CN105026429B - 间皮素结构域-特异性单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Abstract

本文所述的是利用兔杂交瘤技术以及一组截短的间皮素结构域片段，以确定结合间皮素特异区的抗间皮素的mAb。在本发明公开内容的一个方面中，兔的mAb结合不是区域I的一部分的表位。具体地，所鉴别的mAb(YP187，YP223，YP218和YP3)以亚纳摩尔的亲和力结合间皮素的区域II(391‑486)、区域III(487‑581)或天然构象。这些抗体并不与间皮素特异性免疫毒素SS1P或间皮素特异性抗体MORAb‑009竞争结合。在另一方面，本发明公开的是一种结合间皮素的区域I的高亲合力的兔mAb(YP158)。YP158以高亲和力和特异性结合肿瘤细胞和组织中的天然间皮素蛋白质。

Description

间皮素结构域-特异性单克隆抗体及其用途
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2012年8月21日提交的美国临时申请号61/691,719的优先权，所述申请以引用的方式全文纳入本文。
技术领域
本公开内容涉及特异性针对间皮素的单克隆抗体，特别是针对间皮素的片段的单克隆抗体，及其用于癌症的诊断和治疗的用途。
背景技术
人间皮素是一种40kDa的细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)-连接的糖蛋白。该蛋白质作为70kD的前体被合成，然后被蛋白水解处理。间皮素的30KD氨基末端被分泌出来，并被称为巨核细胞强化因子(Yamaguchi et al.，J.Biol.Chem.269：805808，1994)。40kD的羧基末端作为成熟的间皮素与膜保持结合(Chang et al.，Natl.Acad.Sci.USA93：136140，1996)。
间皮素以相对低的水平存在于健康个体的胸膜、腹膜及心包膜的间皮细胞中，但在许多不同的癌症中高度表达，所述癌症包括间皮瘤、胃癌、鳞状细胞癌、***癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌(cholangiocarcinoma)、乳腺癌和卵巢癌(Hassan et al.，Clin.CancerRes.10：3937-3942，2004；McGuire et al.，N.Engl.J.Med.334：1-6，1996；Argani et al.，Clin.Cancer Res.7：3862-3868，2001；Hassan et al.，Αppl.Immunohistochem.Mol.Morphol.13：243-247，2005；Li et al.，Mol.Cancer Ther.7：286-296，2008；Yu et al.，J Cancer 1：141-1749，2010；Tchou et al.，Breast CancerRes Treat 133(2)：799-804，2012；美国专利号7,081,518)。具体而言，已有报道称大多数卵巢浆液性癌和胰腺腺癌表达高水平的间皮素(Yen et al.，Clin.Cancer Res.12：827-831，2006)。此外，已经在多于55％的肺癌和多于70％的卵巢癌中检测到高水平的间皮素(Hassan et al.，Αppl.Immunohistochem.Mol.Morphol.13：243-247，2005；Ho et al.，Clin.Cancer Res.13(5)：1571-1575，2007)。间皮素在正常细胞中的有限表达使其成为用于肿瘤免疫治疗的可行靶标。
间皮素也可以用作用于某些类型的癌症的诊断和预后的标记物，这是因为可以在一些患有间皮素-阳性的癌症的患者的血液中检测到痕量的间皮素(Cristaudo et al.，Clin.Cancer Res.13：5076-5081，2007)。据报道，可以通过缺失间皮素羧基末端或者通过从间皮素的膜结合形式上蛋白水解性切割，而将间皮素释放到血清中(Hassan et al.，Clin.Cancer Res.10：3937-3942，2004)。在暴露于石棉的工人中出现恶性间皮瘤之前的几年，可以检测到可溶形式的间皮素的增加(Creaney and Robinson，Hematol.Oncol.Clin.North Am.19：1025-1040，2005)。此外，患有卵巢癌，胰腺癌和肺癌的患者的血清中也含有增多的可溶性间皮素(Cristaudo et al.，Clin.Cancer Res.13：5076-5081，2007；Hassan et al.，Clin.Cancer Res.12：447-453，2006；Croso et al.，Cancer Detect.Prev.30：180-187，2006)。
发明内容
本文公开了一组以高度亲和力结合全长间皮素和/或间皮素片段的单克隆抗体。本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子，如IgG抗体，以及抗体片段。还提供了包含与间皮素结合例如特异性结合的抗体的组合物，编码这些抗体的核酸分子，包含所述核酸分子的表达载体，以及表达所述核酸分子的分离的宿主细胞。还提供了包含本文公开的抗体和效应分子(例如毒素)的免疫缀合物。
本文提供的抗体和组合物可用于各种目的，例如用于确认对表达间皮素的癌症的确断，所述癌症例如间皮瘤，***癌，肺癌，胃癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌。因而，本文提供了通过以下方式确认受试者中的癌症的诊断的方法：使来自被诊断患有癌症的受试者的样品与结合间皮素的单克隆抗体接触，并检测所述抗体与所述样品的结合。相对于所述抗体与对照样品的结合，所述抗体与所述样品的结合增加，则确认所述癌症诊断。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使特异性识别所述间皮素-特异性抗体的第二抗体与所述样品接触，并检测所述第二抗体的结合。
类似地，本文提供了一种检测受试者中的表达间皮素的癌症的方法。所述方法包括使来自所述受试者的样品与本文所述的单克隆抗体接触，并检测所述抗体与所述样品的结合。所述抗体与所述样品的结合相对于对照样品的增加检测出所述受试者中的癌症。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使特异性识别所述间皮素-特异性抗体的第二抗体与所述样品接触，并检测所述第二抗体的结合。
还提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述癌症例如间皮瘤，***癌，肺癌，胃癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌。所述方法是通过以下方式进行：选择患有表达间皮素的癌症的受试者，并给予所述受试者治疗有效量的特异性针对间皮素的单克隆抗体或者包含所述抗体的免疫缀合物。
还提供了一种抑制受试者的肿瘤生长或转移的方法，所述方法是通过以下方式进行：选择患有表达间皮素的癌症的受试者，并给予所述受试者治疗有效量的本文公开的抗体、免疫缀合物或组合物。
根据下面的参照附图进行的详细描述，本发明前述的和其它的目标、特征和优点将变得更加明显。
附图说明
图1是间皮素的结构示意图。目前的抗-间皮素的治疗性抗体和免疫毒素(包括SS1P和MORAb-009)识别细胞表面间皮素的高免疫原性N-末端区域I内的表位，该N-末端区域I内的表位也结合粘蛋白MUC16/CA125。
图2A-2D为示出了通过ELISA对结构域特异性兔单克隆抗体(mAb)的表征的图。用5μg/mL的全长间皮素(全长)、区域I(第296-390位残基)、区域II(第391-486位残基)和区域III(第487-598位残基)片段包被ELISA板。将区域I mAb克隆(图2A)，区域II mAb克隆(图2B)，区域III mAb克隆(图2C)，以及构象敏感性mAb克隆(图2D)的兔杂交瘤上清液加入ELISA板中，通过山羊抗兔IgG轻链-特异性HRP缀合物检测与间皮素或其片段结合的兔mAb。
图3A-3D为示出了兔mAb与NCI-H226(间皮瘤)细胞系的结合的流式细胞术点图。将NCI-H226细胞(1×106)与区域I结合物(图3A)、构象敏感性结合物(图3B)、区域III结合物(图3C)和区域II结合物(图3D)的兔杂交瘤上清液(用FACS缓冲液1:2稀释)孵育。通过山羊抗兔IgG PE缀合物检测兔mAb与细胞表面间皮素的结合。
图4为示出了三明治ELISA结果的图，其评估了在SS1P免疫毒素的存在下，不同稀释度的YP187、YP223、YP218和YP3与间皮素片段的结合。用SS1P免疫毒素(1μg/mL)包被ELISA板。将重组间皮素蛋白(1μg/mL)加入板中。洗涤后，加入兔mAb上清液(1:3系列稀释)。最后，加入山羊抗兔IgG轻链HRP缀合物(1:5000)以检测兔mAb的结合。
图5为示出了三明治ELISA的结果的图，其评估了(在SS1P免疫毒素的存在下)YP187、YP223、YP218和YP3与不同浓度的重组间皮素的结合。将SS1P免疫毒素(5μg/mL)包被在ELISA板上。从10μg/mL开始1:3系列稀释重组间皮素蛋白，并加入到ELISA板中。洗涤后，加入兔mAb上清液(1:5)。加入山羊抗兔IgG轻链(1:5000)HRP缀合物以检测兔mAb的结合。
图6A-6C为示出了通过ELISA进行的间皮素结合亲和力(KD)的测量的图。将不同量的兔mAb YP223(图6A)、YP218(图6B)和YP3(图6C)与固定量的间皮素(1μg/mL)在室温下孵育1小时。然后洗涤该板，进行标准的ELISA程序以测定兔mAb与间皮素的结合。通过适用于Windows的Prism(3.02版本)(GraphPad software，San Diego，CA)确定亲和力KD值。YP223、YP218和YP3的KD值分别是0.65nM、0.91nM和0.42nM。
图7A-7B为示出了通过三明治ELISA进行的对培养物上清液中的可溶性间皮素的检测的图。用SS1P(5μg/mL)包被ELISA板。加入H9(图7A)或K5(图7B)的培养物上清液(1:3系列稀释)。洗涤后，加入兔mAb培养物上清液(1:5)。使用山羊抗兔轻链特异性HRP缀合物(1:5000)检测兔mAb的结合。
图8A和8B为示出了YP158与癌细胞和组织中的间皮素的结合的免疫印迹。(图8A)人肝癌细胞系中的间皮素蛋白的免疫印迹分析。除A431和H9(仅上样2μg的总蛋白)外，每种样品都上样40μg的全细胞裂解物。(图8B)癌症样品中的间皮素蛋白的免疫印迹分析。使用OVCAR3(人卵巢癌细胞系)和H9(A431.MSLN+)作为阳性对照。使用A431(MSLN-)作为阴性对照。MSLN：间皮素(～40kDa)；前体：～70kDa。
图9示出了A431/H9(表皮样癌A431细胞中强制表达间皮素)、NCI-H226(间皮癌)和KMBC(胆管癌)细胞提取物中的内源性间皮素蛋白的免疫沉淀。使用针对间皮素的人mAb(hAb)拉下所述细胞裂解物中的内源性间皮素蛋白。使用YP158探测拉下的蛋白质中的天然间皮素。C：不相关的VH单-结构域人Fc融合蛋白；IP：免疫沉淀；输入：在免疫沉淀前，对全细胞裂解物的蛋白质印迹。
图10为示出了在SS1P免疫毒素的存在下对可溶性间皮素的检测的图。该测定在三明治ELISA中使用YP223(区域II结合物)和YP218(区域III结合物)。即使在SS1P免疫毒素的存在下，也检测到了可溶性间皮素。
图11为示出了抗间皮素免疫毒素针对表达间皮素的细胞的结合亲和力的图。通过流式细胞术测定并通过荧光强度指示免疫毒素与这些细胞系的结合。hYP218scFv-PE38是人源化的YP218scFv-PE38。人源化的YP218Fv对H9细胞的结合亲和力与最初的兔YP218Fv的结合亲和力相似(Kd＝～4nm)。
图12为示出了YP218scFv-PE38对4种恶性间皮瘤患者原代细胞系的细胞毒性的一系列图。在所述4种原代细胞系(RH16、RH18、RH19和RH21)中，3种对抗间皮素免疫毒素敏感。在所述3种敏感的原代系(RH16、RH19和RH21)中，YP218scFv-PE38的效力是SS1P的2至5倍。
图13为示出了在人恶性间皮瘤模型中YP218scFv-PE38免疫毒素比SS1P更有效的图。将6周的雌性BALB/c nu/nu小鼠腹膜内接种3×l06个稳定表达高水平的Luc/GFP的NCI-H226间皮瘤细胞。在第12、14、16和18天，对小鼠腹膜内给予SS1P(0.4mg/Kg)、YP218scFv-PE38(0.4mg/Kg)或载体(PBS)。通过生物发光光度法测定肿瘤生长，每周3次。基于对照(载体)组，标准化相对生物发光活性。箭头指示注射。N＝5只/组。
序列表
所附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用37C.F.R 1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码显示。仅示出了每个核酸序列的一条链，但是应理解任何对所示链的提及均包括互补链在内。序列表以创建于2013年8月14日的78.7KB的ASCII文本文件提交，并以引用的方式纳入本文。在所附的序列表中：
SEQ ID NO:1是假单胞菌外毒素(PE)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是PE38的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是PE-LR的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是PE-LR/6X的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是具有降低免疫原性的PE的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是PE-LR/8M的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是人间皮素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是YP223VH结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9是YP223VH结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是YP223VL结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是YP223VL结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是YP218VH结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是YP218VH结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是YP218VL结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是YP218VL结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是YP3VH结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17是YP3VH结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是YP3VL结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19是YP3VL结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是YP187克隆1VH结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21是YP187克隆1VH结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是YP187VL结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23是YP187VL结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是YP158VH结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25是YP158VH结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是YP158VL结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27是YP158VL结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是YP187克隆2VH结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO:29是YP187克隆2VH结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是YP218scFv-PE38免疫毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO:31是YP218scFv-PE38免疫毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32是人源化YP218scFv-PE38免疫毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO:33是人源化YP218scFv-PE38免疫毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是YP223scFv-PE38免疫毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO:35是YP223scFv-PE38免疫毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是YP3scFv-PE38免疫毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO:37是YP3scFv-PE38免疫毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38是YP187scFv-PE38免疫毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO:39是YP187scFv-PE38免疫毒素的氨基酸序列。
