需要重链可变域。举例来说，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下具有功能性并且稳定(参见例如Hamers-Casterman等人,《自然(Nature)》,363:446-448,1993；Sheriff等人,《自然结构生物学(Nat.Struct.Biol.)》3:733-736,1996)。
抗体包括完整免疫球蛋白。抗原结合片段在所属领域中是众所周知的，如单域抗体(例如VH域抗体)、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白质(“scFv”)和二硫键稳定Fv蛋白质(“dsFv”)。scFv蛋白质是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过连接子结合，而在dsFv中，链已经突变以引入双硫键以使链的偶联稳定。所述术语还包括基因工程改造的形式，如嵌合抗体(例如人类化鼠抗体)、异结合抗体(如双特异性抗体)。还参见《皮尔斯目录与手册(Pierce Catalog and Handbook)》,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,《免疫学(Immunology)》,第3版,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。
通常，天然存在的免疫球蛋白具有由二硫键互连的重链(H)和轻链(L)。存在两种轻链，lambda(λ)和kappa(κ)。存在五种决定抗体分子的功能活性的主要重链种类(或同型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每个重链和轻链含有恒定区和可变区(所述区域也称为“结构域”)。总而言之，重链和轻链可变区特异性结合抗原。轻链和重链可变区含有间杂有三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)的“构架”区。已定义构架区和CDR的范围。参见例如Kabat等人(参见Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)》,美国卫生和公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),1991)和免疫遗传学资料库(ImMunoGeneTics database；IMGT)(参见Lefranc,《核酸研究(Nucleic Acids Res)》29:207-9,2001；以及//imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest？livret＝0&Option＝humanIg；)。Kabat资料库先进在线上维护(ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)。不同轻链或重链的构架区的序列在物种(如人类)内具有相对保存性。抗体的构架区(其是成分轻链和重链的组合构架区)用于在三维空间中定位和对准CDR。
CDR主要负责结合于抗原的抗原决定基。每个链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始依序编号，并且也通常通过具体CDR所位于的链鉴别。因此，VH CDR3(或H-CDR3)位于发现其的抗体的重链的可变域中，而VL CDR1(或L-CDR1)是来自发现其的抗体的轻链的可变域的CDR1。结合EphA4的抗体例如将具有特异性VH区和VL区序列，并且因此具有特异性CDR序列。具有不同特异性(亦即针对不同抗原的组合位点)的抗体具有不同CDR。尽管抗体与抗体之间的CDR不同，但CDR内仅有限数目的氨基酸位置直接涉及抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定基(SDR)。
对“VH”或“VH”的参考指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。对“VL”或“VL”的参考指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。
“单克隆抗体”或“mAb”是由B-淋巴细胞的单一纯系或由其中已转染单一抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。通过所属领域的技术人员已知的方法产生mAb，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合产生杂交抗体形成细胞。mAb包括人类化mAb。
“嵌合抗体”具有来自一个物种(如人类)的构架残基和来自另一物种的CDR(其通常提供抗原结合)，如特异性结合EphA4的鼠类抗体。
“人类”抗体(也称为“完全人类”抗体)是包括人类构架区和所有来自人类免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个实例中，构架和CDR来自相同的起始人类重链和/或轻链氨基酸序列。然而，来自一个人类抗体的构架可经工程改造以包括来自不同人类抗体的CDR。“人类化”免疫球蛋白是包括人类构架区和一个或多个来自非人类(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白称为“供体”，并且提供构架的人类免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施例中，所有CDR都来自人类化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区未必存在，但如果其存在，那么其必须与人类免疫球蛋白恒定区大体上一致，即至少约85至90％，如约95％或更加一致。因此，人类化免疫球蛋白的所有部分(除外可能CDR)与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分大体上一致。“人类化抗体”是包含人类化轻链和人类化重链免疫球蛋白的抗体。人类化抗体与提供CDR的供体抗体结合于相同抗原。人类化免疫球蛋白或抗体的受体架构可具有由供体构架获得的有限数目的氨基酸取代。人类化或其它mAb可具有其他保守性氨基酸取代，其基本上不影响抗原结合或其它免疫球蛋白功能。人类化免疫球蛋白可借助于遗传工程改造构筑(参见例如美国专利案第5,585,089号)。
结合亲和力：抗体针对抗原的亲和力。在一个实施例中，亲和力是通过由Frankel等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》,16:101-106,1979描述的史卡查方法(Scatchardmethod)的改进形式计算。在另一实施例中，结合亲和力是通过抗原/抗体解离率测量。在另一实施例中，高结合亲和力是通过竞争放射免疫分析测量。在另一实施例中，结合亲和力是通过ELISA测量。以高亲和力“特异性结合”抗原决定基(如人类EphA4和/或小鼠EphA4的抗原决定基)并且不显著结合其它不相关抗原决定基的抗体。
双特异性抗体：由两个不同的抗原结合部分组成并且因此结合于两个不同的抗原决定基的重组型分子。双特异性抗体包括两个抗原结合部分的以化学或遗传方式连接的分子。抗原结合部分可使用连接子连接。抗原结合部分可以是单克隆抗体、抗原结合片段(例如Fab、scFv)、eAd或其组合。双特异性抗体可包括一个或多个恒定结构域，但未必包括恒定域。
化学治疗剂：任何在治疗由异常细胞生长表征的疾病中具有治疗有效性的化学试剂。这类疾病包括肿瘤、赘瘤和癌症以及由增生性生长表征的疾病，如牛皮癣。在一个实施例中，化学治疗剂是用于治疗淋巴瘤、白血病或另一种肿瘤的药剂。在一个实施例中，化学治疗剂是放射性化合物。所属领域的技术人员可容易地鉴别可使用的化学治疗剂(参见例如Slapak和Kufe,《癌症疗法原理(Principles of Cancer Therapy)》,《哈里森内科原理(Harrison's Principles of Internal Medicine)》中的第86章,第14版；Perry等人,《化学疗法(Chemotherapy)》,第2版《阿贝洛夫临床肿瘤学(Abeloff,Clinical Oncology)》中的第17章,2000 Churchill Livingstone,Inc；Baltzer,L.,Berkery,R.(编):《肿瘤学袖珍化疗指南(Oncology Pocket Guide to Chemotherapy)》,第2版St.Louis,Mosby-YearBook,1995；Fischer,D.S.,Knobf,M.F.,Durivage,H.J.(编):《癌症化学疗法手册(TheCancer Chemotherapy Handbook)》,第4版St.Louis,Mosby-Year Book,1993)。组合化学疗法是投与超过一种药剂以治疗癌症。一个实例是与放射性或化合物组合使用的可结合EphA4的抗体或其片段的投药。
保守性变异体：“保守性”氨基酸取代是不会显著影响或降低蛋白质(如特异性结合EphA4的抗体)的亲和力的取代。举例来说，特异性结合EphA4的人类抗体可包括至多约1个、至多约2个、至多约5个和至多约10个或至多约15个保守性取代并且特异性结合EphA4多肽。术语保守性变异还包括使用经取代的氨基酸代替未经取代的亲本氨基酸，限制条件是抗体特异性结合EphA4。非保守性取代是可降低活性或与EphA4的结合的取代。
提供功能性类似氨基酸的保守性氨基酸取代表是所属领域的技术人员众所周知的。以下六个组是彼此视为保守性取代的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
接触：直接物理性缔合的位置；包括固体和液体形式。
细胞毒性：分子对目标细胞的毒性，如免疫毒素(相对于生物体的其余细胞)。在一个实施例中，相比之下，术语“毒性”指免疫毒素对除免疫毒素的靶向部分所欲靶向的细胞以外的细胞的毒性，并且术语“动物毒性”指通过免疫毒素对除免疫毒素所欲靶向的细胞以外的细胞的毒性而产生免疫毒素对动物的毒性。
简并变异体：在本发明中，“简并变异体”指编码多肽的聚核苷酸，如n个EphA4多肽或结合EphA4的抗体，其包括由于基因编码而简并的序列。存在20种天然氨基酸，其中大部分由超过一个密码子指定。因此，包括所有简并核苷酸序列，只要多肽(如EphA4多肽)的氨基酸序列或结合EphA4的抗体(其由核苷酸序列编码)未改变即可。
诊断：鉴别病理性病状(如(但不限于)癌症或ALS)的存在或性质。诊断方法在其敏感性和特异性方面不同。诊断分析的“敏感性”是测试呈阳性的患病个体的百分比(真实阳性百分比)。诊断分析的“特异性”是一减去假阳性率，其中假阳性率定义为测试呈阳性的未患病个体的比例。尽管特定诊断方法可能并不提供病状的决定性诊断，但在所述方法提供辅助诊断的阳性指示时是合格的。“预后”是病理性病状(如癌症或ALS)的发展(例如严重性)机率。
效应分子：嵌合分子中意图对嵌合分子所靶向的细胞具有所需作用的部分。效应分子也称为效应部分(EM)、治疗剂或诊断剂，或类似术语。
治疗剂包括如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂质、碳水化合物或重组型病毒等化合物。核酸治疗和诊断部分包括反义核酸、用于与单螺旋或双螺旋DNA共价交联的衍生寡核苷酸以及形成三链体的寡核苷酸。或者，连接到靶向部分(如抗EphA4抗体)的分子可以是密封***，如脂质体或微胞(其含有治疗性组合物，如药物)、核酸(如反义核酸)或另一治疗性部分，其可避免直接暴露于循环***。制备连接到抗体的脂质体的手段是所属领域的技术人员众所周知的(参见例如美国专利案第4,957,735号；和Connor等人,《药物疗法(Pharm.Ther.)》28:341-365,1985)。诊断剂或部分包括放射性同位素和其它可检测标记。适用于这类目的的可检测标记页数所属领域中众所周知的，并且包括放射性同位素，如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I、荧光团、化学发光剂和酶。
产生红血球生成素的肝细胞(Eph)A4：在大脑、心脏、肺、肌肉、肾脏、胎盘、胰腺(Fox等人,《癌基因(Oncogene)》10:897,1995)和黑色素细胞(Easty等人,《国际癌症杂志(Int.J.Cancer)》71:1061,1997)中表达的受体酪氨酸激酶。EphA4结合细胞膜锚定配位体(艾普瑞林A1、A2、A3、A4、A5、B2和B3；Pasquale,《细胞生物学当前观点(Curr.Opin.in CellBiology)》,1997,9:608；以及配位体B61、AL1/RAGS、LERK4、Htk-L和Elk-L3；Martone等人,《大脑研究(Brain Research)》771:238,1997)，并且配位体结合引起酪氨酸残基上的EphA4自体磷酸化(Ellis等人,癌基因12:1727,1996)。EphA4酪氨酸磷酸化产生具有Src同源性2/3(SH2/SH3)结构域的蛋白质的结合区，如细胞质酪氨酸激酶p59fyn(Ellis等人,见上文；Cheng等人,《细胞激素和生长因子综述(Cytokine and Growth Factor Reviews)》13:75,2002)。人类和小鼠EpHA4的例示性氨基酸序列提供于下文中。
经工程改造的抗体结构域(eAd)：也称为“单一结构域抗体”，这种分子是单一单体可变抗体结构域。可变区包括提供结合特异性的互补决定区(CDR)，和构架区，其是可变域中除CDR以外的部分。通常，eAd具有仅12-15kDa的分子量，并且因此小于具有两个重链和两个轻链(约150-160kDa)和制造片段(约50kDa)的mAb。在一个实施例中，eAd包括可变重链结构域，其具有H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3且特异性结合目标抗原，但并不包括轻链CDR或轻链可变域。eAd在微生物细胞培养物中大量表达，展示有利的生物物理特性，包括可溶性和温度稳定性，并且良好适合于通过活体外选择***(如噬菌体呈现)进行选择和亲和力成熟。eAd作为单体也具有生物活性，并且归因于其小尺寸和固有稳定性，可格式化成较大分子以产生具有延长的血清半衰期或其它药理学活性的药物。eAd可包括任何适合的构架区并且可以是人类或人类化的。
抗原决定基：抗原决定簇。这些是分子上具有抗原性(即引发特异性免疫反应)的具体化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的具体抗原决定基，如人类EphA4和/或小鼠EphA4。
表达：将核酸转译到蛋白质中。蛋白质可被表达并且保持在细胞内，变成细胞表面膜的组分，或分泌到细胞外基质或培养基中。
表达盒：以重组或合成方式产生的核酸构筑体，其具有允许具体多核苷酸序列转录到宿主细胞中的一系列指定核酸元素。表达盒可以是质体、病毒基因组或核酸片段的一部分。通常，表达盒包括待转录的聚核苷酸(例如编码抗EphA4抗体或其结合片段的聚核苷酸)，其可操作地连接于启动子。
表达控制序列：调节其可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和(视需要)转译时，表达控制序列可操作地连接于核酸序列。因此，表达控制序列可包括适合的启动子、强化子、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子(即ATG)(剪接内含子的信号，维持所述基因的正确阅读框架以允许mRNA的适当转译)和终止密码子。术语“控制序列”意图至少包括可影响表达的组分，并且也可以包括其它组分，其存在有利于例如前导序列和融合搭配物序列。表达控制序列可包括启动子。
启动子是足以直接转录的最小序列。还包括足以显现对于细胞类型特异性、组织特异性而言可控制或可由外部信号或试剂诱导的启动子依赖性基因表达，启动子元素；这类元素可位于基因的5'或3'区域。包括组成型和诱导型启动子(参见例如Bitter等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》153:516-544,1987)。举例来说，当在细菌***中选殖时，可使用诱导型启动子，如噬菌体λ、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子)的pL等。在一个实施例中，当在哺乳动物细胞***中选殖时，可使用来源于哺乳动物细胞的基因体(如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(如反转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。也可以使用由重组型DNA或合成技术产生的启动子以实现核酸序列的转录。
构架区：插在CDR之间的氨基酸序列。构架区包括可变轻链和可变重链构架区。构架区用于保持CDR处于适用于抗原结合的定向。
宿主细胞：其中可繁殖载体表达其DNA的细胞。细胞可以是原核或真核。所述术语还包括个体宿主细胞的任何后代。应理解，所有后代可能不与亲本细胞一致，因为在复制期间可能存在突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括这类后代。
免疫反应：免疫***的细胞(如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的反应。在一个实施例中，反应对具体抗原具有特异性(“抗原特异性反应”)。在一个实施例中，免疫反应是T细胞反应，如CD4+反应或CD8+反应。在另一实施例中，反应是B细胞反应，并且引起产生特异性抗体。
免疫结合物：效应分子与抗体、其抗原结合片段或双特异性抗体的共价连接。效应分子可以是可检测标记或免疫毒素。毒素的特异性、非限制性实例包括(但不限于)相思子毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)(PE，如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或其经修饰的毒素，或其它直接或间接抑制细胞生长或杀死细胞的毒性试剂。举例来说，PE和DT是通常通过肝脏毒性引起死亡的高毒性化合物。然而，PE和DT可通过移除毒素的原生靶向组分(如PE的结构域Ia和DT的B链)并且用不同的靶向部分(如抗体)置换而修饰成适用作免疫毒素的形式。“嵌合分子”是与效应分子结合(偶合)的靶向部分，如配位体或抗体。术语“结合”或“连接”指使两个多肽进入一个相邻多肽分子。在一个实施例中，抗体接合到效应分子。在另一实施例中，接合到效应分子的抗体进一步使脂质或其它分子接合到蛋白质或肽以增加其在身体中的半衰期。连接可以通过化学或重组手段实现。在一个实施例中，连接是化学方式，其中抗体部分与效应分子之间的反应产生在两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。可任选地在抗体与效应分子之间包括肽连接子(短肽序列)。因为免疫结合物最初由具有单独功能的两个分子(如抗体和效应分子)产生，其有时也称为“嵌合分子”。因此，如本文中所使用的术语“嵌合分子”指结合(偶合)到效应分子的靶向部分，如配位体或抗体。免疫结合物是非天然存在的分子。
免疫原性肽：包含等位基因特异性主结构或其它序列的肽，如N端重复，使得所述肽将结合MHC分子并且诱导细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应，或针对衍生免疫原性肽的抗原的B细胞反应(例如抗体产生)。
在一个实施例中，使用序列主结构或所属领域中已知的其它方法(如神经网或多项式测定)鉴别免疫原性肽。通常，使用算法测定肽的“结合临界值”，以选择具有较高的以某一亲和力结合的概率并且将是免疫原性的得分的肽。算法是基于对具***置的具体氨基酸的MHC结合的作用、对具***置的具体氨基酸的抗体结合的作用或对含有主结构的肽中具体取代的结合的作用。在免疫原性肽的情形中，“保守残基”是呈现比由肽中的具***置处的随机分布所预期显著更高的频率的残基。在一个实施例中，保守残基是其中MHC结构可提供与免疫原性肽的接触点的残基。在一个特定非限制性实例中，免疫原性多肽包括人类EphA4或其片段的一个区域，其中多肽在表达全长人类EphA4多肽的宿主细胞的细胞表面上表达。
免疫反应性条件：包括对允许产生针对具体抗原决定基的抗体以按比结合于基本上所有其它抗原决定基的可检测地更大的程度(和/或基本上排除)结合于所述抗原决定基的条件的参考。免疫反应性条件取决于抗体结合反应的格式并且通常是免疫分析方案中使用的条件或活体内遇到的条件。关于免疫分析格式和条件的说明，参见Harlow和Lane,见上文。所述方法中使用的免疫反应性条件是“生理条件”，其包括对通常在活的哺乳动物或哺乳动物细胞内部遇到的条件(如温度、容积渗透浓度、pH值)的参考。尽管认识到一些器官遭遇极端条件，但生物体内和细胞内环境通常处于约pH 7(即，pH 6.0到pH 8.0，更通常pH6.5到7.5)，含有水作为主要溶剂，并且存在高于0℃并且低于50℃的温度。容积渗透浓度处于支持细胞存活和增殖的范围内。
抑制或治疗疾病：抑制例如具有疾病(如肿瘤(例如癌症，如乳癌))或运动神经元病(如ALS)风险的个体中疾病或病状的完全发展。“治疗”指治疗性干预，其在疾病或病理学病状开始发展之后改善其病征或症状。如本文中所使用，对于疾病或病理学病状，术语“改善”指任何可观察的有利治疗作用。有利作用可例如通过敏感个体中疾病的临床症状的延迟发作、疾病的一些或所有临床症状的严重度降低、更短的疾病进程、癌转移数目降低、个体的整体健康或幸福的改良或所属领域中众所周知的对具体疾病具有特异性的其它参数证明。“预防性”治疗是出于降低产生病变的风险的目的而投与未呈现疾病病征或仅呈现早期病征的个体的治疗。
分离：“经分离的”生物组分(如核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞器)已大体上从天然产生所述组分的环境(如细胞)中的其它生物组分(即，其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)分离或纯化。“经分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。所述术语还涵盖由宿主细胞以及化学合成的核酸中的重组型表达产生的核酸和蛋白质。在一些实施例中，生物组分是至少95％、96％、97％、98％或99％纯的。