具体实施方式
I.缩写
CAR 嵌合抗原受体
CDR 互补决定区
CTL 细胞毒性T淋巴细胞
ELISA 酶联免疫吸附测定
EM 效应分子
FACS 荧光激活细胞分选
GPI 糖基磷脂酰肌醇
HRP 辣根过氧化物酶
Ig 免疫球蛋白
Kd 解离常数
mAb 单克隆抗体
PE 假单胞菌外毒素
PE 藻红蛋白
VH 重链可变区
VL 轻链可变区
II.术语和方法
除非另外指明，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V,published by Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释：
抗体：至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其识别并结合(例如特异性识别并特异性结合)抗原(例如间皮素)或其片段的表位。免疫球蛋白分子包含重链和轻链，所述重链和轻链各自具有可变区，称为重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。所述VH区和VL区一起负责结合被抗体识别的抗原。
抗体包括完整的免疫球蛋白以及本领域公知的抗体的变体和部分，例如单结构域抗体(例如VH结构域抗体)、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定的Fv蛋白(disulfide stabilized Fv proteins,“dsFv”)。scFv蛋白是其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在dsFv中，所述链被突变以引入二硫键来稳定所述链的连接。术语“抗体”还包括遗传改造的形式例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异缀合抗体(heteroconjugate antibody)(例如双特异性抗体)。还可见于Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。
通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重(H)链和轻(L)链。存在两种轻链类型：λ和κ。存在5种决定抗体分子功能活性的主要重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每条重链和轻链均含有恒定区和可变区(所述区还称为“结构域”)。组合起来，重链可变区和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)隔开的“框架”区。已经根据Kabat et al.(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health andHuman Services,1991)和ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(参见，Lefranc,Nucleic AcidsRes 29:207-9,2001)限定了框架区和CDR的范围。Kabat数据库保持在线。不同的轻链或重链的框架区的序列在同一物种例如人内是相对保守的。抗体的框架区，也就是成分轻链和重链的结合框架区，用于在三维空间中安置和排列所述CDR。
CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR一般被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始顺序编号，并且通常通过所述具体CDR所在的链来鉴定。因此，VH CDR3(或H-CDR3)位于其所在抗体的重链可变区，而VL CDR1(或L-CDR1)是来自其所在抗体的轻链可变区的CDR1。例如，结合间皮素的抗体会具有特定的VH区和VL区序列，并因此具有特定的CDR序列。具有不同特异性的抗体(即，对不同的抗原有不同的结合位点)具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间的CDR不同，但是仅CDR内有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。
提及“VH”或“VH”时，是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的免疫球蛋白重链可变区。提及“VL”或“VL”时，是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的免疫球蛋白轻链可变区。
“单克隆抗体”是由B-淋巴细胞的单个克隆或由其中已转染单一抗体的轻链和/或重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体是由本领域技术人员所知晓的方法产生的，例如通过骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的融合体制备形成杂合抗体的细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
“嵌合抗体”含有来自两种或更多种通常来自不同动物物种的不同抗体分子的结构元件。例如，嵌合抗体可以具有来自一个物种例如人的框架残基和来自另一物种的CDR(其通常赋予抗原以结合性)例如特异性结合间皮素鼠抗体。
“人”抗体(也称为“全人”抗体)是包含人框架区和人免疫球蛋白的全部CDR的抗体。在一个实例中，所述框架和所述CDR是来自相同来源的人重链和/或轻链氨基酸序列。然而，可以改造一种人抗体的框架以包含不同的人抗体的CDR。“人源化”免疫球蛋白是含有人框架区和一个或多个来自非人(例如小鼠、兔、大鼠或合成的)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方案中，在一种人源化免疫球蛋白中，所有的CDR均来自供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在，但是如果存在则必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即，至少约85-90％相同，例如约95％或更高的相同。因此，可能除了所述CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分均与天然的人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。“人源化抗体”是含有人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以具有限数量的由取自供体框架的氨基酸进行的置换。人源化或其他的单克隆抗体可以具有对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本没有影响的额外的保守性氨基酸置换。人源化免疫球蛋白可以通过遗传工程方法构建(参见，例如，美国专利No.5,585,089)。
结合亲和力：是指抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，亲和力是通过由Frankel et al.(Mol.Immunol.,16:101-106,1979)描述的斯卡查德方法的修改方法计算的。在另一实施方案中，结合亲和力是通过抗原/抗体的解离速率测量的。在另一实施方案中，高结合亲和力是通过竞争性放射免疫测定测量的。在另一实施方案中，结合亲和力是通过ELISA测量的。“特异性结合”抗原(例如间皮素)的抗体是以高亲和力结合所述抗原并且不显著结合其他不相关抗原的抗体。
化学治疗剂：在特征为异常细胞生长的疾病的治疗中有治疗作用的任何化学试剂。这样的疾病包括肿瘤、新生物(neoplasm)和癌症以及特征为增生性生长的疾病，例如银屑病。在一个实施方案中，化学治疗剂是用于治疗间皮瘤或另一肿瘤(例如胃癌、鳞状细胞癌、***癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、乳腺癌或卵巢癌)的试剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是放射性化合物。本领域技术人员可容易地鉴定可使用的化学治疗剂(参见，例如，Slapak and Kufe,Principles of Cancer Therapy,Chapter 86in Harrison'sPrinciples of Internal Medicine,14th edition；Perry et al.,Chemotherapy,Ch.17in Abeloff,Clinical Oncology 2nd ed.,2000Churchill Livingstone,Inc；Baltzer,L.,Berkery,R.(eds.):Oncology Pocket Guide to Chemotherapy,2nded.St.Louis,Mosby-Year Book,1995；Fischer,D.S.,Knobf,M.F.,Durivage,H.J.(eds):The Cancer Chemotherapy Handbook,4th ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1993)。联合化疗是给予多于一种的试剂来治疗癌症。一个实例是与放射性或化学化合物联合使用的结合间皮素的抗体(或免疫缀合物)的给药。
胆管癌：一种在肝脏中的胆管中内衬的细胞中发生的癌症类型。
保守性变体：“保守性”氨基酸置换是基本上不影响或降低蛋白的亲和力(例如抗体对间皮素的亲和力)的那些置换。例如，特异性结合间皮素的单克隆抗体可包含至多约1、至多约2、至多约5、至多约10或至多约15个保守性置换，并且特异性结合间皮素多肽。术语保守性变体还包含使用置换的氨基酸代替未置换的亲本氨基酸，只要抗体特异性结合间皮素。非保守置换是降低活性或与间皮素结合的那些。
提供功能上类似的氨基酸的保守性氨基酸置换表是本领域技术人员所公知的。以下六组是被认为是互为保守性置换的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
互补决定区(CDR)：在一起限定天然Ig结合位点的天然Fv区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。Ig的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。
接触：以直接物理连接的方式放置；包括固体形式和液体形式。
细胞毒性：分子例如免疫毒素对意欲靶向的细胞的毒性，而不是对生物体的其他细胞的毒性。在一个实施方案中，相反地，术语“毒性”是指免疫毒素对除意欲被所述免疫毒素的靶向部分靶向的那些细胞之外的细胞的毒性，术语“动物毒性”是指免疫毒素对动物的毒性，这是由于免疫毒素对除意欲被所述免疫毒素靶向的细胞之外的细胞的毒性。
简并变体：在本公开内容的上下文中，“简并变体”是指编码间皮素多肽或结合间皮素的抗体的多核苷酸，所述多核苷酸包括因遗传密码导致简并的序列。存在20种天然氨基酸，其中大多数由多于一种的密码子限定。因此，所有的简并核苷酸序列都包括在内，只要所述核苷酸序列编码的间皮素多肽或结合间皮素的抗体的氨基酸序列没有改变。
诊断：鉴定病理病症例如但不限于癌症的存在或性质。诊断方法的灵敏度和特异性有所不同。诊断测定的“灵敏度”是被测试为阳性的患病个体的百分数(真阳性的百分数)。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中假阳性率定义为被测试为阳性的没有患所述疾病的那些个体的比例。虽然某一具体的诊断方法可能不能提供对病症的明确诊断，但是只要所述方法可提供帮助诊断的阳性指示就足够了。“预后”是指病理病症例如癌症或转移的发展(例如严重程度)的可能性。
效应分子：嵌合分子的一部分，其意欲对所述嵌合分子靶向的细胞具有所需要的作用。效应分子还被称为效应部分(effector moiety，EM)、治疗剂或诊断剂或类似的术语。
治疗剂包括化合物例如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂质、碳水化合物或重组病毒。核酸治疗和诊断部分包括反义核酸、用于与单链或双链DNA共价交联的衍生寡核苷酸、和三链形成寡核苷酸。或者，连接到靶向部分(例如抗间皮素的抗体)的分子可以为包裹***(encapsulation system)例如脂质体或微团，所述脂质体或微团含有治疗组合物例如药物、核酸(例如反义核酸)或可被保护以免于直接暴露于循环***的另一治疗部分。制备连接有抗体的脂质体的方法是本领域技术人员所公知的(参见，例如，美国专利No.4,957,735；和Connor et al.,Pharm.Ther.28:341-365,1985)。诊断剂或诊断部分包括放射性同位素和其他可检测标记物。用于这种目的的可检测标记物在本领域中也是公知的，包括放射性同位素例如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I、荧光团、化学发光剂和酶。
表位：抗原决定簇。这些是具有抗原性(即可诱发特异性免疫应答)的分子上的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽(例如间皮素)上的特定抗原表位。
框架区：介于CDR之间的氨基酸序列。框架区包括轻链可变框架区和重链可变框架区。框架区起到使CDR处于合适的取向以用于抗原结合的作用。
宿主细胞：在其中载体可以被增殖并且其DNA被表达的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，这类后代被包括在内。
杂交瘤：用于产生单克隆抗体的杂交细胞。通过产生抗体的细胞(如从经免疫的动物例如小鼠，大鼠或兔获得的B细胞)和骨髓瘤细胞的融合产生杂交瘤。
免疫应答：免疫***的细胞，例如B细胞、T细胞或单核细胞，对刺激的应答。在一个实施方案中，所述应答特异性针对特定抗原(“抗原特异性应答”)。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在另一实施方案中，所述应答为B细胞应答，并且导致产生特异性抗体。
免疫缀合物：效应分子与抗体或其功能片段的共价连接。效应分子可以为可检测标记物或免疫毒素。毒素的具体非限制性实例包括，但不限于，相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素(PE，例如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素，或它们的经修饰的毒素，或直接或间接地抑制细胞生长或杀死细胞的其他毒性试剂。例如PE和DT是一般通过肝毒性引发死亡的高毒性化合物。然而，PE和DT可通过以下方式被修饰为可用作免疫毒素的形式：除去所述毒素的天然靶向组分(例如PE的结构域Ia和DT的B链)并将其置换为不同的靶向部分(例如抗体)。“嵌合分子”是缀合(偶联)至效应分子的靶向部分，例如配体或抗体。术语“缀合”或“连接”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子。在一个实施方案中，抗体被连接到效应分子。在另一实施方案中，连接到效应分子的抗体被进一步连接到脂质或其他分子如蛋白或肽，以增加其在体内的半衰期。连接是可通过化学或重组方式进行。在一个实施方案中，所述连接是化学连接，其中抗体部分和效应分子之间的反应产生了在所述两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。在所述抗体和效应分子之间可任选地包含肽接头(短的肽序列)。因为免疫缀合物最初是由两个具有独立功能的分子(例如抗体和效应分子)制备，它们有时还被称为“嵌合分子”。因此，本文使用的术语“嵌合分子”是指缀合(偶联)至效应分子的靶向部分，例如配体或抗体。
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞器)已经被从所述组分天然存在的环境(例如细胞)中的其他生物组分(即，其他染色体及染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)中基本上分离或纯化出来。已经被“分离”的核酸和蛋白质包括用标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
标记物：直接或间接地缀合到另一分子(例如抗体或蛋白质)以便于检测该分子的可检测的化合物或组合物。标记的具体非限制性实例包括荧光标签、酶连接物和放射性同位素。在一个实例中，“标记的抗体”是指在抗体中纳入另一分子。例如，所述标记物为可检测的标记物，例如纳入放射性标记的氨基酸或者连接到可通过经标记的亲和素(例如可以通过光学或比色方法检测的含有荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。多种标记多肽和糖蛋白的方法是本领域中已知的并且可以使用。可用于多肽的标记物的实例包括，但不限于如下：放射性同位素或放射性核苷酸(例如35S、11C、13N、15O、18F、19F、99mTc、131I、3H、14C、15N、90Y、99Tc、111In和125I)、荧光标记物(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、稀土无机发光材料(lanthanide phosphor))、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基团、由第二报告分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)或磁性试剂例如钆螯合物。在一些实施方案中，标记物被不同长度的间隔臂连接以减少可能的空间位阻。
接头：在一些情况中，接头是抗体结合片段(例如Fv片段)内的肽，其起到间接地将重链可变区结合至轻链可变区间的作用。“接头”还可以指用于将靶向部分(例如抗体)连接至效应分子(例如细胞毒素或可检测标记)的肽。
术语“缀合”、“连接(join)”、“结合”、“连接(linking)”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子，或者是指将放射性核素或其他分子与多肽(例如scFv)共价连接。在具体上下文中，所述术语包括连接配体(例如抗体部分)与效应分子。所述连接是可通过化学或重组的方式进行。“化学方式”是指所述抗体部分与效应分子之间的反应，其使得所述两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
肺癌：在肺组织中形成的通常在气体通道内衬的细胞中的癌症。两种主要的类型是小细胞肺癌和非小细胞肺癌。基于细胞在显微镜下的外观诊断这些类型。
哺乳动物：该术语包括人和非人哺乳动物。类似的，术语“受试者”包括人受试者和兽医受试者。
间皮素：一种40kDa的细胞-表面糖基磷脂酰肌醇(GPI)-连接的糖蛋白。人间皮素蛋白质作为69kD前体被合成，然后所述前体被蛋白水解处理。间皮素的30kD氨基末端被分泌并被称为巨核细胞强化因子(Yamaguchi et al.，J.Biol.Chem.269：805808，1994)。40kD的羧基末端作为成熟间皮素保持与膜结合(Chang et al.，Natl.Acad.Sci.USA93：136140，1996)。示例性的间皮素的核酸和氨基酸序列记载于PCT公开号WO97/25068；美国专利号6,083,502；Chang and Pastan，Int.J.Cancer 57：90，1994；Chang and Pastan，Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：136，1996；Brinkmann et al.，Int.J.Cancer71：638，1997；以及Chowdhury et al.，Mol.Immunol.34：9，1997。人间皮素的氨基酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:7。间皮素也指保持在细胞内的间皮素蛋白或多肽，以及分泌的和/或分离的细胞外的间皮素蛋白。
间皮瘤：一类衍生自胸膜和腹膜的内衬细胞的新生物，其生长为覆盖内脏的厚层，并且包括包覆(立方细胞内衬的)腺状空间的纺锤形细胞或纤维组织。间皮素往往起源于肺、心脏或腹部内衬的组织。在一些情况下，间皮瘤是由暴露于石棉引起的。
MORAb-009：一种嵌合(小鼠/人)单克隆IgG/κ，具有针对间皮素的高亲和力和特异性。小鼠抗间皮素scFv的VH和VL区是通过在间皮素阳性细胞上淘选噬菌体展示文库来获得，所述噬菌体展示文库是以间皮素cDNA免疫的小鼠的脾脏mRNA制成。VH和VL区被移植在具有人IgG1和κ恒定区的框架中(Hassan and Ho，Eur J Cancer 44(l)：46-53，2008)。
瘤形成、恶性肿瘤、癌症和肿瘤：新生物是由过度细胞***引起的组织或细胞的异常生长。新生物生长可产生肿瘤。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，其可以以肿瘤的数目、体积或重量来测量。不转移的肿瘤称为“良性的”。侵袭周围组织和/或可转移的肿瘤称为“恶性的”。血液肿瘤的实例包括白血病，其包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病和成髓细胞白血病、前髓细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin'sdisease)、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高级别形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤例如肉瘤和癌的实例，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤、间皮瘤、胆管癌、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、***癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、***状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌(bile duct carcinoma)、绒毛膜癌、维尔姆斯氏瘤、***、睾丸肿瘤、***瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅神经胶质瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜神经胶质瘤(menangioma)、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
在某些实例中，癌症是间皮瘤，胃癌，鳞状细胞癌，***癌，胰腺癌，肺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能关系的方式放置时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列是可操作地连接的。例如，如果启动子例如CMV启动子影响编码序列的转录或表达，那么所述启动子与所述编码序列是可操作地连接的。所述可操作地连接的DNA序列通常是连续的，并且当需要将两个蛋白编码区域连接时，位于相同的读码框中。
卵巢癌：在卵巢(一对雌性生殖腺体之一，其中形成卵(ova或egg))组织中形成的癌症。大多数卵巢癌是卵巢上皮癌(在卵巢表面上的细胞中开始的癌症)，或者是恶性生殖细胞肿瘤(在***中开始的癌症)。
胰腺癌：其中在胰腺组织中发现恶性(癌)细胞的疾病。也称为外分泌癌。
药剂：当被正确地给予受试者或细胞时能够诱导所需的治疗或预防作用的化学化合物或组合物。
可药用载体：可使用的可药用载体是常规的。Remington’s PharmaceuticalSciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co,Easton,PA,15 th Edition,1975记载了适用于本文公开的抗体的药物递送的组合物和制剂。
通常，所述载体的性质取决于采用的具体给药方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体作为运载体(vehicle)，所述可注射流体包含可药用和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液(aqueous dextrose)、甘油等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可以包括，例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体之外，待给药的药物组合物还可以包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理病症开始发展后改善其征象或症状的治疗性干预，例如减少肿瘤负荷或减小转移灶的尺寸数目。“改善”是指降低疾病(例如癌症)的征象或症状的数量或严重程度。
***癌：***(雄性生殖***中的腺体，位于膀胱下方和直肠前方)组织中形成的癌症。***癌通常在老年男性中发生。
纯化的：术语纯化的并不需要绝对的纯净，而是意欲作为一个相对的术语。因此，例如，纯化的肽制品是其中所述肽或蛋白质比所述肽或蛋白在其细胞中的天然环境下更加富集的肽制品。在一个实施方案中，纯化制品以使得所述蛋白质或肽占所述制品的总肽或蛋白质含量的至少50％。基本上纯化表示从其他蛋白质或细胞组分中纯化。基本上纯的蛋白质是至少60％、70％、80％、90％、95％或98％纯的。因此，在一个具体的非限制性实例中，基本上纯的蛋白质是90％不含其他蛋白或细胞组分的。
重组体：重组核酸是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个原本分离的序列片段而制备的序列的核酸。该人工组合通常是通过化学合成或者通过人工操作核酸的分离片段(例如通过遗传程技术)来完成。
重组毒素：其中细胞靶向部分与毒素融合的嵌合蛋白(Pastan et al.,Science,254:1173-1177,1991)。如果细胞靶向部分是抗体的Fv部分，那么所述分子被称为重组免疫毒素(Chaudhary et al.,Nature,339:394-397,1989)。在遗传上改变所述毒素部分以使其不能结合大多数正常细胞上存在的毒素受体。重组免疫毒素选择性地杀死被抗原结合域识别的细胞。这些重组毒素和免疫毒素可用于治疗癌症，例如表达间皮素的癌症。
样品(或生物样品)：获自受试者的含有基因组DNA、RNA(包括mRNA)、蛋白质或它们的组合的生物样本。实例包括，但不限于，外周血、组织、细胞、尿、唾液、组织活检物、细针抽出物、外科手术样本和尸检材料。在一个实例中，样品包括肿瘤活检样品，例如肿瘤活检样品。
序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性被表示为所述序列之间的相似性，或者称为序列同一性。序列同一性经常通过同一性(或相似性或同源性)百分比来度量；所述百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，多肽或核酸分子的同系物或变体具有相对较高程度的序列同一性。
用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。多种程序和比对算法记载于：Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988；Higgins and Sharp,Gene 73:237,1988；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151,1989；Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881,1988；以及Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988。Altschul et al.,Nature Genet.6:119,1994提供了序列对比方法和同源性计算的详细思路。
NCBI基础局部比对检索工具(BLAST)(Altschul al.,J.Mol.Biol.215:403,1990)可以从若干来源获得，包括美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI，Bethesda,MD)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。互联网上的NCBI网站提供了如何使用该程序确定序列同一性的说明。
特异性结合间皮素或其片段的抗体VL或VH的同系物和变体通常特征为，当使用NCBI Blast 2.0、空位blastp设置为默认参数时，在全长比对上计算，与所述抗体的氨基酸序列具有至少约75％，例如至少约80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。为了比较超过约30个氨基酸的氨基酸序列，使用了Blast 2 sequences功能，采用设置为默认参数(空位存在罚分为11，每个残基空位罚分为1)的默认BLOSUM62矩阵。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，比对应使用Blast 2 sequences功能进行，采用设置为默认参数(开放空位9，延伸空位1罚分)的PAM30矩阵。通过该方法评估时，与参考序列有更高相似性的蛋白会显示增加的同一性百分比，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。当比较非完全序列的序列同一性时，同系物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口中具有至少80％的序列同一性，并且取决于它们与参考序列的相似性，可具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性。确定在这样的短窗口上的序列同一性的方法可以从互联网上的NCBI网站获得。本领域的技术人员会理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导；非常显著的同系物完全有可能落在所提供范围之外。
鳞状细胞癌：衍生自复层鳞状上皮的恶性肿瘤，但也可发生在例如通常存在腺上皮或柱状上皮的支气管粘膜位置。鳞状细胞癌是最常见的皮肤癌类型。
SS1P：由连接至介导细胞杀伤的截短型假单胞菌外毒素的抗间皮素Fv(与MORAb-009相同的Fv)组成的重组免疫毒素(Chowdhury and Pastan，Nat Biotechnol 17：568-572，1999；Pastan et al.，Nat Rev Cancer6：559-565，2006)。SS1P也称为CAT-5001，对表达间皮素的细胞系具有细胞毒性，导致裸鼠中表达间皮素的肿瘤异种移植物完全消退，并且对从人癌症患者获得的细胞具有细胞毒性(Hassan et al.，Clin Cancer Res10：3937-3942，2001；Hassan et al.,Clin Cancer Res 8：3520-3526，2002)。
胃癌：在胃内衬的组织中形成的癌症。也称为胃癌(gastric cancer)。
受试者：活的多细胞脊椎生物——一个包括人受试者和兽医受试者的类别，包括人和非人哺乳动物。
合成的：在实验室中通过人工方法生产的，例如通过杂交瘤技术产生的或从cDNA构建体表达的单克隆抗体。
治疗有效量：足以在被治疗的受试者中达到需要效果的具体物质的量。例如，这可以是抑制或遏制肿瘤生长所必需的量。在一个实施方案中，治疗有效量是清除肿瘤、降低肿瘤的大小或防止肿瘤转移所必需的量。当给予受试者时，一般使用会达到靶组织浓度(例如在肿瘤中)的剂量，所述靶组织浓度已被表明可达到需要的体外效果。
毒素：对细胞有细胞毒性的分子。毒素包括相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素、皂草素、局限曲菌素或白树毒素，或它们的经修饰的毒素。例如PE和DT是一般通过肝毒性导致死亡的高毒性化合物。然而，PE和DT可通过以下方式被修饰为可用作免疫毒素的形式：除去所述毒素的天然靶向部分(例如PE的结构域Ia或DT的B链)并将其置换为不同的靶向部分(例如抗体)。
载体：被导入宿主细胞从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含本领域中已知的一个或多个选择标记基因以及其他遗传元件。
除非另有说明，本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同。除非文中另有明确说明，单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。“包含A或B”意指包含A或B，或A和B。还应该理解，为核酸或多肽给出的全部碱基大小或氨基酸大小以及全部分子量或分子质量值是近似值，并且提供用于说明目的。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开内容的实施或测试，但下文描述了适合的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式全文纳入本文。如果出现冲突，以本说明书(包括对术语的解释)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅是示例性的，而并不意欲进行限制。
III.引言
针对间皮素的单克隆抗体(mAb)目前正处于评估和临床开发中，用于治疗间皮瘤和几种其它形式的癌症。然而，几乎所有的目前正在临床前或临床研究中评估的现有间皮素mAb(包括MORAb-009)都识别区域I(细胞表面间皮素的高免疫原性的N-末端，其也结合粘蛋白MUC16/CA125)。患者中的自身抗体或可溶性MUC16/CA125蛋白可以隔离抗区域I的mAb，限制了它们的抗癌功效。此外，当在使用MORAb-009治疗的临床试验中测定患者随访的可溶性间皮素时，FDA批准的MesoMarkTM试剂盒不能检测到血清间皮素，因为它与MORAb-009形成复合物，并且MORAb-009的表位与MesoMarkTM中使用的抗区域I的抗体的表位重叠。因此，需要生成针对间皮素的所有潜在的功能性亚结构域的mAb，并评估所述抗体的抗肿瘤活性和诊断价值。
兔杂交瘤技术和一组截短的间皮素结构域片段被用于鉴定特异性结合不是区域I的一部分的表位的抗间皮素mAb。4种兔mAb(YP187，YP223，YP218和YP3)被鉴定为针对区域II(391-486)、区域III(487-581)或者天然构象具有高的亚纳摩尔的亲和力。SS1P，由连接至截短的假单胞菌外毒素的抗间皮素Fv组成的重组免疫毒素，在ELISA中不与这些抗体竞争结合间皮素，因此这些新的兔mAb识别的表位不同于MORAb-009/SS1P位点。流式细胞术分析表明，兔mAb还结合癌细胞上的天然间皮素。
包含融合至PE38的兔scFv YP187、YP223、YP218或YP3的免疫毒素，能够结合表达间皮素的细胞并且诱导细胞毒性。YP218scFv-PE38表现出最高的结合亲和力，因此，进一步评估了该免疫毒素针对四种间皮瘤患者原代细胞的细胞毒性，以及在间皮瘤小鼠模型中的细胞毒性。结果表明，YP218scFv-PE38针对原代患者间皮瘤细胞的效力比SS1P高2-5倍，并且在体内针对肿瘤复发比SS1P更有效。
本文还公开了一种结合间皮素的区域I(YP158)的高亲和力的兔mAb的鉴定。YP158以非常高的亲和力和特异性结合癌症细胞和组织中的天然间皮素蛋白。
IV.特异性针对间皮素的兔单克隆抗体
本文公开了一组结合间皮素的特定区域的兔抗间皮素单克隆抗体(mAb)。在本公开内容的一个方面，兔mAb结合非区域I的一部分的表位。具体地，所鉴定的mAb(YP187、YP223、YP218和YP3)以亚纳摩尔的亲和力结合间皮素的区域II(391-486)、区域III(487-581)或天然构象。这些抗体并不与间皮素特异性免疫毒素SS1P或间皮素特异性抗体MORAb-009竞争结合。在另一个方面，公开了一种结合间皮素区域I的高亲合力兔mAb(YP158)。YP158以高亲和力和特异性与肿瘤细胞和组织中的天然间皮素蛋白结合。
以下示出了YP223、YP218、YP3、YP187和YP158的VH和VL结构域的核苷酸和氨基酸序列。
YP223VH的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)
CAGGAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGGTTAGACTTCAGTAGCAGCTACTGGATATGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGGTGTCGTCATACTTTTACTGCTAACACATGGTCCGCGAGCTGGGTGAATGGCCGGTTCACCATCTCCAGAAGCACCAGCCTAGGCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGAATCTAATAATGATGGTTGGGATTTTAAGTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