标记：一种可检测化合物或组合物，其与另一分子(如抗体或蛋白质)直接或间接结合以促进所述分子的检测。标记物的特异性、非限制性实例包括荧光标签、酶促连接和放射性同位素。在一个实例中，“经标记的抗体”指另一分子并入抗体中。举例来说，标记是可检测标记物，如放射性标记氨基酸并入或连接到可由经标记的抗生物素蛋白(例如含有可通过光学或色度方法检测到的荧光标记或酶促活性的抗生蛋白链菌素)检测到的生物素基部分的多肽。所属领域中已知并且可使用多种标记多肽和糖蛋白的方法。用于多肽的标记物的实例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I)、荧光标记物(如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明(rhodamine)、镧系磷光体)、酶促标记物(如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基、由第二报导子识别的预定多肽抗原决定基(如白胺酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、抗原决定基标签)或磁性试剂，如钆螯合剂。在一些实施例中，标记物由具有多种长度的间隔基臂连接以降低潜在位阻。
连接子：在一些情况下，连接子是肽，如抗体结合片段(如Fv片段)内，其用于使可变重链间接结合到可变轻链。“连接子”还可以指用于使靶向部分(如抗体)连接到效应分子(如细胞毒素或可检测标记)的肽。
术语“结合”、“接合”、“粘合”或“连接”指使两个多肽进入一个相邻多肽分子，或使放射性核种或其它分子共价附接到多肽，如scFv。在特定情形中，所述术语包括对使配位体(如抗体部分)接合到效应分子的参考。连接可以通过化学或重组手段实现。“化学手段”指抗体部分与效应分子之间的反应，使得在两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
哺乳动物：这一术语包括人类和非人类哺乳动物。类似地，术语“个体”包括人类和家畜个体。
赘瘤形成、恶性疾病、癌症或肿瘤：肿瘤是由过度的细胞***引起的组织或细胞的异常生长。赘生性生长可产生肿瘤。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，其可以肿瘤的数目、体积或重量形式测量。不会转移的肿瘤称为“良性”。侵袭周围组织和/或可转移的肿瘤称为“恶性”。血液学肿瘤的实例包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性骨髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和骨髓母细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin'sdisease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链疾病、骨髓发育不良综合症、毛状细胞白血病和骨髓异常增生。
实体肿瘤(如肉瘤和癌瘤)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌瘤、淋巴恶性疾病、胰脏癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、***癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、髓质甲状腺癌、***状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌瘤、***状癌、***状腺癌、髓性癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆液管癌、绒膜癌、威耳姆士肿瘤(Wilms'tumor)、子***、睾丸肿瘤、***瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(如神经胶质瘤、星形细胞瘤、神经管胚细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。在若干实例中，肿瘤是乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。
核酸：由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其相关天然存在的结构变异体和合成性非天然存在的类似物)组成的聚合物，其相关天然存在的结构变异体和合成性非天然存在的类似物。因此，所述术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸和其之间的连接包括非天然存在的合成类似物，如例如并且不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。这类聚核苷酸可例如使用自动DNA合成器合成。术语“寡核苷酸”通常指短聚核苷酸，通常不超过约50个核苷酸。应理解，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，这还包括其中“U”代替“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。
本文中使用常规注解描述核苷酸序列：单股核苷酸序列的左侧末端是5'端；双股核苷酸序列的左侧方向称为5'方向。核苷酸添加到初生RNA转录物的5'到3'方向称为转录方向。与mRNA具有相同序列的DNA股称为“编码股”；DNA股上具有与由所述DNA转录的mRNA相同的序列并且位于RNA转录物的5'到5'端的序列称为“上游序列”；DNA股上具有与RNA相同的序列并且是编码RNA转录物的3'到3'端的序列称为“下游序列”。
“cDNA”指与mRNA互补或一致的呈单股或双股形式的DNA。
“编码”指聚核苷酸中核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)的特异性序列的固有性质，其充当生物过程中具有已确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或已确定的氨基酸序列和由其所得生物特性的其它聚合物和大分子的合成模板。因此，如果由基因产生的mRNA的转录与翻译在细胞或其它生物***中产生蛋白质，那么所述基因编码蛋白质。基因或cDNA的编码股(其核苷酸序列与mRNA序列一致并且通常在序列表中提供)和非编码股(用作转录模板)可称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其它产物。除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
“重组型核酸”指具有非天然接合在一起的核苷酸序列的核酸。这包括核酸载体，其包含可用于转型适合的宿主细胞的扩增或组装核酸。包含重组型核酸的宿主细胞称为“重组型宿主细胞”。接着基因在重组型宿主细胞中表达以产生如“重组型多肽”。重组型核酸也可以发挥至编码功能(如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。
如果其中序列是第一序列的聚核苷酸与其中序列是第二序列的聚核苷酸特异性杂交，那么第一序列相对于第二序列是“反义”的。
用于描述两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“选自”、“对比窗口”、“一致性”、“序列一致性百分比”、“大体上一致”、“互补”和“大体上互补”。
对于核酸序列的序列对比，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机内，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。使用默认程序参数。用于比较的序列比对方法在所属领域中是众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith和Waterman,《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482,1981的局部同源算法、Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》48:443,1970的同源性比对演算法、搜索Pearson和Lipman,《美国国家科学院学报(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA)》85:2444,1988的类似性方法、这些算法的计算机化实施方案(威斯康星遗传软件包(Wisconsin Genetics Software Package),遗传学计算机组(Genetics Computer Group),575Science Dr.,Madison,WI)或手动比对和目视检验(参见例如最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等人编,1995,增刊))来进行。
适用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用Feng和Doolittle,《分子演进学杂志(J.Mol.Evol.)》35:351-360,1987的进行性比对方法的简化形式。所使用的方法与由Higgins和Sharp,加拿大BIOS协会(CABIOS)5:151-153,1989描述的方法类似。使用PILEUP，使用以下参数比较参考序列与其它测试序列以测定序列一致性关系百分比：默认间隙权数(3.00)、默认间隙长度权数(0.10)和加权末端间隙。PILEUP可从GCG序列分析软件包(如版本7.0(Devereaux等人,核酸研究(Nuc.Acids Res.)12:387-395,1984)获得。
适用于测定序列一致性百分比和序列类似性的算法的另一实例是BLAST和BLAST2.0算法，其描述于Altschul等人,《分子生物学杂志》215:403-410,1990和Altschul等人,核酸研究25:3389-3402,1977中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。BLASTN程式(对于核苷酸序列)使用字长值(W)11、比对值(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两个股的对比作为默认。BLASTP程式(对于氨基酸序列)使用字长值(W)3和期望值(E)10以及BLOSUM62计分矩阵作为默认(参见Henikoff和Henikoff，《美国国家科学院院刊》89:10915,1989)。
可操作地连接：当第一核酸序列置放成与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。举例来说，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子(如CMV启动子)可操作地连接于编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是相邻的，并且必要时在相同阅读框架中接合两个蛋白质编码区。
肽：长度在3与30个氨基酸之间的氨基酸链。在一个实施例中，肽长度是约10到约25个氨基酸。在另一实施例中，肽长度是约11到约20个氨基酸。在另一实施例中，肽长度是约9到12个氨基酸。
“人类EphA4肽”是来自人类EphA4蛋白质的一系列相邻氨基酸残基。“小鼠EphA4肽”是来自小鼠EphA4蛋白质的一系列相邻氨基酸残基。
在一个实例中，关于包含人类EphA4肽的免疫原性组合物，所述术语进一步指这些肽的变异形式，其中存在氨基酸的保守性取代，只要所述变异形式不改变超过约20％(如不超过约1％、约5％或约10％)的肽的能力以产生B细胞反应或(当结合于主要组织相容性复合体I类分子时)活化针对表达野生型人类EphA4蛋白质的细胞的细胞毒性T淋巴细胞即可。使用合成肽和CTL细胞毒性分析的CTL的诱导教示于例如美国专利案第5,662,907号中。
肽修饰：多肽(如EphA4多肽)包括本文中所描述的肽的合成实施例。此外，本文所描述的方法中可使用这些蛋白质的类似物(非肽有机分子)、衍生物(由所披露的肽序列作为起始而获得的化学功能化肽分子)和变异体(同系物)。每个多肽包含氨基酸序列，其可以是L-和/或D-氨基酸、天然存在和其它氨基酸序列。
肽可通过多种化学技术修饰以产生具有与未经修饰的肽基本上相同的活性并且任选地具有其它所需特性的衍生物。举例来说，蛋白质的羧酸基(无论羧基端或侧链)可以药学上可接受的阳离子的盐或酯化的形式提供以形成C1-C16酯，或转化成式NR1R2的酰胺，其中R1和R2各自独立地是H或C1-C16烷基，或组合以形成杂环，如5或6元环。肽的氨基(无论氨基端或侧链)可呈药学上可接受的酸加成盐形式，如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸和其它有机盐，或可修饰成C1-C16烷基或二烷基氨基或进一步转化成酰胺。
肽侧链的羟基可使用公认的技术转化成C1-C16烷氧基或C1-C16酯。肽侧链的苯基和酚环可经一个或多个卤素原子(如氟、氯、溴或碘)或C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯或这类羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基可扩展成同源C2-C4烯烃。硫醇可由许多公认保护基中的任一种保护，如乙酰胺基团。所属领域的技术人员也将认识到用于将环状结构引入EphA4肽以选择和提供可产生增强的稳定性的结构的构形限定。
设想肽模拟和有机模拟实施例，由此这类肽模拟物和有机模拟物的化学成分的三维配置模拟肽主链和组分氨基酸侧链的三维配置，引起EPHA4多肽的这类肽模拟物和有机模拟物具有可测量或增强的产生免疫反应的能力。对于计算机模型化应用，药效团是生物活性的结构要求的理想化、三维定义。肽模拟物和有机模拟物可经设计以拟合每个药效团与当前计算机模型化软体(使用计算机辅助药物设计或CADD)。关于CADD中使用的技术的说明，参见Walters,《药物的计算机辅助模型化(Computer-Assisted Modeling of Drugs)》,Klegerman和Groves编,1993,《医药学生物技术(Pharmaceutical Biotechnology)》,Interpharm Press,Buffalo Grove,IL,第165-174页和《药理学原理(Principles ofPharmacology)》Munson(编)1995,第102章。还包括使用这类技术制备的模拟物。
药剂：在适当地投与个体或细胞时能够诱导所需治疗性或预防性作用的化合物或组合物。
药物学上可接受的载剂：使用的药物学上可接受的载剂是常规的。《雷明顿医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版,1975描述适用于本文中所披露的抗体的医药学传递的组合物和配制物。
通常，载剂的性质将取决于所使用的具体投药模式。举例来说，非经肠配制物通常包含包括医药学上和生理学上可接受的流体的可注射流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等来作为媒剂。对于固体组合物(如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规无毒性固体载剂可包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载剂以外，待投与的药物组合物可以含有微量无毒辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂以及pH值缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病指抑制疾病的完全发展。“治疗”指在疾病或病理学病状开始发展后可改善疾病或病理学病状的病征或症状的治疗性干预，如肿瘤负荷降低、癌转移的尺寸的数目降低或运动技能增加。“改善”指疾病(如肿瘤或ALS)的病征或症状的数目或严重度降低。
启动子：启动子是引导核酸的转录的核酸控制序列的阵列。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子(TATA元素)情况下。启动子还任选地包括末端强化子或抑制子元素，其可位于来自转录起始位点的多达数千个碱基对。包括组成型和诱导型启动子(参见例如Bitter等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》153:516-544,1987)。
可使用的启动子的特异性、非限制性实例包括来源于哺乳动物细胞的基因体(如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(入反转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。还可以使用由重组型DNA或合成技术产生的启动子。可将聚核苷酸***含有启动子序列的表达载体中，所述启动子序列有助于宿主的所***的基因序列的有效转录。表达载体通常含有复制起点、启动子以及特异性核酸序列，其允许经转型的细胞的表现型选择。
纯化：术语纯化不需要绝对纯度；相反，意为相对术语。因此，举例来说，纯化的肽制剂是其中肽或蛋白质比肽或蛋白质在细胞内的其天然环境中更加富集的制剂。在一个实施例中，制剂经纯化使得蛋白质或肽占制剂的总肽或蛋白质含量的至少50％。
本文中所披露的EphA4多肽、特异性结合EphA4的抗体、抗原结合片段和双特异性抗体可通过所属领域中已知的方法中的任一种纯化。参见例如《蛋白质纯化指导(Guide toProtein Purification)》,Deutscher编,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》185,AcademicPress,San Diego,1990；和Scopes,《蛋白质纯化：原理和实践(Protein Purification:Principles and Practice)》,Springer Verlag,New York,1982。基本上纯化表示从其它蛋白质或细胞组分纯化。基本上纯化的蛋白质是至少60％、70％、80％、90％、95％或98％纯的。因此，在一个特异性、非限制性实例中，基本上纯化的蛋白质是90％不含其它蛋白质或细胞组分。
重组型：重组型核酸是具有非天然存在的序列或具有通过序列的两个以其它方式分离的区段的人工组合而制得的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成或核酸的经分离的区段的人工操作实现，例如通过遗传工程改造技术。
重组型毒素：其中细胞靶向部分(如抗体、抗原结合片段或双特异性抗体)与毒素融合的嵌合蛋白(Pastan等人,《科学(Science)》,254:1173-1177,1991)。如果细胞靶向部分是抗体的Fv部分，那么分子称为重组型免疫毒素(Chaudhary等人,《自然(Nature)》,339:394-397,1989)。毒素部分以基因方式改变使得其不能结合于大部分正常细胞上的毒素受体。重组型免疫毒素选择性杀死由抗原结合域识别的细胞。这些重组型毒素和免疫毒素可用于例如***，例如其中表达人类EphA4的肿瘤。重组型毒素是非天然存在的。
样品(或生物样品)：含有从个体获得的基因组DNA、RNA(包括mRNA)、蛋白质或其组合的生物样品。实例包括(但不限于)末梢血液、组织、细胞、尿液、唾液、组织活检、细针穿刺物、手术样品和尸检材料。在一个实例中，样品包括HCC组织活检。
序列一致性：根据序列之间的类似性来表示氨基酸与核酸序列之间的类似性，或称为序列一致性。序列一致性经常依据一致性百分比(或相似性或同源)测量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法对准时，多肽或核酸分子的同系物或变异体将具有相对较高的序列一致性程度。
用于比较的序列比对方法在所属领域中是众所周知的。多种程序和比对算法描述于以下文献中：Smith和Waterman,《应用数学进展》2:482,1981；Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志》48:443,1970；Pearson和Lipman,《美国国家科学院院刊》,85:2444,1988；Higgins和Sharp,《基因(Gene)》73:237,1988；Higgins和Sharp,加拿大BIOS协会5:151,1989；Corpet等人,核酸研究16:10881,1988；以及Pearson和Lipman,《美国国家科学院院刊》,85:2444,1988。Altschul等人,自然遗传学6:119,1994呈现序列比对方法和同源性计算的具体考虑因素。
NCBI基本查询工具(NCBI Basic Local Alignment Search Tool；BLAST)(Altschul等人,《分子生物学杂志》215:403,1990)可从若干来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和因特网，以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。如何使用这种程序测定序列一致性的说明课在因特网上的NCBI网站获得。
通过使用NCBI Blast 2.0(空隙blastp设定成默认参数)与抗体的氨基酸序列的全长比对，特异性结合EphA4多肽的抗体的VL或VH的同系物和变异体通常由拥有至少约75％，例如至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性计数表征。对于超过约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，使用设定成默认参数的默认BLOSUM62矩阵，使用Blast2序列功能(间隙存在成本是11，并且每个残基间隙成本是1)。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用Blast 2序列功能，使用设定成默认参数的PAM30矩阵(开放间隙9，延伸间隙1罚分)进行比对。当通过这种方法评估时，与参考序列具有甚至更大类似性的蛋白质将展示增加的百分比标识，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性。当小于全部序列比较序列一致性时，同系物和变异体在10-20个氨基酸的短窗口内通常将具有至少80％序列一致性，并且视其与参考序列的类似性可具有至少85％或至少90％或95％的序列标识。用于测定这类短窗口内的序列一致性的方法可在因特网上的NCBI网站获得。所属领域的技术人员将了解，仅出于指导目的而提供这些序列一致性范围；完全有可能获得处于所提供的范围以外的强显著同系物。
特异性结合剂：大体上仅结合于既定目标的试剂。因此，EphA4特异性结合剂是大体上结合于EphA4多肽(如人类和/或小鼠EphA4)的试剂。在一个实施例中，特异性结合剂是特异性结合EphA4多肽的人类单克隆抗体、其抗原结合片段，或双特异性抗体。