YP223VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)
QEQLEESGGDLVQPEGSLTLTCKASGLDFSSSYWICWVRQAPGKGLEWIGCRHTFTANTWSASWVNGRFTISRSTSLGTVDLKMTSLTAADTATYFCARDESNNDGWDFKLWGPGTLVTVSS
YP223VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACCAGGCATCCACTCTGGCACCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTAGTAGTAATGTTGAGAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGGGGTGGTGGTC
YP223VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)
AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYQASTLAPGVSSRFKGSGSGTEFTLTISGVECADAATYYCQQGYTSSNVENVFGGGTGVVV
表1.YP223VH(SEQ ID NO：9)CDR以及YP223VL(SEQ ID NO：11)CDR的氨基酸位置
H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
Kabat 31-36 51-67 100-111 24-34 50-56 89-100
IMGT 27-34 52-59 98-111 27-32 50-52 89-100
YP218VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)
CAGCAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGATTCGACCTCGGTTTCTACTTTTACGCCTGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATACTGCTGGTAGTGGTAGCACGTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAGCCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGGCAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGATCTACTGCTAATACTAGAAGTACTTATTATCTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
YP218VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)
QQQLEESGGGLVKPEGSLTLTCKASGFDLGFYFYACWVRQAPGKGLEWIACIYTAGSGSTYYASWAKGRFTISKASSTTVTLQMTSLAAADTATYFCARSTANTRSTYYLNLWGPGTLVTVSS
YP218VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)
GACGTCGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGGATTAGTAGTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTTTGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCCTCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAATACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAGAGTTATGCTTATTTTGATAGTAATAATTGGCATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTC
YP218VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)
DVVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQRISSYLSWYQQKPGQRPKLLIFGASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISDLECADAATYYCQSYAYFDSNNWHAFGGGTEVVV
表2.YP218VH(SEQ ID NO：13)CDR和YP218VL(SEQ ID NO：15)CDR的氨基酸位置
H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
Kabat 31-36 51-68 100-112 24-34 50-56 89-101
IMGT 27-34 52-59 98-112 27-32 50-52 89-101
YP3VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)
CAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGAATCGACTTCAGTCGCTACTACATGTGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGGGGATCGCATGTATTTATATTGGTGGTAGTGGTAGCACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAGCCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCGAGAGGGACTAATCTTAATTATATTTTTAGGTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
YP3VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)
QEQLVESGGGLVQPGASLTLTCTASGIDFSRYYMCWVRQAPGKGLEGIACIYIGGSGSTYYASWAKGRFTISKASSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGTNLNYIFRLWGPGTLVTVSS
YP3VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAATAATGGTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAGGCTCCTGATCTATTCTGCATCCAATCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTATTGTCAATGTATTTGGGATGGTAATAGTTATGTTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTC
YP3VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)
DVVMTQTPSPVSAAVGGTVTIKCQASQSINNGLAWYQQKPGQPPRLLIYSASNLESGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECDDAATYYCQCIWDGNSYVNAFGGGTEVVV
表3.YP3VH(SEQ ID NO：17)CDR和YP3VL(SEQ ID NO：19)CDR的氨基酸位置
H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
Kabat 31-35 50-67 99-108 24-34 50-56 89-100
IMGT 26-33 51-58 97-108 27-32 50-52 89-100
YP187克隆1VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)
CAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTAGCAATGCAATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGTTGGTGATGGCAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGGGGATATGCTAGTTATGGTAGTGATTATTATTGGGACTACTTTAAGTTGTGGGGCCCA
YP187克隆1VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)
QSLEESGGDLVKPGASLTLTCKASGFDFSSNAMCWVRQAPGKGLEWIACIYVGDGNTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGYASYGSDYYWDYFKLWGP
YP187克隆2VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)
CAGGAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCGGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGCAGCAGCTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGCTGGTGATGGTGGTGCCACCTATGACGCGAGCTGGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAAGGGTGCTGCTCCTACTACTTATTACTATTTTAATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
YP187克隆2VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)
QEQLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEWIACIYAGDGGATYDASWVNGRFSISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARKGAAPTTYYYFNLWGPGTLVTVSS
YP187VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGCACTGCATTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGGTCCTGATCTATGCTGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAACAGGCTGCTACCATTATTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTC
YP187VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)
AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASQSISTALAWYQQKPGQPPKVLIYAASNLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQQAATIINVDNVFGGGTEVVV
表4A.YP187克隆1VH(SEQ ID NO：21)CDR和YP187VL(SEQ ID NO：23)CDR的氨基酸位置
H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
Kabat 31-35 50-66 98-113 24-34 50-56 89-100
IMGT 25-33 51-57 96-113 27-32 50-52 89-100
表4B.YP187克隆2VH(SEQ ID NO：29)的氨基酸位置
H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3
Kabat 31-36 51-68 100-112
IMGT 26-34 52-60 98-112
YP158VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)
CAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCGACTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGGTGGTGGTAGTAATACTGCCACCTACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATCTCGGTTTTGTTGATTATGCTTTGGAATTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
YP158VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)
QSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSGDYYMCWVRQAPGKGLEWIACIGGGSNTATYYATWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARDLGFVDYALELWGPGTLVTVSS
YP158VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)
GACATTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAAAACATGTACAACTCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGTACTTTTTATAGTCATAATAATAATTATGGTGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTC
YP158VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)
DIVMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASENMYNSLAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLESGVPSRFKGSGSGTEYTLTISDLECADAATYYCQCTFYSHNNNYGGAFGGGTEVVV
表5.YP158VH(SEQ ID NO：25)CDR和YP158VL(SEQ ID NO：27)CDR的氨基酸位置
H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
Kabat 30-35 50-67 99-109 24-34 50-56 89-102
IMGT 25-33 51-59 97-109 27-32 50-52 89-102
本文提供了结合(例如特异性结合)间皮素(例如细胞表面的或可溶性的间皮素)的分离的单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含在本文中示出为SEQID NO：9(YP223)、SEQ ID NO：13(YP218)、SEQ ID NO：17(YP3)、SEQ ID NO：21(YP187克隆1)、SEQ ID NO：29(YP187克隆2)或SEQ ID NO：25(YP158)的氨基酸序列的至少一部分，例如通过IMGT确定的来自SEQ ID NO：9、13、17、21、29或25的一个或多个(如全部三个)CDR序列。在其它实施方案中，所述抗体包含使用Kabat方法确定的来自SEQ ID NO：9、13、17、21、29或25的一个或多个(如全部三个)CDR序列。
在一些实施方案中，所述抗体的VL结构域包含在本文中示出为SEQ ID NO：11(YP223)、SEQ ID NO：15(YP218)、SEQ ID NO：19(YP3)、SEQ ID NO：23(YP187)或SEQ ID NO：27(YP158)的氨基酸序列的至少一部分，例如通过IMGT确定的来自SEQ ID NO：11、15、19、23或27的一个或多个(如全部三个)CDR序列。在其它实施方案中，所述抗体包含使用Kabat方法确定的来自SEQ ID NO:11、15、19、23或27的一个或多个(如全部三个)CDR序列。