关于抗原(如EphA4)，术语“特异性结合”是指抗体或其它配位体(整体或部分)与携有所述抗原的细胞或组织的优先偶联并且不与不含所述抗原的细胞或组织(如表达不同EphA的细胞)偶联。当然，认识到分子与非目标细胞或组织之间可存在某种程度的非特异性相互相用。然而，特异性结合可由通过抗原的特异性识别来介导而区分。尽管选择性反应性抗体结合抗原，但其可能以低亲和力结合。另一方面，特异性结合引起抗体(或其它配位体)与携有抗原的细胞之间的比结合抗体(或其它配位体)与不含所述抗原的细胞之间的更强的偶联。与不含多肽的细胞或组织相比，特异性结合通常引起结合抗体或其它配位体(每单位时间)与携有EphA4多肽的细胞或组织的量增加超过2倍，如超过5倍、超过10倍或超过100倍。在这类条件下特异性结合于抗体需要针对其对具体蛋白质的特异性选择的抗体。多种免疫分析格式适于选择与具体蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体或其它配位体。举例来说，固相ELISA免疫分析通常用于选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的mAb。关于可用于测定特异性免疫反应性的免疫分析格式和条件的说明，参见Harlow和Lane,《抗体实验指南(Antibodies,A Laboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Publications,New York(1988)。
个体：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人类和家畜个体的类别，包括人类和非人类哺乳动物。
治疗有效量：足以在所治疗的个体中实现所需作用的特定物质的量。举例来说，这可以是抑制或抑止肿瘤生长所必需的量。在一个实施例中，治疗有效量是消除、减小尺寸或预防肿瘤转移所必需的量。当投与个体时，通常将使用可实现已证实可实现所需活体外作用的目标组织浓度(例如肿瘤中)的剂量。
毒素：对细胞具有细胞毒性的分子。毒素包括相思子毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素、沙泊宁(saporin)、局限曲菌素(restrictocin)或白树素(gelonin)或其经修饰的毒素。举例来说，PE和DT是通常通过肝脏毒性引起死亡的高毒性化合物。然而，PE和DT可通过移除毒素的原生靶向组分(如PE的结构域Ia和DT的B链)并且用不同的靶向部分(如抗体)置换而修饰成适用作免疫毒素的形式。
载体：引入宿主细胞的核酸分子，从而产生经转型的宿主细胞。载体可包括核酸序列，其允许其在宿主细胞中复制，如复制起点。载体还可以包括一个或多个可选标记基因和所属领域中已知的其它基因元素。
除非另外阐述，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。除非上下文另外明确规定，否则单数形式包含复数个指示物。除非上下文另外明确指示，否则短语“A或B”意图包括A、B以及A和B。因此，“包含A或B”意谓包括A、B或“A和B”。还应理解，关于核酸或多肽提供的所有碱基尺寸或氨基酸尺寸以及所有分子量或分子量值都是近似值，并且提供用于说明目的。虽然可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等效于本文中所描述的那些方法和材料的方法和材料，但在下文描述合适的方法和材料。本文中所提到的所有公开案、专利申请案、专利案以及其它参考文献以全文引用的方式并入本文中。所有寄存编号以引用的方式并入本文中，如同其出现在2011年9月5日的资料库中。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法以及实例仅仅是说明性的并且不打算作为限制。
具体实施方式
I.说明
本发明提供特异性结合EphA4的单克隆抗体，以及这些抗体的抗原结合片段(如单链抗体、Fab或F(ab')2、重链或轻链的可变区，即，VH或VL)、这些抗体的双特异性形式以及这些抗体/片段与一个或多个效应分子的结合物(包括呈融合蛋白形式的结合物)。此外，披露编码这些抗体、抗原结合片段、双特异性抗体和呈融合蛋白形式的结合物的核酸。在一些实施例中，披露包括这些核酸的载体，和包括这些载体的宿主细胞。在其它实施例中，医药组合物包括这些单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物、核酸和载体。这些单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体、结合物、核酸和载体可用于鉴别和治疗患有肿瘤的个体，并且还可用于鉴别和治疗患有神经退化性疾病(例如AD、PD、ALS、MS等)或情感障碍(如抑郁症)的个体。
更确切地说，本发明涵盖具有不同活性的若干种完全人类单克隆EphA4抗体。IgG1m101、m105和m119特异性识别EphA4的配位体结合域。举例来说，IgG1 m105特异性抑制EphA4与艾普瑞林-A/B的相互相用，但不干扰艾普瑞林-B与EphB2受体之间的相互相用。抗体还呈现针对EphA4配位体结合域的强结合亲和力。m101和m119IgG1以1nmol/L的EC50结合于人类和小鼠EphA4，而m105IgG1以次纳摩尔EC50结合于人类和小鼠EphA4。此外，IgG1m119通过刺激EphA4活化来充当促效抗体，而IgG1 m105充当EphA4拮抗剂，其减弱艾普瑞林-A1诱导的EphA4活化。IgG1 m105的拮抗活性使这一抗体称为用于治疗神经变性病(如AD、PD、MS或ALS)的潜在高效治疗工具。IgG1 m105不影响EphB与其配位体的结合，并且其展示针对具有不同同源配位体成员的EphA4的不同拮抗活性。抗体显示对其拮抗活性的特异性。当由Aβ刺激时，IgG1 m105结合神经元上的EphA4受体，Aβ是引起AD中突触损伤的主要试剂。据本发明人所知，这是第一种拮抗性EphA4抗体。尽管若干更早的专利文件描述多种EphA4抗体，但无一与本发明的完全人类单克隆抗体类似。举例来说，US 7,604,799披露EphA4促效抗体。然而，这些更早的抗体与本发明的抗体不同。不仅在于其具有不同的CDR氨基酸序列，这些更早的抗体还不具有高亲和力结合EphA4和本发明的抗体的特异性。类似地，未报导US 8,003,098和20090191211A1中所披露的抗体具有拮抗性活性。
II.单克隆抗体和抗原结合片段
本发明披露新型抗EphA4抗体。本文中披露抗体和抗原结合片段，其特异性结合EphA4，如人类和小鼠EphA4。在一些实施例中，抗体以0.1×10-8M、至少约0.3×10-8M、至少约0.5×10-8M、至少约0.75×10-8M、至少约1.0×10-8M、至少约1.3×10-8M、至少约1.5×10- 8M或至少约2.0×10-8M的结合亲和力结合EphA4。
在一个实施例中，人类EphA4具有如以下阐述的氨基酸序列：
还参见GENEBANK寄存编号AAH26327.1，如可在2005年7月30日获得，其以引用的方式并入本文中。
在其它实施例中，小鼠EphA4具有如以下阐述的氨基酸序列：
还参见GENEBANK寄存编号AAH04782，2003年10月3日，其以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括m101的重链CDR中的一个或多个。m101的重链的氨基酸序列是：
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATAPMVCSSTSCYLRGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3，其中CDR由粗体和下划线表示)。
因此，在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115中的一个或多个。在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115。在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列。在所有这些实施例中，抗体特异性结合EphA4。
在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括m105的重链CDR中的一个或多个。m105的重链的氨基酸序列是：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARELLYCSSTSCGTHGFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:4，其中CDR由粗体和下划线表示)
因此，在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115中的一个或多个。在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、SEQ IDNO:4的氨基酸51-58和如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115。在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列。在所有这些实施例中，抗体特异性结合EphA4。
在其它实施例中，重链可变域抗体或抗原结合片段包括m119的重链CDR中的一个或多个。m119的重链的氨基酸序列是：
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:5，其中CDR由粗体和下划线表示)
因此，在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一个或多个。在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括实施例，抗体的重链包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一个或多个。在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的重链可变域包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列。在所有这些实施例中，抗体特异性结合EphA4。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的轻链可变域包括m101的轻链CDR中的一个或多个。m101的轻链的氨基酸序列是：
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPITFGQGTRLEIK(SEQ ID NO:6，其中CDR由粗体和下划线表示)
因此，抗体或抗原结合片段的轻链可变域可包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一个或多个。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的轻链可变域包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100。在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的轻链可变域包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列。在所有这些实施例中，抗体特异性结合EphA4。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的轻链可变域包括m105的轻链CDR中的一个或多个。m105的轻链的氨基酸序列是：
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLAFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:7，其中CDR由粗体和下划线表示)
因此，抗体或抗原结合片段的轻链可变域可包括如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一个或多个。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的轻链可变域包括如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100。在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的轻链可变域包括如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列中阐述的氨基酸序列。在所有这些实施例中，抗体特异性结合EphA4。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的轻链可变域包括m119的轻链CDR中的一个或多个。m105的轻链的氨基酸序列是：
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:8，其中CDR由粗体和下划线表示)
因此，抗体或抗原结合片段的轻链可变域可包括如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100中的一个或多个。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的轻链可变域包括如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100。在其它实施例中，抗体或抗原结合片段的轻链可变域包括如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列。在所有这些实施例中，抗体特异性结合EphA4。
本文中所披露的单克隆抗体、抗原结合片段和双特异性抗体可以是完全人类的。完全人类单克隆抗体包括人类构架区。重链构架区可以是SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5(这些序列包括CDR序列以及构架序列)中的构架区中的一个或多个。然而，重链构架区可以来自另一来源。轻链构架区可以是SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中阐述的构架区中的一个或多个。然而，轻链构架区可以来自另一来源。在一些实施例中，在以治疗方式使用时，使用人类构架区可降低对抗体的反应。还提供所披露的抗体的嵌合形式，其中重链构架区和/或轻链构架区中的一个或多个来自另一物种，如小鼠、大鼠或兔抗体。在一些实施例中，选择具有低免疫原性的构架区。
本文中所披露的重链可变域中的任一个可以与本文中所披露的任何轻链可变域区域组合，限制条件是单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合EphA4。在一些实施例中，单克隆抗体或抗原结合片段包括以下中的一个：
a)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；
b)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括SEQ ID NO:7的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或
c)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100。
在其它实施例中，单克隆抗体或抗原结合片段包括以下中的一个：
a)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、SEQ IDNO:6的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；
b)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、SEQ IDNO:7的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或
c)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和轻链可变域，其包括SEQ ID NO:8的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100。
在一些实施例中，单克隆抗体或抗原结合片段包括以下中的一个：
a)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列；
b)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列；或
c)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列。
本文中所披露的单克隆抗体可以具有任何同型。单克隆抗体可以是例如IgM或IgG抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。根据众所周知的程序，可用另一种抗体替换特异性结合EphA4的抗体类别(例如IgG可换成IgM)。类别变换也可用于将一种IgG子类别转换成另一种，如从IgG1到IgG2。
本发明涵盖抗体片段，如Fab、F(ab')2和Fv，其包括重链和轻链可变区并且能够结合EphA4上的抗原决定基。这些抗体片段保留与抗原选择性结合的能力。双特异性抗体中可包括抗原结合片段。这些抗原结合片段包括：
(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其可通过用番木瓜酶消化完全抗体以产生完整轻链和一个重链的一部分来产生；
(2)Fab'，可通过用胃蛋白酶处理完全抗体，接着还原以产生完整轻链和重链的一部分而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab'片段；
(3)(Fab')2，可通过用胃蛋白酶处理完全抗体且无后续还原而获得的抗体的片段；F(ab')2是由两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体；
(4)Fv，含有表达为两个链的轻链的可变区和重链的可变区的经基因工程改造的片段；和
(5)单链抗体(如scFv)，定义为含有轻链的可变区、重链的可变区(由适合的多肽连接子连接)的经基因工程改造的分子，如基因融合单链分子。
(6)单链抗体的二聚体(scFV2)，定义为scFV的二聚体。其been称为“微型抗体”。
制造这些片段的方法是所属领域中已知的(参见例如Harlow和Lane,《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork,1988)。在若干实例中，抗体中所包括的可变区是m610.27的可变区。在一组实施例中，抗体具有VH CDRsm610.27，或这些CDR的组合，如上文所讨论。
在另一组实施例中，抗体是Fv抗体，其通常是约25kDa并且含有完全抗原结合位点，其中每个重链和每个轻链具有三个CDR。为了产生这些抗体，VH和VL可由宿主细胞中两个个别核酸构筑体表达。如果非连续地表达VH和VL，那么Fv抗体的链通常由非共价相互作用保持在一起。然而，这些链倾向于在稀释时分解，因此已研发方法以使链通过戊二醛、分子间二硫键或肽连接子交联。因此，在一个实例中，Fv可以是二硫键稳定化Fv(dsFv)，其中重链可变区和轻链可变区通过二硫键化学连接。
在另一实例中，Fv片段包含由肽连接子连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白质(scFv)是通过建构包含编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备。将结构基因***表达载体中，所述表达载体随后被引入如大肠杆菌的宿主细胞中。重组型宿主细胞合成单个多肽链，其中连接肽桥接两个V域。用于产生scFv的方法是所属领域中已知的(参见Whitlow等人,《方法：酶学方法手册(Methods:a Companion to Methods inEnzymology)》,第2卷,第97页,1991；Bird等人,科学242:423,1988；美国专利案第4,946,778号；Pack等人,《生物技术(Bio/Technology)》11:1271,1993；以及Sandhu,见上文)。还涵盖单链抗体的二聚体(scFV2)。
抗体片段可通过抗体的蛋白水解或在编码片段的DNA的大肠杆菌中的表达来制备。抗体片段可以通过以常规方法，通过完全抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得。举例来说，抗体片段可通过用胃蛋白酶进行抗体的酶促裂解以提供5S片段(表示为F(ab')2)来产生。可以使用巯基还原剂，以及任选地由二硫键裂解产生的巯基的保护基团来进一步裂解这一片段以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行的酶促裂解直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段(参见美国专利案第4,036,945号和美国专利案第4,331,647号，以及其中所含的参考文献；Nisonhoff等人,《生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》89:230,1960；Porter,《生物化学杂志(Biochem.J.)》73:119,1959；Edelman等人,酶学方法,第1卷,第422页,Academic Press,1967；以及Coligan等人,第2.8.1-2.8.10和2.10.1-2.10.4章)。
其它裂解抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步裂解片段的方法或其它酶、化学或遗传技术也可使用，只要所述片段结合到被完整抗体识别的抗原即可。
所属领域的技术人员将认识到可产生抗体的保守性变异体。抗体片段(如dsFv片段或scFv片段)中使用的这类保守性变异体将保留对于VH和VL区域之间的正确折叠和稳定化来说所必需的关键氨基酸残基，并且将保留残基的电荷特征以保留分子的低pI和低毒性。可在VH和VL区中进行氨基酸取代(如至多一个、至多两个、至多三个、至多四个或至多五个氨基酸取代)以增加产率。提供功能性类似氨基酸的保守性氨基酸取代表是所属领域的技术人员众所周知的(参见上文)。因此，所属领域的技术人员可容易评论上文展示的序列、鉴别保守性取代以及使用众所周知的分子技术产生保守性变异体。
本文中还提供双特异性抗体。一种衍生抗体是通过使两个(或更多个)不同抗体、抗原结合片段和/或经工程改造的抗体结构域eAd交联以产生双特异性抗体来产生。适合的交联剂包括异型双功能性、具有由适合的间隔基间隔的两个明显反应性基团(如间顺丁烯二酰亚胺苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯)或同型双功能性(如辛二酸二丁二酰亚氨酯)交联剂。这类连接子可从Pierce Chemical Company,Rockford,Ill获得。因此，两个所披露的EphA抗体或其抗原结合片段可组合以形成双特异性抗体。所披露的抗体和抗原结合片段还可以与eAd组合以产生双特异性抗体。