在一些实施方案中，结合间皮素的抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:9的第27-34、52-59和98-111位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:11的第27-32、50-52和89-100位氨基酸残基。在其它实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:9的第31-36、51-67和100-111位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:11的第24-34、50-56和89-100位氨基酸残基。在一些实例中，所述VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:9至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同；和/或所述VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:11至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。在具体的实例中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:9和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:13的第27-34、52-59和98-112位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:15的第27-32、50-52和89-101位氨基酸残基。在其它实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:13的第31-36，51-68和100-112位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:15的第24-34，50-56和89-101位氨基酸残基。在一些实例中，所述VH结构域的氨基酸序列与SEQ IDNO:13至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同；和/或所述VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:15至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。在具体的实例中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:13和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:15。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:17的第26-33，51-58和97-108位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:19的第27-32、50-52和89-100位氨基酸残基。在其它实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:17的第31-35、50-67和99-108位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:19的第24-34、50-56和89-100位氨基酸残基。在一些实例中，所述VH结构域的氨基酸序列与SEQ IDNO:17至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同；和/或所述VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:19至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。在具体的实例中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:17和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:19。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:21的第25-33、51-57和96-113位氨基酸残基，或SEQ ID NO:29的第26-34、52-60和98-112位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:23的第27-32、50-52和89-100位氨基酸残基。在其它实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:21的第31-35、50-66和98-113位氨基酸残基，或SEQ ID NO:29的第31-36、51-68和100-112位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:23的第24-34、50-56和89-100位氨基酸残基。在一些实例中，所述VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:29至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同；和/或所述VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:23至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。在具体的实例中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:29，和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:25的第25-33、51-59和97-109位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:27的第27-32、50-52和89-102位氨基酸残基。在其它实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:25的第30-35、50-67和99-109位氨基酸残基；和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:27的第24-34、50-56和89-102位氨基酸残基。在一些实例中，所述VH结构域的氨基酸序列与SEQ IDNO:25至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同；和/或所述VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:27至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。在具体的实例中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:25和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:27。
还提供了结合(如特异性结合)间皮素的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含VH结构域和/VL结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQID NO:21、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:25的氨基酸序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:9和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:13和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:15。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:17和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:19。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:21和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:29和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:25和/或所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:27。
在一些实施方案中，结合(如特异性结合)间皮素的单克隆抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，结合(如特异性结合)间皮素的单克隆抗体是Fab片段，Fab'片段，F(ab)'2片段，单链可变片段(scFv)，或二硫键稳定可变片段(dsFv)。在其它实施方案中，所述抗体是免疫球蛋白分子。在具体的实例中，所述抗体是IgG。
在一些实施方案中，所公开的抗体以约1nM或更小的解离常数(Kd)结合间皮素(可溶性或细胞表面间皮素)。在某些实施方案中，所述单克隆抗体以约1nM、约0.9nM、约0.8nM、约0.7nM、约0.6nM，约0.5nM、约0.4nM、约0.3nM、约0.2nM、约0.15nM或约0.1nM的结合亲和力结合间皮素。
本文公开的单克隆抗体可被标记，如用荧光，酶或放射性标记物标记。
本文还提供了包含治疗有效量的所公开的抗体和可药用载体的组合物。
还提供了包含本文公开的单克隆抗体和效应分子的免疫缀合物。所述效应分子可以是例如毒素或可检测标记物。在一些实施方案中，所述免疫缀合物包含本文公开的抗间皮素的抗体之一的VH和/或VL结构域和毒素，所述毒素例如PE或其变体如PE38。在具体的实例中，所述免疫缀合物包含与PE38融合的YP223、YP218、YP3、YP187或YP158的VH和VL。在一些实例中，所述毒素是包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的PE38。在具体的非限制性实例中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:39的氨基酸序列。免疫缀合物的实例在下文第VI部分更详细地讨论。
本文还提供了包含治疗有效量的本文公开的免疫缀合物和可药用载体的组合物。
本文还提供了编码所公开的单克隆抗体的分离的核酸分子。在一些实施方案中，编码所述单克隆抗体的VH结构域的核苷酸序列包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:24的至少一部分，例如编码SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO：24的一个或多个CDR的部分。在一些实例中，所述单克隆抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:24的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码所述单克隆抗体的VL结构域的核苷酸序列包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26的至少一部分，例如编码SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26的一个或多个CDR的部分。在一些实例中，所述人单克隆抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26的核苷酸序列。
在一些实例中，所述分离的核酸分子与启动子可操作地连接。
还提供了包含本文公开的分离的核酸分子的表达载体。本文还提供了包含所述核酸分子或载体的分离的宿主细胞。在一些实例中，所述宿主细胞是T细胞，如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
V.抗体和抗体片段
本文所公开的单克隆抗体可以是任何同种型。所述单克隆抗体可以是，例如，IgM或IgG抗体，例如IgG1或IgG2。根据公知的方法，可以将特异性结合间皮素的抗体的类别转换为另一类(例如，IgG可以被转换为IgM)。类别转换还可以用于将一种IgG亚类转换为另一种，例如从IgG1至IgG2。
抗体片段也被包括在本公开内容中，例如单结构域抗体(例如VH结构域抗体)、Fab、F(ab’)2和Fv。这些抗体片段保持选择性结合所述抗原的能力。这些片段包括：
(1)Fab，包含抗体分子的单价抗原-结合片段的片段，其可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体以生成完整的轻链和重链的一部分而产生；
(2)Fab’，可通过以下方式获得的抗体分子的片段：用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，以生成完整轻链和重链的一部分；每个抗体分子可以获得两个Fab’片段；
(3)(Fab’)2，可通过以下方式获得的抗体的片段：用胃蛋白酶处理整个抗体但不进行随后的还原；F(ab’)2是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab’片段的二聚体；
(4)Fv，包含表达为两条链的轻链的可变区和重链的可变区的经遗传改造的片段；
(5)单链抗体(例如scFv)，包含通过适合的多肽接头连接为基因上融合的单链分子的轻链的可变区和重链的可变区的经遗传改造的分子；
(6)单链抗体的二聚体(scFV2)，定义为scFV的二聚体(也称为“微型抗体”)；和
(7)VH单链抗体，由重链可变结构域构成的抗体片段。
制备这些片段的方法是本领域中已知的(参见，例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1998)。
在一些情况下，可通过对所述抗体的蛋白水解或通过在宿主细胞中表达编码所述片段的DNA来制备抗体片段(例如大肠杆菌(E.coli))。通过常规方法对整个抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得抗体片段。例如，抗体片段可以通过以下方式产生：用胃蛋白酶对抗体进行酶法切割以提供名称为F(ab’)2的5S片段。该片段还可以使用巯基还原剂(和任选的用于因切割二硫键产生的巯基的保护基)来进一步切割，以产生3.5S Fab’单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行的酶法切割直接产生了两个单价Fab’片段和一个Fc片段(参见，美国专利4,036,945和美国专利4,331,647)。
还可以使用切割抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，片段的进一步切割，或其他酶法、化学或基因技术，只要所述片段结合被完整抗体识别的抗原。
本领域技术人员会认识到可以产生所述抗体的保守性变体。在抗体片段(例如dsFV片段或scFv片段)中采用这类保守性变体会保留VH和VL区之间的正确折叠和稳定所必需的关键氨基酸残基，并且会保持所述残基的电荷特征以保留所述分子的低pI和低毒性。可在VH和/或VL区中进行氨基酸置换(例如至多一个、至多两个、至多三个、至多四个或至多五个氨基酸置换)以增加产率。提供功能上类似的氨基酸的保守性氨基酸置换表是本领域技术人员所公知的。以下六组是被认为是互为保守性置换的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
VI.免疫缀合物
可将所公开的特异性针对间皮素或其片段的单克隆抗体缀合到治疗剂或效应分子。免疫缀合物包括但不限于，其中存在治疗剂与抗体的共价连接的分子。治疗剂是具有针对具体靶分子或带有靶分子的细胞的特定生物活性的试剂。本领域的技术人员会理解，治疗剂可包括多种药物(例如长春碱、道诺霉素等)、细胞毒素(例如天然的或经修饰的假单胞菌外毒素或白喉毒素)、本身含有药物组合物的包囊剂(例如脂质体)、放射性试剂(例如125I、32P、14C、3H和35S)和其他标记物、靶部分和配体。
具体治疗剂的选择取决于具体的靶分子或细胞，以及所需要的生物学作用。因此，例如，所述治疗剂可以为用于导致具体靶细胞(例如肿瘤细胞)的死亡的细胞毒素。相反地，在需要引起非致死性生物学反应的情况下，可将所述治疗剂缀合至非致死的药剂或含有非致死药剂的脂质体。
使用本文描述的治疗剂和抗体，本领域技术人员可容易地构建含有功能等价核酸(例如序列不同、但编码相同的效应部分或抗体序列的核酸)的多个克隆。因此，本公开内容提供了编码抗体及其缀合物和融合蛋白的核酸。
效应分子可使用本领域技术人员已知的任何数量的方式连接至目的抗体。可使用共价和非共价连接方式。连接所述效应分子和抗体的方法会根据效应物的化学结构而有所不同。多肽一般含有多个官能团；例如羧酸(COOH)、游离氨基(-NH2)或巯基(-SH),其可用于与抗体上合适的官能团发生反应以导致与所述效应分子的结合。或者，可将所述抗体衍生化以暴露或连接另外的反应性官能团。所述衍生化可包括连接任意的多种已知接头分子。所述接头可以是用于连接所述抗体与效应分子的任何分子。所述接头能够与所述抗体和效应分子两者形成共价键。合适的接头是本领域技术人员所公知的，包括但不限于直链或支链的碳接头、杂环碳接头或肽接头。在所述抗体和效应分子是多肽的情况下，所述接头可以通过其侧基(例如通过与半胱氨酸的二硫键)连接到成分氨基酸或者连接至末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
在一些情况中，当所述免疫缀合物已经到达其靶位点时，需要从所述抗体释放所述效应分子。因此，在这些情况中，免疫缀合物会包含在所述靶位点附近可切割的键。切割所述接头以将所述效应分子从所述抗体释放，这可以由酶活性引起，或由所述免疫缀合物在所述靶细胞内或靶位点附近所处的条件引起。
考虑到已经报道的用于将多种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、标记(例如酶或荧光分子)药物、毒素和其他试剂连接到抗体的大量方法，本领域技术人员将能够确定用于将给定试剂连接至抗体或其他多肽的合适方法。
可将本文公开的抗体或抗体片段衍生化或连接至另外的分子(例如另外的肽或蛋白质)。通常，衍生化所述抗体或其部分会使得与靶抗原的结合不受所述衍生化或标记化的不利影响。例如，所述抗体可以被功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他)到一种或多种其他分子实体，例如另外的抗体(例如双特异性抗体(bispecificantibody))或双价抗体(diabody))、检测试剂、药剂和/或可介导所述抗体或抗体部分与另外的分子(例如链霉亲和素核心区或多组氨酸标签)的缔合的蛋白质或肽。
一种类型的衍生抗体是通过交联两个或更多个抗体(同一类型或者不同类型，例如以产生双特异性抗体)产生。合适的交联剂包括那些异双功能交联剂或同双功能交联剂，所述异双功能交联剂具有被适合的间隔基分开的两个不同反应活性的基团(例如间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，所述同双功能交联剂为例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯。这样的交联剂是可商购的。