本文中提供所披露的单克隆抗体、抗原结合片段和双特异性抗体的结合物。多肽通常含有多个官能团；如羧酸(COOH)、自由胺(-NH2)或硫氢基(-SH)，其可用于与抗体上适合的官能团反应以引起效应分子的结合。或者，抗体、抗原结合片段或双特异性抗体经衍生以暴露或连接其它反应性官能团。所述衍生作用可以涉及连接许多连接分子中的任一个，如购自Pierce Chemical Company,Rockford,IL的连接分子。连接子可以是任何用于使抗体与效应分子接合的分子。连接子能够形成与抗体和效应分子的共价键。适合的连接子是所属领域的技术人员众所周知的并且包括(但不限于)直链或分支链碳连接子、杂环碳连接子或肽连接子。当单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体和效应分子是多肽时，连接子可通过其侧面基团(如通过与半胱氨酸的二硫键)与成分氨基酸接合或与末端氨基酸的α碳氨基和羧基接合。实际上，可使用类似方法形成双特异性抗体，或多价抗体，如通过使单克隆抗体或抗原结合片段连接到另一相关抗体。
本文中所披露的特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗体片段和双特异性抗体可关于与另一分子(如另一个肽或蛋白质)的连接而衍生。通常，抗体或其部分经衍生使得与EphA4的结合不受衍生作用或标记的不利影响。单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体可功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价偶联或以其它方式)到一个或多个其它分子实体，如另一抗体(例如以形成双特异性抗体)、检测剂、药剂、毒素和/或蛋白质或肽，其可介导抗体或抗体部分与另一分子(如抗生蛋白链菌素核心区或多组氨酸标签)的偶联。
共价和非共价连接手段都可以用于效应分子的连接。用于使效应分子连接到单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体的程序根据效应子的化学结构而变化。在一些情况下，当免疫结合物到达其目标位点时，需要使效应分子脱离单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体。因此，在这些情形中，免疫结合物将包含可在目标位点附近裂解的连接。连接子裂解以从单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体释放效应分子可通过目标细胞内部或目标位点附近的酶促活性或免疫结合物经历的条件来促进。鉴于已报导大量的用于连接多种放射诊断化合物、放射性治疗化合物、标记物(如酶或荧光分子)药物、毒素和其它试剂的方法，所属领域的技术人员将能够确定用于使既定试剂连接到抗体或其它多肽的适合方法。
在若干实施例中，连接子可包括间隔元素，其在存在时增加连接子的尺寸使得效应分子或可检测标记物与抗体(或抗原结合片段)之间的距离增加。例示性间隔基是所属领域的技术人员已知的并且包括美国专利案第7,964,5667号、第498,298号、第6,884,869号、第6,323,315号、第6,239,104号、第6,034,065号、第5,780,588号、第5,665,860号、第5,663,149号、第5,635,483号、第5,599,902号、第5,554,725号、第5,530,097号、第5,521,284号、第5,504,191号、第5,410,024号、第5,138,036号、第5,076,973号、第4,986,988号、第4,978,744号、第4,879,278号、第4,816,444号和第4,486,414号以及美国专利公开案第20110212088号和第20110070248号中列出的间隔基，其中每一个以全文引用的方式并入。
特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体可用可检测部分标记。适用检测剂包括荧光化合物，包括萤光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰基氯、藻红蛋白、镧系磷光体等。还可以使用生物发光标记物，如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)。单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体还可以用适用于检测的酶标记，如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。可检测酶可通过添加酶用于产生可辨别的反应产物的其它试剂来检测。举例来说，当存在试剂辣根过氧化酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺可产生彩色的反应产物，其可目视检测。单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体还可以用生物素标记，并且通过抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合的间接测量来检测。应注意，抗生物素蛋白本身可用酶或荧光标记来标记。
单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体可用磁性试剂标记，如钆。单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体也可以用镧系元素(乳铕和镝)和锰标记。还可以使用顺磁粒子(如超顺磁氧化铁)作为标记物。单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体还可以用可由第二报导子(如白胺酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、抗原决定基标签)识别的预定多肽抗原决定基标记。在一些实施例中，标记物由具有多种长度的间隔基臂连接以降低潜在位阻。
单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体也可以用放射性标记氨基酸标记。放射性标记可以用于诊断和治疗目的。举例来说，放射性标记可用于通过x射线、发射光谱或其它诊断技术检测EphA4。用于多肽的标记物的实例包括(但不限于)以下放射性同位素或放射性核种：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。在一些实施例中，这些结合物可用于***，例如乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。在其它实施例中，这些毒素可用于治疗肌肉萎缩性侧索硬化。
单克隆抗体、抗原结合片段和双特异性抗体可与治疗剂(如化学治疗剂)结合以产生抗体药物结合物(ADC)。在若干实施例中，多种化学治疗剂可与所提供的抗体结合以产生结合物。在一些实施例中，这些结合物可用于***，例如乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。
毒素可与特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体以及这些抗体的抗原结合片段一起使用。例示性毒素包括绿脓杆菌外毒素(PE)、蓖麻毒素、相思子毒素、白喉毒素和其子单元、核糖体毒素、核糖核酸酶、沙泊宁和卡奇霉素(Calicheamicins)，以及肉毒杆菌毒素A到F。这些毒素在所属领域中是众所周知的并且许多可以从商业来源(例如Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)获得。预期毒素还包括所述毒素的变异体(参见例如参见美国专利案第5,079,163号和第4,689,401号)。在一些实施例中，这些结合物可用于***，例如乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。在其它实施例中，这些毒素可用于治疗肌肉萎缩性侧索硬化。
沙泊宁是来源于石碱草(Saponaria officinalis)的毒素，其通过不活化核糖体复合物的60S部分来干扰蛋白质合成(Stirpe等人,生物技术，10:405-412,1992)。然而，毒素不具有用于特异性进入细胞的机制，并且因此需要与识别内化细胞表面蛋白质的抗体(或抗原结合片段)结合以被细胞有效吸收。
从白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)分离白喉毒素。通常，用于免疫毒素的白喉毒素经突变以降低或消除非特异性毒性。从1970年代已知称为CRM107的突变体，其具有完全酶促活性但非特异性毒性显著降低(Laird和Groman,《病毒学杂志(J.Virol.)》19:220,1976)，并且已用于人类临床试验中。参见美国专利案第5,792,458号和美国专利案第5,208,021号。
蓖麻毒素是来自蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻豆)的凝集素RCA60。关于蓖麻毒素的实例，参见美国专利案第5,079,163号和美国专利案第4,689,401号。蓖麻凝集素(RCA)以称为RCA60和RCA120的两种形式产生(分别根据其分子量是约65和120kD)(Nicholson和Blaustein,《生物化学与生物物理学报(J.Biochim.Biophys.Acta)》266:543,1972)。A链负责不活化蛋白质合成和杀死细胞。B链使蓖麻毒素与细胞表面半乳糖残基结合并且促进A链传递到细胞溶质中(Olsnes等人,自然249:627-631,1974和美国专利案第3,060,165号)。
核糖核酸酶也与适用作免疫毒素的靶向分子结合(参见Suzuki等人,自然生物技术17:265-70,1999)。例示性核糖体毒素(如α-八叠球菌和局限曲菌素)讨论于例如Rathore等人,《基因》190:31-5,1997；和Goyal和Batra,《生物化学(Biochem.)》345Pt 2:247-54,2000中。卡奇霉素首先从棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)分离并且是烯二炔抗肿瘤抗生素家族的成员，其引起DNA中的双链破坏，从而引起细胞凋亡(参见例如Lee等人,《抗生素杂志(J.Antibiot.)》42:1070-87,1989)。药物是临床试验中免疫毒素的毒性部分(参见例如Gillespie等人,《肿瘤学年鉴(Ann.Oncol.)》11:735-41,2000)。
相思子毒素包括来自相思子(Abrus precatorius)的毒性凝集素。毒性成分(相思子毒素a、b、c和d)具有约63和67kD的分子量并且由两个二硫键连接的多肽链A和B组成。A链抑制蛋白质合成；B链(相思子毒素-b)结合于D-半乳糖残基(参见Funatsu等人,《农业与生物化学(Agr.Biol.Chem.)》52:1095,1988；和Olsnes,酶学方法50:330-335,1978)。
在一个实施例中，毒素是绿脓杆菌外毒素(PE)(美国专利案第5,602,095号)。如本文中所使用，PE包括全长原生(天然存在的)PE或已经修饰的PE。这类修饰可包括(但不限于)结构域Ia的消除、结构域Ib、II和III中的多种氨基酸缺失、单一氨基酸取代和羧基端处一个或多个序列的添加(例如参见Siegall等人,《生物化学杂志》264:14256-14261,1989)。
与所提供的抗体一起使用的PE可包括原生序列、原生序列的细胞毒性片段和原生PE的保守性修饰变异体以及其细胞毒性片段。PE的细胞毒性片段包括具有或不具有后续蛋白水解或目标细胞中的其它处理的细胞毒性片段。PE的细胞毒性片段包括PE40、PE38和PE35。关于PE和其变体的其它说明，参见例如美国专利案第4,892,827号；美国专利案第5,512,658号；美国专利案第5,602,095号；美国专利案第5,608,039号；美国专利案第5,821,238号；以及美国专利案第5,854,044号；WO 99/51643；Pai等人,《美国国家科学院院刊》,88:3358-3362,1991；Kondo等人,《生物化学杂志》,263:9470-9475,1988；Pastan等人,《生物化学与生物物理学报》,1333:C1-C6,1997。在一些实例中，PE是PE38。
本文中还涵盖蛋白酶耐受性PE变异体和具有降低的免疫原性的PE变异体，如(但不限于)PE-LR、PE-6X、PE-8X、PE-LR/6X和PE-LR/8X(参见例如Weldon等人,《血液学(Blood)》113(16):3792-3800,2009；Onda等人,《美国国家科学院院刊》105(32):11311-11316,2008；WO 2007/016150、WO 2009/032954和WO 2011/032022)。
在一些实例中，PE是对溶酶体降解具有抗性的变异体，如PE-LR(Weldon等人,《血液学》113(16):3792-3800,2009；WO 2009/032954)。在其它实例中，PE是称为PE-LR/6X的变异体(WO 2011/032022)。在其它实例中，PE是称为PE-LR/8M的变异体(WO 2011/032022)。
单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体也可以用化学基团衍生，如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团。这些基团可适用于改良抗体的生物特征，如增加血清半衰期或增加组织结合。
结合物中每个抗体(或抗原结合片段)的效应分子或可检测标记物部分的平均数目可例如在每个抗体(或抗原结合片段)1到20个部分范围内。对于一些结合物，每个抗体(或抗原结合片段)的效应分子或可检测标记物部分的平均数目可由抗体(或抗原结合片段)上连接位点的数目限制。举例来说，当连接是半胱氨酸硫醇时，抗体(或抗原结合片段)可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基，或可仅具有一个或若干个充分反应性硫醇基(连接子可通过其连接)。在某些实施例中，结合物中每个抗体(或抗原结合片段)的效应分子或可检测标记物部分的平均数目在1到约8个；约2到约6个；约3到约5个；约3到约4个；约3.1约3.9个；约3.2到约3.8个；约3.2到约3.7个；约3.2到约3.6个；约3.3到约3.8个；或约3.3到约3.7个范围内。参见例如美国专利案第7,498,298号(其以全文引用的方式并入本文中)。结合物制剂中每个抗体(或抗原结合片段)的效应分子或可检测标记物部分的平均数目可由常规手段(如质谱和ELISA分析)表征。
可以不同方式控制结合物的负荷(例如效应分子/抗体比率)，例如通过：(i)限制效应分子-连接子中间物或连接子试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制结合反应时间或温度，(iii)部分或限制半胱氨酸硫醇修饰的还原条件，(iv)通过重组技术对抗体的氨基酸序列进行工程改造，使得半胱氨酸残基的数目和位置经修饰以控制连接子效应分子连接的数目或位置(如根据WO2006/034488中所披露制备的thioMab或thioFab)。
III.核酸和宿主细胞
本文还提供编码所披露的重链和轻链可变域的氨基酸序列的核酸。核酸分子可以是cDNA。编码所披露的抗体和抗原结合片段的重组型核酸分子可由所属领域的技术人员使用本文中提供的氨基酸序列和基因码容易地产生。此外，所属领域的技术人员可容易地构筑多种含有功能等效核酸的纯系，如序列不同但编码相同蛋白质序列的核酸。因此，本文中提供编码所披露的抗体和抗原结合片段以及其组分、结合物、双特异性形式和结合物的核酸分子。
编码特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、结合物和双特异性抗体的核酸序列可通过任何适合的方法制备，包括例如适合的序列的克隆或通过如以下方法进行直接化学合成：如Narang等人,《酶学方法》68:90-99,1979中的磷酸三酯方法的方法；Brown等人,《酶学方法》68:109-151,1979中的磷酸二酯方法；Beaucage等人,《四面体通讯(Tetra.Lett.)》22:1859-1862,1981的二乙基氨基磷酸酯方法；由Beaucage和Caruthers,《四面体通讯》22(20):1859-1862,1981描述的固相氨基磷酸三酯方法，例如使用自动合成器，如例如Needham-VanDevanter等人,《核酸研究》12:6159-6168,1984中所描述；以及美国专利案第4,458,066号中的固体载体方法。化学合成产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过使用单股作为模板与DNA聚合酶聚合来转化成双股DNA。所属领域的技术人员将识别到，尽管DNA的化学合成通常受限于约100个碱基的序列，但可通过较短序列的接合来获得更长的序列。
编码特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、结合物和双特异性抗体的例示性核酸可通过克隆技术制备。适合的克隆和测序技术以及足以指导所属领域的技术人员进行许多克隆实践的指令的实例见于Sambrook等人,见上文，Berger和Kimmel(编),见上文和Ausubel,见上文中。来自生物试剂和实验设备的制造商的产品信息也提供适用的信息。这类制造商包括SIGMA Chemical Company(Saint Louis,MO)、R&D Systems(Minneapolis,MN)、Pharmacia Amersham(Piscataway,NJ)、CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA)、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI)、Glen Research,Inc.、GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD)、Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland)、Invitrogen(San Diego,CA)和Applied Biosystems(Foster City,CA)，以及所属领域的技术人员已知的许多其它商业来源。
核酸也可以通过扩增方法制备。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增***(TAS)、自身持续序列复制***(3SR)。许多克隆方法、宿主细胞和活体外扩增方法是所属领域的技术人员众所周知的。
在一个实例中，所使用的抗体是通过将编码来自抗体的可变区的cDNA***包含编码效应分子(EM)的cDNA的载体(如酶或标记)中来制备。进行***使得框内读取可变区和EM，使得产生一个连续多肽。因此，经编码的多肽含有功能性Fv区域和功能性EM区域。在一个实施例中，编码酶的cDNA接合到scFv，使得酶位于scFv的羧基端。在若干实例中，编码辣根过氧化酶或碱性磷酸酶的cDNA或相关多肽标记物接合到scFv，使得酶(或多肽标记物)位于scFv的氨基端。在另一实例中，标记位于scFv的氨基端。在另一个实例中，编码蛋白质或多肽标记物的cDNA接合抗体的重链可变区，使得酶或多肽标记物位于重链可变区的羧基端。重链可变区可接着使用二硫键接合到抗体的轻链可变区。在另一个实例中，编码酶或多肽标记物的cDNA接合抗体的轻链可变区，使得酶或多肽标记物位于轻链可变区的羧基端。轻链可变区可接着使用二硫键接合到抗体的重链可变区。
在分离和选殖编码可特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段和/或双特异性抗体的核酸后，蛋白质可使用适合的表达载体在以重组方式经工程改造的细胞(如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞)中表达。一个或多个编码抗体或其片段的DNA序列可通过DNA转移到适合的宿主细胞中来活体外表达。细胞可以是原核或真核。所述术语还包括个体宿主细胞的任何后代。应理解，所有后代可能不与亲本细胞一致，因为在复制期间可能存在突变。稳定转移(意谓外来DNA在宿主中持续保持)的方法是所属领域中已知的。本发明还涵盖表达相关抗体的融合瘤。
编码特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、结合物和双特异性抗体的聚核苷酸序列可操作地连接于表达控制序列。接合可操作地连接于编码序列的表达控制序列，使得在与表达控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。表达控制序列包括(但不限于)适合的启动子、强化子、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子(即ATG)(剪接内含子的信号，维持所述基因的正确阅读框架以允许mRNA的适当转译)和终止密码子。
可***表达载体中的编码抗体、经标记的抗体或其功能片段的聚核苷酸序列包括(但不限于)质体、病毒或其它媒剂，其可经操作以实现序列的***或并入并且可以在原核细胞或真核生物中表达。宿主可包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物生物体。在原核细胞中表达具有真核或病毒序列的DNA序列的方法在所属领域中是众所周知的。能够在宿主中表达和复制的生物功能性病毒和质体DNA载体是所属领域中已知的。
用重组型DNA进行的宿主细胞的转型作用可通过常规技术进行，如所属领域的技术人员众所周知。当宿主是原核生物(如大肠杆菌)时，能够进行DNA捕捉的胜任细胞可由所收集的细胞在指数生长期并且接着使用所属领域中众所周知的程序通过CaCl2方法处理之后制备。或者，可使用MgCl2或RbCl。也可以在(如果需要)形成宿主细胞的原生质体之后或通过电致孔进行转型作用。
当宿主是真核生物时，可使用如磷酸钙共沉淀物、常规机械程序(如微注射)、电致孔、***包覆在脂质体中的质体或病毒载体等DNA转染方法。真核细胞也可以由编码抗体、经标记的抗体或其功能性(抗原结合)片段的聚核苷酸序列和编码可选表现型(如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因)的第二外来DNA分子共转型。另一种方法是使用真核病毒载体(如猴病毒40(SV40)或牛***瘤病毒)以短暂感染或转型真核细胞和表达蛋白质(参见例如《真核病毒载体(Eukaryotic Viral Vectors)》,Cold Spring Harbor Laboratory,Gluzman编,1982)。所属领域的技术人员可容易地使用表达***，如用于在细胞(包括高级真核细胞，如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系)中产生蛋白质的质体和载体。