可以用可检测部分标记可结合(例如特异性结合)间皮素的抗体或其片段。可用的检测试剂包括荧光化合物，其包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、稀土无机发光材料等。还可使用生物发光标记物，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)。可用于检测的酶也可以用来标记抗体，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体被可检测酶标记时，可以通过加入另外的试剂来检测所述抗体，所述另外的试剂可被所述酶使用以产生可识别的反应产物。例如，当存在试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺可产生可目视检测的显色反应产物。还可用生物素标记抗体并通过间接测量亲和素或链霉亲和素结合来检测。应注意，亲和素本身可用酶或荧光标记物来标记。
可用磁性试剂例如钆来标记抗体。还可用稀土元素(例如铕和镝)和锰来标记抗体。顺磁性颗粒(例如超顺磁性氧化铁)也可用作标记物。还可用可被第二报告分子(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定多肽表位来标记抗体。在一些实施方案中，标记物被不同长度的间隔臂连接以减少可能的空间位阻。
还可用放射性标记的氨基酸来标记抗体。放射性标记可用于诊断和治疗目的。例如，放射性标记可用于通过X-射线、发射谱或其他诊断技术来检测间皮素。用于多肽的标记物的实例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核苷酸：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
抗体还可用化学基团例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或碳水化合物基团来衍生化。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如用以增加血清半衰期或增加组织结合。
可将本文描述的单克隆抗体与毒素一起使用以产生免疫毒素。示例性的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素和它们的亚基，以及肉毒杆菌毒素A-F。这些毒素可容易地从商业来源获得(例如，Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)。所考虑的毒素还包括本文描述的毒素的变体(参见，例如参见美国专利No.5,079,163和4,689,401)。在一个实施方案中，所述毒素为假单胞菌外毒素(PE)(美国专利No.5,602,095)。本文使用的“假单胞菌外毒素”是指全长的天然(天然存在)的PE或经过修饰的PE。这类修饰可包括但不限于结构域Ia的消除，结构域Ib、II和III中的多个氨基酸缺失，单个氨基酸置换以及羧基端的一个或多个序列的添加(例如，参见，Siegall et al.,J.Biol.Chem.264:14256-14261,1989)。
与本文描述的单克隆抗体一起使用的PE可以包括其天然序列、所述天然序列的细胞毒性片段以及天然PE及其细胞毒性片段的保守性修饰的变体。PE的细胞毒性片段包括在靶细胞中在具有或不具有随后的蛋白水解或其他加工的情况下都有细胞毒性的那些。PE的细胞毒性片段包括PE40、PE38和PE35。对PE及其变体的另外的描述参见例如美国专利No.4,892,827；5,512,658；5,602,095；5,608,039；5,821,238；和5,854,044；PCT公开文本No.WO99/51643；Pai et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA88:3358-3362,1991；Kondo et al.,J.Biol.Chem.263:9470-9475,1988；Pastan et al.,Biochim.Biophys.Acta 1333:C1-C6,1997。
全长PE序列在本文示出为SEQ ID NO:1：
AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQTQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK
在一些实例中，所述PE是PE38，其包含以下氨基酸序列：
PEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO：2)
本文还考虑蛋白酶抗性的PE变体和具有降低的免疫原性的PE变体，例如，但不限于，PE-LR、PE-6X、PE-8X、PE-LR/6X和PE-LR/8X(参见，例如，Weldon et al.，Blood 113(16)：3792-3800，2009；Onda et al.，Proc Natl Acad Sci USA 105(32)：11311-11316，2008；和PCT公开文本No.WO 2007/016150、WO 2009/032954和WO 2011/032022，其以引用的方式纳入本文)。
在一些实例中，所述PE为对溶酶体降解有抗性的变体，例如PE-LR(Weldon etal.，Blood 113(16)：3792-3800，2009；PCT公开文本No.WO 2009/032954)，其具有如下的氨基酸序列：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO：3)
在其他实例中，所述PE为被称为PE-LR/6X的变体(PCT公开文本No.WO 2011/032022)，其具有如下的氨基酸序列：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYATSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEESGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDSEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO：4)
在其他实例中，所述PE变体为免疫原性降低的PE，例如具有如下序列的PE：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGXVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEXGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWXGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAXGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYXTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEXGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDXEXAISALPDYASQPGKPPREDLK(X＝G，A or S；SEQ ID NO：5)
在其他实例中，PE为被称为PE-LR/8M的变体(PCT公开文本No.WO 2011/032022)，其具有如下的氨基酸序列：
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGAVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYATSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEESGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDSEAAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO：6)
本文通过参考本文中示出为SEQ ID NO：1的全长PE氨基酸序列限定PE的置换。本文通过参考存在于特定位置的氨基酸残基，以及在特定置换中替换该残基的氨基酸来描述PE的置换。在这一方面，PE的具体实施方案的氨基酸序列的位置在本文中被称为所述具体实施方案的氨基酸序列的位置，或SEQ ID NO:1限定的位置。因此，置换是指在PE的具体实施方案的氨基酸序列中氨基酸残基的替换，其对应于SEQ ID NO:1的613个氨基酸序列的指定位置，需要理解的是，各个氨基酸序列中的实际位置可能不同。除非另作特别说明，在两个或更多位置的多个置换的情况下，所述两个或更多个置换可能是相同的或不同的——被置换的两个或更多个氨基酸残基中的每个氨基酸残基可被相同或不同氨基酸残基置换。
PE的修饰可发生在之前描述的任何变体中，包含PE的细胞毒性片段(例如PE38、PE-LR和PE-LR/8M)。如以上描述的，修饰的PE可包括对PE的一个或多个T细胞表位和/或B细胞表位中的一个或多个氨基酸残基的任何置换。
在本文公开的具体实例中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39的氨基酸序列，和/或由SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的核酸序列编码。
本文描述的抗体还可用于将任何数量的不同诊断或治疗性化合物靶向至其表面上表达间皮素的细胞。因此，可以将本公开内容的抗体直接连接或通过接头连接至待直接递送至表达细胞表面间皮素的细胞的药物。可这样做以用于治疗、诊断或研究目的。治疗剂包括诸如核酸、蛋白质、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂质、碳水化合物或重组病毒的化合物。核酸治疗或诊断部分包括反义核酸、用于与单链或双链DNA共价交联的衍生寡核苷酸以及三链形成寡核苷酸。
或者，与抗间皮素抗体连接的分子可以为包裹***例如脂质体或微团，所述脂质体或微团含有治疗组合物例如药物、核酸(例如反义核酸)或优选地被保护而免于直接暴露于循环***的另一治疗部分。制备连接有抗体的脂质体的方法是本领域技术人员所公知的(参见，例如，美国专利No.4,957,735；Connor et al.,Pharm.Ther.28:341-365,1985)。
本文描述的抗体还可共价或非共价连接至可检测标记物。适用于这种用途的可检测标记物包括可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组合物。可用的标记物包括磁性小珠、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)和比色标记物例如胶体金或者有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)小珠。
检测这类标记物的方法是本领域技术人员所公知的。因此。例如，放射性标记物是使用照相胶片或闪烁计数器来检测，荧光标记物是使用光检测器检测发出的光来检测。酶标记物一般是通过为酶提供底物并检测所述酶作用于所述底物而产生的反应产物来检测，比色标记物是通过简单地目视所述有色标记物来检测。
VII.组合物和使用方法
提供了包括在载体中的一种或多种结合(例如特异性结合)间皮素的所公开的抗体的组合物。还提供了包含免疫缀合物或免疫毒素的组合物。所述组合物可以以用于给予受试者的单位剂型制备。给药量和给药时间由治疗医生决定以达到需要的结果。所述抗体可被配制用于全身或局部(例如肿瘤内)给药。在一个实例中，所述抗体被配制用于肠胃外给药，例如静脉内给药。
用于给药的组合物可以包括溶于可药用载体(例如水性载体)中的抗体的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不需要的物质。这些组合物可以通过常规的公知灭菌技术灭菌。所述组合物可以含有接近生理条件所需要的可药用辅料例如pH调节剂和缓冲试剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠等。这些制剂中抗体的浓度可以有很大的差异，并且将主要根据所选择的具体给药方式和受试者需要基于流体体积、粘度、体重等来选择。
用于静脉内给药的一般药物组合物含有约0.1至10mg抗体/受试者/天。可以使用从0.1mg至最高约100mg/受试者/天的剂量，尤其当所述试剂被给药至隔离的位点而不进入循环***或淋巴***(例如进入到体腔或进入到器官的腔)时。制备可给药的组合物的实际方法是本领域技术人员已知的或者显而易见的，并且更详细地记载于例如Remington'sPharmaceutical Science,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA(1995)的出版物中。
抗体可以以冻干形式提供并在给药前用无菌水再水化，但是它们也可以以具有已知浓度的无菌溶液的形式提供。然后，可以将所述抗体溶液加入到含有0.9％氯化钠(USP)的输注袋中，并且在一些情况中以0.5至15mg/kg体重的剂量给药。本领域中可获得大量关于抗体药物给药的经验，自从1997年被批准后抗体药物在美国已经上市。抗体可以通过缓慢输注来给予，而不是静脉推注或快速注射(bolus)。在一个实例中，给予较高的负荷剂量(loading dose)，然后以较低水平给予维持剂量。例如，可以在约90分钟时间内输注4mg/kg的初始负荷剂量，如果前剂量耐受良好，可以在30分钟时间内输注2mg/kg的每周维持剂量，持续4-8周。
受控释放的肠胃外制剂可被制成埋植剂、油性注射剂或被制成颗粒***。对于蛋白递送***的全面综述，参见Banga,A.J.,Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems,Technomic Publishing Company，Inc.,Lancaster,PA,(1995)。颗粒***包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊含有所述治疗性蛋白质(例如细胞毒素或药物)作为中央核心。在微球中，所述治疗剂分散在整个所述颗粒。小于约1μm的颗粒、微球和微胶囊通常被分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管的直径为约5μm，使得只有纳米颗粒可静脉内给药。微粒直径通常为约100μm，经皮下或者肌内给药。参见，例如Kreuter,J.,Colloidal Drug DeliverySystems,J.Kreuter,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,pp.219-342(1994)；和Tice&Tabibi,Treatise on Controlled Drug Delivery,A.Kydonieus,ed.,Marcel Dekker,Inc.New York,NY,pp.315-339,(1992)。
聚合物可以用于本文公开的抗体组合物的离子控制释放。用于受控药物递送的多种可降解和不可降解的聚合基质是本领域中已知的(Langer,Accounts Chem.Res.26:537-542,1993)。例如，嵌段共聚物polaxamer 407在低温下以粘稠的流动液体形式存在，但是在体温下形成半固体凝胶。已证明它是配制和持续递送重组白细胞介素-2和脲酶的有效运载体(Johnston et al.,Pharm.Res.9:425-434,1992；和Pec et al.,J.Parent.Sci.Tech.44(2):58-65,1990)。或者，羟基磷灰石已被用作用于蛋白质的控制释放的微载体(Ijntemaet al.,Int.J.Pharm.112:215-224,1994)。又在另一方面，脂质体被用于脂质包裹的药物的控制释放以及药物靶向(Betageri et al.,Liposome Drug Delivery Systems,Technomic Publication Co.,Inc.,Lancaster,PA(1993))。已知用于治疗性蛋白质的控制递送的许多另外的***(参见美国专利No.5,055,303；美国专利No.5,188,837；美国专利No.4,235,871；美国专利No.4,501,728；美国专利No.4,837,028；美国专利No.4,957,735；美国专利No.5,019,369；美国专利No.5,055,303；美国专利No.5,514,670；美国专利No.5,413,797；美国专利No.5,268,164；美国专利No.5,004,697；美国专利No.4,902,505；美国专利No.5,506,206；美国专利No.5,271,961；美国专利No.5,254,342和美国专利No.5,534,496)。
A.治疗方法
可给予本文公开的抗体、组合物和免疫缀合物，以减缓或抑制肿瘤细胞的生长或者抑制肿瘤细胞的转移，例如间皮瘤，***癌，肺癌，胃癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌。在这些应用中，将治疗有效量的抗体给予受试者，其量足以抑制癌细胞生长、复制或转移或足以抑制癌症的征象或症状。合适的受试者可包括被诊断患有表达间皮素的癌症(例如，但不限于，间皮瘤，***癌，肺癌，胃癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌)的受试者。
在一个非限制性的实施方案中，本文提供了一种通过以下方式治疗患有癌症的受试者的方法：选择患有表达间皮素的癌症的受试者，并给予所述受试者治疗有效量的本文公开的抗体、组合物或免疫缀合物。
本文还提供了一种通过以下方式抑制肿瘤生长或转移的方法：选择患有表达间皮素的癌症的受试者，并给予所述受试者治疗有效量的本文公开的抗体、组合物或免疫缀合物。
间皮素特异性的抗体或免疫缀合物的治疗有效量将取决于疾病的严重程度以及患者健康的一般状况。所述抗体的治疗有效量是指提供症状的主观缓解或由临床医师或者其他有资质的观察者注意到的可客观辨别的改善的量。
人GPC3特异性抗体或免疫缀合物的治疗有效量将取决于疾病的严重程度以及患者健康的一般状况。所述抗体的治疗有效量是指提供症状的主观缓解或者由临床医师或者其他有资质的观察者注意到的可客观辨别的改善的量。
本文公开的抗体和免疫缀合物的给药还可伴随其他抗癌剂的给药或治疗性处理(例如肿瘤的手术切除)。任何合适的抗癌剂均可以与本文公开的抗体、组合物和免疫缀合物组合给予。示例性的抗癌剂包括但不限于化学治疗剂，例如有丝***抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素(intercalating antibiotic)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗生存剂(anti-survival agent)、生物应答调节剂、抗激素剂(例如抗雄激素剂)和抗血管生成剂。其他抗癌治疗包括放射治疗和特异性靶向癌细胞的其他抗体。