可通过常规手段(包括制备型色谱和免疫分离)进行以重组方式表达的多肽的分离和纯化。在表达后，抗体、经标记的抗体或其功能片段可根据所属领域中的标准程序纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、管柱色谱等(通常参见R.Scopes,《蛋白质纯化(ProteinPurification)》,Springer-Verlag,N.Y.,1982)。本文中所披露的大体上纯组合物具有至少约90到95％均质性，并且对于医药学目的，可使用98到99％或更高的均质性。在纯化后(视需要部分或纯化成均质)，如果在治疗学上使用，那么多肽应基本上不含内毒素。
已描述用于单链抗体的表达和/或从细菌(如大肠杆菌)再折叠成适合的活性形式(包括单链抗体)的方法并且是众所周知的，并且适用于本文中所披露的抗体。参见Buchner等人,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》205:263-270,1992；普鲁克通,《生物技术(Biotechnology)》9:545,1991；Huse等人,《科学》246:1275,1989和Ward等人,《自然》341:544,1989。
通常，从包涵体分离来自大肠杆菌或其它细菌的功能性异源蛋白质并且需要使用强变性剂溶解，并且随后再折叠。在溶解步骤期间，如所属领域中众所周知，必须存在还原剂以分离二硫键。具有还原剂的例示性缓冲液是：0.1M Tris pH 8、6M胍、2mM EDTA、0.3MDTE(二硫赤藓糖醇)。二硫键的再氧化可在呈还原和氧化形式的低分子量硫醇试剂存在下进行，如Saxena等人,《生物化学(Biochemistry)》9:5015-5021,1970中所描述，并且尤其如Buchner等人,见上文所描述。
复性通常通过在再折叠缓冲液中稀释(例如100倍)经变性和还原的蛋白质来实现。例示性缓冲液是0.1M Tris，pH 8.0、0.5M L-精氨酸、8mM氧化谷胱甘肽(GSSG)和2mMEDTA。
作为两链型抗体纯化方案的改良，单独地溶解和还原重链和轻链区域并且接着在再折叠溶液中组合。当这两种蛋白质以一种蛋白质相比另一种蛋白质不超过5倍摩尔过量的摩尔比的方式混合时，获得例示性产率。可在氧化还原-重排完成之后，将过量的经氧化的谷胱甘肽或其它氧化低分子量化合物添加到再折叠溶液中。
除重组型方法以外，本文中所披露的特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、结合物和双特异性抗体也可以完全或部分使用标准肽合成构筑。长度小于约50个氨基酸的多肽的固相合成可通过使序列的C端氨基酸连接到不溶性载体，接着依序添加序列中的其余氨基酸来实现。用于固相合成的技术由Barany和Merrifield,《肽：分析、合成、生物学(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.)》,第2卷:《肽合成中的特别方法，部分A(Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.)》,第3-284页；Merrifield等人,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》85:2149-2156,1963和Stewart等人,《固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)》,第2版,Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.,1984描述。更大长度的蛋白质可通过较短片段的氨基和羧基端的缩合来合成。通过羧基末端的活化(如通过使用偶合剂N,N'-二环己基碳化二亚胺)来形成肽键的方法在所属领域中是众所周知的。
VI.组合物和治疗方法
提供组合物，其包括治疗有效量的特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体和/或其结合物中的一种或多种和载剂。提供组合物，其包括含治疗有效量的一种或多种编码特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体和/或结合物的核酸的载剂。组合物可以用于投与个体(如患有肿瘤、神经退化性病症或情绪障碍的个体)的单位剂型形式制备。组合物可配制用于持续释放。
在一些实施例中，个体患有肿瘤，包括恶性肿瘤。可使用本文中所披露的抗体、抗原结合片段、双特异性抗体和结合物治疗任何表达(尤其过度表达)EphA4的肿瘤。肿瘤可以是例如乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。
在其它实施例中，个体患有神经退化性病症，如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、多发性硬化(MS)或肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)。这类疾病的一个实例是运动神经元病，如WHO的ICD-10分类中的G12疾病。在一些实施例中，运动神经元病是前角病变。在其它实施例中，运动神经元病是肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)或脊髓性肌萎缩(SMA)。在其它实施例中，个体患有情感障碍，如抑郁症。
在一些情况下，接受本发明的治疗性组合物的投药的患者尚未呈现相关疾病的任何决定性症状；实际上，其可视为由于例如异常高含量的EphA4表达(如通过例如本发明的诊断方法测定)而在稍后的时间具有增加的产生这类疾病的风险。换句话说，本文中所描述的组合物可以用于治疗性目的以及预防性目的。
不希望受理论约束，在一些实施例中，抗体、抗原结合片段、双特异性抗体和结合物可结合于EphA4(如人类和/或小鼠EphA4)并且抑制EphA4的活性(如酪氨酸激酶活性)。在一些实施例中，抗体、抗原结合片段、双特异性抗体和结合物阻断EphA4的自体磷酸化，引起细胞信号传导减少。在一些实施例中，细胞是运动神经元，如在患有ALS的个体中。在其它实施例中，细胞是肿瘤细胞，如在患有癌症的个体中。
在一些实施例中，个体患有ALS，其可以是家族性ALS或偶发性ALS。个体可患有手臂发作型ALS或延髓发作型ALS。在其它实施例中，个体患有AD。在一些非限制性实例中，个体可患有“延迟发作型”ALS或AD，其在年龄超过60岁的个体中发生。因此，个体年龄可超过60、65、70、75、80或85岁。在其它非限制性实例中，个体可患有“早发型”ALS或AD，其在年龄超过60岁或更年轻的个体中发生。因此，个体可以是18到60岁的成年个体，如年龄在20、25、30、35、35、40、45、50、55岁与60岁之间的个体。个体可以是年轻的成年人(例如20到39岁)，或中年人(例如40-64岁)，或老年人(例如超过65岁)。个体还可以用RILUZOLETM(力如太)治疗，或可在不存在用RILUZOLETM(力如太)进行的治疗的情况下投与抗体、抗原结合片段、结合物或双特异性抗体。
投药的量和时间由治疗医师判断以实现所需目的。特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物可经配制以用于全身或局部(如肿瘤内)投药。在一个实例中，医药组合物经配制以用于非经肠投药，如静脉内投药。在其它实例中，医药组合物经配制以用于肌肉内投药。
用于投药的组合物可包括特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物的溶液，或编码特异性的结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物的核酸，其溶解于医药学上可接受的载剂中，如水性载剂。在一些实例中，单克隆抗体、抗原结合片段、结合物或双特异性抗体结合于EphA4并且干扰信号传导以改良存活期，如在患有ALS或肿瘤的个体中。可使用多种水性载剂，例如缓冲生理食盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不合需要的物质。这些组合物可以通过常规的众所周知的灭菌技术灭菌。组合物可视需要含有医药学上可接受的助剂物质以接近生理条件，如pH值调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制物中的抗体浓度可广泛变化，并且将根据所选择的具体投药模式和个体需要而主要基于流体体积、粘度、体重等选择。
用于静脉内投药的典型医药组合物包括约0.1到10mg抗体/个体/天。可使用0.1到约100mg/个体/天的剂量，尤其在药剂投与隔离位点并且不进入循环或淋巴***(如进入体腔或进入器官腔)时。用于制备可投与的组合物的实际方法将是所属领域的技术人员已知或显而易见的并且更详细地描述于如《雷明顿的药物科学(Remington's PharmaceuticalScience)》,第19版,Mack Publishing Company,Easton,PA(1995)等公开案中。
特异性结合EphA4、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物的单克隆抗体可以冻干形式提供并且在投药之前用无菌水复原，但其也以已知浓度的无菌溶液形式提供。接着将抗体溶液添加到含有0.9％氯化钠的输液包(USP)中，并且通常以0.5到15mg/kg体重的剂量投与。所属领域中可获得许多投与抗体药物的经验，自从1997年获得批准，其已在美国市售。抗体可通过缓慢输注而非静脉内推注或推注来投与。在一个实例中，投与较高起始剂量，随后以较低含量投与维持剂量。举例来说，4mg/kg的初始起始剂量可在约90分钟时间内输注，接着如果前述剂量被良好耐受，那么在30分钟时间内输注2mg/kg的每周维持剂量持续4-8周。
也可以投与个体治疗有效量的编码特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物的核酸。一种投与核酸的方法是用质体DNA进行直接免疫接种，如用哺乳动物表达质体。编码所披露的抗体的核苷酸序列可受启动子控制以增加分子的表达。由核酸构筑体进行免疫接种是所属领域中众所周知并且教示于例如美国专利案第5,643,578号和美国专利案第5,593,972号和美国专利案第5,817,637号、美国专利案第5,880,103号中，其描述若干种向生物体传递编码免疫原性肽或其它抗原的核酸的方法。所述方法包括核酸的脂质体传递。
在另一种使用方法中，核酸也可以由经灭毒的病毒宿主或载体或细菌载体表达。可使用重组型牛痘病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、反转录病毒、巨细胞病毒、痘病毒或其它病毒载体表达抗体。举例来说，牛痘描述于美国专利案第4,722,848号中。BCG(卡介菌(Bacillus Calmette Guerin))提供另一种用于所披露的抗体的表达的载体(参见Stover,《自然》351:456-460,1991)。
在一个实施例中，可将编码所披露的特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物的核酸直接引入细胞以用于表达。举例来说，可通过标准方法将核酸装载到金微米球上并且通过如Bio-Rad's基因枪等装置引入皮肤。核酸可以是“裸”的，由受强启动子控制的质体组成。
通常，将DNA注射到肌肉中，但其也可以直接注射到其它位点。注射剂量通常是约0.5mg/kg到约50mg/kg，并且通常是约0.005mg/kg到约5mg/kg(参见例如美国专利案第5,589,466号)。
在一个实例中，个体是人类。抗体可投与患有肿瘤的非人类哺乳动物(如小鼠、灵长类动物或食蟹猕猴(cynomolgus)或恒河猴(rhesus monkey))，所述肿瘤表达所述抗体、抗原结合片段、结合物或双特异性抗体可交叉反应的EphA4受体。抗体还可以投与作为ALS的模型***的动物。应注意，动物模型(如小鼠和灵长类动物模型)可适用于评估作用机制和确定抗体疗效。
可向患有疾病或病症的个体投与特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物，其中已证实或怀疑所述疾病或病症中存在大量EphA4受体活性可引起疾病或病症的病理生理学或是促进疾病或病症恶化的因素。因此，预期抑制EphA4活性或表达所述受体的细胞可缓解病症的症状和/或进程。这类病症可例如通过细胞表面上EphA4的受体含量增加或患有病症的个体中EphA4的量增加来证明。
特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物可在活体内或活体外减缓或抑制细胞(如肿瘤细胞)生长。在活体内应用中，以足以抑制肿瘤生长或抑制肿瘤的病征或症状的量投与个体治疗有效量的抗体。适合的个体可包括患有表达EphA4受体的肿瘤的个体，如患有乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌的个体。在一些实例中，所述方法引起肿瘤的重量或体积不再增加或降低重量或体积。在其它实例中，所述方法引起转移减少。
可向患有运动神经元病(如(但不限于)ALS，如家族性或偶发性ALS)的个体投与特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物。相关个体披露于上文中。单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物可用于降低运动神经元中EphA的活性。在一些实施例中，减缓疾病的进程。单克隆抗体可用于测定与ALS相关的EphA4表达量，或降低的EphA4表达可用于监测对疗法的反应。
通常，将评估一种或多种症状或参数以检验个体中运动神经元病的进程。治疗可降低肌肉衰弱和/或萎缩。治疗可减少一种或多种症状，如行动、吞咽(吞咽困难)和说话或成词(发音困难)困难。治疗还可以减少肌肉的绷紧和僵硬(痉挛)和过度反射(反射过强)，包括减少呕吐反射。治疗可改变巴氏病征的(在足底受刺激时大脚趾朝上伸展)，其表示上部运动神经元损害减少。治疗可延缓或减少运动神经元变性，以及延缓或减少肌肉衰弱和萎缩、肌肉痉挛和可在皮下发现的肌肉短暂抽搐(肌束震颤)。治疗也可以降低假延髓病影响，也称为“情绪不稳”，由此减少不可控制的大笑、哭泣或微笑的出现。
用于这一用途的有效量将取决于疾病严重度和患者的一般健康状况。治疗有效量的特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物，或编码特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物的核酸提供症状的主观缓解或可客观识别的改良，如由临床医师或其它合格观测员指出。在一些实施例中，所述治疗降低细胞信号传导，如通过降低EphA4的酪氨酸激酶活性和/或EphA4的自体磷酸化。
所披露的组合物可与另一种药剂结合投与(同时或依序)，如用于治疗ALS的药剂。在特异性非限制性实例中，个体患有ALS，并且投与个体另一种用于治疗ALS的药剂。在特异性非限制性实例中，还投与治疗有效量的RILUZOLETM(力如太)。
对于***，所披露的组合物可与化学治疗剂一起投与。所属领域中当前已知的许多化学治疗剂。在一个实施例中，化学治疗剂选自由以下组成的群组：有丝***抑制剂、烷基化剂、抗代谢剂、插层抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应调节剂、抗激素剂(例如抗雄激素剂)和抗血管生成剂。
抗血管生成剂(如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环加氧酶II)抑制剂)可与所披露的抗体、抗原结合片段和结合物结合使用以用于***。适用的COX-II抑制剂的实例包括CELEBREXTM(阿莱昔布(alecoxib))、伐地考昔(valdecoxib)和罗非考昔(rofecoxib)。适用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例描述于WO 96/33172、WO 96/27583、WO 98/07697、WO 98/03516、WO 98/34918、WO 98/34915、WO98/33768、WO 98/30566、欧洲专利公开案606,046、欧洲专利公开案931,788、WO 90/05719、WO 99/52910、WO 99/52889、WO 99/29667、美国专利案第5,863,949号、美国专利案第5,861,510号和欧洲专利公开案780,386中。在一个实例中，MMP抑制剂在投药时不诱导关节痛。在另一实例中，MMP抑制剂与其它基质-金属蛋白酶(如MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13)相比选择性抑制MMP-2和/或MMP-9。可使用的MMP抑制剂的一些特定实例是AG-3340、RO 32-3555、RS 13-0830、3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨甲酰基-环戊基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧-双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸羟基酰胺；(2R,3R)-1-[4-(2-氯-4-氟-苯甲氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-甲酸羟基酰胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-甲酸羟基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨甲酰基-环丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-甲酸羟基酰胺；(R)-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-3-甲酸羟基酰胺；(2R,3R)-1-[4-(4-氟-2-甲基-苯甲氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-甲酸羟基酰胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟基氨甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(4-羟基氨甲酰基-四氢-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧环[3.2.1]辛-3-甲酸羟基酰胺；3-内-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧-环[3.2.1]辛-3-甲酸羟基酰胺；和(R)-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-呋喃-3-甲酸羟基酰胺；以及所述化合物的医药学上可接受的盐和溶剂合物。
所披露的特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物，或编码特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物的核酸也可以与信号转导抑制剂(如可抑制EGF-R(表皮生长因子受体)反应的试剂，如EGF-R抗体、EGF抗体和作为EGF-R抑制剂的分子)；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，如VEGF受体和可抑制VEGF的分子；以及erbB2受体抑制剂，如结合于erbB2受体的有机分子或抗体(例如HERCEPTINTM(Genentech,Inc.))一起使用。EGF-R抑制剂描述于例如WO 95/19970、WO 98/14451、WO 98/02434和美国专利案第5,747,498号(1998年5月5日颁布)中。EGFR抑制剂还包括(但不限于)mAb C225和抗EGFR 22Mab(ImClone Systems Incorporated)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)、EMD-5590(Merck KgaA)、MDX-447/H-477(Medarex Inc.和Merck KgaA)以及化合物ZD-1834、ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK 787(Novartis)、CP 701(Cephalon)、来氟米特(leflunomide)(Pharmacia/Sugen)、Cl-1033(Warner LambertParke Davis)、Cl-1033/PD183,805(Warner Lambert Parke Davis)、CL-387,785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche)、那米定A(Naamidine A)(BristolMyers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、OLX-103(Merck&Co.)、VRCTC-310(Ventech Research)、EGF融合毒素(Seragen Inc.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperial Cancer Research Fund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center)、WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)和EGF-R疫苗(York Medical/Centro deImmunologia Molecular (CIM))。
VEGF抑制剂(例如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.)、SH-268(Schering)和NX-1838(NeXstar))也可以与特异性结合EphA4的抗体结合使用。VEGF抑制剂描述于例如WO 99/24440、WO 95/21613、WO 99/61422、美国专利案第5,834,504号、WO 98/50356、美国专利案第5,883,113号、美国专利案第5,886,020号、美国专利案第5,792,783号、WO 99/10349、WO97/32856、WO 97/22596、WO 98/54093、WO 98/02438、WO 99/16755和WO 98/02437中。一些特异性VEGF抑制剂的其它实例是IM862(Cytran Inc.)；Genentech,Inc.的抗VEGF mAb；以及安吉酶(angiozyme)，一种来自Ribozyme和Chiron的合成核糖核酸酶。这些和其它VEGF抑制剂可与特异性结合EphA4的抗体结合使用。