烷化剂的非限制性实例包括氮芥(nitrogen mustard)(例如双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、美法仑(melphalan)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)或苯丁酸氮芥(chlorambucil))、烷基磺酸酯(alkyl sulfonate)(例如白消安(busulfan))、亚硝基脲(nitrosourea)(例如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链佐星(streptozocin)或达卡巴嗪(dacarbazine))。
抗代谢物的非限制性实例包括叶酸类似物(例如氨甲蝶呤(methotrexate))、嘧啶类似物(例如5-FU或阿糖胞苷(cytarabine))和嘌呤类似物，例如巯基嘌呤(mercaptopurine)或硫鸟嘌呤(thioguanine)。
天然产物的非限制性实例包括长春花生物碱(vinca alkaloid)(例如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)或长春地辛(vindesine))、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(例如依托泊苷(etoposide)或替尼泊苷(teniposide))、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)或丝裂霉素C(mitomycin C))和酶(例如L-天冬酰胺酶)。
混杂剂(miscellaneous agent)的非限制性实例包括铂配位络合物(例如顺式二胺-二氯铂II，也称为顺铂)、取代的脲(例如羟基脲)、甲肼衍生物(methyl hydrazinederivative)(例如丙卡巴肼(procarbazine))和肾上腺皮质(adrenocrotical)抑制剂(例如米托坦(mitotane)和氨鲁米特(aminoglutethimide))。
激素和拮抗剂的非限制性实例包括肾上腺皮质类固醇(例如***(prednisone))、孕激素(例如己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)和醋酸甲地孕酮(magestrol acetate))、***(例如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和炔雌醇(ethinyl estradiol))、抗***(例如他莫昔芬(tamoxifen))和雄激素(例如丙酸睾酮(testerone proprionate)和氟***(fluoxymesterone))。最常用的化学治疗剂的实例包括阿霉素(Adriamycin)、爱克兰(Alkeran)、Ara-C、BiCNU、白消安、CCNU、碳铂(Carboplatinum)、顺铂(Cisplatinum)、环磷酰胺(Cytoxan)、柔红霉素、DTIC、5-FU、氟达拉滨(Fludarabine)、羟基脲(Hydrea)、伊达比星(Idarubicin)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、光神霉素(Mithramycin)、丝裂霉素(Mitomycin)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、氮芥、紫杉醇(或其他紫杉烷，例如多西他赛(docetaxel))、硫酸长春碱制剂(Velban)、长春新碱、VP-16，而一些更新的药物包括吉西他滨(Gemcitabine,Gemzar)、赫赛汀(Herceptin)、伊立替康(Irinotecan,Camptosar，CPT-11)、克拉立平(Leustatin)、诺维本(Navelbine)、RituxanSTI-571、泰索帝(Taxotere)、托泊替康(Topotecan,Hycamtin)、希罗达(Xeloda，卡培他滨(Capecitabine))、泽娃灵(Zevelin)和骨化三醇(calcitriol)。
可使用的免疫调制剂的非限制性实例包括AS-101(Wyeth-Ayerst Labs.)、溴匹立明(bropirimine,Upjohn)、γ干扰素(Genentech)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；Genetics Institute)、IL-2(Cetus或Hoffman-LaRoche)、人免疫球蛋白(CutterBiological)、IMREG(来自Imreg of New Orleans,La.)、SK&F 106528和TNF(肿瘤坏死因子；Genentech)。
对于某些类型的癌症的另一种常见治疗是手术治疗，例如手术切除癌症或其一部分。治疗的另一实例是放射治疗，例如在进行手术切除前，向肿瘤部位给予放射性物质或能量(例如外线束疗法)以帮助消灭肿瘤或使其缩小。
B.诊断和检测的方法
本文提供了在体外或体内检测间皮素表达的方法。在一些情况下，检测了生物样品中的间皮素表达。所述样品可以为任何样品，包括但不限于来自活组织检查、尸体解剖和病理标本的组织。生物样品还包括组织的切片，例如为组织学目的获取的冷冻切片。生物样品还包括体液，例如血液、血清、血浆、痰、脊髓液或尿。生物样品一般获自哺乳动物，例如人或非人灵长类。
在一个实施方案中，提供了一种通过以下方式确定受试者是否患有癌症的方法：使来自所述受试者的样品与本文公开的单克隆抗体接触并检测所述抗体与所述样品的结合。与所述抗体和对照样品的结合相比，所述抗体与所述样品的结合的增加鉴定出所述受试者患有癌症。
在另一实施方案中，提供了一种通过以下方式确认受试者中的癌症的诊断的方法：使来自被诊断患有癌症的所述受试者的样品与本文公开的单克隆抗体接触并检测所述抗体与所述样品的结合。与所述抗体和对照样品的结合相比，所述抗体与所述样品的结合的增加确认所述受试者中的癌症的诊断。
在所公开的方法的一些实例中，所述单克隆抗体是经直接标记的。
在一些实例中，所述方法还包括使特异性结合所述单克隆抗体的第二抗体与所述样品接触并检测所述第二抗体的结合。与所述第二抗体和对照样品的结合相比，所述第二抗体与所述样品的结合的增加检测出所述受试者中的癌症或确认所述受试者中的癌症的诊断。
在一些情况下，所述癌症是间皮瘤，***癌，肺癌，胃癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌，或任何其它类型的表达间皮素的癌症。
在一些实例中，对照样品是来自未患癌症的受试者的样品。在具体的实例中，所述样品是血液或组织样品。
在一些情况下，结合(例如特异性结合)间皮素的所述抗体是用可检测标记物直接标记的。在另一实施方案中，所述结合(例如特异性结合)间皮素的抗体(第一抗体)是未经标记的，并且可结合所述特异性结合间皮素的抗体的第二抗体或其他分子是经标记的。如本领域技术人员所公知的，可选择能够特异性结合特定种类和类型的第一抗体的第二抗体。例如，如果所述第一抗体为人IgG，那么所述第二抗体就可以为抗人IgG。可结合抗体的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，其两者均是可商购的。
上文描述了用于所述抗体或第二抗体的合适标记物，包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性试剂和放射性材料。合适酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。合适荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹酰氯或藻红蛋白。非限制性的示例性发光材料是鲁米诺；非限制性的示例性磁性试剂是钆，并且非限制性的示例性放射性标记包括125I、131I、35S或3H。
在替代的实施方案中，可利用以可检测物质标记的间皮素标准品和特异性结合间皮素的未标记抗体通过竞争性免疫测定来测定生物样品中的间皮素。在该测定中，所述生物样品、所述标记的间皮素标准品和所述特异性结合间皮素的抗体被合并，并且确定结合到所述未标记的抗体的所述标记的间皮素标准品的量。所述生物样品中间皮素的量与结合到所述特异性结合间皮素的抗体的所述标记的间皮素标准品的量成反比。
本文公开的免疫测定和方法可用于多种目的。在一个实施方案中，特异性结合间皮素的所述抗体可用于检测细胞培养物的细胞中的间皮素的产生。在另一实施方案中，所述抗体可用于检测生物样品中间皮素的量，所述生物样品例如组织样品，或者血液或血清样品。在一些实例中，间皮素是细胞表面间皮素。在其他实例中，间皮素是可溶性间皮素(例如，细胞培养物上清液中的间皮素，或体液样品例如血液或血清样品中的可溶性间皮素)。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测生物样品例如血液样品或组织样品中的间皮素的试剂盒。例如，为了确认受试者中的癌症诊断，可进行活组织检查以获得用于组织学检查的组织样品。或者，可获得血液样品以检测可溶性间皮素蛋白或片段的存在。用于检测多肽的试剂盒一般包含特异性结合间皮素的单克隆抗体，例如本文公开的任何抗体。在一些实施方案中，所述试剂盒中包括抗体片段，例如scFv片段、VH结构域或Fab。在另外的实施方案中，所述抗体是经标记的(例如，用荧光标记物、放射性标记物或酶标记物)。
在一个实施方案中，试剂盒包括公开结合间皮素的抗体的使用方法的说明性材料。所述说明性材料可以是书面的、电子形式(例如计算机磁盘或光盘)或者可以是可视形式(例如视频文件)。所述试剂盒还可以包括有助于该试剂盒被设计用于的具体应用的其他组分。因此，例如，所述试剂盒可以额外地含有检测标记物的装置(例如用于酶标记物的酶底物、用于检测荧光标记物的滤光装置、适当的第二标记物例如第二抗体等)。所述试剂盒可以额外地包括常规用于实施具体方法的缓冲液及其他试剂。这类试剂盒和适当的内容物是本领域技术人员所公知的。
在一个实施方案中，所述诊断试剂盒包括免疫测定。虽然免疫测定的细节会随着所用的具体形式而有所不同，但是检测生物样品中间皮素的方法通常包括使所述生物样品与在免疫反应条件下与间皮素多肽特异性地反应的抗体接触的步骤。使所述抗体在免疫反应条件下特异性结合以形成免疫复合物，并且直接或间接地检测所述免疫复合物(结合的抗体)的存在。
确定细胞表面标记物存在或不存在的方法在本领域中是公知的。例如，可将所述抗体缀合至其他化合物，该化合物包括但不限于酶、磁性小珠、胶体磁性小珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物或药物。所述抗体还可用于免疫测定，例如但不限于放射免疫测定(RIA)、ELISA或免疫组织化学测定。抗体还可用于荧光激活的细胞分选(FACS)。FACS采用多个颜色通道、低角度和钝角的光散射检测通道和阻抗通道，以及其他更复杂水平的检测，以分离或分选细胞(参见美国专利No.5,061,620)。任何本文公开的结合间皮素的单克隆抗体可用于这些测定。因此，所述抗体可用于常规免疫测定，包括但不限于ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学、蛋白质印迹或免疫沉淀。
C.工程化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
所公开的单克隆抗体还可用于产生被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR；也称为嵌合T细胞受体、人造T细胞受体或嵌合免疫受体)的CTL。通常，CAR包括结合部分、细胞外铰链和间隔物元件(spacer element)、跨膜区和进行信号转导功能的内结构域(endomain)(Cartellieri et al.,J Biomed Biotechnol 2010:956304,2010)。在许多实例中，所述结合部分为单克隆抗体的抗原结合片段，例如scFv。已经使用若干不同的内结构域来产生CAR。例如，内结构域可以由具有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)(例如CD3δ或FcεRIγ)的信号转导链组成。在一些实例中，所述内结构域还包括至少一个另外的共刺激结构域(例如CD28和/或CD137)的胞内部分。
表达CAR的CTL可用于靶向具体的细胞类型，例如肿瘤细胞。因此，本文公开的单克隆抗体可用于对表达CAR(含有间皮素特异性抗体的抗原结合片段)的CTL进行工程化，从而使所述工程化的CTL靶向至表达间皮素的肿瘤细胞。工程化的T细胞之前已经被用于针对一些类型的癌症的过继疗法(adoptive therapy)(参见例如，Park et al.,Mol Ther15(4):825-833,2007)。表达CAR的T细胞的使用比标准的基于CTL的免疫疗法更普遍，因为表达CAR的CTL是HLA不受限的并因此可用于患有表达靶抗原的肿瘤的任何患者。
因此，本文提供了包含间皮素特异性抗体结合片段如scFv的CAR。还提供了编码CAR的分离的核酸分子和载体，以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞如CTL。表达包含间皮素特异性抗体结合片段的CAR的CTL可用于治疗表达间皮素的癌症，如间皮瘤，***癌，肺癌，胃癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌。因此，本文提供了通过以下方式治疗患有癌症的受试者的方法：选择患有表达间皮素的癌症的受试者，并给予所述受试者治疗有效量的表达间皮素-靶向的CAR的CTL。
D.双特异性抗体
双特异性抗体是包含两种不同单克隆抗体的抗原结合片段的重组蛋白。因此，双特异性抗体结合两种不同的抗原。双特异性抗体可通过同时靶向CTL(例如CTL受体组分，例如CD3)和肿瘤抗原而用于癌症免疫治疗。本文公开的间皮素特异性单克隆抗体可用于产生靶向间皮素和CTL的双特异性抗体，从而提供治疗表达间皮素的癌症的方法。
本文提供了包含间皮素特异性单克隆抗体或其抗原结合片段的双特异性单克隆抗体。在一些实施方案中，所述双特异性单克隆抗体还包含特异性结合T细胞受体的组分(例如CD3)的单克隆抗体或其抗原结合片段。还提供了编码所述双特异性抗体的分离的核酸分子和载体，以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。包含间皮素特异性抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体可用于治疗表达间皮素的癌症，例如间皮瘤，***癌，肺癌，胃癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌。因此，本文提供了通过以下方式治疗患有癌症的受试者的方法：选择患有表达间皮素的癌症的受试者并给予所述受试者治疗有效量的靶向间皮素的双特异性抗体。
提供以下实施例以举例说明某些具体的特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开内容限定为所描述的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1：特异性针对间皮素的兔单克隆抗体的鉴定和表征
本实施例描述了几个特异性结合间皮素的区域II、区域III或构象表位的兔单克隆抗体的鉴定。对所述抗体的表征确认了，它们不与现有的结合细胞表面间皮素的区域I的间皮素特异性治疗抗体(包括SS1P和MORAb-009)竞争结合。
背景
细胞表面间皮素的结构如图1所示。到目前为止生产的所有抗间皮素的治疗性抗体都识别细胞表面间皮素的高免疫原性N-末端区域I内的表位，所述N-末端区域I结合粘蛋白MUC16/CA125。患者中的自身抗体或可溶性MUC16/CA125可以隔离抗-区域I的抗体，限制了它们的抗癌功效。此外，当在使用MORAb-009(阿麦妥昔单抗(amatuximab))治疗的临床试验中测定患者随访的可溶性间皮素时，FDA批准的MesoMarkTM试剂盒不能检测到血清间皮素，因为它与MORAb-009形成复合物。MORAb-009的表位与MesoMarkTM中使用的抗区域I的抗体的表位重叠。因此，为了诊断和治疗目的，需要鉴定一种不结合间皮素区域I的、高亲和力的间皮素特异性单克隆抗体。
特异性针对间皮素的各个结构域的兔mAb的发现
为了鉴定不与区域I抗体竞争结合的间皮素特异性单克隆抗体，基于它们与间皮素蛋白的ELISA结合信号，选择了232个兔mAb。为此，制备了3种间皮素片段：区域I(第296-390位残基)，区域II(第391-486位残基)和区域III(第487-598位残基)(SEQ ID NO:7；Kaneko et al.，J Biol Chem 284：3739-3749，2009)。所述间皮素片段被用于通过ELISA选择结构域特异性兔mAb。在所筛选的克隆中，223个(96％)结合区域I，5个克隆结合区域II，3个克隆结合区域III。此外，鉴定了一个结合构象敏感性表位的克隆。
通过ELISA对区域I、区域II、区域III和构象敏感性mAb克隆进行了评估。用全长间皮素、或区域I、区域II或区域III间皮素片段包被ELISA板。将兔杂交瘤上清液加入到ELISA板中，并且采用山羊抗兔IgG轻链-特异性HRP缀合物检测与间皮素或其片段结合的兔mAb(图2A-2D)。结果表明，区域I、区域II或区域III特异性抗体能够结合它们各自的间皮素片段，以及全长间皮素。构象敏感性mAb克隆只能结合全长间皮素。
为了评估兔mAb克隆与细胞表面间皮素的结合，进行使用NCI-H226细胞(间皮瘤细胞系)的FACS分析。用兔杂交瘤上清液(在FACS缓冲液中1:2稀释)孵育NCI-H226细胞(1×106)。通过山羊抗兔IgG PE缀合物检测兔mAb与细胞表面间皮素的结合。如图3A-3D所示，区域I、区域II、区域III以及构象敏感性mAb克隆都能结合细胞表面间皮素。
高亲和力的mAb结合位点的表征
基于上述的结合数据，4个克隆被选择用于进一步的分析：
YP187-区域II结合物
YP223–区域II结合物
YP218–区域III结合物
YP3-构象敏感的
使用三明治ELISA确定兔mAb是否结合间皮素中不同于SS1P/MORAb-009(区域I)位点的位点。在第一个实验中，使用不同浓度的每种mAb克隆评估在存在SS1P的情况下YP187、YP223、YP218和YP3与重组间皮素的结合。用SS1P免疫毒素(1μg/mL)包被ELISA板。将重组间皮素蛋白(1μg/mL)被加入到该板中。洗涤后，加入兔mAb上清液(1:3系列稀释)，并使用山羊抗兔IgG轻链HRP缀合物(1:5000)检测兔mAb的结合。结果表明，YP187、YP223、YP218和YP3都识别不同于SS1P位点的位点(图4)。