ErbB2受体抑制剂(如GW-282974(Glaxo Wellcome))以及mAb AR-209(AronexPharmaceuticals Inc.)和2B-1(Chiron)也可以与所披露的抗体、抗原结合片段、双特异性抗体和结合物组合，例如WO 98/02434、WO 99/35146、WO 99/35132、WO 98/02437、WO 97/13760、WO 95/19970和美国专利案第5,587,458号中所指示。
视患者需要和耐受的剂量和频率，投与组合物的单次或多次投药，如投与患有ALS或肿瘤的个体。在任何情况下，组合物应提供足以有效治疗患者的量的至少一种本文中所披露的抗体。剂量可一次性投与，但可周期性施用直到获得治疗结果或直到副作用迫使停止疗法。在一个实例中，每隔一天经三十分钟输注一定剂量的抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物。在这一实例中，可投与约一次到约十次给药，如可每隔一天投与三次或六次给药。在另一个实例中，持续约五到约十天投与连续输注。可以规则间隔(如每月一次)治疗个体直到获得所需治疗结果。通常，所述剂量足以治疗或改善疾病的症状或病征而不对患者产生不可接受的毒性。
可以植入物、油状注射物或粒状***形式制得控制释放非经肠配制物。关于蛋白质传递***的广泛概述，参见Banga,A.J.,《治疗性肽和蛋白质：配制物、处理和传递***(Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and DeliverySystems)》，Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,PA,(1995)，其以引用的方式并入本文中。粒状***包括微米球、微米粒子、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米粒子。微胶囊含有治疗性蛋白质(如细胞毒素或药物)作为中心核心。在微米球中，治疗性物质分散遍布粒子。约1μm的粒子、微米球和微胶囊通常分别称为纳米粒子、纳米球和纳米胶囊。毛细管具有约5μm直径使得仅静脉内投与纳米粒子。微米粒子的直径通常是约100μm并且是皮下或肌肉内投与。参见例如Kreuter,J.,《胶态药物传递***(Colloidal Drug DeliverySystems)》,J.Kreuter编,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,第219-342页(1994)；和Tice和Tabibi,《受控药物传递论述(Treatise on Controlled Drug Delivery)》,A.Kydonieus编,Marcel Dekker,Inc.New York,NY,第315-339页,(1992)，其皆以引用的方式并入本文中。
聚合物可用于本文中所披露的组合物的离子控制释放。多种用于控制药物传递的可降解和不可降解聚合基质是所属领域中已知的(Langer,《化学研究报告(AccountsChem.Res.)》26:537-542,1993)。举例来说，嵌段共聚物，泊洛沙姆(polaxamer)407，在低温下以粘稠但流动性液体形式存在，但在体温下形成半固体凝胶。已证实其是用于重组型白介素-2和尿素酶的配制和持续传递的有效媒剂(Johnston等人,《药物研究(Pharm.Res.)》9:425-434,1992；和Pec等人,《遗传科学技术杂志(J.Parent.Sci.Tech.)》44(2):58-65,1990)。或者，已使用羟基磷灰石作为用于蛋白质的控制释放的微载体(Ijntema等人,《国际制药学杂志(Int.J.Pharm.)》112:215-224,1994)。在另一个方面中，脂质体用于脂质囊封药物的控制释放以及药物靶向(Betageri等人,《脂质体药物传递***(Liposome DrugDelivery Systems)》,Technomic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,PA(1993))。已知用于治疗性蛋白质的控制传递的许多其它***(参见美国专利案第5,055,303号；美国专利案第5,188,837号；美国专利案第4,235,871号；美国专利案第4,501,728号；美国专利案第4,837,028号；美国专利案第4,957,735号；美国专利案第5,019,369号；美国专利案第5,055,303号；美国专利案第5,514,670号；美国专利案第5,413,797号；美国专利案第5,268,164号；美国专利案第5,004,697号；美国专利案第4,902,505号；美国专利案第5,506,206号；美国专利案第5,271,961号；美国专利案第5,254,342号和美国专利案第5,534,496号)。
V.诊断方法和试剂盒
本文中提供用于活体外或活体内检测EphA4的方法。在一个实例中，在生物样品中检测EphA4的表达。样品可以是任何样品，包括(但不限于)来自活检体的组织、尸检材料和病变样品。生物样品还包括组织切片，例如采集用于组织学目的的冷冻切片。生物样品还包括体液，如血液、血清、血浆、痰液、脊髓液或尿液。生物样品通常从哺乳动物(如人类)获得。
在若干实施例中，提供用于检测肿瘤或评估产生肿瘤(如乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌)的风险的方法。还提供用于测定患有这些恶性病中的任一种的个体的预后的方法。个体可以是任何相关个体，如怀疑患有肿瘤的个体。与对照物相比，来自个体的样品中EphA4的含量增加表明个体患有肿瘤或具有增加的在稍后的时间产生肿瘤的风险。在特异性非限制性实例中，样品是血液、血清、血浆、痰液或活组织检查样品。
在其它实施例中，提供用于检测或评估产生神经退化性病症(如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、多发性硬化(MS)或肌肉萎缩性侧索硬化(ALS))的风险的方法。这类疾病的一个实例是运动神经元病，如WHO的ICD-10分类中的G12疾病。在一些实施例中，运动神经元病是前角病变。在其它实施例中，运动神经元病是肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)或脊髓性肌萎缩(SMA)。在其它实施例中，个体患有情感障碍，如抑郁症。在其它实施例中，运动神经元病是脊髓性肌萎缩(SMA)。个体可以是任何相关个体，如怀疑患有神经退化性病症(如AD、PD、MS或ALS)或具有增加的产生神经退化性病症的风险的个体。与对照物相比，来自个体的样品中EphA4的含量增加表明个体患有病症(如ALS的运动神经元病)或具有增加的产生病症的风险。在特异性非限制性实例中，样品包括神经元。
在其它实施例中，提供用于测定个体中神经退化性病症(如AD、PD、MS或ALS)的发作或进程的方法，其包含测定个体的样品中的EphA4含量。根据其它特定实施例，降低的EphA4含量和/或活性表示发作延迟(在具有产生神经退化性疾病的风险的个体中)和/或存活期延长和/或症状较少。EphA4含量增加表明早发(在具有产生神经退化性疾病的风险的个体中)和/或存活期(或疾病持续时间)缩短和/或疾病的症状(如AD、PD、MS和ALS)增加。疾病可以是家族性或偶发性。可使用相同的一般方法测定个体中情感障碍(如抑郁症)的发作或进程，包含测定个体的样品中的EphA4含量和比较所述含量与标准对照物或先前测定的来自相同类型的样品中的EphA4含量。与标准对照值或先前测量值相比增加表明疾病的发作或进程。
提供用于检测生物样品中的EphA4的方法，其中所述方法包括使生物样品与特异性结合EphA4的单克隆抗体或其抗原结合片段在有助于形成免疫复合物的条件下接触，并且检测所述免疫复合物，以检测生物样品中的EphA4。在一个实例中，检测到样品中EphA4增加表明个体患有恶性疾病。在另一实例中，检测到样品中EphA4增加表明个体倾向于转移。在其它实例中，肿瘤是乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。
可比较样品中EphA4的量与对照值。对照物可以是参考标准或来自未患有肿瘤或运动神经元病的个体(如健康个体)的样品。
当做出阳性诊断时，例如测定患者患有肿瘤、神经退化性病症或情绪障碍或具有增加的产生肿瘤、神经退化性病症或情绪障碍的风险，患者可接受其它测试以确认基于EphA4结果的发现。在一些情况下，可使用一种或多种临床上批准的治疗性或预防性方法向患者提供适用于其病状的治疗。此外，患者可接受后续测试和治疗以继续维持和长期监测。
在一个实施例中，特异性结合EphA4的单克隆抗体或抗原结合片段用可检测标记直接标记。在另一实施例中，特异性结合EphA4的单克隆抗体或抗原结合片段(第一抗体)未经标记并且可与特异性结合EphA4的单克隆抗体或抗原结合片段结合的第二抗体或其它分子经标记。如所属领域的技术人员众所周知，选择能够特异性结合第一抗体的特定物种和种类的第二抗体。举例来说，如果第一抗体是人类IgG，那么二级抗体可以是抗人类lgG。其它可结合于抗体的分子包括(但不限于)蛋白质A和蛋白质G，其都可以从市场获得。
适用于特异性结合EphA4的单克隆抗体或抗原结合片段和二级抗体的标记物描述于上文中，并且包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性试剂和放射性物质。适合的酶的非限制性实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。适合的辅基复合物的非限制性实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。适合的荧光材料的非限制性实例包括伞酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺萤光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。非限制性例示性发光材料是鲁米诺(luminol)；非限制性例示性磁性试剂是钆，并且非限制性例示性放射性标记物包括125I、131I、35S或3H。
在替代性实施例中，可利用标记有可检测物质的EphA4标准和未经标记的特异性结合EphA4的人类抗体通过竞争免疫分析来分析生物样品中的EphA4。在这一分析中，组合生物样品、经标记的EphA4标准和特异性结合EphA4的单克隆抗体或特异性结合EphA4的抗原结合片段，并且测定结合于未经标记的抗体的经标记的EphA4标准的量。生物样品中EphA4的量与结合于特异性结合EphA4的单克隆抗体或特异性结合EphA4的抗原结合片段的经标记的EphA4标准的量成反比。取决于相关样品，EphA4可以是人类或小鼠EphA4。
本文中所披露的免疫分析和方法可用于许多目的。在一个实施例中，特异性结合EphA4的单克隆抗体或抗原结合片段可用于检测细胞培养物中细胞产生EphA4。在另一实施例中，抗体可用于检测生物样品中EphA4的量。EphA4的表达增加与若干种癌症(包括乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌)相关联。因此，如上文所披露，EphA4的含量可用于诊断个体中的乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌或胰脏癌或测定其预后。还已知EphA4的表达增加与运动神经元病(如ALS)的存在和严重度相关。因此，如上文所披露，来自个体的样品中的EphA4含量可用于诊断患有运动神经元病症(如ALS)的个体或测定其预后。
在一个实施例中，提供用于检测生物样品(如血液样品或活组织检查样品)中的EphA4的试剂盒。用于检测多肽的试剂盒将通常包含特异性结合EphA4的单克隆抗体或抗原结合片段，如本文中所披露的抗体或抗原结合片段中的任一种。在一些实施例中，试剂盒中包括抗体片段，如Fv片段。对于活体内用途，抗体可以是scFv片段。在另一实施例中，标记(例如用荧光、放射性或酶促标记)特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体。
在一个实施例中，试剂盒包括说明材料，其披露特异性结合EphA4的抗体的使用方法。说明材料可以是书面材料、电子形式(如计算机磁盘或光盘)或可以是可视形式(如视频文件)。试剂盒还可以包括其它组分以促进所设计的试剂盒的具体应用。因此，举例来说，试剂盒可额外含有用于检测标记的工具(如用于酶促标记物的酶衬底、用于检测荧光标记物的过滤器组、适合的第二标记物(如二级抗体)等)。试剂盒可额外包括缓冲液和其它通常用于实践具体方法的试剂。这类试剂盒和适合的内含物是所属领域的技术人员众所周知的。
在一个实施例中，诊断试剂盒包含免疫分析。尽管免疫分析的细节可随所使用的具体格式而变化，但检测生物样品中EphA4的方法通常包括使生物样品与在免疫反应性条件下与EphA4多肽(如人类或小鼠EphA4)特异性反应的抗体接触的步骤。使抗体在免疫反应性条件下特异性结合以形成免疫复合物，并且直接或间接检测免疫复合物(结合的抗体)的存在。
特异性结合EphA4的单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体可与其它化合物结合，包括(但不限于)酶、磁珠、胶态磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物或药物。抗体也可以用于免疫分析中，如(但不限于)放射免疫分析(RIA)、酶连接免疫吸附分析(ELISA)或免疫组织化学分析。抗体也可以用于荧光激活细胞分选术(FACS)。FACS使用多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道以及阻抗通道以及其它更复杂的检测程度以分离或分选细胞(参见美国专利案第5,061,620号)。这些分析中可使用如本文中所披露的特异性结合EphA4的抗体、抗原结合片段或双特异性抗体中的任一种。因此，抗体可用于常规免疫分析中，包括(但不限于)ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、西方印迹或免疫沉淀。
实例
提供以下实例仅作为说明并且不具有限制性。所属领域的技术人员将容易地识别出多种可被改变或修改以产生基本相同或类似结果的非关键参数。
EphA4(艾普瑞林的受体)在多种人类恶性肿瘤中过表达，包括(但不限于)胃癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。EphA4与肿瘤生长、侵袭、转移和血管生成相关联。此外，还发现EphA4与神经退化性疾病肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)相关联，其中不含EphA4基因使ALS患者与具有完整基因的患者相比存活显著更长时间。本文中提供结合于人类EphA4和小鼠EphA4的若干人类单克隆抗体(mAb)的鉴别和表征。这些mAb可以裸mAb、双特异性格式和/或抗体-药物结合物形式用作ALS和癌症治疗剂。
实例1：5种重组型EphA4的表达和纯化
为了从噬菌体文库有效选择抗体，需要经纯化的重组型抗原，在这种情况下，EphA4。为了增加EphA4分子的免疫原性，使人类和小鼠EphA4基因与人类IgG1Fc融合。通过蛋白质G纯化的人类和小鼠EphA4-Fc在聚丙烯酰胺凝胶上的纯度>95％。使用经纯化的小鼠EphA4-Fc融合蛋白淘选来源于健康人类血液的原生人类Fab噬菌体呈现文库。
实例2：Fab与重组型EphA4的高亲和力结合
在293个自由式细胞中产生的小鼠EphA4-Fc用生物素标记并且用于大型Fab文库的淘选。在第三轮淘选(图1)之后，筛选200个纯系并且鉴别几十个具有不同序列的阳性纯系。与其它纯系相比，纯系E1、E2、E5和E19以较高亲和力结合于人类和小鼠EphA4并且被选择用于进一步表征。以5、2和20nmol/L的EC50(如通过ELISA(图2)所测量)结合于人类和小鼠EphA4的Fab E1(m101)、E5(m105)和E19(m119)转化成IgG1格式。m101和m119IgG1以1nmol/L的相同EC50结合于人类和小鼠EphA4，而m105IgG1以次纳摩尔EC50结合于人类和小鼠EphA4(图3)。
实例3：IgG1s m101、m105和m119特异性地识别EphA4的配位体结合域
为了研究IgG1 m101、m105和m119对EphA4的结合性质，表达和纯化GST-人类EphA4配位体结合域(LBD)。通过西方印迹分析来测定3种IgG1 m101、m105和m119的EphA4LBD识别。在SDS-PAGE上操作EphA4LBD蛋白质并且其用3种IgG1进行免疫印迹法(图4)。通过进行等温滴定量热法(ITC)实验来进一步分析3种IgG1与EphA4LBD相互相用的动力学。用敏感性量热计测量由EphA4LBD重组型蛋白质与IgG1的相互相用产生的热。IgG1 m101、m105和m119呈现针对EphA4LBD的强结合亲和力(图5)。
实例4：IgG1 m101、m105和m119缓解小鼠艾普瑞林-A1与小鼠EphA4的相互相用
进行竞争性ELISA以证明IgG针对EphA4的结合和针对EphA4和其配位体艾普瑞林-A的相互相用的抑制。ELISA盘预先用小鼠EphA4重组型蛋白质的细胞外结构域涂布并且接着与IgG1 m101、m105或m119在不同浓度下一起培育，接着进行若干轮洗涤，并且最终与生物素化重组型小鼠艾普瑞林-A1Fc嵌合蛋白质一起培育。通过抗生蛋白链菌素-生物素检测方法测定由IgG1s灭毒的EphA4与艾普瑞林-A的相互相用。测定3种IgG1的IC50。如图6中所见，3种IgG1能够在纳摩尔范围(IC50：m101＝0.71nM；m105＝0.35nM；并且m119＝1.81nM)内阻断小鼠EphA4细胞外结构域与小鼠艾普瑞林-A1之间的相互相用。
实例5：IgG1 m105特异性减弱EphA4与艾普瑞林-A/B的相互相用，但不减弱艾普瑞林-B与EphB2受体之间的相互相用
为了测定IgG1 m105减弱EphA4与其配位体的特异性，通过竞争性ELISA证明IgG1m105阻断EphA4-配位体的相互相用。小鼠EphA4重组型蛋白质的细胞外结构域或小鼠EphB2重组型蛋白质的细胞外结构域首先与IgG1 m105一起培育，接着与不同生物素化重组型小鼠艾普瑞林-A/艾普瑞林-B Fc嵌合蛋白培育。接着通过抗生蛋白链菌素-生物素检测方法测定IgG1 m105对EphA4/EphB2与艾普瑞林-A/艾普瑞林-B的相互相用的作用。如图7中所见，IgG1 m105展示阻断EphA4与艾普瑞林-A和艾普瑞林B的特异性。
实例6：mAb与细胞表面偶联EphA4的特异性结合
治疗性或诊断性抗体应识别原生蛋白质。多种临床应用需要不同尺寸和价态的抗体以实现最佳作用。举例来说，小尺寸优选用于靶向和成像，而全尺寸抗体(IgG)在循环中具有显著更长的半衰期，并且一些全尺寸抗体能够介导效应子功能。因此，测试IgG1E1(m101)与细胞表面偶联原生EphA4的结合。在这些实验中，293T细胞用小鼠EphA4短暂转染，并且测试m101与经转染的细胞以及未经转染的细胞的结合。如图8中所示，m101以与EphA4的天然配位体(艾普瑞林-A5-Fc)相同的效力特异性结合于EphA4-293T细胞，表明所鉴别的mAb可特异性结合细胞表面偶联EphA4。
实例7：IgG1 m119刺激EphA4活化
IgG1 m101、m105和m119结合于EphA4并且干扰EphA4与艾普瑞林的相互相用。检验其充当促效剂以活体内调节EphA4活化的能力。通过经IgG1处理的所培养的皮层神经元中EphA4的酪氨酸磷酸化来测定由IgG1进行的EphA4受体的活化。简单来说，所培养的皮层神经元用IgG1 m101、m105或m119以2μg/ml的浓度处理。EphA4蛋白质与来自蛋白质溶解物的EphA4抗体一起免疫沉淀，在SDS-PAGE上操作并且接着与酪氨酸磷酸化抗体一起进行免疫印迹法(参见图9)。
实例8：IgG1 m105充当减弱艾普瑞林-A1诱导的EphA4活化的EphA4拮抗剂
IgG1 m101、m105和m119结合于EphA4LBD并且干扰EphA4与艾普瑞林的相互相用。在所培养的神经元中检验其充当拮抗剂以减弱EphA4活化的能力。在7 DIV下，所培养的皮层神经元用所示IgG1预先处理，接着用预先集群的艾普瑞林-A1处理。对于m105，这是2μg/ml(较低剂量，指示为105L)和5μg/ml(较高剂量，指示为105H)，而m101(101)、119(119)和IgG都是5μg/ml。接着收集细胞并且经历免疫沉淀和使用所示抗体进行的西方印迹分析。如图10(A)中所见，m105以剂量依赖性方式减弱艾普瑞林-A1诱导的EphA4磷酸化。曲线展示在免疫沉淀之后EphA4的P-Tyr的定量(图10(B))和EphA4的Tyr602磷酸化的定量(图10(C))。
实例9：IgG1 m105识别所培养的海马神经元中的EphA4：Aβ降低经m105标记的EphA4受体与突触后标记物PSD-95的共定位
如图11中所示，Aβ降低经m105标记的EphA4受体与PSD-95的共定位。如所指示，荧光影像展示在不同时间点时用500nM Aβ处理的所培养的海马神经元(约18-20DIV)。细胞用IgG1 m105和PSD-95抗体免疫染色。图式展示与PSD-95共定位的EphA4含量降低。NEphA4(n)表示通过超分辩率成像获得的共定位数目(或定位计数)。这一数字仅反映EphA4(N)的相对丰度，但其不是蛋白质的精确数目或甚至荧光标签的数目，因为每个染料分子在成像期间可切换多次。
实例10：阻断EphA4正向信号传导可缓解Aβ(1-42)寡聚物介导的突触传递损伤
为了检验IgG1 m105抑制EphA4信号传导的能力，进行EphA4集群分析。如图12中所示，通过计算轴突上EphA4丛集的总面积(Tau阳性面积)的比例来定量EphA4丛集。
阻断EphA4正向信号传导可缓解Aβ(1-42)寡聚物介导的突触传递和突触可塑性的损伤。如图13中所见，m105抗体(其阻断内源性EphA4与艾普瑞林-A的相互相用)可缓解Aβ(1-42)寡聚物(500nM)介导的mEPSC的出现频率降低。所培养的海马神经元(22DIV)用2μg/ml m105处理30分钟，接着用500nM Aβ(1-42)处理24小时。
材料和方法
制备EphA4蛋白质。由Genscript(Piscataway,NJ)合成人类和小鼠EphA4基因区段。将编码与IgG1Fc和Avi标签(EphA4-Fc)融合的人类或小鼠EphA4的质体转染到293个自由式细胞(Invitrogen)中以用于短暂表达，并且使用小鼠EphA4-Fc进行生物淘选。由SDS-PAGE判定蛋白质纯度，并且以分光光度法(NanoVue,GE Healthcare)测量蛋白质浓度。
EphA4特异性Fab的选择、表达和纯化以及对IgG1的转化。使用与磁珠结合的生物素标记的小鼠EphA4-Fc融合蛋白(英杰公司)淘选使用来自40名健康志愿者的PMBCcDNA构筑的大型噬菌体呈现文库和另一个使用来自10名供体的脐血构筑的噬菌体呈现文库。在第一、第二和第三轮生物淘选期间，1012个噬菌体呈现Fab的扩增文库分别与5、3和1μg EphA4-Fc一起在室温下培育2小时。使用多克隆和单克隆噬菌体ELISA，从第三轮淘选鉴别结合于EphA4-Fc的纯系。对这些纯系的VH和VL域进行测序，并且鉴别显性纯系。对于转化成IgG1，扩增Fab的重链和轻链并且再克隆到pDR12载体(由D.Burton,Scripps Research Institute,La Jolla,CA提供)中。如先前所描述表达Fab和IgG1。由SDS-PAGE评估蛋白质纯度>95％并且以分光光度法(NanoVue,GE Healthcare)测量蛋白质浓度。
ELISA。在4℃下，将EphA4蛋白质以50纳克/孔涂于96孔盘(Costar)上，在PBS中过夜。对于噬菌体ELISA，来自每一轮淘选的噬菌体(多克隆噬菌体ELISA)或从受感染的TG1细胞随机收集的纯系(单克隆噬菌体ELISA)与经固定的抗原一起培育。用抗M13-HRP多克隆Ab检测结合的噬菌体(Pharmacia,Piscataway,NJ)。对于可溶性Fab结合分析，使用HRP结合的小鼠抗FLAG标签Ab(Sigma-Aldrich)检测Fab结合。对于IgG1结合分析，使用HRP结合的抗Fab Ab(Sigma-Aldrich)进行检测。对于竞争性ELISA分析，将小鼠EphA4重组型蛋白质的细胞外结构域或小鼠EphB2重组型蛋白质的细胞外结构域预先涂布到ELISA盘上并且接着与不同的IgG1在室温下一起培育1小时。在用DPBS洗涤若干次之后，EphA4或EphB2蛋白质接着与不同的生物素化重组型小鼠艾普瑞林-A/艾普瑞林-B Fc嵌合体蛋白质一起在室温下培育1小时。通过抗生蛋白链菌素-生物素侦测方法测定EphA4/EphB2和艾普瑞林-A/艾普瑞林-B的相互相用。
流式细胞测量术。为了测量IgG1与EphA4的相互作用，293T细胞或经小鼠EphA4转染的293T细胞的等分试样与IgG1或艾普瑞林-A5-Fc一起在250μL补充有10％胎牛血清的RPMI中、在冰上培育1小时。用培养基洗去未结合的蛋白质。二级抗体FITC结合的抗人类IgG(Fc特异性)抗体(Sigma-Aldrich)与细胞一起培育30分钟。洗涤细胞并且再悬浮于PBS加0.5％牛血清白蛋白(BSA)中以用于在(Becton Dickinson)上进行流式细胞测量术。
免疫沉淀分析。所培养的神经元与多种蛋白酶抑制剂一起溶解于放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(1％Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、150mM NaCl、10mM磷酸钠、2mM EDTA和0.2％钒酸钠)中。蛋白质溶解物与EphA4抗体一起在4℃下免疫沉淀2小时，接着与蛋白质G-琼脂糖一起在4℃下培育1小时。样品用RIPA缓冲液或缓冲液A洗涤并且再悬浮于SDS样品缓冲液中。使用4G10抗体通过西方印迹分析检测EphA4的酪氨酸磷酸化。
免疫细胞化学分析。所培养的神经元通过含4％多聚甲醛和5％蔗糖的PBS固定。在用1％牛血清白蛋白、4％山羊血清和0.1％Triton X-100(Sigma)阻断20分钟之后，细胞与相应的初级抗体一起在4℃下培育过夜并且接着用1×PBS洗涤3次。在室温下，在黑暗中经1小时添加Alexa Fluor二级抗体与1％牛血清白蛋白。通过超分辨率成像***分析EphA4的细胞定位。
EphA4集群。将大鼠海马神经元以6000个细胞/孔接种到经聚-D-赖氨酸(50μg/mL)涂布的48孔盘上。在3DIV下，神经元用IgG1预先处理20分钟并且接着再用预先集群的艾普瑞林-A1(0.25μg/mL)处理40分钟。固定细胞并且用抗EphA4和抗Tau-1抗体免疫染色以观察EphA4丛集和标识性轴突。使用IN Cell Analyzer 6000高含量分析***(GE Healthcare)进行EphA4丛集的细胞成像和定量。
mEPSC。所培养的海马神经元(约22-26DIV)用Aβ处理24小时。对于mEPSC记录，细胞保持在-70mV下。这些实验的滴管电阻通常是3-5MΩ，而串联电阻是15-20MΩ。在各种条件下，从各细胞经1分钟记录mEPSC。通过用于测量AMPAR EPSC的Mini Analysis Program(Synaptosoft)测量mEPSC。仅分析其中串联和输入电阻变化<10％的记录时期。
在本申请案中列举的所有专利案、专利申请案和其它公开案(包括GenBank寄存编号)都以全文引用的方式并入以用于所有目的。
序列表
<110> 美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）
迪米特尔·S·迪米特罗夫
应天磊
<120> 针对EPHA4的人类单克隆抗体和其用途
<130> 4239-93116-01
<160> 8
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 949
<212> PRT
<213> 人类
<400> 1
Met Ala Gly Ile Phe Tyr Phe Ala Leu Phe Ser Cys Leu Phe Gly Ile
1 5 10 15
Cys Asp Ala Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr
20 25 30
Leu Leu Asp Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser
35 40 45
Pro Leu Glu Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn
50 55 60
Thr Pro Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Pro Ser Gln
65 70 75 80
Asn Asn Trp Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg
85 90 95
Val Tyr Ile Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro
100 105 110
Gly Val Met Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu
115 120 125
Ser Asp Asn Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Asn Gln Phe Val Lys
130 135 140
Ile Asp Thr Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly
145 150 155 160
Asp Arg Ile Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu
165 170 175
Ser Lys Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile
180 185 190
Ala Leu Val Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val
195 200 205
Arg Asn Leu Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser
210 215 220
Ser Leu Val Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys
225 230 235 240
Asp Val Pro Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
245 250 255
Ile Gly Asn Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Arg Ser Gly Glu
260 265 270
Cys Gln Ala Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala
275 280 285
Thr Cys Ala Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala
290 295 300
Thr Ser Cys Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala
305 310 315 320
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile
325 330 335
Ser Asn Val Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln
340 345 350
Asn Thr Gly Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys
355 360 365
Cys Gly Ala Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val
370 375 380
His Tyr Thr Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Lys Val Ser Ile
385 390 395 400
Thr Asp Leu Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val
405 410 415
Asn Gly Val Ser Lys Tyr Asn Pro Asn Pro Asp Gln Ser Val Ser Val
420 425 430
Thr Val Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ala Leu Val Gln
435 440 445
Ala Lys Glu Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu Ala Trp Leu Glu Pro
450 455 460
Asp Arg Pro Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu Val Lys Tyr Tyr Glu
465 470 475 480
Lys Asp Gln Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val Arg Thr Ala Ala Arg
485 490 495
Asn Thr Asp Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr Ser Tyr Val Phe His
500 505 510
Val Arg Ala Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Pro Leu
515 520 525
Glu Val Thr Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile Ile Gly Asp Gly Ala
530 535 540
Asn Ser Thr Val Leu Leu Val Ser Val Ser Gly Ser Val Val Leu Val
545 550 555 560
Val Ile Leu Ile Ala Ala Phe Val Ile Ser Arg Arg Arg Ser Lys Tyr
565 570 575
Ser Lys Ala Lys Gln Glu Ala Asp Glu Glu Lys His Leu Asn Gln Gly
580 585 590
Val Arg Thr Tyr Val Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala
595 600 605
Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ala Ser Cys Ile Lys Ile Glu
610 615 620
Lys Val Ile Gly Val Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly Arg Leu
625 630 635 640
Lys Val Pro Gly Lys Arg Glu Ile Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys
645 650 655
Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser
660 665 670
Ile Met Gly Gln Phe Asp His Pro Asn Ile Ile His Leu Glu Gly Val
675 680 685
Val Thr Lys Cys Lys Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn
690 695 700
Gly Ser Leu Asp Ala Phe Leu Arg Lys Asn Asp Gly Arg Phe Thr Val
705 710 715 720
Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Gly Ser Gly Met Lys Tyr
725 730 735
Leu Ser Asp Met Ser Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile
740 745 750
Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Met Ser
755 760 765
Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro Glu Ala Ala Tyr Thr Thr Arg Gly Gly
770 775 780
Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Tyr Arg Lys
785 790 795 800
Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu
805 810 815
Val Met Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp
820 825 830
Val Ile Lys Ala Ile Glu Glu Gly Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp
835 840 845
Cys Pro Ile Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Glu
850 855 860
Arg Ser Asp Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Met Leu Asp Lys
865 870 875 880
Leu Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Arg Thr Gly Thr Glu Ser Ser
885 890 895
Arg Pro Asn Thr Ala Leu Leu Asp Pro Ser Ser Pro Glu Phe Ser Ala
900 905 910
Val Val Ser Val Gly Asp Trp Leu Gln Val Ile Lys Met Asp Arg Tyr
915 920 925
Lys Asp Asn Phe Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Thr Leu Glu Ala Val Val
930 935 940
His Val Asn Gln Glu
945
<210> 2
<211> 927
<212> PRT
<213> 人类
<400> 2
Met Asp Glu Lys Asn Thr Pro Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val
1 5 10 15
Met Glu Ala Ser Gln Asn Asn Trp Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg
20 25 30
Glu Gly Ala Gln Arg Val Tyr Ile Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp
35 40 45
Cys Asn Ser Leu Pro Gly Val Met Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn
50 55 60
Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Asp Asn Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu
65 70 75 80
Ser Gln Phe Gly Lys Ile Asp Thr Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr
85 90 95
Gln Val Asp Ile Gly Asp Arg Ile Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg
100 105 110
Asp Val Gly Pro Leu Ser Lys Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp
115 120 125
Val Gly Ala Cys Ile Ala Leu Val Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys
130 135 140
Cys Pro Leu Thr Val Arg Asn Leu Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr
145 150 155 160
Gly Ala Asp Thr Ser Ser Leu Val Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn
165 170 175
Asn Ser Glu Glu Lys Asp Val Pro Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly
180 185 190
Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Asn Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu
195 200 205
Glu Gln Asn Gly Glu Cys Gln Ala Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Asp Ala Ser Cys Ala Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser
225 230 235 240
Val Trp Glu Gly Ala Thr Ser Cys Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg
245 250 255
Ala Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala
260 265 270
Pro Leu Asn Leu Ile Ser Asn Val Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu
275 280 285
Trp Ser Ser Pro Gln Asn Thr Gly Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn
290 295 300
Val Val Cys Lys Lys Cys Gly Ala Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro
305 310 315 320
Cys Gly Ser Gly Val His Tyr Thr Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr
325 330 335
Thr Arg Val Ser Ile Thr Asp Leu Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe
340 345 350
Glu Ile Trp Ala Val Asn Glu Val Ser Lys Tyr Asn Pro Ser Pro Asp
355 360 365
Gln Ser Val Ser Val Thr Val Thr Thr Asn Gln Ala Ala Pro Ser Ser
370 375 380
Ile Ala Leu Val Gln Ala Lys Glu Val Thr Arg Tyr Ser Val Ala Leu
385 390 395 400
Ala Trp Leu Glu Pro Asp Arg Pro Asn Gly Val Ile Leu Glu Tyr Glu
405 410 415
Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Asp Gln Asn Glu Arg Ser Tyr Arg Ile Val
420 425 430
Arg Thr Ala Ala Arg Asn Thr Asp Ile Lys Gly Leu Asn Pro Leu Thr
435 440 445
Ser Tyr Val Phe His Val Arg Ala Arg Thr Ala Ala Gly Tyr Gly Asp