在第二个实验中，使用不同浓度的重组间皮素评估在SS1P的存在下YP187、YP223、YP218和YP3与重组间皮素的结合。将SS1P免疫毒素(5μg/mL)包被在ELISA板上。1:3系列稀释重组间皮素蛋白(从10μg/mL开始)，并将其加到ELISA板中。洗涤后，加入兔mAb上清液(1:5)，并使用山羊抗兔IgG轻链(1:5000)HRP缀合物检测兔mAb的结合。如图5所示，YP187、YP223、YP218和YP3识别不同于SS1P位点的位点。除了YP187，所有其它的兔mAb(YP223、YP218和YP3)都以剂量依赖的方式结合间皮素。YP187mAb抗体部分地与SS1P竞争间皮素，这表明YP187位点(在区域II中)可能接近在区域I中的SS1P位点。
这些结果表明，YP223(区域II)，YP218(区域Ⅲ)和YP3(构象敏感性)兔mAb不结合与MORAb-009/SS1P位点(区域I)重叠的表位。YP187(区域II)mAb部分地与SS1P竞争间皮素，表明在YP187位点可能接近区域I中SS1P位点。
兔mAb克隆的结合亲和力
通过ELISA评估YP223、YP218和YP3针对间皮素的结合亲和力。在室温下将不同含量的兔mAb与固定量的间皮素(1μg/mL)孵育1小时，随后洗涤板并按照标准的ELISA程序测量兔mAb对间皮素的结合。通过适用于Windows的Prism(3.02版本)(GraphPad software，San Diego，CA)测定亲和力Kd值。如图6A-6C所示，所有的兔mAb对间皮素具有高的亚纳摩尔的亲和力。具体地，YP223的KD值为0.65nM，YP218的KD值为0.91nM，YP3的KD值为0.42nM。
接着，进行研究以评估使用兔mAb克隆进行的对培养物上清液中的可溶性间皮素蛋白的检测。H9和K5细胞系广泛用于异种移植物模型，用于在小鼠中评价间皮素-靶向癌症疗法。K5细胞系表达一种在区域II具有一个10-氨基酸缺失(411-420位残基)的形式的间皮素，而H9细胞系表达全长、野生型间皮素。
用SS1P(5μg/mL)包被ELISA板。加入H9或K5培养物上清液(1:3系列稀释)。洗涤后，加入兔mAb培养物上清液(1:5)。使用山羊抗兔轻链-特异性HRP缀合物(1:5000)检测兔mAb的结合(图7A-7B)。
区域II、区域III和构象敏感性mAb结合H9细胞系中的野生型间皮素。但是，区域II(YP223)和区域III(YP218)mAb，而非构象敏感性(YP3)mAb，较弱地结合由K5细胞系表达的具有一个10-氨基酸缺失的突变间皮素，但不是如此，这表明YP3识别野生型间皮素的构象所特有的天然构象。
通过三明治ELISA检测可溶性间皮素
使用在PBS中的5μg/ml的YP223(区域II结合物)过夜包被Nunc Maxisorp 96孔平底板。使用ELISA缓冲液(0.01％的吐温20，10％的Pierce SuperBlock)将纯化的间皮素-Fc融合蛋白稀释为不同浓度(从0.25至8nM)，并在室温下在平板上孵育1小时。对于SS1P竞争实验，在室温下，将5μg/mL SS1P与间皮素-Fc融合蛋白预孵育1小时，然后将混合物(SS1P和间皮素)加到板中。为了检测可溶性间皮素，随后将所述板用5μg/mL生物素化的YP218(区域III结合物)在室温下孵育1小时；随后将1:2000稀释的链霉亲和素-HRP(Invitrogen)加在板上，在室温下持续1小时。在每次包被之间将板洗涤四次。使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺检测试剂(KPL)实现可视化，并且使用Spectra Max Plus板读数器(Molecular Devices)读取450nm处的吸光度。结果如图10所示。
这些结果表明了建立了一种新的在SS1P免疫毒素的存在下使用YP223和YP218兔抗体测量可溶性间皮素蛋白的三明治ELISA方法。SS1P的存在不影响YP223或YP218与间皮素的结合。这种新的三明治ELISA测定是高度灵敏的，因为(1)它的EC50约为0.5nM，并且(2)它可以检测0.2nM的可溶性间皮素蛋白。
实施例2：特异性针对间皮素区域I的高亲和力兔mAb
本实施例描述了以高亲和力和特异性结合癌症细胞和组织中的天然间皮素的区域I的兔mAb克隆的鉴定和表征。
如实施例1所述，鉴定了223个结合间皮素区域I(第296-390位残基)的兔mAb克隆。在该组中的高亲和力结合物中，鉴定出YP158。YP158对肿瘤细胞和组织中的间皮素具有高度特异性。
为了评估YP158与人癌细胞的结合，进行使用一组肝癌细胞系和癌症样品的免疫印迹分析。如图8A-8B所示，YP158能够检测肿瘤细胞中的天然间皮素。随后评价YP158检测免疫沉淀复合物中的天然间皮素的能力。在该实验中，对A431/H9(在表皮样癌A431细胞系中强制表达(forced expression)间皮素)、NCI-H226(间皮瘤)和KMBC(胆管癌)细胞提取物中的内源性间皮素蛋白进行免疫沉淀。使用针对间皮素的人mAb免疫沉淀细胞裂解物中的内源性间皮素蛋白。使用YP158探测在免疫沉淀蛋白中的天然间皮素(图9)。
这些结果表明，YP158以非常高的亲和力和特异性结合癌症细胞和组织中的天然间皮素蛋白。
实施例3：CD22特异性免疫毒素的生成与表征
按照标准技术，使用融合至假单胞菌外毒素片段PE38(SEQ ID NO:2)的YP3、YP218、YP223和YP187scFv生成重组免疫毒素。简言之，在每个免疫毒素构建体中，利用编码肽(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:31的第125-139位氨基酸残基)的接头序列，使抗体VH结构域融合至VL结构域。使用短接头序列(ASGG；SEQ ID NO:31的第251-254位氨基酸残基)使抗体VL结构域融合至PE38。YP218scFv-PE38、人源化YP213scFv-PE38、YP223scFv-PE38、YP3scFv-PE38和YP187scFv-PE38免疫毒素的核苷酸和氨基酸序在本文中列示出为SEQ ID NO:30-39。
通过流式细胞术评估YP3scFv-PE38、YP218scFv-PE38和YP223scFv-PE38免疫毒素针对一组表达间皮素的肿瘤细胞的结合亲和力。还评估了YP3scFv-PE38、YP218scFv-PE38和YP223scFv-PE38免疫毒素对表达间皮素的肿瘤细胞的细胞毒性。使用间皮素特异性免疫毒素SS1P作为阳性对照，使用HB21-PE40免疫毒素(特异性针对人转铁蛋白受体)作为阴性对照。结果总结于下表6中。所有3种免疫毒素以不同的亲和力结合间皮素阳性细胞系，其中YP218scFv-PE38表现出最高的亲和力。YP218scFv-PE38还诱导了最高的针对表达间皮素的肿瘤细胞的细胞毒性。
表6，抗间皮素免疫毒素针对表达间皮素的细胞的细胞毒性和亲和力的总结
*间皮素阴性
此外，通过流式细胞术评价了YP3scFv-PE38、YP187scFv-PE38、YP218scFv-PE38及其人源化形式hYP218scFv-PE38和YP223scFv-PE38对H9细胞的结合亲和力。结果示出于图11，并总结于下表7。YP218scFv-PE38免疫毒素的人源化没有显著改变其对间皮素阳性H9细胞的结合亲和力。
表7.免疫毒素对H9细胞的结合亲和力
免疫毒素 Kd(nM)
SS1P 1.3
YP3scFv-PE38 2.352
YP218scFv-PE38 3.865
YP223scFv-PE38 25.21
YP187scFv-PE38 ＞158
hYP218scFv-PE38 3.607
然后，将YP218scFv-PE38针对4种恶性间皮瘤患者原代细胞系的细胞毒性与SS1P免疫毒素的细胞毒性进行比较。在所述4种原代细胞系(RH16、RH18、RH19和RH21)中，3种对抗-间皮素免疫毒素敏感。在所述3种敏感的原代系(RH16、RH19和RH21)中，YP218scFv-PE38的效力是SS1P的2至5倍(见图12和表8)。
表8.YP218scFv-PE38对4种间皮瘤患者原代细胞系的细胞毒性
恶性间皮瘤患者细胞 SS1P YP218scFv-PE38
IC50(ng/ml) IC50(ng/ml)
RH16 10.4 2.0
RH18 ＞100 ＞100
RH19 0.63 0.33
RH21 0.73 0.23
在裸鼠的NCI-H226人间皮瘤模型中对YP218scFv-PE38进行进一步评估。对6周的雌性BALB/c nu/nu小鼠腹膜内接种3×106个稳定表达高水平的Luc/GFP的NCI-H226间皮瘤细胞。在第12、14、16和18天对小鼠腹膜内给予SS1P(0.4mg/kg)、YP218scFv-PE38(0.4mg/kg)或载体(PBS)。SS1P和YP218-PE38免疫毒素在治疗过程中有效地抑制了肿瘤的生长。然而，在SS1P的治疗完成后残留的间皮瘤肿瘤细胞很快引起复发，而YP218scFv-PE38组的间皮瘤复发显著性地更慢(图13)。在第25天和第27天，YP218scFv-PE38组的5只小鼠中的2只几乎没有肿瘤，而SS1P组中的所有小鼠都有肿瘤。
实施例4：间皮素特异性单克隆抗体用于检测受试者中的癌症或确认受试者中的癌症的诊断
本实施例描述了间皮素特异性单克隆抗体用于检测受试者中的癌症的用途，所述间皮素特异性单克隆抗体例如本文公开的兔单克隆抗体或这些抗体的人源化或标记的形式。本实施例进一步描述了这些抗体用于确认受试者中的癌症的诊断的用途。
从诊断患有或怀疑患有间皮素-阳性癌症(即过表达间皮素的癌症，如间皮瘤，***癌，肺癌，胃癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌)的患者获得血液样品。来自未患有癌症的患者的血液样品用作对照。进行ELISA以检测所述血液样品中可溶性间皮素的存在。按照本领域公知的方法将存在于所述血液样品(患者样品和对照样品)中的蛋白质固定在固体载体如96孔板上(参见，例如Robinson et al.，Lancet 362：1612-1616，2003)。固定后，将直接用荧光标记物标记的间皮素特异性单克隆抗体施加到所述固定蛋白的板上。在合适的缓冲液(例如PBS)中洗涤板，以除去任何未结合的抗体，并且最小化抗体的非-特异性结合。可以根据标准方法使用荧光板读取器来检测荧光。患者样品的荧光强度相对于对照样品增加，表明所述抗间皮素抗体特异性结合来自血液样品的蛋白质，从而检测到样品中间皮素蛋白的存在。在患者样品中检测到间皮素蛋白表明所述患者患有间皮素-阳性癌症，或确认所述受试者中的癌症的诊断。
实施例5：间皮素特异性单克隆抗体用于治疗癌症
本实施例描述了间皮素特异性单克隆抗体(如本文公开的兔单克隆抗体或这些抗体的人源化形式)用于治疗表现出间皮素过表达的癌症(在本文中被称为“间皮素-阳性”癌症)的用途，所述癌症包括但不限于间皮瘤，***癌，肺癌，胃癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，胆管癌，乳腺癌或卵巢癌。被诊断为患有间皮素-阳性癌症的患者可以根据本领域的标准程序进行治疗(参见例如，Hassan et al.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.21：29a，2002；Kreiman etal.，Proc.Am.Soc.Clinl Oncol.21：22b，2002)。
在本实施例中，给予被诊断患有间皮素-阳性癌症的患者包含连接至假单胞菌外毒素(PE)的间皮素特异性单克隆抗体的免疫缀合物。PE免疫缀合物的制备已经有所记载(参见，例如美国专利No.7,081,518和美国专利申请公开文本No.2005/0214304)。在一些患者中，通过静脉快速注射每隔一日给予所述免疫缀合物，共三至六个剂量。在其他患者中，通过在十天的时间内连续静脉输注给予所述免疫缀合物。给予患者的免疫缀合物的剂量取决于所述患者的体重和性别以及给药的方式和时程。治疗后，评估患者的癌症进展(包括肿瘤生长和转移)和疾病的其他临床征象。
考虑到所公开的本发明的原理所适用的许多可能的实施方案，应当认识到，所举例的实施方案只是本发明的优选实例，并且不应当被认为是对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由以下的权利要求书确定。所以，本发明人要求保护落入这些权利要求的范围和主旨内的所有发明。

Claims (31)

1.一种结合间皮素的分离的单克隆抗体，其中：
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:13的第27-34，52-59和98-112位氨基酸残基；并且
所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:15的第27-32，50-52和89-101位氨基酸残基。
2.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中：
所述VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:13至少90％相同；并且
所述VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:15至少90％相同。
3.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中：
所述VH结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:13至少95％相同；并且
所述VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:15至少95％相同。
4.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中：
所述抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:13，并且
所述抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:15。
5.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链可变片段(scFv)或二硫键稳定的可变片段(dsFv)。
6.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是IgG。
7.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是嵌合的、合成的或人源化的。
8.权利要求1的分离的单克隆抗体，其中所述抗体是经标记的。
9.权利要求8的分离的单克隆抗体，其中所述标记是荧光标记、酶标记或放射性标记。
10.一种分离的免疫缀合物，其包含权利要求1-7任一项的单克隆抗体和效应分子。
11.权利要求10的分离的免疫缀合物，其中所述效应分子是毒素。
12.权利要求11的分离的免疫缀合物，其中所述毒素是假单胞菌(Pseudomonas)外毒素或其变体。
13.权利要求12的分离的免疫缀合物，其中所述假单胞菌外毒素或其变体包含SEQ IDNO:1-6中任一个的氨基酸序列。
14.权利要求10的分离的免疫缀合物，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
15.一种分离的免疫缀合物，包含权利要求1的单克隆抗体和效应分子，其中所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
16.一种嵌合抗原受体(CAR)，包含权利要求1-7任一项的单克隆抗体。
17.一种细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其表达权利要求16的CAR。
18.一种双特异性抗体，包含权利要求1-7任一项的单克隆抗体。
19.一种组合物，其包含在可药用载体中的治疗有效量的权利要求1-9任一项的抗体、权利要求10-15任一项的免疫缀合物、权利要求16的CAR、权利要求17的CTL或者权利要求18的双特异性抗体。
20.权利要求1-9任一项的分离的单克隆抗体，权利要求10-15任一项的免疫缀合物、权利要求16的CAR、权利要求17的CTL、权利要求18的双特异性抗体或者权利要求19的组合物用于制备治疗受试者中的癌症的药剂的用途，包括选择患有表达间皮素的癌症的受试者并给予所述受试者药剂，从而治疗所述受试者中的癌症。
21.权利要求1-9任一项的分离的单克隆抗体，权利要求10-15任一项的免疫缀合物、权利要求16的CAR、权利要求17的CTL、权利要求18的双特异性抗体、或者权利要求19的组合物用于制备抑制受试者中的肿瘤生长或转移的药剂的用途，包括选择患有表达间皮素的癌症的受试者并给予所述药剂，从而抑制所述受试者中的肿瘤生长或转移。
22.权利要求1-9任一项的单克隆抗体用于制备确定受试者是否患有癌症的药剂的用途，包括：
将来自所述受试者的样品与所述药剂接触；
检测所述药剂与所述样品的结合；和
如果与所述药剂与对照样品的结合相比，检测到所述药剂与所述样品的结合增加，则确定所述受试者患有癌症。
23.权利要求1-9任一项的单克隆抗体用于制备确认受试者中的癌症的诊断的药剂的用途，包括：
将来自被诊断患有癌症的受试者的样品与所述药剂接触；
检测所述药剂与所述样品的结合；和
如果与所述药剂与对照样品的结合相比，检测到所述药剂与所述样品的结合增加，则确认所述受试者中的癌症的诊断。
24.权利要求20-23任一项的用途，其中所述癌症是间皮瘤、***癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌或卵巢癌。
25.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-9任一项的单克隆抗体、权利要求10-15任一项的免疫缀合物、权利要求16的CAR或者权利要求18的双特异性抗体。
26.权利要求25的分离的核酸分子，其中：
(i)编码所述单克隆抗体的VH结构域的核苷酸序列包含SEQ ID NO:12；和
(ii)编码所述单克隆抗体的VL结构域的核苷酸序列包含SEQ ID NO:14。
27.权利要求25或26的分离的核酸分子，其中编码所述免疫缀合物的核苷酸序列包含SEQ ID NO:30。
28.一种分离的核酸分子，编码包含权利要求1的单克隆抗体和效应分子的免疫缀合物，其中所述编码所述免疫缀合物的核苷酸序列包含SEQ ID NO:32。
29.权利要求25-28任一项的分离的核酸分子，可操作地与启动子连接。
30.一种表达载体，其包含权利要求25-29任一项的分离的核酸分子。
31.一种分离的宿主细胞，其是用权利要求25-30任一项的分离的核酸分子或表达载体转化的。
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