450 455 460
Phe Ser Glu Pro Leu Glu Val Thr Thr Asn Thr Val Pro Ser Arg Ile
465 470 475 480
Ile Gly Asp Gly Ala Asn Ser Thr Val Leu Leu Val Ser Val Ser Gly
485 490 495
Ser Val Val Leu Val Val Ile Leu Ile Ala Ala Phe Val Ile Ser Arg
500 505 510
Arg Arg Ser Lys Tyr Ser Lys Ala Lys Gln Glu Ala Asp Glu Glu Lys
515 520 525
His Leu Asn Gln Gly Val Arg Thr Tyr Val Asp Pro Phe Thr Tyr Glu
530 535 540
Asp Pro Asn Gln Ala Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ala Ser
545 550 555 560
Cys Ile Lys Ile Glu Lys Val Ile Gly Val Gly Glu Phe Gly Glu Val
565 570 575
Cys Ser Gly Arg Leu Lys Val Pro Gly Lys Arg Glu Ile Cys Val Ala
580 585 590
Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Gln Arg Arg Asp Phe
595 600 605
Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly Gln Phe Asp His Pro Asn Ile Ile
610 615 620
His Leu Glu Gly Val Val Thr Lys Cys Lys Pro Val Met Ile Ile Thr
625 630 635 640
Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ser Leu Asp Ala Phe Leu Arg Lys Asn Asp
645 650 655
Gly Arg Phe Thr Val Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Gly
660 665 670
Ser Gly Met Lys Tyr Leu Ser Asp Met Ser Tyr Val His Arg Asp Leu
675 680 685
Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser
690 695 700
Asp Phe Gly Met Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro Glu Ala Ala Tyr
705 710 715 720
Thr Thr Arg Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala
725 730 735
Ile Ala Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly
740 745 750
Ile Val Met Trp Glu Val Met Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp
755 760 765
Met Ser Asn Gln Asp Val Ile Lys Ala Ile Glu Glu Gly Tyr Arg Leu
770 775 780
Pro Pro Pro Met Asp Cys Pro Ile Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp
785 790 795 800
Cys Trp Gln Lys Glu Arg Ser Asp Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val
805 810 815
Asn Met Leu Asp Lys Leu Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Arg Thr
820 825 830
Gly Ser Glu Ser Ser Arg Pro Asn Thr Ala Leu Leu Asp Pro Ser Ser
835 840 845
Pro Glu Phe Ser Ala Val Val Ser Val Gly Asp Trp Leu Gln Ala Ile
850 855 860
Lys Met Asp Arg Tyr Lys Asp Asn Phe Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Thr
865 870 875 880
Leu Glu Ala Val Val His Met Ser Gln Asp Asp Leu Ala Arg Ile Gly
885 890 895
Ile Thr Ala Ile Thr His Gln Asn Lys Ile Leu Ser Ser Val Gln Ala
900 905 910
Met Arg Thr Gln Met Gln Gln Met His Gly Arg Met Val Pro Val
915 920 925
<210> 3
<211> 126
<212> PRT
<213> 人类
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Ala Pro Met Val Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Leu Arg Gly
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 126
<212> PRT
<213> 人类
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Leu Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Gly Thr His Gly
100 105 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人类
<400> 5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人类
<400> 6
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人类
<400> 7
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人类
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (51)

1.一种经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ IDNO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ IDNO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；
b)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ IDNO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和/或如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括SEQ ID NO:7的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或
c)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ IDNO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ IDNO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100，
其中所述单克隆抗体或抗原结合片段特异性结合EphA4。
2.根据权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：
a)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ IDNO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ IDNO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；
b)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸26-33、如SEQ IDNO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸51-58和如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列的氨基酸97-115，和轻链可变域，其包括SEQ ID NO:7的氨基酸27-37、如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100；或
c)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ IDNO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和/或如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100，和轻链可变域，其包括如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸27-37、如SEQ IDNO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸55-57和如SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的氨基酸94-100。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的经分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：
a)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列，和轻链可变域，其包括如SEQID NO:6阐述的氨基酸序列；
b)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:4阐述的氨基酸序列，和轻链可变域，其包括如SEQID NO:7阐述的氨基酸序列；或
c)重链可变域，其包括如SEQ ID NO:5阐述的氨基酸序列，和轻链可变域，其包括如SEQID NO:8阐述的氨基酸序列。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的经分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段是完全人类的。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的经分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是IgG。
6.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的经分离的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是scFv、Fv、Fab或F(ab)2抗原结合片段。
7.一种双特异性抗体，其包含根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
8.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的经分离的单克隆抗体或抗原结合片段，或根据权利要求7所述的双特异性抗体，其结合于效应分子。
9.根据权利要求8所述的经分离的单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体，其中所述效应分子是可检测标记。
10.根据权利要求9所述的经分离的单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体，其中所述可检测标记是荧光标记、放射性标记、抗生物素蛋白、生物素或酶。
11.根据权利要求8所述的经分离的单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体，其中所述效应分子是毒素或化学治疗剂。
12.根据权利要求11所述的经分离的单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体，其中所述毒素是绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)。
13.一种多核苷酸序列，其编码根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的双特异性抗体或根据权利要求8到12中任一权利要求所述的结合物，其任选地可操作地连接于启动子。
14.一种表达盒，其包含根据权利要求13所述的多核苷酸序列。
15.一种载体，其包含根据权利要求13所述的多核苷酸序列或根据权利要求14所述的表达盒。
16.根据权利要求15所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
17.一种宿主细胞，其包含根据权利要求15或权利要求16所述的载体。
18.一种检测生物样品中艾普瑞林(ephrin)EphA4的方法，其包含：
使所述样品与根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的双特异性抗体或根据权利要求8到10中任一权利要求所述的结合物在足以形成免疫复合物的条件下接触，和
检测存在或不存在所述免疫复合物，
其中存在所述免疫复合物表明所述生物样品中存在EphA4。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品来自人类个体。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品来自鼠类个体。
21.根据权利要求18所述的方法，其包含使所述样品与根据权利要求8到10中任一权利要求所述的结合物接触。
22.一种检测个体中存在肿瘤的方法，其包含
使来自怀疑患有肿瘤的个体的生物样品与有效量的根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的双特异性抗体或根据权利要求8到10中任一权利要求所述的结合物接触；和
检测所述单克隆抗体、抗原结合片段或所述双特异性抗体的结合；
其中与对照物相比，所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物的结合增加表示所述个体患有肿瘤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述对照物是参考标准或所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体与来自健康个体的样品的结合。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述肿瘤是乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。
25.根据权利要求22到24中任一权利要求所述的方法，其中所述样品是血液、血清、血浆、痰液或活组织检查样品。
26.一种测定患有肿瘤的个体的预后的方法，其包含
使来自怀疑患有肿瘤的个体的生物样品与有效量的根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的双特异性抗体或根据权利要求8到10中任一权利要求所述的结合物接触；和
检测所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与所述样品的结合；
其中与对照物相比，所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物的结合增加表示所述患有肿瘤的个体的预后较差。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述对照物是参考标准或所述单克隆抗体、抗原结合片段或双特异性抗体与来自健康个体的样品的结合。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤是乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。
29.根据权利要求26到28中任一权利要求所述的方法，其中所述样品是血液、血清、血浆、痰液或活组织检查样品。
30.一种用于治疗患有肿瘤的个体的方法，其包含向该个体投与治疗有效量的根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的双特异性抗体或根据权利要求8和11到12中任一权利要求所述的结合物，从而治疗所述肿瘤。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述肿瘤是乳癌、食道癌、非小细胞肺癌、胃癌和胰脏癌。
32.根据权利要求30所述的方法，其中治疗包含减小肿瘤体积或减少转移。
33.一种检测个体中存在神经退化或情感障碍或评估个体中产生神经退化或情感障碍的风险的方法，其包含
使来自个体的生物样品与有效量的根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的双特异性抗体或根据权利要求8到10中任一权利要求所述的结合物接触；和
检测所述单克隆抗体、抗原结合片段或所述双特异性抗体与EphA4的结合；
其中与对照物，所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与所述生物样品中EphA4的结合增加表明所述个体患有神经退化或情感障碍或具有升高的产生神经退化或情感障碍的风险。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述对照物是参考标准或所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与来自健康个体的样品中EphA4的结合。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述神经退化是AD、PD、MS或ALS。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述ALS是家族性或偶发性。
37.根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述情感障碍是抑郁症。
38.一种测定个体中神经退化或情感障碍的预后的方法，其包含
使来自怀疑患有神经退化或有效病症的个体的生物样品与有效量的根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的双特异性抗体或根据权利要求8到10中任一权利要求所述的结合物接触；和
检测所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与所述生物样品中EphA4的结合；
其中与对照物相比，所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与EphA4的结合增加表明所述个体的预后较差。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述对照物是参考标准或所述单克隆抗体、抗原结合片段、双特异性抗体或结合物与来自健康个体的样品中EphA4的结合。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述神经退化是AD、PD、MS或ALS。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述ALS是家族性或偶发性。
42.根据权利要求38到40中任一权利要求所述的方法，其中所述样品是血液、血清、血浆、痰液或活组织检查样品。
43.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述情感障碍是抑郁症。
44.一种用于治疗患有神经退化或情感障碍的个体的方法，其包含向该个体投与治疗有效量的根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的双特异性抗体或根据权利要求8和11到12中任一权利要求所述的结合物，从而治疗所述神经退化或有效病症。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述神经退化是AD、PD、MS或ALS。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述ALS是家族性或偶发性。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述情感障碍是抑郁症。
48.根据权利要求44所述的方法，其中所述单克隆抗体是IgG1m105。
49.一种医药组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1到6中任一权利要求所述的单克隆抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的双特异性抗体或根据权利要求8到12中任一权利要求所述的结合物，编码所述抗体、抗原结合片段或结合物的核酸，或包含所述核酸的载体，和医药学上可接受的载剂。
50.根据权利要求48所述的医药组合物，其经配制以用于持续释放。
51.根据权利要求48所述的医药组合物，其中所述单克隆抗体是IgG1m105。
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